CN106967760A - 一种提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基 - Google Patents

一种提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，该培养基包括种子培养基和发酵培养基；其中所述种子培养基的组分为：葡萄糖50g/L、大豆油1ml/L、酵母浸提物2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L；所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20～80g/L、大豆油1～4ml/L、玉米黄浆100～500ml/L、酵母浸提物2～10g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L。本发明通过优化培养基组分，在发酵培养基中添加一定量的玉米黄浆实现了降低生产成本的目的，同时所述培养基对发酵产物产量的提升也有明显的促进效果，具有工业应用前景。

Description

一种提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基
技术领域
本发明涉及一种用于提高微生物次级代谢产物发酵产量的培养基，具体涉及一种用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，属于微生物发酵技术领域。
背景技术
多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)是指含两个或两个以上不饱和双键结构且碳原子数为16～22的直链脂肪酸。根据第一个不饱和键位置的不同，PUFAs可分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列(即ω编号系统，也叫n编号系统)。其中，ω-3系列PUFAs主要有：α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等；ω-6系列PUFAs主要有：亚油酸(LA)、二高-γ-亚麻酸(DHGLA)、γ-亚麻酸(GLA)和花生四烯酸(AA)等。PUFAs大多数是重要生物活性物质的前体，在机体内具有稳定细胞膜功能、调控基因表达、维持细胞因子和脂蛋白平衡、减肥、抗心血管病、促进生长发育、抗炎、抗癌、增加动物的产仔率和成活率等生理功能，而且双键愈多，不饱和程度愈高，营养价值也愈高。目前，PUFAs在食品、医药、精细化工、饲料等许多行业和领域都得到了广泛的应用，发展极为迅速，已受到越来越多业内人士的关注。
目前，LA、GLA和ALA主要通过植物种子来提取，而AA、EPA和DHA从海洋鱼油中提取，一些哺乳动物也能提取AA。但是PUFAs的植物来源受气候和地域的限制，并且植物资源受农药污染的威胁。而鱼油有特殊气味，在提炼过程中易氧化，工艺复杂，尚不能满足市场需求。并且，由于各国老年人口比例的逐渐增加，心脑血管疾病的肆虐，以及人们日益重视健康的态度，作为药品和保健食品材料的PUFAs的需求量会愈来愈多。因此，除LA以外，目前的PUFAs资源远远不能满足市场需求。
与传统的生产工艺相比，利用微生物发酵生产PUFAs除了具有产量高外，还具有许多其他的优点。例如，微生物细胞增殖快，生产周期短；微生物生长所需的原料丰富，价格便宜，如淀粉、糖类、特别是食品工业和造纸行业的废弃物都可以加以利用，从而保护了环境；用微生物方法比农业生产所需的劳动力少，同时不受季节、气候变化的限制；能连续大规模生产，生产成本低等。这些优点决定了利用微生物生产PUFAs是一条开发新油源的良好途径。产PUFAs的微生物多种多样,包括细菌(嗜酸乳杆菌、混浊红球菌、弧菌等)、酵母(弯假丝酵母、浅白色隐球酵母、胶黏红酵母、斯达氏油脂酵母、产油油脂酵母等)、霉菌(深黄被孢霉、高山被孢霉、卷枝毛霉、米曲霉、土曲霉、雅致枝霉、三孢布拉氏霉)和藻类(盐生杜氏藻、粉核小球藻、等鞭金藻、三角褐指藻、新月菱形藻等)。由于细菌产量低，目前对于PUFAs的生产主要集中在真菌和藻类。
检索发现，现有技术中以深黄被孢霉发酵生产PUFAs的研究多集中在以高浓度葡萄糖为营养碳源进行油脂生产，而通过降低培养基中葡萄糖的比例以低成本生物质资源为营养进行发酵产脂的研究却鲜有报道。
发明内容
针对现有的技术不足，本发明要解决的问题是提供一种用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基。
本发明所述用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，该培养基包括种子培养基和发酵培养基；其中所述的多不饱和脂肪酸是指：棕榈酸(C16:0)，硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1)，亚油酸(C18:2)，α-亚麻酸(C18:3)，γ-亚麻酸(C18:3)，花生酸(C20:0)，花生一烯酸(C20:1)，花生二烯酸(C20:2)和/或花生四烯酸(C20:4)；
