CN102586297A - 一种生产共轭亚油酸的重组酵母菌株及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生产共轭亚油酸的重组酵母菌株及其用途。本发明对来自痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)中的亚油酸异构酶(PAI)基因进行密码子优化得到优化基因opai，制备了含有opai基因的重组表达质粒和重组耶氏解脂酵母菌，并利用表达opai基因的重组耶氏解脂酵母菌生产共轭亚油酸。

Description

一种生产共轭亚油酸的重组酵母菌株及其用途

技术领域

本发明涉及共轭亚油酸的微生物制造，具体是提供了一种生产共轭亚油酸的重组酵母菌株、所述菌株的制备方法以及所述菌株在生产共轭亚油酸中的用途。

背景技术

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid，CLA)是具有共轭双键的十八碳二烯酸混合物的统称。在过去的三十年中，CLA由于其多样的生理活性功能而受到广泛的关注，CLA具有的主要生理功能包括抗癌、抗动脉粥样硬化、抑制脂肪积累、促进生长、刺激免疫等。其中c9，t11-CLA、t10，c12-CLA和t9，t11CLA是迄今为止确认具有生理活性的三种共轭亚油酸单体。不同的单体其生理活性及信号传导机制均不同。在自然界中，CLA存在于来源于反刍动物的肉制品和乳制品中，但是含量极低。目前，CLA的合成广泛采用化学异构法，即将红花油或葵花籽油通过碱催化异构法。但是通过此种方法获得的产物是多种异构体的混合物，其中包含许多生理功能及安全性未知的异构体，活性异构体难以分离纯化。为了满足CLA在医药及营养领域的应用要求，获得单一、安全的CLA单体变得非常重要，而通过生物技术生产CLA成为国内外研究人员公认的可行方案。亚油酸异构酶(PAI)可以催化亚油酸生成共轭亚油酸。早在1965年，Tove和他的同事就发现了在溶纤维丁酸弧菌中具有亚油酸异构酶的活性，可以催化LA转化为cis-9，trans-11CLA。四十年过去了，人们只发现了三种亚油酸异构酶，它们分别来源于罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、生孢梭菌(Clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)。前两种亚油酸异构酶的产物是cis-9，trans-11CLA，而最后一种亚油酸异构酶的产物则是t10，c12CLA。来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶是唯一一种已知晶体结构的亚油酸异构酶，并先后在大肠杆菌、酿酒酵母、烟草种子、大米及乳酸菌中成功进行了重组表达。

虽然已有国外研究人员在烟草种子和大米中表达亚油酸异构酶基因PAI，但共轭亚油酸的产量却非常低，这主要是由于这两种植物的油脂含量很低，而且与脂肪酸脱氢酶及延长酶不同，PAI底物的唯一形式是游离的脂肪酸，亚油酸的磷脂、甲酯、Co-A或甘三酯的的形式均不能作为PAI的底物。在大多数真核生物中游离脂肪酸的含量是非常低的，这也是生物转化法生产CLA的最主要限制性因素。相比之下，产油微生物耶氏解脂酵母不仅可以积累脂质达25％以上，而且可以罕见地在细胞内积累大量的游离脂肪酸。因此，耶氏解脂酵母是亚油酸异构酶最为合适的表达宿主。而通过耶氏解脂酵母生产安全、专一性高、具有生理活性的共轭亚油酸产品，对于共轭亚油酸在制药和营养领域的应用具有重要的推动意义。综上所述，构建一株可以生成t10，c12CLA的耶氏解脂酵母菌株具有很大的研究和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够利用内源性亚油酸专一性生产t10，c12-CLA的耶氏解脂酵母菌株。

本发明的内容包括：PAI基因经过密码子优化获得的基因OPAI、携带基因PAI或OPAI的表达质粒、含有基因PAI或OPAI的能够生产共轭亚油酸的重组耶氏解脂酵母菌株、所述重组耶氏解脂酵母菌的制备方法和所述重组耶氏解脂酵母菌在生产共轭亚油酸中的用途等。

