CN112708570B

CN112708570B - 一种生产共轭亚油酸的方法

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Publication number: CN112708570B
Application number: CN201911025170.4A
Authority: CN
Inventors: 陈卫; 陈海琴; 杨波; 高鹤; 刘云云; 赵建新; 陈永泉; 张灏
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2039-10-25
Also published as: CN112708570A

Abstract

本发明公开了一种生产共轭亚油酸的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明的重组耶氏解脂酵母菌株可以以红花籽油等甘油酯为底物转化生产共轭亚油酸，可高产共轭亚油酸，且其所产得的共轭亚油酸异构体多为cis9,trans11‑CLA；将本发明的重组耶氏解脂酵母菌株加入含红花籽油的培养基中培养36h，即可使发酵液中共轭亚油酸的产量高达751.7mg/L，其中，cis9,trans11‑CLA的产量高达224.0mg/L，约占总共轭亚油酸产量的29.8％。

Description

一种生产共轭亚油酸的方法

技术领域

本发明涉及一种生产共轭亚油酸的方法，属于基因工程以及微生物工程技术领域。

背景技术

共轭亚油酸(conjugated linoleic acids，CLA)是一系列碳原子数为18，含有共轭双键 (-C＝C C＝C-)的必需脂肪酸亚油酸的多种几何与位置异构体混合物的总称。CLA的双键在碳链上有多种位置排列方式，共轭双键起始于羧基端的第8、9、10、11位碳原子，其主要位置异构有4种：8，10-、9，11-、10，12-和11，13-，由于共轭双键两端的碳原子都具有顺式 (cis)和反式(trans)两种几何构型，每种位置异构又具有4种几何异构体，故CLA的种类十分丰富，一般认为CLA总共有16种同分异构体。

在人体和动物中，以cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA形式最为普遍存在，其中， cis9,trans11-CLA是唯一能被动物细胞吸收进入其磷脂层的异构体，也是与人类和动物营养最为相关、最具有生物活性的CLA，被命名为瘤胃酸，另外，trans10,cis12-CLA异构体在改善人体的身体组成等方面也具有显著作用，同cis9,trans11-CLA共同发挥着不同的生理作用。

CLA是人和动物不可缺少的脂肪酸之一，却是自身无法合成的一种具有显著药理作用和营养价值的物质，对人体健康有很大益处。大量文献证明，CLA具有抗肿瘤，抗氧化，抗突变，抗菌，降低人体胆固醇，抗动脉粥样硬化，提高免疫力，提高骨骼密度，防治糖尿病及促进生长等多种重要生理功能。近年来又有一些临床研究报告证明，CLA进入机体后能够增加体能消耗，因此在体重控制方面可以有效降低体内脂肪沉积。对CLA安全性毒理学试验研究表明，它是一种既无毒又无任何副作用的物质，被誉为“21世纪绿色营养保健食品”。目前， CLA已成为食品、药品、化妆品等行业的研究热点。

CLA在自然界中含量较少，主要存在于反刍动物牛、羊等的肉和奶及其制品中，非反刍动物及其它食品中含量较少。为了充分发挥CLA的特异性功能，人工合成法是获得大量CLA 的有效途径。

目前，关于CLA的合成方法很多，主要有生物合成和化学合成两种方法。其中，化学合成法会导致很多有毒性的副产物的产生，对环境以及人体均具有毒害作用，并且，通过化学合成法制备得到的共轭亚油酸异构体种类多，很难进行有效的分离，因此，化学合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产。

