CN110229832A

CN110229832A - 一种提高耶式解脂酵母生物量和细胞壁产量的菌株和方法

Info

Publication number: CN110229832A
Application number: CN201910518865.XA
Authority: CN
Inventors: 宋元达; 肖娜; 张怀渊
Original assignee: Shandong University of Technology
Current assignee: Shandong University of Technology
Priority date: 2019-06-16
Filing date: 2019-06-16
Publication date: 2019-09-13

Abstract

本发明涉及一种提高耶式解脂酵母生物量和细胞壁的菌株和方法。本发明制备了含有来自耶式解脂酵母的Δ12脱氢酶基因的重组表达质粒和重组耶式解脂酵母菌株，并利用表达Δ12脱氢酶基因的重组耶式解脂酵母菌株提高其生物量和细胞壁产量。

Description

一种提高耶式解脂酵母生物量和细胞壁产量的菌株和方法

技术领域

本发明涉及酵母细胞壁的微生物提取，具体是提供了一种生产酵母细胞壁的重组酵母菌株、所述菌株的制备方法以及所述菌株在生产酵母细胞壁中的用途。

背景技术

酵母细胞约占整个细胞干重的20%~30%，具有维持细胞形态和细胞间识别的重要作用。按结构划分，酵母细胞壁可分为3层，内层为葡聚糖层，中间层主要由蛋白质组成，外层为甘露聚糖层，层与层之间可部分镶嵌；按化学组成划分，甘露聚糖约占酵母细胞壁干重的30%，β-葡聚糖约占30%，糖蛋白和几丁质约占20%，蛋白质、类脂、无机盐等其他成分约占20%。最内层的 β-葡聚糖属结构多糖，与原生质体膜相连接，构成了酵母细胞壁的主要成分，功能是支撑外部甘露聚糖。 β-葡聚糖由β-1,3-葡聚糖和β-1,6-葡聚糖组成，两者比例为85:15。 β-葡聚糖以β-1,3-葡聚糖为骨架，β-1,6-葡聚糖为支链，β-1,6-葡聚糖的还原端连接到β-1,3-葡聚糖非还原端的末端葡萄糖上，并在氢键作用下共同构成一个三维的网络结构。其网状结构具有较强弹性，在正常渗透压下可大量延伸。而当细胞处于高渗透压情况下时，三维网状结构可迅速收缩，只占原来体积的40%左右，当渗透压恢复正常后，三维网状结构则可恢复原状。

酵母细胞壁是一种绿色添加剂，富含 β-葡聚糖和甘露聚糖（MOS）等多种生物活性物质，具有增强免疫、防治疾病、促进生长、缓解应激、吸附霉菌毒素、补充营养等多种生理功能，且其来源广泛，生产成本低廉，现已应用到猪、禽、反刍家畜、水产等动物养殖。近年来，随着养殖业向集约化、规模化、高密度转型，饲养畜禽容易遭受多种应激影响，主要表现为免疫力降低、易发病、死亡率高，畜产品质量受影响，可明显降低养殖效益。通过饲料添加剂手段解决以上问题，成为一种常规途径。研究表明，酵母细胞壁是一种新型的绿色饲料添加剂，其主要成分对多种动物具有促进生长、增强免疫、防治疾病、缓解应激、吸附霉菌毒素、补充营养等多种生理功能，已在猪、鸡、牛、羊、水产动物中得到广泛应用，且取得了良好效果。

在耶式解脂酵母中过表达来自耶式解脂酵母本身的Δ12脱氢酶基因，可以大幅度提高耶式解脂酵母的生物量，从而通过耶式解脂酵母生产安全、专一性高的酵母细胞壁产品，对于酵母细胞壁在动物养殖的应用具有重要推动作用。综上所述，构建一株可以提高其生物量和细胞壁含量的耶式解脂酵母菌株具有很大的研究和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够利用基因技术提高生物量和细胞壁含量的耶式解脂酵母菌株。

本发明的内容包括：获得携带Δ12脱氢酶基因的表达质粒、获得含有Δ12脱氢酶基因的重组耶式解脂酵母菌株、所述重组耶式解脂酵母的制备方法和所述重组耶式解脂酵母在生产酵母细胞壁中的用途等。

