CN103233036B - 基于基因工程策略优化耶氏解脂酵母重组菌合成共轭亚油酸 - Google Patents

Abstract

本发明将来自高山被孢霉（Mortierella alpine ATCC32222，M.alpina ATCC32222）中的delta-12脱饱和酶基因（FADS12,d12）进行扩增，制备了插入opai/d12共表达基因的多拷贝重组表达质粒和重组耶氏解脂酵母菌株。本发明的重组耶氏解脂酵母菌株通过表达d12基因可以增加内源性底物亚油酸（LA）的量以及发酵培养基中外加大豆油增加底物亚油酸的量，所述菌株中多拷贝整合方式增加了opai基因和d12基因的表达量及转录量，能够进一步提高重组耶氏解脂酵母菌中共轭亚油酸t10，c12-CLA专一异构体的合成量。

Description

基于基因工程策略优化耶氏解脂酵母重组菌合成共轭亚油酸

技术领域

本发明涉及基因工程手段对耶氏解脂酵母重组菌进行优化从而提高共轭亚油酸产量，具体是对合成共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株进一步优化。

技术背景

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid,CLA）是由一系列含有碳9、碳10、碳11开始的共轭双键、具有位置和几何异构的十八碳二烯酸构成的。近30年来，由于CLA具有包括抗癌、抗动脉粥样硬化、免疫系统的调节以及抑制脂肪的积累等对人类健康有益的效果，而被广泛的研究。c9，t11-CLA、t10，c12-CLA是含量最多并且是迄今为止确认具有生理活性功能的三种共轭亚油酸单体（还包括t9，t11-CLA）中的两种。CLA存在于多种动、植物及人体组织中，特别是反刍动物乳制品中，但其含量较低。通过将红花籽油或葵花籽油碱催化异构法等化学方法合成的CLA异构体的混合物，具有活性功能的异构体较难从中分离纯化。而通过生物转化法来获得成分单一的功能CLA是目前的一个前沿技术，能够满足CLA在医药及营养领域的应用要求。

到目前为止，c9，t11-CLA生物合成的最高量是Delacroixia coronata菌株通过delta-9脱饱和酶作用将t-亚油酸转化成CLA，浓度最高达到10.5mg/ml。转基因烟草种子以及大米中t10，c12-CLA占总脂肪酸的量仅分别为0.3%及1.6%。相对而言，生物合成t10，c12-CLA具有很大的提升空间。亚油酸异构酶（PAI）可以将游离亚油酸（LA）催化为共轭亚油酸。在之前我们的研究中通过优化PAI基因成功实现了在耶氏解脂酵母（Yarrowia lipolytica，Y.lipolytica）重组菌株中的异源表达，并在重组菌株的脂肪酸组分中检测到了产物t10，c12-CLA，利用多拷贝整合进一步提高了PAI基因在Y.lipolytica中的表达量及t10，c12-CLA产量，CLA产量占总脂肪酸量的5.9%。但此重组菌株的t10，c12-CLA产量还远远不能满足实际应用的要求。在Y.lipolytica细胞中，LA不只是PAI的底物，它也会参与到脂肪酸贝塔氧化等代谢途径中，这些途径中的相关酶和PAI之间存在竞争关系，因此无论是PAI表达量的提高还是LA的增多都会使更多的LA流向CLA合成通路。来源于本实验室高山被孢霉（Mortierella alpine ATCC32222，M.alpineATCC32222）的delta-12脱饱和酶基因（FADS12，d12）具有较广的适配性，无论酵母还是丝状真菌均能成为其表达宿主，delta-12脱饱和酶是将OA转化为LA的脂肪酸脱氢酶，可进一步提高菌体内LA的含量。另外培养基中添加一些植物油也可使底物LA的含量大大提高。

所以本发明通过基因工程的方法来改造Y.lipolytica重组菌株，提高PAI基因表达量和底物亚油酸(LA)的含量，并且培养基中额外添加LA含量较高的大豆油，达到了用微生物法高产t10，c12-CLA的目标。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程及发酵手段提高耶氏解脂酵母重组菌株中PAI的表达量以及底物LA的量，从而提高t10，c12-CLA专一异构体的产量。