生物合成法是采用特定的酶或微生物催化相应的底物得到CLA，其具有污染少，合成的异构体种类较为单一的优势，但是，该方法也存在明显的缺陷，缺陷如下：

第一，生产CLA的菌种多为严格厌氧菌，在工业或实验室中不易培养且产量较低，难以广泛应用到食品和药品中，例如，溶纤维丁酸弧菌以及双歧杆菌等；

第二，生产CLA的菌种多为致病菌，存在极大的安全性问题，不能直接作为共轭亚油酸生产菌株进行工业化生产，例如，溶纤维丁酸弧菌、丙酸杆菌以及产芽孢梭状芽孢杆菌等；

第三，部分生产CLA的菌种多严格依赖亚油酸作为底物，过量游离的亚油酸和副产物的生成会抑制CLA菌的生长，从而影响其转化率，导致CLA的生产效率过低，例如，植物乳杆菌ZS2058(具体可见参考文献：齐慧,杨波等.植物乳杆菌ZS2058生物转化共轭亚油酸机理的研究[D],江南大学,2017)。

上述缺陷使得现有的微生物合成法无法真正实现共轭亚油酸的大规模工业化生产，因此，急需找到一种非严格厌氧、安全性高、不严格依赖亚油酸且产量高的共轭亚油酸生产菌株以克服上述缺陷以克服上述缺陷。

发明内容

[技术问题]

本发明要解决的技术问题是提供一种严格好氧、安全性高、可以甘油酯为底物且产量高的重组耶氏解脂酵母菌株。

[技术方案]

为解决上述问题，一种重组耶氏解脂酵母菌株，所述重组耶氏解脂酵母菌株以耶氏解脂酵母为表达宿主，以编码亚油酸异构酶的基因为目的基因；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸异构酶来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)。

在本发明的一种实施方式中，所述亚油酸异构酶来源于短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828。

在本发明的一种实施方式中，所述目的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

在本发明的一种实施方式中，所述重组耶氏解脂酵母菌株以pINA 1312sp质粒为表达载体。

本发明还提供了上述重组耶氏解脂酵母菌株在生产共轭亚油酸方面的应用。

本发明还提供了一种生产共轭亚油酸的方法，所述方法为先将上述重组耶氏解脂酵母菌株接种至含有亚油酸和/或甘油酯的培养基中，于温度为35～40℃、转速为150～250rpm的条件下进行培养，得到富含共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株，然后将富含共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株进行提取，得到共轭亚油酸。

在本发明的一种实施方式中，所述甘油酯为红花籽油、亚麻仁油、棉籽油、和/或大豆油。

在本发明的一种实施方式中，所述甘油酯为红花籽油。

在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA 和/或trans9,trans11-CLA

在本发明的一种实施方式中，所述共轭亚油酸为cis9,trans11-CLA。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为YPD培养基。

本发明还提供了上述重组耶氏解脂酵母菌株在生产亚油酸异构酶方面的应用，所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了一种生产亚油酸异构酶的方法，所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；所述方法为先将上述重组耶氏解脂酵母菌株接种至培养基中，于温度为 35～40℃、转速为150～250rpm的条件下培养，得到富含亚油酸异构酶的重组耶氏解脂酵母菌株，然后将富含亚油酸异构酶的重组耶氏解脂酵母菌株进行提取，得到亚油酸异构酶。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为YPD培养基。

[有益效果]

(1)本发明的重组耶氏解脂酵母菌株可以以红花籽油等甘油酯为底物转化生产共轭亚油酸，可高产共轭亚油酸，且其所产得的共轭亚油酸异构体多为cis9,trans11-CLA；将本发明的重组耶氏解脂酵母菌株加入含游离亚油酸的培养基中培养36h，即可使发酵液中共轭亚油酸的产量高达5.8mg/L，其中，cis9,trans11-CLA的产量高达1.5mg/L，约占总共轭亚油酸产量的25％；将本发明的重组耶氏解脂酵母菌株加入含红花籽油的培养基中培养36h，即可使发酵液中共轭亚油酸的产量高达751.7mg/L，其中，cis9,trans11-CLA的产量高达224.0 mg/L，约占总共轭亚油酸产量的29.8％。

(2)耶氏解脂酵母属于广泛认为是安全的(generally regarded as safe,GRAS)微生物，并且，耶氏解脂酵母已被欧盟认定为可用于食品中的安全菌株，因此，本发明重组耶氏解脂酵母菌株所产得的共轭亚油酸相对而言更为安全。