其特征在于：
所述种子培养基的组分为：葡萄糖50g/L、大豆油1ml/L、酵母浸提物2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L；
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20～80g/L、大豆油1～4ml/L、玉米黄浆100～500ml/L、酵母浸提物2～10g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L。
上述用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基中：所述发酵培养基的组分优选为：葡萄糖80g/L、大豆油1ml/L、玉米黄浆200ml/L、酵母浸提物4g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L。
上述用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基中：所述培养基采用自来水配制，pH为7.0±0.2，115℃灭菌30min。
本发明公开了一种用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，是通过优化培养基尤其是发酵培养基的组成，降低培养基中葡萄糖的比例，增加低成本生物质资源的比例，提高深黄被孢霉产多不饱和脂肪酸的产量，从而降低生产成本。本发明所采用的玉米黄浆里面含有大量的玉米蛋白和少量的玉米淀粉，其是一种便宜易得的工业原料。本发明通过优化培养基组分，在发酵培养基中添加一定量的玉米黄浆实现了降低生产成本的目的，同时所述培养基对发酵产物产量的提升也有明显的促进效果，具有工业应用前景。
附图说明
图1.深黄被孢霉多不饱和脂肪酸的气相色谱分析图谱。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明提供的发酵方法进行详细描述和说明。所描述的实例仅仅是本发明内容的一部分实例，不是全部实例。其内容是对本发明的解释而非用于限定本发明的保护范围。
实施例1：深黄被孢霉的发酵及产脂分析
(1)菌株活化
将深黄被孢霉(编号3.341，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在PDA试管斜面培养基(马铃薯浸出液200ml/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，用自来水配制，pH自然，115℃灭菌30min)上活化，28℃恒温箱培养5～7天，形成深黄色的分生孢子。
(2)种子液的制备
用无菌铲挖取(1)中活化后的深黄被孢霉，投入到种子培养基(葡萄糖50g/L、大豆油1ml/L、酵母浸提物2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L，用自来水配制，pH为7.0±0.2，115℃灭菌30min)中，在26℃、180r/min条件下培养42h。
(3)摇瓶发酵培养
将培养好的(2)种子液按照体积比为5％的接种量转接到装有100ml新鲜的发酵培养基中进行发酵，转速为180r/min，28℃培养8天。采用4层无菌纱布过滤回收菌丝体。
(4)生物量的测定
将(3)中收集的菌丝体用自来水冲洗干净，于60℃烘干，称重。用g干菌体/L发酵液来计算生物量。
(5)菌体粗脂质的测定
称取干燥后的菌丝体于研钵中，加入适量石英砂研磨至微粒。将滤纸片叠成纸包后移入烘箱中105±2℃干燥2h。取出放入干燥器中冷却至室温。向滤纸包中装入研细的菌丝体并称量其总重量。将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，加入石油醚使样品包完全浸没。连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流在70-80℃恒温水浴中进行抽提，每小时回流7次左右，萃取7h。抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使石油醚挥发。将滤纸包置于105±2℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重为止。再次称量装有样品的滤纸包，减少的重量即为菌体粗脂质的重量。粗脂质重量/菌体重量即为产脂率(％)。
结果显示，在上述条件下发酵结束后深黄被孢霉生物量为16.1g/L，产脂量5.43g/L，产脂率33.7％。
实施例2：深黄被孢霉发酵培养基组成优化
为了选择更适合深黄被孢霉产多不饱和脂肪酸的培养基，对深黄被孢霉发酵培养基中的葡萄糖(A)、大豆油(B)、玉米黄浆(C)和酵母浸提物(D)的用量进行了L9(34)正交实验优化。设定实验因素和水平如表1所示。
表1正交实验因素水平表
深黄被孢霉的发酵及产脂分析方法同实施例1。
正交实验结果如表2所示。
表2正交试验结果