本发明涉及含有opai/d12共表达基因的重组表达质粒，所述质粒可以是pJU16-opai-d12。

本发明另外一方面还涉及含有所述的重组表达质粒的宿主细胞，宿主细胞中包含的质粒可以是单拷贝或多拷贝的，例如1-8个拷贝，优选4个、5个、6个、7个或8个拷贝，最优选8个拷贝，所述宿主细胞可以是耶氏解脂酵母菌，例如CCFM-JUL系列菌，优选CCFM-JUL277。

本发明还涉及利用所述的重组表达质粒或所述的宿主细胞在生产共轭亚油酸中的用途，所述的共轭亚油酸是t10，c12-CLA，通过发酵所述宿主细胞，并在大豆油培养基中进行发酵可制备生产共轭亚油酸t10，c12-CLA专一异构体，具体发酵培养条件如下：CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5%接种量转接至5LYN₂₀BDS培养基中，28℃发酵，发酵时间为30-45小时，优选的发酵时间为40小时。

本发明克隆了来源于本实验室高山被孢霉（MortierellaalpineATCC32222，M.alpinaATCC32222）的delta-12脱饱和酶基因，并通过基因工程技术将该基因插入了包含亚油酸异构酶（PAI）基因的质粒载体中，最终获得了包含脱饱和酶基因delta-12和亚油酸异构酶基因opai的表达质粒pJU16-opai-d12。将该质粒通过本领域常用的转化方法耶氏解脂酵母菌株CCFM-JUL中。最终筛选得到了能够高产量生产CLA的CCFM-JU277系列重组菌株。delta-12脱饱和酶基因（FADS12，d12）可以将OA转化为LA的脂肪酸脱氢酶，进一步提高菌体内LA的含量，LA的增多使更多的LA流向CLA合成通路。此外，转化后筛选所获得的耶氏解脂酵母菌株中的多拷贝基因组合也提高了所述菌株中PAI表达量，PAI表达量的提高也会同时进一步促进更多的游离亚油酸（LA）被催化转化为共轭亚油酸。opai/d12共表达及多拷贝整合对CLA产量的提高具有促进作用。

本发明的内容包括：携带opai/d12共表达基因的多拷贝表达质粒、含有opai/d12共表达基因的多拷贝整合的重组耶氏解脂酵母菌株、所述重组菌株的制备方法、以及利用所述菌株发酵制备共轭亚油酸的方法。

本发明优选的技术方案为：将密码子优化后的亚油酸异构酶基因opai（SeqIDNo.1）插入质粒pJU16中。质粒pJU16为本实验室构建，该质粒具有尿嘧啶等位基因作为筛选标签，添加有调控元件16×UAS1B构成的启动子sp16，并用多拷贝方式进行整合，该质粒转化到大肠杆菌Escherichia coliDH5α（E.ColiDH5α）菌中进行保藏，E.Coli DH5α（pJU16）现保藏于江南大学食品生物技术中心菌种库（Culture Collection of Food Microorganisms,Jiangnan universityCCFM），同时提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏（具体保藏编号为：CGMCC7223））。从E.ColiDH5α菌中获得质粒pJU16后，将亚油酸异构酶基因opai插入质粒pJU16中获得重组质粒pJU16-opai，其中密码子优化后的亚油酸异构酶基因opai的序列如序列表中的序列1所示。将从M.alpinaATCC32222中得到的delta-12脱饱和酶基因d12插入pJU16-opai中，获得表达质粒pJU16-opai-d12，其中delta-12脱饱和酶基因d12的序列如序列表中的序列2所示。将上述构建后的重组质粒用NotⅠ酶切，得到的表达单元用乙酸锂方法转化进耶氏解脂酵母菌株CCFM-JUL中（该菌为本实验室从野生型菌株CCFM-JUW通过紫外诱变方法得到的尿嘧啶缺陷型菌株，现保藏于江南大学食品生物技术中心菌种库（CultureCollection of Food Microorganisms,Jiangnan universityCCFM），同时提交至中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏（保藏编号为：CGMCC7222）），经同源重组后，从YNBD固体平板中筛选得到CCFM-JU277系列重组菌株。用RT-PCR方法检测转化菌株中表达单元的拷贝数目发现，CCFM-JU277-9菌株拷贝数最多为8个；用气相色谱和气质联用对优化后重组菌株CCFM-JU277的脂肪酸进行检测，结果显示CCFM-JU277-9菌体合成CLA的量最高，可达总脂肪酸的10.1%；用大豆培养基对CCFM-JU277-9进行的5L发酵罐发酵，结果显示CLA的产量最高出现在40h，达到4.4g/L。