(3)耶氏解脂酵母属于严格好氧菌，相较严格厌氧菌更易实现工业化培养，并且，以耶氏解脂酵母作为生产菌株的工业化生产工艺已十分成熟，因此，本发明的重组耶氏解脂酵母菌株更适用于大规模工业化生产。

(4)红花籽油等甘油酯的来源广泛、价格低廉，本发明的重组耶氏解脂酵母菌株可以以红花籽油等甘油酯为底物转化生产共轭亚油酸，产量较高，且其所产得的共轭亚油酸异构体多为cis9,trans11-CLA，因此，本发明的重组耶氏解脂酵母菌株成本更低，更适用于大规模工业化生产。

附图说明

图1：未经密码子优化的bbi序列以及经密码子优化的bbi序列的CAI图谱。

图2：重组质粒pINA 1312sp-obbi的质粒图谱。

图3：重组质粒pINA 1312sp-obbi的PCR验证结果。

图4：重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi的PCR验证结果。

图5：重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以游离脂肪酸为底物生产cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量。

图6：重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以游离脂肪酸为底物生产得到的cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的含量占生产得到的总共轭脂肪酸含量的比例。

图7：重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以红花籽油为底物生产cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量。

图8：重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以红花籽油为底物生产得到的cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量占生产得到的总共轭脂肪酸产量的比例。

图9：重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi在不同底物下生产得到共轭亚油酸的GC-MS鉴定图谱；其中，(a)表示重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以游离脂肪酸为底物生产得到共轭亚油酸的GC-MS鉴定图谱，(b) 表示重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以红花籽油为底物生产得到共轭亚油酸的GC-MS鉴定图谱，(c)表示样品中脂肪酸的组成色谱图(此处样品为购自Sigma 公司的共轭亚油酸标准品)，数字1、2、3分别表示cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA 以及trans9,trans11-CLA。

图10：红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA1312sp-obbi生产 cis9,trans11-CLA的产量的影响。

图11：红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA1312sp-obbi发酵 84h时生产得到的cis9,trans11-CLA的产量的影响。

图12：红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA1312sp-obbi发酵84h时生产得到的cis9,trans11-CLA的产量的占生产得到的总共轭脂肪酸产量的比例。

图13：红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA1312sp-obbi生产 cis9,trans11-CLA的产量以及转化率的影响。

具体实施方式

下述实施例中涉及的游离亚油酸购自Sigma公司；下述实施例中涉及的红花籽油购自中粮(昌吉)粮油工业有限公司；下述实施例中涉及的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购自通用生物有限公司；下述实施例中涉及的耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)购自北纳生物，产品编号为：BNCC193899；下述实施例中涉及的pINA 1312质粒购自BioVector质粒载体菌种细胞基因保藏中心；下述实施例中涉及的细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技 (北京)有限公司，型号为DP302；下述实施例中涉及的pINA 1312sp质粒的构建方法记载于文献“Zhang B，Chen H，Li M，Gu Z，Song Y，Ratledge C，Chen YQ，Zhang H，Chen W(2013)Genetic engineering of Yarrowia lipolytica for enhancedproduction of trans-10， cis-12conjugated linoleic acid.Microb Cell Fact.12：70”中。

下述实施例中涉及的培养基如下：

MRS固体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K₂HPO₄·3H₂O 2.6g/L、MgSO₄·7H₂O 0.1g/L、MnSO₄·H₂O 0.05g/L、吐温801mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L，使用前添加100μg/mL 的卡那霉素。

LB固体培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L，使用前添加100μg/mL的卡那霉素。

YNBD固体培养基：酵母含氮碱基(不含氨基酸)6.7g/L、葡萄糖20g/L、琼脂15g/L，pH为5.5。

YNBD液体培养基：酵母含氮碱基(不含氨基酸)6.7g/L、葡萄糖20g/L，pH为5.5。

YPD培养基：蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L、葡萄糖20g/L，pH为6.5。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

