CN106047738A - 一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用 - Google Patents

一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106047738A
CN106047738A CN201610392406.8A CN201610392406A CN106047738A CN 106047738 A CN106047738 A CN 106047738A CN 201610392406 A CN201610392406 A CN 201610392406A CN 106047738 A CN106047738 A CN 106047738A
Authority
CN
China
Prior art keywords
novq
ppic9
pichia pastoris
culture medium
recombinant yeast
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610392406.8A
Other languages
English (en)
Inventor
郑之明
李哲敏
赵根海
刘会
王鹏
王丽
方雪
孙小雯
吴锡华
吴荷芳
尉鸿飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Original Assignee
Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hefei Institutes of Physical Science of CAS filed Critical Hefei Institutes of Physical Science of CAS
Priority to CN201610392406.8A priority Critical patent/CN106047738A/zh
Publication of CN106047738A publication Critical patent/CN106047738A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开一株重组的毕赤酵母菌(GS115‑ppic9‑novQ)，其于2016年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016105。本发明还公开一种由上述重组的毕赤酵母菌的构建方法以及在生产芳香族异戊烯基转移酶中的应用。通过对该工程菌的诱导培养，可以在发酵液上清中直接获得具有生物活性的可溶性重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ，省去了细胞搜集，细胞破碎等过程，简化了生产工艺。本发明涉及的芳香族异戊烯基转移酶相较于其他来源酶，具有活性不依赖活细胞或生物膜结构，底物特异性低，能催化多种底物的异戊烯基化，催化活力高等优点。

Description

一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用
技术领域
本发明属于芳香族异戊烯基转移酶基因工程领域，尤其涉及一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用。
背景技术
芳香族异戊烯基转移酶(aromatic prenyltransferase)是一大类能催化芳香族化合物异戊烯基化，生成异戊烯基化芳香族化合物及其衍生物的转移酶。异戊烯基化是多种重要生物来源的芳香性活性分子，如辅酶Q，维生素K2，紫草素，萘萜二醇等生物合成中的关键步骤。芳香族异戊烯基转移酶在医药工业，食品保健品加工，化工合成等领域，具有重要作用和意义。
国内外对芳香族异戊烯基转移酶的分类、功能及其在生物活性物质合成中的应用已有较多报道。研究主要利用生物本底芳香族异戊烯基转移酶，或通过诱变筛选、过表达芳香族异戊烯基转移酶，在细胞中进行产物合成。如Sasaki等人(Sasaki K.，Mito K.，OharaK.，Yamamoto H.，Yazaki K.2008.Cloning and characterization of naringenin 8-prenyltransferase,a flavonoid-specific prenyltransferase ofSophoraflavescens.Plant Physiol2008，146：1075–1084.)从苦参中克隆得到一种植物芳香族异戊烯基转移酶基因SfN8DT-1，并在苦参和拟南芥中过表达，以含该酶的植物活细胞为催化剂，催化合成异戊烯基化的黄酮化合物。这类方法依赖活细胞发挥催化功能，因此酶的表达量难以提高，催化条件相对受限，且该类芳香族异戊烯基转移酶多为膜结合蛋白，离开生物膜后活性丧失，且底物特异性较高，往往一种酶仅能催化一种或有限几种底物的异戊烯基化，实际应用价值较低。近来有研究表明，放线菌来源的芳香族异戊烯基转移酶，特别是ABBA家族异戊烯基转移酶为可溶性酶类，且底物特异性较低，可催化多种芳香族底物的异戊烯基化，具有较高的应用价值。Kuzuyama T.等人(Kuzuyama T.,Noel J.P.,RichardS.B.(2005).Structural basisfor the promiscuous biosynthetic prenylation ofaromaticnatural products.Nature 435,983–987.)从某种放线菌中得到一种可溶性异戊烯基转移酶NphB，并将其在大肠杆菌中进行可溶性表达，提取得到的纯酶可直接用于多种芳香族化合物的异戊烯基化催化，特别是具有抗癌活性的naphterpin合成。该方法能产生不依赖活细胞发挥作用的低特异性芳香族异戊烯基转移酶，具有较高的应用价值，但由于大肠杆菌表达系统的限制，表达量不高，且酶蛋白表达后集中在细胞内部，后续分离提取纯化工序复杂。
毕赤酵母菌是美国FDA公认的几种Generally Recognized as Safe(GRAS)生物之一，在食品药品生产加工中被广泛应用。相比于原核大肠杆菌表达系统，毕赤酵母表达系统具有高效的胞外蛋白表达能力，能将目的蛋白直接分泌到细胞外，更利于异源蛋白的正确折叠和表达后分离纯化。相较于酿酒酵母表达系统，毕赤酵母表达的蛋白糖基化程度较低，更有利于原核来源蛋白的活性保持。
发明内容
为克服现有技术的缺点与不足，本发明目的在于提供一株重组的毕赤酵母菌。该菌是将雪白色链霉菌(Streptomyces niveus)来源的芳香族异戊烯基转移酶基因novQ经加工重组后转入毕赤酵母菌GS115后得到的。该菌能在甲醇诱导下，高效表达带组氨酸标签的重组芳香族异戊烯基转移酶，并分泌到胞外，在发酵液上清中可直接获取具有生物活性的芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
本发明的另一目的在于提供一种由上述重组的毕赤酵母菌的构建方法以及在生产芳香族异戊烯基转移酶中的应用。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题的：一株重组的毕赤酵母菌(GS115-ppic9-novQ)，其于2016年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M2016105。
一种重组的毕赤酵母菌的构建方法，包括以下步骤：
(1)构建重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ：