本发明优选为：根据耶氏解脂酵母基因组数据，分析耶氏解脂酵母的密码子偏好性、GC含量等参数，将来源于痤疮丙酸杆菌的亚油酸异构酶基因(pai)(genebank：AX062088)进行密码子优化，得到新的酶基因序列opai，优化后的opai基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；将天然基因pai和优化后的亚油酸异构酶基因opai分别插入单拷贝整合质粒pINA1312，并将opai插入多拷贝整合质粒pINA1292中，获得三种重组质粒pINA1312-pai、pINA1312-opai和pINA1292-opai(质粒pINA1312和pINA1292参见Nicaud，J.-M.，Madzak，C.，Van den Broek，P.，Gysler，C.，Duboc，P.，Niederberger，P.，et al.(2002).Protein expression andsecretion in the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS Yeast Research，2，371.279)。将构建后的重组质粒分别用Not I酶切，得到三种表达单元转化进耶氏酵母菌株Polh(耶氏酵母菌Polh参见Madzak，C.，Gaillardin，C.，&Beckerich，J.-M.(2004).Heterologous protein expression and secretion inthe non-conventional yeast Yarrowia lipolytica.Journal of Biotechnology，109，63-81)，经同源重组后，筛选得到三种重组菌株Polh-1312-pai、Polh-1312-opai和Polh-1292-opai；经western blot分析检测重组菌株的重组蛋白表达情况显示，三种重组菌株Polh-1312-pai、Polh-1312-opai和Polh-1292-opai均成功表达了重组蛋白PAI，且蛋白表达量呈递增趋势；经气相色谱和气质联用检测，三种重组菌株Polh-1312-pai、Polh-1312-opai和Polh-1292-opai的脂肪酸中均检测到t10，c12-CLA，且与蛋白表达量呈正相关，Polh-1312-pai的CLA产量最高为总脂肪酸的0.2％，Polh-1312-opai的CLA产量为1.2％，而Polh-1292-opai菌株的CLA产量可达总脂肪酸的5.9％。

附图说明

图1：亚油酸异构酶基因密码子优化前后的密码子适应指数：经过密码子优化后，密码子适应指数从0.76提高到0.91。

图2：在耶氏解脂酵母中表达亚油酸异构酶的质粒pINA1312-pai、pINA1312-opai和pINA1292-opai的结构示意图。

图3：Polh-pINA1312-pai转化子PCR验证电泳图：挑出的转化子全部扩增出了大小为570bp的特异条带，说明均为阳性转化子。

图4：Polh-pINA1312-opai转化子PCR验证电泳图：挑出的转化子全部扩增出了大小为630bp的特异条带，说明均为阳性转化子。

图5：Polh-pINA1292-opai转化子PCR验证电泳图：挑出的转化子全部扩增出了大小为630bp的特异条带，说明均为阳性转化子。

图6：SDS-PAGE检测pai蛋白纯化效果图：利用Ni-NTA纯化BL21(DE3)/pET28a-pai过表达的重组蛋白pai

图7：Polh-pINA1312-pai系列转化子的westernblot检测图，并标注了CLA在

总脂肪酸中的比例(w/w％)。

图8：Polh-pINA1312-opai系列转化子的westernblot检测图，并标注了CLA在总脂肪酸中的比例(w/w％)。

图9：Polh-pINA1292-opai系列转化子的westernblot检测图，并标注了CLA在总脂肪酸中的比例(w/w％)。

图10：重组耶氏解脂酵母气相色谱图

图11：重组耶氏解脂酵母Polh-pINA1312-opai的气质检测图，A为Polh-pINA1312-opai脂肪酸的气相色谱图，B为气相色谱检测到的t10，c12-CLA的质谱图。

具体实施方式

实施例1亚油酸异构酶(PAI)基因的密码子优化

参照pai基因序列(genebank：AX062088)，基于耶氏解脂酵母基因组的特点，利用Genscript OptimumGeneTM系统的运算法则对pai的转录、翻译和蛋白折叠等多种相关参数进行优化设计，包括GC含量、稀有密码子使用情况、mRNA结构及转录和翻译过程中的各种顺式元素。同时，在基因序列的起始密码子前加入了有利于真核生物中起始翻译的Kozak序列：GCCACA。经密码子优化后的opai核苷酸序列如SEQID NO：1所示，其密码子适应指数(CAI)从0.76提高至0.91，具体结果见图1。优化后的opai基因由南京金斯瑞生物科技有限公司进行全基因合成，并亚克隆至载体pUC57(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)上，得到pUC57-opai。

实施例2重组表达质粒的构建

以含有痤疮丙酸杆菌来源的天然亚油酸异构酶基因pai(genebank：AX062088)的质粒pGEX6-1-PAI(德国哥廷根大学Ivo Feussner教授惠赠Prof.Ivo Feussner，Georg-August-University，

ttingen，Germany)为模板，用一对引物：

P1：5′-CACGTGATGTCCATCTCGAAGG-3′和

P2：5′-GGTACCTTACACGAAGAACCGC-3′

通过PCR对亚油酸异构酶基因pai进行扩增。PCR程序为：94℃15seconds，57℃30seconds，68℃1minute，30个循环。PCR反应体系：5μl2mM的dNTPs，5μl 10×Buf.，1μl KOD plus，2μl 25mM的MgSO4，上游及下游引物各1.5μl，模板1μl。将扩增后的片段连在T载体pMD19T(购自TaKaRa公司)上，得到pMD19T-pai。