亚油酸异构酶比酶活的检测方法：收集菌体，将菌体加入KPB缓冲液(pH 6.5)中，并将菌体用玻璃珠破碎，得到细胞破碎液；将细胞破碎液于8000g离心10min收集上清，得到粗酶液；调整粗酶液中蛋白含量为0.5mg/mL，并将调整后的粗酶液分装至6个反应玻璃瓶中，每个玻璃瓶1mL；分别在玻璃瓶中加入终浓度为0.1mg/mL亚油酸，于37℃反应60min，得到反应液；反应结束后，迅速在反应液中加入异丙醇以及正己烷，对脂肪酸进行萃取，测定脂肪酸的含量变化(脂肪酸含量变化的检测方法参考下述共轭亚油酸产量、各共轭亚油酸异构体产量、共轭亚油酸转化率、各共轭亚油酸异构体转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及各共轭亚油酸异构体占比的检测方法)，从而计算比酶活；比酶活(U/mg)＝W/(T×M)，其中，W为反应生成的共轭亚油酸的质量(μg)，T为反应时间(min)，M为待测样品质量(mg)

其中，亚油酸异构酶比酶活的定义为：于37℃、pH 6.5的条件下，1min内转化生成1mg 共轭亚油酸所需的酶量，单位为U/mg。

共轭亚油酸产量、各共轭亚油酸异构体产量、共轭亚油酸转化率、各共轭亚油酸异构体转化率、共轭亚油酸中共轭亚油酸异构体类型以及各共轭亚油酸异构体占比的检测方法：采用盐酸-甲醇法甲酯化重组耶氏解脂酵母菌体中的脂肪酸：称取20～25mg冻干菌粉，置于5mL 玻璃瓶中，加入100μL C17:0脂肪酸内标(2.000g/L)、1mL 10％的盐酸-甲醇，60℃水浴 3h(每隔30min振荡1min)；冷却至室温后加入1mL正己烷和1mL饱和NaCl振荡混匀，3000×g离心3min，吸取上层溶液；再向原体系中加入1mL正己烷振荡混匀，3000g离心3min，吸取并合并上层溶液，氮气吹干后，加入1mL正己烷混匀，转入气相瓶，进行气相色谱分析；其中，脂肪酸分析方法参考文献“杨波，陈海琴，宋元达，等.动物双歧杆菌肌球交叉反应抗原MCRA酶学功能的研究[J].中国生物工程杂志，2012，32(12):30-36.”；

其中，共轭亚油酸产量＝(共轭亚油酸峰面积/内标峰面积)×0.1mL×2.0mg/mL；

各共轭亚油酸异构体产量＝(各共轭亚油酸异构体的峰面积/内标峰面积)×0.1mL×2.0 mg/mL；

共轭亚油酸转化率＝(共轭亚油酸的质量/对照组中亚油酸的质量)×100％；

各共轭亚油酸异构体转化率＝(各共轭亚油酸异构体的质量/对照组中亚油酸的质量) ×100％。

实施例1：编码亚油酸异构酶的基因的筛选

具体步骤如下：

通过PacBio测序平台采集短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828(记载于公开号为CN105925514A的专利申请文本中)在亚油酸胁迫下的转录组学数据，采样时间点分别为3h，8h，15h。经过生信分析发现，短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCCNo.11828中三个时间点处基因转录水平均增大的基因共8个，根据转化水平变化大小将这8个基因分别注释为编码“未知蛋白1”、“蜜二糖载体蛋白”、“核糖激酶”、亚油酸水合酶、“未知蛋白2”、“转录调控蛋白”、“核糖结合ABC通道蛋白1”以及“核糖结合ABC通道蛋白2”的基因，其中，编码“未知蛋白1”的基因在8h时的转录水平较3 h上升68倍，15h和8h时的转录水平较3h上调了3.5倍和8.2.倍，并且，其未与其他基因形成基因簇，因此，推测该基因参与CLA转化的可能性比较大(“未知蛋白1”的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示、编码“未知蛋白1”的基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示)。