提取雪白色链霉菌总DNA，PCR扩增获取含novQ基因完整开放阅读框的片段；通过PCR在novQ开放阅读框5’端接上ppic9质粒分泌信号肽α因子C端基因同源片段，3’端切除终止密码子，接上六聚组氨酸标签和ppic9质粒插入位点下游同源序列片段；使用限制性内切酶将ppic9质粒切割线性化；使用ezfusion同源重组酶将改造后的novQ基因片段连入ppic9质粒，得到重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ；
(2)构建重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ：
通过大肠杆菌扩增后获取足量ppic9-novQ载体，经限制性内切酶线性化后，转入毕赤酵母菌GS115，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ。
一种重组的毕赤酵母菌在生产芳香族异戊烯基转移酶中的应用，包括以下步骤：
(1)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ在种子培养基中震荡培养，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ；
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ接入生长培养基中，震荡培养，离心除去培养基，得到菌体；
(3)离心后的菌体重悬于同离心前体积的诱导发酵培养基中，震荡培养，培养期间加入诱导剂；
(4)诱导培养结束后，将发酵液离心，取上清液，将上清液纯化即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
优选地，步骤(1)所述种子培养基为MGY培养基、BMGY培养基、YPD培养基、SOC培养基中的一种；培养温度为20～35℃；摇床转速为180～300rpm；培养时间为24～48h。
优选地，步骤(2)所述生长培养基为MGY培养基、BMGY培养基、YPD培养基、OC培养基中的一种；接种体积比为5～20％；培养温度为20～35℃；摇床转速为180～300rpm；培养时间为24～48h；离心参数为2000～8000g，离心时间10～30min。
优选地，步骤(3)所述诱导发酵培养基为BMMY培养基；培养温度为20～30℃；摇床转速为180～300rpm；培养时间为48～144h；诱导剂为甲醇，每24h加入0.5％～3％(v/v)。
优选地，步骤(4)所述离心参数为2000～8000g，离心时间10～30min，；纯化是使用亲和层析柱纯化。
优选地，步骤(1～3)所述震荡培养装液量为5～25％。
优选地，步骤(1)中培养温度为28℃；摇床转速为250rpm；培养时间为36h；步骤(2)中接种体积比为10％；培养温度为28℃；摇床转速为250rpm；培养时间为36h；离心参数为为4000g，15min；步骤(3)中培养温度为25℃；摇床转速为250rpm；培养时间为96h；诱导剂每24h加入1％(v/v)；步骤(4)中离心参数为4000g，15min；纯化是使用Ni-NTA His BindResin镍柱。
优选地，步骤(1～3)所述震荡培养装液量为10％。
本发明相比于现有技术具有如下的优点：
本发明将来源于雪白色链霉菌的芳香族异戊烯基转移酶基因novQ进行改造后，通过ppic9质粒整合到毕赤酵母菌GS115染色体上，构建重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ。通过对该工程菌的诱导培养，可以在发酵液上清中直接获得具有生物活性的可溶性重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ，省去了细胞搜集，细胞破碎等过程，简化了生产工艺。本发明涉及的芳香族异戊烯基转移酶相较于其他来源酶，具有活性不依赖活细胞或生物膜结构，底物特异性低，能催化多种底物的异戊烯基化，催化活力高等优点。
附图说明
图1为novQ基因片段电泳图
图2为novQ基因改造修饰电泳图
图3为Ppic9酶切线性化电泳图
图4为Ppic9-novQ重组质粒电泳图
图5为NovQ蛋白western-blot检测图谱
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一株重组的毕赤酵母菌(GS115-ppic9-novQ)，其于2016年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山八一路299号，中国典型培养物保藏中心)，保藏编号为CCTCC M 2016105。
由以下步骤构建得到：
步骤一：构建重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ：
(1)异戊烯基转移酶novQ基因获取
使用高氏一号培养基，50mL/250mL装液量，28℃，180rpm摇瓶培养雪白链霉菌(购买于中国药学微生物菌种保藏管理中心)72h，过滤得到菌丝体，使用CTAB法提取菌丝体总DNA。以总DNA为模板，使用NovQ基因正向引物SEQ ID No.1和反向引物SEQ ID No.2进行PCR扩增，扩增参数为95℃变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延长90s，72℃延长10min，32循环。获取含novQ基因完整开放阅读框的片段。该片段电泳结果如图1所示，DNA测序结果为SEQ ID No.3。
(2)novQ基因片段改造修饰
以含novQ基因完整开放阅读框的片段为模板，使用正向修饰引物SEQ ID No.4和反向修饰引物SEQ ID No.5进行PCR，在novQ开放阅读框5’端接上ppic9质粒分泌信号肽α因子C端基因同源片段，在3’端切除终止密码子，接上六聚组氨酸标签和ppic9质粒插入位点下游同源序列片段。PCR参数为95℃变性5min，95℃变性30s，48℃退火30s，72℃延长90s，3循环，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延长90s，72℃延长10min，29循环。得到改造修饰后的novQ基因片段。该片段电泳结果如图2所示。
(3)目的基因片段与载体连接
使用限制性内切酶Xho I和Not I将ppic9质粒切割线性化后，琼脂糖凝胶电泳割胶回收大片段，该片段电泳结果如图3所示。使用ezfusion同源重组酶将改造修饰后的novQ基因片段连入ppic9质粒，连接反应参数为25℃,40min。得到重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ。
步骤二：构建重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ：
(1)重组载体ppic9-novQ扩增
将毕赤酵母表达载体ppic9-novQ转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基筛选培养后，挑取阳性克隆。获得含ppic9-novQ的重组大肠杆菌DH5α。挑取重组大肠杆菌DH5α单菌落接种到含50mLLB培养基的250mL三角瓶中，200rpm，37℃震荡培养18h，10000g离心10min，得到重组大肠杆菌DH5α菌体。使用Axygen质粒中量抽提试剂盒，中量抽提质粒，获取足量ppic9-novQ载体。该载体电泳结果如图4所示。
(2)ppic9-novQ转化毕赤酵母菌
ppic9-novQ载体经限制性内切酶Stu I线性化后，电转化转入毕赤酵母菌GS115感受态细胞，转入参数为1.5kv，25μF，放电时间4.5ms。使用MGY组氨酸营养缺陷培养基平板筛选，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ。该菌能够在甲醇诱导情况下高水平胞外表达具有生物活性的可溶性重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