本发明优选为：提取高山被孢霉的Δ12脱氢酶基因，Δ12脱氢酶基因的核苷酸序列如核苷酸序列图所示；将Δ12脱氢酶基因分别插入单拷贝整合质粒pINA1312，并将Δ12脱氢酶基因插入多拷贝整合质粒pINA1292中，获得两种重组质粒pINA1312-Δ12和pINA1292-Δ12（质粒pINA1312和pINA1292参见Nicaud, J.-M, Madzak, C, Van denBroek, P, Gysler, C, Duboc, P, Niederberger, P.,et al.(2002) Proteinexpression andsecretion in the yeast Yarrowialipolytica FEMS Yeast Research,2,371.279）。将构建好的重组质粒分别用Not酶切，得到两种表达单元转化进耶式解脂酵母菌株Polh（耶式解脂酵母Polh参见Mazak,C., Gaillardin,C.,&Beckerich, J.-M.(2004). Heterologous protein expression and secretioninthe non-conventionalyeast Yarrowialipolytica. Journal of Biotechnology,109,63-81），经同源重组后，筛选得到两种重组菌株Polh-1312-Δ12和Polh-1292-Δ12。经PCR验证，两种重组菌株Polh-1312-Δ12和Polh-1292-Δ12均成功表达了Δ12脱氢酶基因。经过发酵测量其生物量，两种重组菌株的生物量和酵母细胞壁含量均得到提高，且与表达量呈正相关。Polh-1312-Δ12的生物量最高达到5g/L，Polh-1292-Δ12的生物量最高达到12g/L。

附图说明

图1：在耶式解脂酵母中表达Δ12脱氢酶的质粒pINA1312-Δ12的结构示意图。

图2：在耶式解脂酵母中表达Δ12脱氢酶的质粒pINA1292-Δ12的结构示意图。

图3：Polh-1312-Δ12和Polh-1292-Δ12转化子PCR验证电泳图：挑出的转化子全部扩增出了大小为1300bp的特异条带，说明均为阳性转化子。

图4：重组菌株Polh-1312-Δ12和Polh-1292-Δ12的生物量图。

图5：重组菌株Polh-1312-Δ12和Polh-1292-Δ12细胞壁含量表。

具体实施方式

实施例1重组表达质粒的构建

以含有Δ12脱氢酶基因的质粒为模版，用一对引物：

P1：GGAACCCGAAACTAAGGATCATGGATTCGACCACGCAGAC

P2：GACAGGCCATGGAGGTACCGGATCCTACTTTTTAGAAGG

通过PCR对Δ12脱氢酶基因进行扩增。PCR程序为：95℃ 20seconds，58℃ 30seconds，72℃ 80seconds，35个循环。PCR反应体系：5μl 2mM的dNTPS，5μl10ΧBuf.，1μl KOD plus，2μl 25mM的MgSO4，上游及下游引物各1.5μl，1μl DNA模板。

将扩增后的片段连在T载体上，得到pINA1312-Δ12。多拷贝整合重组质粒pINA1292-Δ12的构建与单拷贝整合质粒相同。将构建好的质粒转化E.Coli DH5α 感受态细胞并均匀涂布于LB平板（含有100μg/mL卡那青霉素的LB琼脂平板）37℃过夜培养后，挑选单克隆，PCR验证。

实施例2重组耶式解脂酵母菌的制备

重组质粒pINA1312-Δ12、pINA1292-Δ12经Not 37℃充分反应3h后，通过1%琼脂糖凝胶电泳分离回收并纯化带有目的基因的表达单元DNA片段，并利用70%乙醇进行浓缩，浓缩至浓度大于1μg/μL，取1μL用于耶式解脂酵母polh的转化。转化过程如下：

1）菌株Y.lipolyticaPolh在固体培养基上划线，28℃培养12h；

2）用接种环从平板上挑取一环Polh，重悬于1mL TE溶液中；

3） 10000rpm离心2min，收集菌体，将菌体悬浮于600μl的0.1mol/L的乙酸锂（pH6.0）缓冲液中，28℃水浴1h，注意不要晃动样品；

4）水浴结束，3000rpm离心2min，弃上清；

5）轻轻将菌体重新悬浮于80μl 0.1mol/L的乙酸锂（pH6.0）中；至此，酵母感受态细胞制备完成。

6）取40μl上述酵母菌感受态，加入2μl鲑鱼精DNA和4μl待转化DNA片段；28℃水浴15min，注意水浴过程中不要晃动样品；

7）上述样品中加入350μl 40%(w/v)的PEG 4000（溶于0.1mol/l pH6.0乙酸锂中）与16μl 1mol/l的DDT，28℃水浴1h，注意不要晃动样品；

8）逐滴加入40μl DMSO，轻轻混匀，然后置于39℃水浴中热休克10min；

9）向上述样品中加入600μl 0.1mol/l的乙酸锂（pH 6.0）,轻轻晃动混匀；将酵母菌悬液稀释成不同浓度涂布YNBD平板，28℃培养2-4d，得到单菌落。

分别挑取Polh-pINA1312-Δ12转化子和Polh-pINA1292-Δ12转化子于5mLYNBD培养基中，28℃，200rpm培养1-2d，收集菌体，提取转化子的基因组，以引物P3/P4对转化子基因组进行PCR验证，引物序列如下：

P3：ACATACAACCACACACATCC

P4：ACCGGCAACGTGGGGAC

PCR程序为：95℃ 20seconds，53℃ 30seconds，72℃ 80seconds，35个循环。

PCR反应体系：5μl 2mM的dNTPS，5μl 10ΧBuf.，1μl KOD plus，2μl 25mM的MgSO4，上游及下游引物各1.5μl，1μl DNA模板。