实施例2：编码亚油酸异构酶的基因的克隆

具体步骤如下：

从保菌管中挑取短双岐杆菌(Bifidobacterium breve)CGMCC No.11828的菌液划线于MRS 固体培养基上，于37℃恒温厌氧工作站中培养48h，获得单菌落；挑取单菌落接种于MRS 液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中继续静置培养24h，连续活化3代，获得活化好的菌液；将活化好的菌液按1％(v/v)的接种量接种至MRS液体培养基中，于37℃恒温厌氧工作站中培养24h，获得菌悬液；将获得的菌悬液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取湿菌体中的基因组DNA，并通过PCR反应扩增bbi；PCR反应结束，得到扩增产物，对扩增产物进行纯化后通过1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物条带大小，获得bbi(此bbi基因即为编码“未知蛋白1”的基因)；其中，扩增bbi所用引物见表1；

PCR反应体系包含：KOD 1μL、ddH2O 29μL、上下游引物各1μL、基因组DNA 1μL、dNTP 5μL、10×reactionbuffer 5μL以及Mg²⁺3μL；

PCR反应条件为：95℃，5min；(95℃，30s；55℃，30s；68℃，1min)循环30次； 68℃，5min；12℃，5min。

表1引物序列

实施例3：编码亚油酸异构酶的基因的优化

具体步骤如下：

根据耶氏解脂酵母的密码子偏好性，利用Genscript OptimumGene TM软件对bbi基因进行优化，优化后密码子适应指数从0.80提高至0.96，优化后的基因命名为obbi基因。

obbi基因由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并克隆至载体pUC57上，得到重组质粒pUC57-obbi；其中，bbi基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，obbi基因的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示、bbi基因和obbi基因的CAI图谱如图1所示。

实施例4：重组耶氏解脂酵母菌株的构建

具体步骤如下：

使用限制性内切酶BamHI和KpnI对pINA 1312sp质粒以及实施例2获得的重组质粒pUC57-obbi进行酶切，然后利用T₄连接酶将经酶切、纯化后的DNA进行连接，获得连接产物；将获得的连接产物于16℃下过夜连接15h后，转化至大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞中；将转化后的大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞涂布LB固体培养基(含有10μg/mL的卡那霉素)，37℃倒置培养12～16h；挑取阳性转化子，提取质粒，测序验证结果表明连接成功，获得重组质粒pINA 1312sp-obbi，重组质粒pINA 1312sp-obbi的质粒图谱见图2，验证结果见图3。

将获得的重组质粒pINA 1312sp-obbi导入耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)中；将转化后的耶氏解脂酵母划线于YNBD固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养2～3d；挑取阳性转化子接种于YNBD液体培养基中，28℃、200rpm/min培养2d，收集菌体，提取基因组，用验证引物P1/P2(P1的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示：ATACAAGAGCGTTTGCCAGC/P2 的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示：CCTTGGTCCAGGGGTTGA)对转化子的基因组进行PCR 验证，验证正确，获得重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi(共获得20个验证正确的转化子)，验证结果见图4。

将重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi划线于YNBD固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养2～3d；挑取接种于YNBD液体培养基中，28℃、200rpm/min 培养2d；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至5mL的YPD培养基中，28℃、200rpm/min 培养36h，获得发酵液；将发酵液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体进行破碎后于25℃、12000g的条件下离心10min，获得细胞破碎上清液；检测获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶比酶活，检测结果如下：

重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi发酵获得的细胞破碎上清液中的亚油酸异构酶比酶活为2.31U/mg。可见，重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi可成功表达亚油酸异构酶。