SEQ ID NO:1：密码子优化后的亚油酸异构酶基因（opai）核苷酸序列（1281bp）。

SEQIDNO:2：delta-12脱饱和酶基因（FADS12，d12）核苷酸序列（1200bp）。

耶氏解脂酵母CCFM-JUL于2013年1月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCNo.7222。

解脂亚罗酵母CCFM-JU277-9于2013年3月06日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCNo.7284。

大肠埃希氏菌Escherichia coli DH5α（pJU16）于2013年1月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCC No.7223。

附图说明

图1耶氏解脂酵母中表达亚油酸异构酶质粒pJU16-opai-d12的示意图。

图2pJU16-opai-d12转化子PCR验证电泳图（A,B:CCFM-JU277重组菌中opai和d12的验证M:DNA分子量Marker;Line1-9:9个CCFM-JU277转化子;PC:阳性对照;NC:阴性对照）。

图3Y.lipolytica多拷贝整合重组菌株中opai/d12共表达基因的拷贝数。

图4耶氏解脂酵母重组菌株CCFM-JU277系列菌合成t10，c12-CLA的产量。

图5在5-L发酵罐中，Y.lipolytica重组菌株利用YN20BDS培养基的生长情况（A）、胞内脂质含量及CLA产量（B）、培养基中脂质含量及CLA产量（C）。

表1引物序列表

a用于构建重组PAI表达载体的引物，b用于转化子验证的引物，c用于定量PCR的引物。具体实施方式

实施例1.重组表达质粒的构建

根据Genbank数据库中delta-12脱饱和酶基因（FADS12，d12，其核苷酸序列如SEQIDNO:2所示）的序列设计引物P1/P2（见表1），提取M.alpineATCC32222的mRNA并反转录为cDNA，并以cDNA为模板，通过PCR对d12基因进行扩增，基因两端连有PmlI和KpnI酶切位点。PCR程序为：94°C15s，58°C30s，68°C1min，30个循环。将扩增后的片段连在T载体pMD19T上（购自TaKaRa公司），得到pMD19T-d12。优化后的opai基因（其核苷酸序列如SEQID NO:1所示）由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并亚克隆至载体pUC57（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）上，得到pUC57-opai。根据质粒pUC57-opai上opai表达单元的序列设计引物P3/P4（见表1），以质粒pUC57-opai为模板，通过PCR对opai表达单元进行扩增，表达单元两端连有EcoRI酶切位点，PCR程序为：94°C15s，60°C30s，68°C2min，30个循环。将扩增后的片段连在T载体pMD19T上，得到插入pai表达单元的pMD19T-exp-opai质粒。质粒pMD19T-d12经PmlI和KpnI消化，得到d12片段，质粒pMD19T-exp-opai经PmlI和KpnI消化后，回收载体部分与d12片段连接，得到带有d12表达单元的pMD19T-exp-d12。

pUC57-opai经PmlIand KpnI酶切，得到opai片段，pJU16经PmlIand KpnI消化后与opai片段连接，得到pJU16-opai。质粒pMD19T-exp-d12经EcoRI酶切，得到exp-d12片段，质粒pJU16-opai经EcoRI酶切后与exp-d12片段连接，得到重组表达质粒pJU16-opai-d12，见图1。将构建后的重组表达质粒转化到E.ColiDH5α感受态细胞并均匀涂布于LB平板（含有100μg/mL卡那青霉素），37°C过夜培养后，挑选单克隆，PCR验证正确后送北京六合华大生物技术（上海）有限公司测序，测序结果显示插入基因opai和d12与理论序列一致。

实施例2.重组耶氏解脂酵母菌的构建

重组质粒pJU16-opai-d12经NotⅠ37℃消化1.5h后，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离并回收带有目的基因的表达单元片段，浓缩至500ng/μl，取2μg用于转化耶氏解脂酵母CCFM-JUL。转化过程如下：