挑出的转化子全部扩增出了大小为1300的特异条带，说明均为阳性转化子，见图3。

实施例3重组耶式解脂酵母生物量的测定

每隔 12 h 进行无菌操作取样，取样量为 50 mL 放于烧杯中，用移液器准确吸取 4mL 菌液于离心管中，离心管已在前称重(m₁)，4000 r/min，离心 10 min，分别收集菌体和上清，上清保存于-20°C，用于后续处理，菌体用蒸馏水洗涤 2 次，以尽可能除去残余的培养基，冷冻干燥后准确称量(m₂)，二者重量的差别(m₂-m₁)的 250 倍即生物量(单位，g/L)。

实施例4重组耶式解脂酵母细胞壁的提取

酵母细胞壁是生产中应用最多的多糖。酵母细胞壁是将啤酒酵母培养增殖后，收集菌株细胞，音波震碎，多次清洗过滤，将其可溶物在高温、酸碱处理后仅此呢离心分离，提取的细胞壁于特定的温度和压强下进行喷雾干燥而得到一种全天然绿色添加剂。其产品为淡黄色粉末，无苦味。啤酒酵母细胞壁占整个细胞干重的20%-30%。

序列表

<110> 山东理工大学

<120> 一种提高耶式解脂酵母生物量和细胞壁产量的菌株和方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> 耶式解脂酵母(Yarrowia lipolytica sp.)

<400> 1

atggattcga ccacgcagac caacaccggc accggcaagg tggccgtgca gccccccacg 60

gccttcatta agcccattga gaaggtgtcc gagcccgtct acgacacctt tggcaacgag 120

ttcactcctc cagactactc tatcaaggat attctggatg ccattcccca ggagtgctac 180

aagcggtcct acgttaagtc ctactcgtac gtggcccgag actgcttctt tatcgccgtt 240

tttgcctaca tggcctacgc gtacctgcct cttattccct cggcttccgg ccgagctgtg 300

gcctgggcca tgtactccat tgtccagggt ctgtttggca ccggtctgtg ggttcttgcc 360

cacgagtgtg gccactctgc tttctccgac tctaacaccg tcaacaacgt caccggatgg 420

gttctgcact cctccatgct ggtcccttac tacgcctgga agctgaccca ctccatgcac 480

cacaagtcca ctggtcacct cacccgtgat atggtgtttg tgcccaagga ccgaaaggag 540

tttatggaga accgaggcgc ccatgactgg tctgagcttg ctgaggacgc tcccctcatg 600

accctctacg gcctcatcac ccagcaggtg tttggatggc ctctgtatct gctgtctaac 660

gttaccggac agaagtaccc caagctcaac aaatgggctg tcaaccactt caaccccaac 720

gccccgctgt ttgagaagaa ggactggttc aacatctgga tctctaacgt cggtattggt 780

atcaccatgt ccgtcatcgc atactccatc aaccgatggg gcctggcttc cgtcaccctc 840

tactacctga tcccctacct gtgggtcaac cactggctcg tggccatcac ctacctgcag 900

cacaccgacc ccactctgcc ccactaccac gccgaccagt ggaacttcac ccgaggagcc 960

gccgccacca tcgaccgaga gtttggcttc atcggctcct tctgcttcca tgacatcatc 1020

gagacccacg ttctgcacca ctacgtgtct cgaattccct tctacaacgc ccgaatcgcc 1080

actgagaaga tcaagaaggt catgggcaag cactaccgac acgacgacac caacttcatc 1140

aagtctcttt acactgtcgc ccgaacctgc cagtttgttg aaggtaagga aggcattcag 1200

atgtttagaa acgtcaatgg agtcggagtt gctcctgacg gcctgccttc taaaaagtag 1260

Claims

1.从耶式解脂酵母中提取Δ12脱氢酶基因得到目的基因。

2.如权利要求1所述的基因Δ12脱氢酶基因，其核苷酸序列如核苷酸序列图所示。

3.含有Δ12脱氢酶基因或权利要求1-2任一项所述的Δ12脱氢酶基因的重组表达质粒。

4.如权利要求3所述的重组表达质粒，具体是pINA1312-Δ12和pINA1292-Δ12。

5.含有Δ12脱氢酶基因、权利要求1-2任一项所述的Δ12脱氢酶基因或者权利要求3-4任一项所述的重组表达质粒的耶式解脂酵母。

6.权利要求5的所述的耶式解脂酵母，具体是耶式解脂酵母Polh。

7.Δ12脱氢酶基因、权利要求1-2任一项所述的Δ12脱氢酶基因、权利要求3-4任一项所述的重组表达质粒或权利要求5-6任一项所述的耶式解脂酵母菌在提高生物量和细胞壁产量中的用途。

8.权利要求8所述的用途，其特征在于所述的细胞壁是耶式解脂酵母细胞壁。