实施例5：共轭亚油酸的制备

1、以亚油酸为底物

以含有空质粒的重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp作为对照，将重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi划线于YNBD固体培养基上，于 28℃恒温培养箱中培养2～3d；挑取单菌落接种于YNBD液体培养基中，28℃、200rpm/min 培养2d；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至5mL的YPD培养基中，28℃、200rpm/min 培养36h后，在培养基中添加终浓度为0.5g/L的游离亚油酸，继续于28℃、200rpm/min培养36h，获得发酵液；将发酵液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体用0.85％NaCl洗涤两遍后检测细胞中cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9, trans11-CLA的产量以及cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的含量占生产得到的总共轭脂肪酸含量的比例，检测结果见图5-6、9。

由图5-6、9可知，重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以游离脂肪酸为底物生产cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量分别为1.5mg/L、0.5mg/L、3.8mg/L，其中，cis9,trans11-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的25％、 trans10,cis12-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的9％、trans9,trans11-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的66％。

2、以红花籽油为底物

以含有空质粒的重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp作为对照，将重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi划线于YNBD固体培养基上，于 28℃恒温培养箱中培养2～3d；挑取单菌落接种于YNBD液体培养基中，28℃、200rpm/min 培养2d；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至5mL的YPD培养基中，28℃、200rpm/min 培养36h后，在培养基中添加终浓度为20g/L的红花籽油，继续于28℃、200rpm/min培养 36h，获得发酵液；将发酵液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体用0.85％ NaCl洗涤两遍后检测细胞中cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9, trans11-CLA的产量以及cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的含量占生产得到的总共轭脂肪酸含量的比例，检测结果见图7-9。

由图7-9可知，重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以红花籽油为底物生产cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量分别为 146.8mg/L、50.9mg/L、310.7mg/L，其中，cis9,trans11-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的 30％、trans10,cis12-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的10％、trans9,trans11-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的60％。

3、扩大培养

将重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi划线于YNBD固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养2～3d；挑取单菌落接种于YNBD液体培养基中，28℃、200 rpm/min培养2d；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至50mL的YPD培养基中，28℃、200rpm/min培养36h后，在培养基中添加终浓度为20g/L的红花籽油，继续于28℃、200 rpm/min培养36h，获得发酵液；将发酵液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体用0.85％NaCl洗涤两遍后检测细胞中cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量以及cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的含量占生产得到的总共轭脂肪酸含量的比例，检测结果如下：

重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi以红花籽油为底物生产cis9, trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量分别为224.0mg/L、73.7 mg/L、454.0mg/L，其中，cis9,trans11-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的29.8％、trans10, cis12-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的9.8％、trans9,trans11-CLA的含量占总共轭脂肪酸含量的60.4％。

4、红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi生产cis9, trans11-CLA的产量以及转化率的影响

将重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi划线于YNBD固体培养基上，于28℃恒温培养箱中培养2～3d；挑取单菌落接种于YNBD液体培养基中，28℃、200 rpm/min培养2d；将种子液以1％(v/v)的接种量接种至50mL的YPD培养基中，28℃、200rpm/min培养36h后，在培养基中分别添加终浓度为10g/L、20g/L、30g/L、50g/L、70g/L的红花籽油，继续于28℃、200rpm/min培养，每隔12h取50mL发酵液；将发酵液于25℃、12000g的条件下离心10min，获得湿菌体；将湿菌体用0.85％NaCl洗涤两遍后检测细胞中cis9,trans11-CLA、trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的产量以及cis9,trans11-CLA、 trans10,cis12-CLA以及trans9,trans11-CLA的含量占生产得到的总共轭脂肪酸含量的比例，其中，红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi生产cis9, trans11-CLA的产量的影响结果见图10，红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowia lipolytica/pINA 1312sp-obbi发酵84h时生产得到的cis9,trans11-CLA的产量的影响见图11，红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowialipolytica/pINA 1312sp-obbi发酵84h时生产得到的cis9,trans11-CLA的产量的占生产得到的总共轭脂肪酸产量的比例见图12，红花籽油浓度对重组耶氏解脂酵母菌株Yarrowialipolytica/pINA 1312sp-obbi生产cis9,trans11-CLA的产量以及转化率的影响见图13。