从表2中可以看出，葡萄糖20g/L、大豆油4ml/L、玉米黄浆500ml/L、酵母浸提物10g/L的条件下深黄被孢霉的生物量达到最大值34.04g/L，此时深黄被孢霉的产脂率为17.24％；其次是葡萄糖80g/L、大豆油4ml/L、玉米黄浆200ml/L、酵母浸提物2g/L的条件下深黄被孢霉的生物量达到32.98g/L，产脂率为36.70％。虽然在葡萄糖40g/L、大豆油1ml/L、玉米黄浆200ml/L、酵母浸提物10g/L以及葡萄糖80g/L、大豆油1ml/L、玉米黄浆500ml/L、酵母浸提物4g/L条件下深黄被孢霉的产油率达到最大，分别是52.23％和52.16％，但是此时深黄被孢霉的生物量和产油量也偏低。对生物量和产脂率的极差分析表明，对生物量影响最大的是大豆油，其后依次是玉米黄浆、葡萄糖和酵母浸提物，优选方案是B3C2A3D1；对产脂率影响最大的是大豆油，其后依次是葡萄糖、玉米黄浆和酵母浸提物，优选方案是B1A3C2D2。
对优选的方案B3C2A3D1、B1A3C2D2进行摇瓶发酵后,前一组优化培养基得到的生物量达到32.98g/L，产脂量达到12.10g/L，产脂率为36.70％；后一组优化培养基得到的生物量为32.53g/L,产脂量达到17.29g/L，产脂率为53.16％。
验证结果显示：方案B1A3C2D2优于方案B3C2A3D1，故选定的优化方案为B1A3C2D2，即培养基中葡萄糖、大豆油、玉米黄浆、酵母浸提物的含量分别优选80g/L、1ml/L、200ml/L、4g/L。
实施例3深黄被孢霉发酵液中多不饱和脂肪酸的检测
(1)选用实施例2中优化的培养基作为深黄被孢霉生产多不饱和脂肪酸的发酵培养基。
(2)深黄被孢霉的发酵及菌体中脂质的提取方法同实施例1。
以不接入深黄被孢霉的液体培养基作为对照组，对照组和实验组分别设立3个平行。
(3)深黄被孢霉中多不饱和脂肪酸组分的气相色谱分析
脂肪酸甲酯化：取脂质样品0.05g，置于10mL试管中，加入28g/L氢氧化钾-甲醇溶液溶液1mL，60℃水浴皂化15min，冷却后加入14％的三氟化硼-甲醇溶液1mL，于60℃水浴中振荡2min进行甲酯化，放冷，准确加入正己烷1mL，振荡加入饱和氯化钠1mL，取上清液。
气相色谱条件：脂肪酸甲酯化样品采用GC-2010(Shimadzu Co.,Japan)进行分析，色谱柱为DB-Waxetr(30m×0.32mm，φ0.25μm)。氢火焰离子检测器检测，汽化室和检测器温度分别为250℃和260℃，分流方式进样1μl，分流比10:1，载气为氮气。程序升温：初始温度120℃保持3min，以5℃/min升到190℃，再以1℃/min升到210℃，保持15min。
多不饱和脂肪酸标准品购自上海甄准生物科技有限公司。
比对样品和标准品在气相色谱上出峰的保留时间(见图1)，利用面积归一化计算深黄被孢霉发酵液中不饱和脂肪酸的含量分别为：棕榈酸(C16:0)2.02g/L，硬脂酸(C18:0)1.85g/L，油酸(C18:1)2.16g/L，亚油酸(C18:2)3.02g/L，α-亚麻酸(ALA,C18:3)0.38g/L，γ-亚麻酸(GLA,C18:3)0.31g/L，花生酸(C20:0)0.064g/L，花生一烯酸(C20:1)0.026g/L，花生二烯酸(C20:2)0.019g/L,花生四烯酸(C20:4)2.14g/L。
结果显示，本发明所述培养基对发酵产物产量的提升有明显的促进效果，具有工业应用前景。

Claims (3)

1.一种用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，该培养基包括种子培养基和发酵培养基；其中所述的多不饱和脂肪酸是指：棕榈酸(C16:0)，硬脂酸(C18:0)，油酸(C18:1)，亚油酸(C18:2)，α-亚麻酸(C18:3)，γ-亚麻酸(C18:3)，花生酸(C20:0)，花生一烯酸(C20:1)，花生二烯酸(C20:2)和/或花生四烯酸(C20:4)；
其特征在于：
所述种子培养基的组分为：葡萄糖50g/L、大豆油1ml/L、酵母浸提物2g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L；
所述发酵培养基的组分为：葡萄糖20～80g/L、大豆油1～4ml/L、玉米黄浆100～500ml/L、酵母浸提物2～10g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L。
2.根据权利要求1所述用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，其特征在于：所述发酵培养基的组分为：葡萄糖80g/L、大豆油1ml/L、玉米黄浆200ml/L、酵母浸提物4g/L、硫酸铵2g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钾1g/L、硫酸镁2g/L。
3.根据权利要求1或2所述用于提高深黄被孢霉代谢产物多不饱和脂肪酸产量的培养基，其特征在于：所述培养基采用自来水配制，pH为7.0±0.2，115℃灭菌30min。
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