亚克隆载体pUC57-opai和pMD19T-pai经内切酶Pml I和Kpn I 37℃消化1.5h后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收得到目的片段，将两种目的片段分别与经同样内切酶处理过的质粒片段pINA1312进行连接，得到重组质粒pINA1312-pai和pINA1312-opai。多拷贝整合重组质粒pINA-1292-opai的构建与单拷贝整合质粒相同，见图2。将构建后的质粒转化E.Coli DH5α感受态细胞并均匀涂布于LB平板(含有100μg/mL卡那青霉素的LB琼脂平板)，37℃过夜培养后，挑选单克隆，PCR验证正确后送北京六合华大生物技术(上海)有限公司测序。

实施例3重组耶氏解脂酵母菌的制备

三种重组质粒pINA1312-pai、pINA1312-opai和pINA1292-opai经Not I 37℃消化1.5h后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收带有目的基因的表达单元片段，浓缩至500ng/μl，取2μtg用于转化耶氏解脂酵母polh。转化过程如下：

1)菌株Y.lipolytica Polh在YPD固体培养基上划线，28℃培养12h；

2)用接种环从平板上挑取一环Polh，重悬于1mL TE溶液中；

3)10000rpm离心，收集菌体，将菌体悬浮于600μl的0.1mol/l的乙酸锂(pH6.0)缓冲液中，28℃水浴1h，注意不要晃动样品；

4)水浴结束，3000rpm离心2min，弃上清；

5)轻轻将菌体重新悬浮于80μl 0.1mol/l的乙酸锂(pH6.0)中；至此，酵母菌感受态细胞制备完成。

6)取40.0μl上述酵母菌感受态，加入2.0μl单链鱼精DNA和4.0μl待转化DNA片段；28℃水浴15min，注意水浴过程中不要晃动样品；

7)上述样品中加入350.0μl 40％(w/v)的PEG 4000(溶于0.1mol/lpH6.0乙酸锂中)与16.0μl 1mol/l的DDT，28℃水浴1h，注意不要晃动样品；

8)逐滴加入40.0μl DMSO，轻轻混匀，然后置于39℃水浴中热休克10min；

9)向上述样品中加入600.0μl 0.1mol/l的乙酸锂(pH 6.0)，轻轻晃动混匀；将酵母菌悬液稀释成不同浓度涂布YNBD平板，28℃培养2-4d，得到单菌落。

分别挑取7个Polh-pINA1312-pai系列转化子、12个Polh-pINA1312-opai系列转化子和13个Polh-pINA1292-opai系列转化子于5mL YNBD培养基中，28℃，200rpm培养1-2d，收集菌体，提取转化子的基因组，以引物P3/P4和P5/P6分别对插入基因pai和opai的转化子基因组进行PCR验证，引物序列如下：

P3/P4：5′-ACGCCAACGGCCACTACAAC-3′和

5′-CAGCCCAGCGGTGGTAGTAAAC-3′；

P5/P6：5′-ACCAGGGATACGACGCTAAC-3′和

5′-ATGGTTTCGGAGCAGGTAAG-3′。

PCR程序为：94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环，72℃补充延伸5min。PCR反应体系：2μl 2.5mM的dNTPs，2μl 10×Buf.，0.5μlTaq，，上游及下游引物各0.5μl，模板1μl。挑出的转化子全部扩增出了大小为570bp或630bp的特异条带，说明均为阳性转化子，见图3-5。对照菌株Polh-pINA1312和Polh-pINA1292的构建方法同上。

实施例4pai特异性多克隆抗体的制备

以含有pai基因(genebank：AX062088)的质粒pGEX6-1-PAI为模板，用一对引物：

P7：5′-CGCCATATGTCCATCTCGAAGGATTCAC-3′和

P8：5′-CCGCTCGAGTTACACGAAGAACCGCG-3′。

通过PCR对亚油酸异构酶基因pai进行扩增。PCR程序为：94℃15s，57℃30s，68℃1min，30个循环。PCR反应体系：5μl 2mM的dNTPs，5μl 10×Buffer，1μl KOD plus，2μl 25mM的MgSO4，上游及下游引物各1.5μl，模板1μl。将扩增后的片段和质粒pET28a(购自默克上海代表处)分别经内切酶Nde I和Xho I 37℃消化1.5h后，通过1％琼脂糖凝胶电泳分离并回收得到目的片段，将目的片段与质粒片段进行连接，得到用于在大肠杆菌中过表达的重组质粒pET28a-pai。将构建后的质粒转化E.Coli DH5α感受态细胞并均匀涂布于LB平板(含有100μg/mL卡那青霉素的LB琼脂平板)，37℃过夜培养后，挑选单克隆，PCR验证正确后送北京六合华大生物技术(上海)有限公司测序。