由图10-13可知，发酵时间为84h，红花籽油的添加浓度为50g/L时，cis9,trans11-CLA 的含量最高，达到了350mg/L；此时cis9,trans11-CLA的占总CLA的比例达到了27.5％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110> 江南大学

<120> 一种生产共轭亚油酸的方法

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 1

Met Leu Phe Gln Val Tyr Gly Asp Asn Ala Ile Tyr Gln Trp Ile Gly

1 5 10 15

Trp Ile Leu Val Phe Cys Cys Leu Ile Gly Ala Asn Glu Leu Ala Arg

20 25 30

Arg Thr Lys Thr Gly Gly Ile Val Ala Phe Leu Val Val Pro Ala Val

35 40 45

Leu Thr Val Tyr Phe Ile Thr Ile Tyr Thr Ala Ala Ala Met Gly Ala

50 55 60

Asp Trp Ala Leu Asn Asn Pro Thr Tyr Val His Met Thr Ser Trp Phe

65 70 75 80

His Tyr Ala Lys Leu Tyr Ala Ala Thr Ile Gly Cys Ile Gly Phe Met

85 90 95

Ala Leu Lys Tyr Lys Trp Gly Ser Ile Gly Lys Ser His Trp Phe Lys

100 105 110

Cys Phe Pro Phe Val Ile Val Ala Ile Asn Ile Leu Ile Ala Val Val

115 120 125

Ser Asp Phe Glu Ser Ala Ile Arg Gly Trp Gly Thr Thr Trp Ile Ser

130 135 140

Thr Glu Gly Val Thr Leu Tyr Gly Gly Trp His Asn Val Phe Asn Gly

145 150 155 160

Leu Ala Gly Ile Leu Asn Ile Phe Cys Met Thr Gly Trp Phe Gly Ile

165 170 175

Tyr Ala Ser Lys Lys Lys Asp Asp Met Leu Trp Pro Asp Met Thr Trp

180 185 190

Val Phe Ile Val Ala Tyr Asp Leu Trp Asn Phe Cys Tyr Thr Tyr Asn

195 200 205

Cys Leu Pro Thr His Ser Trp Tyr Cys Gly Leu Ala Leu Leu Leu Ala

210 215 220

Pro Thr Val Ala Asn Phe Phe Trp Asn Lys Gly Gly Trp Ile Gln Asn

225 230 235 240

Arg Ala Asn Thr Leu Ala Ile Trp Cys Met Phe Ala Gln Val Phe Pro

245 250 255

Met Phe Gln Asp Tyr Ser Val Phe Ser Thr Gln Ser Val Asn Asn Pro

260 265 270

Asn Val Asn Leu Ala Val Ser Leu Ile Ala Leu Val Ala Asn Val Leu

275 280 285

Ala Leu Gly Tyr Ile Leu Leu Arg Ala Lys Lys Gln Gly Ile Asn Pro

290 295 300

Trp Thr Lys Glu Val Phe Lys Gly Thr Lys Asp Tyr Glu Gln Ala Ile

305 310 315 320

Ala Arg Ala Asp Ala Ser Glu Leu Val Ala

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）

<400> 2

atgctgtttc aggtctacgg cgacaacgcc atctaccaat ggattggctg gatactcgtc 60

ttctgctgcc ttatcggcgc caatgaactg gctcgtcgca ccaaaaccgg cggcatcgtc 120

gccttcctcg tcgtcccggc tgtgctgacc gtctacttca tcaccatcta caccgccgcc 180

gcaatgggcg ccgactgggc actcaacaac ccgacctacg tgcacatgac cagctggttc 240

cactacgcca agctctacgc ggccaccatc ggctgcatcg gctttatggc cctcaaatac 300

aagtggggct ctatcggcaa atcccactgg ttcaagtgct tcccgttcgt gatcgtggcc 360

atcaacatcc tcatcgccgt ggtctctgac ttcgaatccg ccatccgcgg ctggggcacc 420

acctggatct ccactgaagg cgtgaccctc tacggtggct ggcacaacgt gttcaacggc 480

ttggccggca tcctcaatat cttctgcatg accggctggt tcggcatcta cgcctccaag 540