1)菌株Y.lipolyticaCCFM-JUL在YPD固体培养基上划线，28℃培养12h；

2)用接种环从平板上挑取一环CCFM-JUL,重悬于1mLTE溶液中；

3)10000rpm离心，收集菌体，将菌体悬浮于600μl的0.1mol/1的乙酸锂(pH6.0)缓冲液中，28℃水浴1h，注意不要晃动样品；

4)水浴结束，3000rpm离心2min，弃上清；

5)轻轻将菌体重新悬浮于80μl0lmol/1的乙酸锂(pH6.0)中；至此，酵母菌感受态细胞制备完成。

6)取40μl上述酵母菌感受态，加入2μl单链鱼精DNA和4μl待转化DNA片段；28℃水浴15min，注意水浴过程中不要晃动样品；

7)上述样品中加入350μl40％(w/v)的PEG4000(溶于0.1mol/1pH6.0乙酸锂中)与16μllmol/L的DDT，28℃水浴1h，注意不要晃动样品；

8)逐滴加入40μlDMSO，轻轻混匀，然后置于39℃水浴中热休克10min；

9)向上述样品中加入600μl0.1mol/1的乙酸锂(pH6.0)，轻轻晃动混匀；将酵母菌悬液稀释成不同浓度涂布YNBD平板，28℃培养2-4d，得到单菌落。

挑取9个CCFM-JU277系列转化子于5mLYNBD培养基中，28℃，200rpm培养1-2d，收集菌体，提取转化子的基因组，以引物P5/P6和P7/P8（见表1）分别对插入基因opai和d12的转化子基因组进行PCR验证，PCR程序为：94℃30s，55℃30s,72℃30s,30个循环，72℃补充延伸5min。PCR反应体系：2μl2.5mM的dNTPs,2μl10×Buf.,0.5μlTaq,,上游及下游引物各0.5μl,模板1μl。其中挑出的转化子都扩增出了大小为626bp（opai基因的部分序列）和644bp（d12基因的部分序列）的特异条带，说明全部是阳性转化子（见图2）。

实施例3.多拷贝整合菌株中表达单元的拷贝数分析

根据GenBank中Y.lipolytica的ura3及suc2的基因（基因ura3和suc2参见Dheepak M,Robyn R,Rajesh L,Clinton S,Robin M,Johann G,SantoshR.(2008).Multi-copy expression and fed-batch production of Rhodotourla araucariaeepoxide hydrolase in Yarrowia lipolytica.Appl Microbiol Biotechnol,79:235-244）序列设计上下游引物P9/P10和P11/P12（见表1）。20μLPCR反应体系中含有SYBRGREEN2×PCRMaster Mix10μL、DNA模板5μL(30ng)、上下游引物5μL（1μmol/L）。程序为95℃5min，95℃15s，60℃1min，40个循环。采用ABI7500sequence detection system软件进行数据分析，以SUC2基因表达量作为内参，扩增循环数法（Ct法）对URA3基因拷贝数进行定量。9个CCFM-JU277转化子中表达单元的拷贝数差异不大，最少的拷贝数为4，最多为8个，平均拷贝数5个，拷贝数最多的菌株是CCFM-JU277-9，整合了8个外源基因表达单元（见图3），恰属于稳定遗传的拷贝数范围。并且用气相色谱和气质联用对优化后重组菌株CCFM-JU277（YPD培养基不添加大豆油，28℃200rpm培养72h）的脂肪酸进行检测，结果表明CCFM-JU277-9菌株合成CLA的量最高（见图4），CLA净产量为45.6mg/L，占总脂肪酸量的10.1%，远远高于出发菌株的CLA产量（2.3mg/L），约为后者的20倍。说明，opai/d12共表达及多拷贝整合对CLA产量的提高具有促进作用。