将测序正确的质粒转化E.Coli BL21(DE3)感受态细胞并均匀涂布于LB平板(含有100μg/mL卡那青霉素的LB琼脂平板)，获得大肠杆菌重组菌株E.Coli BL21(DE3)-pET28a-pai。将重组菌株经活化后，接种于250mL LB液体培养基中，37℃200rpm/min培养至OD₆₀₀达到0.6～0.8，加入IPTG(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，终浓度0.1mM)，诱导20h，离心收集菌体，用100mM磷酸缓冲液(pH 7.5)重悬，冰浴下超声破壁，10000rpm/min离心10min，取上清过Ni-NTA agarose柱纯化，SDS-PAGE检测纯化效果(图6)，纯化后的pai蛋白用于免疫兔子，最后获得pai的特异性多克隆抗体。

实施例5重组耶氏解脂酵母重组蛋白的Westernblot检测

耶氏解脂酵母重组菌株活化后，将种子液接种于50ml YPD培养基中，至OD₆₀₀＝0.5，28℃，200rpm培养3d。8000rpm离心5min，收集菌体，无菌水洗菌体两次，菌体重悬于RIPA裂解液中，冰浴30min，10000rpm离心10min，上清通过BCA法测定总蛋白浓度，取20μg蛋白上样，经8-12％SDS-PAGE分离后，转移至硝酸纤维素膜上，先后与PAI特异性多克隆抗体及羊抗兔lgG抗体杂交后，加入显色液避光显色。

经Westernblot检测，7个Polh-pINA1312-pai转化子中只有Polh-1312-pai-3和Polh-1312-pai-4两个转化子检测到了PAI的杂交条带，而12个Polh-pINA1312-opai转化子和13个Polh-pINA1292-opai转化子全部检测到了杂交条带，充分说明亚油酸异构酶基因的密码子优化对于重组蛋白的表达有明显促进作用。而多拷贝整合菌株(Polh-pINA1312-opa)的蛋白表达量也明显高于单拷贝整合菌株(Polh-pINA1292-opai)，结果见图7-9。

实施例6重组耶氏解脂酵母的脂质提取及脂肪酸组分检测

耶氏解脂酵母重组菌株活化后，将种子液接种于50ml YPD培养基中，至OD₆₀₀＝0.5，28℃，200rpm培养3d。8000rpm离心5min，收集菌体，无菌水洗菌体两次，取50mg冻干后的酵母菌体，加入10％盐酸-甲醇，60℃水浴3h，气相色谱定性、定量分析脂肪酸甲酯，并进一步通过气质联用确定目的产物t10，c12-CLA。

通过气相色谱对于脂肪酸组分的分析发现，重组菌株和对照菌株之间的脂肪酸组分差异不大，但大部分重组菌株都在23min处检测到一个特征峰，而对照菌株无此峰出现，通过与CLA标准品的比较，确定其为t10，c12-CLA(图10)，之后通过气质联用进一步确定了t10，c12-CLA的产生，见图11。与重组蛋白PAI的表达情况一致，7个Polh-pINA1312-pai转化子中只有Polh-1312-pai-3和Polh-1312-pai-4两个转化子检测到了t10，c12-CLA，而12个Polh-pINA1312-opai转化子和13个Polh-pINA1292-opai转化子全部检测到了t10，c12-CLA，而PAI的表达量与产物t10，c12-CLA的产量也呈正相关(图7-9)。经过亚油酸异构酶基因的密码子优化，CLA在耶氏解脂酵母中的产量提高了6倍，而同时使用了多拷贝整合质粒后，CLA在耶氏解脂酵母中的产量较单拷贝插入天然酶基因的转化子提高了近30倍，达到总脂肪酸含量的5.9％，见表1。

表1.重组耶氏解脂酵母的脂肪酸组成

表中数值代表了每种脂肪酸在总脂肪酸中所占的质量比，数据来源于三组独立的平行试验，ND代表未检测到。

Claims (8)

1.对天然亚油酸异构酶基因(pai)进行密码子优化后得到的基因opai。

2.如权利要求1所述的基因opai，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

3.含有天然亚油酸异构酶基因pai或权利要求1-2任一项所述的opai基因的重组表达质粒。

4.如权利要求3所述的重组表达质粒，具体是pINA1312-pai、pINA1312-opai或pINA1292-opai。

5.含有天然亚油酸异构酶基因pai、权利要求1-2任一项所述的基因opai或者权利要求3-4任一项所述的重组表达质粒的耶氏解脂酵母菌。

6.权利要求5所述的耶氏解脂酵母菌，具体是耶氏解脂酵母菌Polh。

7.天然亚油酸异构酶基因pai、权利要求1-2任一项所述的基因opai、权利要求3-4任一项所述的重组表达质粒或权利要求5-6任一项所述的耶氏解脂酵母菌在生产共轭亚油酸中的用途。

8.权利要求8所述的用途，其特征在于所述的共轭亚油酸是t10，c12CLA。

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