aagaaggacg acatgctctg gccggacatg acctgggtgt tcatcgtggc ctacgatctg 600

tggaacttct gctacaccta caattgcctg cccacccact cctggtactg cggccttgca 660

ctgctgctgg cgcccaccgt ggccaacttc ttctggaaca agggcggctg gatccagaat 720

cgcgccaata cattggccat ctggtgcatg ttcgcgcagg tattcccgat gttccaggac 780

tactccgtgt tctccaccca gtccgtgaac aacccgaacg tgaaccttgc ggtgtcccta 840

atcgcgctag tggccaacgt gttggcactc ggctacatcc tgctgcgcgc caagaagcag 900

ggcatcaacc cgtggaccaa ggaagtcttc aagggcacca aagactacga gcaggccatc 960

gctcgcgccg atgcatcgga gttggtggcg tag 993

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagcctatgc tgtttcaggt ctacggcga 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

catatgctac gccaccaact ccgat 25

<210> 5

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatccatgc tgttccaggt gtacggagac aacgccatct accagtggat tggttggatt 60

ctggtcttct gttgcctgat cggtgctaac gagctggctc gacgaaccaa gaccggcgga 120

attgtggcct tcctggtggt ccccgctgtg ctgaccgtct acttcatcac catctacacc 180

gctgctgcta tgggagctga ctgggctctg aacaacccca cctacgtgca catgacctct 240

tggttccact acgccaagct gtacgctgcc accattggtt gtatcggctt catggctctg 300

aagtacaagt ggggctctat tggcaagtct cactggttca agtgcttccc cttcgtgatc 360

gtcgccatca acattctgat cgctgtggtc tccgacttcg agtctgccat tcgaggctgg 420

ggaaccacct ggatctccac cgagggagtg accctgtacg gtggctggca caacgtcttc 480

aacggcctgg ccggaattct gaacatcttc tgtatgaccg gttggttcgg catctacgct 540

tctaagaaga aggacgacat gctgtggccc gacatgacct gggtgttcat tgtcgcctac 600

gacctgtgga acttctgtta cacctacaac tgcctgccca cccactcctg gtactgtggt 660

ctggctctgc tgctggctcc taccgtggct aacttcttct ggaacaaggg aggttggatt 720

cagaaccgag ccaacaccct ggctatctgg tgcatgttcg cccaggtctt ccccatgttc 780

caggactact ctgtgttctc cacccagtct gtcaacaacc ccaacgtgaa cctggctgtc 840

tctctgattg ctctggtggc taacgtcctg gctctgggct acattctgct gcgagctaag 900

aagcagggaa tcaacccctg gaccaaggaa gtgttcaagg gcaccaagga ctacgagcag 960

gctattgctc gagctgacgc ttctgagctg gtggcttagg gtacc 1005

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atacaagagc gtttgccagc 20

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccttggtcca ggggttga 18

Claims

1.一种重组耶氏解脂酵母菌株在生产共轭亚油酸方面的应用；所述重组耶氏解脂酵母菌株以耶氏解脂酵母为表达宿主，以编码亚油酸异构酶的基因为目的基因；所述亚油酸异构酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述方法为先将权利要求1所述的重组耶氏解脂酵母菌株接种至含有亚油酸和/或甘油酯的培养基中，于温度为28℃、转速为150~250rpm的条件下进行培养，得到富含共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株，然后将富含共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株进行提取，得到共轭亚油酸；所述甘油酯为红花籽油。

3.如权利要求2所述的一种生产共轭亚油酸的方法，其特征在于，所述共轭亚油酸为cis9, trans11-CLA、trans10, cis12-CLA和/或trans9, trans11-CLA。