实施例4重组耶氏解脂酵母菌株在5-L发酵罐中的CLA合成

CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5%接种量转接至5LYN20BDS培养基中（无氨基酸酵母氮源6.7g/L、葡萄糖10g/L、NH₄Cl5g/L，Uracil0.1g/L，Casamino acids20g/L，大豆油20g/L，大豆油预先加入含有0.2%Tween80的水溶液中，至终浓度为200g/L，超声乳化五分钟（功率200w），经0.22μm的无菌滤膜过滤除菌，按1:10的比例添加到已灭过菌的培养基中），28℃发酵7天。主要参数：通气率3L/min，搅拌速度500r/min，pH6.0（通过3MKOH和2MH₂SO₄进行调节），消泡剂silicone（有机硅消泡剂）根据发酵情况适量添加。每个时间点取样10mL，8000rpm离心15min，收集菌体，并将培养基上清收集于干净的离心管中，用0.85%的NaCl溶液洗菌体两次，洗菌体后的上清液与培养基上清合并。取20mg冻干后的酵母菌体，加入10%盐酸-甲醇，60℃水浴3h，气相色谱定性、定量分析脂肪酸甲酯，并进一步通过气质联用确定目的产物10t，12c–CLA。

培养基中脂肪酸的提取是用1mL氯仿甲醇混合液（1:1）对培养基上清提取两次并合并，用10%盐酸-甲醇进行甲酯，此为培养基中总脂肪酸；培养基中游离脂肪酸的提取方法与上述相同，但用三甲基硅烷化重氮甲烷进行甲酯，气相色谱定性、定量分析脂肪酸甲酯，并进一步通过气质联用确定目的产物t10，c12-CLA。

表2Y.lipolytica重组菌YN₂₀BDS培养基在发酵模式下的胞内外脂肪酸组成

a：两次平行试验所得的数据ND：未检测到

通过气相色谱对于脂肪酸组分的分析发现，胞内脂质含量最高点出现在35h，占干菌重的33.3%，CLA在干菌重中的含量也是在35h时最高，为干菌重的13.8%，但是CLA产量的最大值出现在40h，为3.3g/L。培养基上清中CLA的最高含量1.1g/L也出现在40h，见图5（在5-L发酵罐中，Y.lipolytica重组菌株利用YN₂₀BDS培养基的生长情况、脂质含量及CLA产量，图中数据均为两次平行试验所得（A）耶氏解脂酵母重组菌体中去除脂质的生物量和培养基中的葡萄糖浓度，(B)，(C)耶氏解脂酵母重组菌体和培养基中脂质含量及CLA产量）。因此，在发酵40h，CLA总产量达到最大值4.4g/L，对应的转化率为39%。而且经不同甲酯化方法检测，培养基中的CLA全部为游离脂肪酸。

0h和40h的脂肪酸组成如表2所示，菌体和培养基中的LA在TFA中的比例分别从59.8%下降至14.4%和从56.6%降至22.4%；菌体和培养基中CLA的含量则从0.2%升至44.9%及从0升至30.5%，转化效率很高。Y.lipolytica高效吸收利用脂类物质的特性，使得Y.lipolytica将培养基中的大豆油水解吸收进入细胞，定向增加了PAI的底物LA，显著提高了t10，c12-CLA的产量。

Claims (8)

1.一株耶氏解脂酵母菌CCFM-JUL，该菌株已于2013年1月28日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCNo.7222。

2.一株耶氏解脂酵母菌CCFM-JU277-9，该菌株已于2013年3月06日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏中心的保藏编号为CGMCCNo.7284。

3.根据权利要求1或2所述的菌株，其特征在于所述菌株含有opai/d12共表达基因的重组表达质粒。

4.根据权利要求3所述的的菌株，其特征在于所述重组表达质粒为pJU16-opai-d12。

5.权利要求1或2所述的耶氏解脂酵母菌在生产共轭亚油酸中的用途，其特征在于所述的共轭亚油酸是t10，c12-CLA。

6.利用权利要求1或2所述的耶氏解脂酵母菌生产共轭亚油酸的方法，其特征在于包括发酵培养所述耶氏解脂酵母菌。

7.根据权利要求6所述的生产共轭亚油酸的方法，其特征在于在大豆油培养基中发酵生产，具体发酵培养条件如下：CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5％接种量转接至5LYN₂₀BDS培养基中，28℃发酵，发酵时间为30-45小时。

8.根据权利要求6所述的生产共轭亚油酸的方法，其特征在于具体发酵培养条件如下：CCFM-JU277-9菌株活化后，将种子液按5％接种量转接至5LYN₂₀BDS培养基中，28℃发酵，发酵时间为40小时。