实施例2
一种重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产芳香族异戊烯基转移酶NovQ，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有25mL的MGY培养基的250mL三角瓶中，28℃，250rpm震荡培养36h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比10％的接种量接入盛有25mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，28℃，250rpm震荡培养36h。将发酵液以4000g，15min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，25mL/250mL装液量，25℃，250rpm震荡培养96h，培养期间每隔24小时加入0.25mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，4000g，15min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。该蛋白western-blot检测结果如图5所示。
实施例3
一种重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产芳香族异戊烯基转移酶NovQ，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有12.5mL的BMGY培养基的250mL三角瓶中，20℃，180rpm震荡培养24h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比5％的接种量接入盛有12.5mL MGY培养基的250mL三角瓶中，20℃，180rpm震荡培养24h。将发酵液以2000g，10min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，12.5mL/250mL装液量，20℃，180rpm震荡培养48h，培养期间每隔24小时加入0.0625mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，2000g，10min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
实施例4
一种重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产芳香族异戊烯基转移酶NovQ，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有62.5mL的YPD培养基的250mL三角瓶中，35℃，300rpm震荡培养48h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比20％的接种量接入盛有62.5mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，35℃，300rpm震荡培养48h。将发酵液以8000g，30min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，62.5mL/250mL装液量，30℃，300rpm震荡培养144h，培养期间每隔24小时加入1.875mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，8000g，30min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
实施例5
一种重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产芳香族异戊烯基转移酶NovQ，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有50mL的SOC培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm震荡培养36h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比15％的接种量接入盛有50mLOC培养基的250mL三角瓶中，30℃，200rpm震荡培养36h。将发酵液以4000g，15min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，50mL/250mL装液量，28℃，300rpm震荡培养96h，培养期间每隔24小时加入0.5mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，4000g，15min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
实施例6
一种重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产芳香族异戊烯基转移酶NovQ，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有40mL的MGY培养基的250mL三角瓶中，32℃，280rpm震荡培养36h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比15％的接种量接入盛有40mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，32℃，280rpm震荡培养40h。将发酵液以6000g，20min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，40mL/250mL装液量，25℃，250rpm震荡培养120h，培养期间每隔24小时加入0.4mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，6000g，20min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
实施例7
一种重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ用于生产芳香族异戊烯基转移酶NovQ，包括以下步骤：
(1)挑取重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ单菌落，接种于盛有50mL的MGY培养基的250mL三角瓶中，30℃，220rpm震荡培养40h，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液。
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌液以体积比18％的接种量接入盛有50mL BMGY培养基的250mL三角瓶中，30℃，220rpm震荡培养40h。将发酵液以4000g，15min离心除去培养基，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体。
(3)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ菌体重悬于同离心前体积的BMMY培养基中，50mL/250mL装液量，25℃，250rpm震荡培养120h，培养期间每隔24小时加入1mL甲醇诱导剂。
(4)诱导培养结束后，4000g，15min离心发酵液，弃去沉淀。上清液通过Ni-NTA HisBind Resin镍柱挂柱吸附，10倍柱体积20mM咪唑溶液洗杂，8倍柱体积250mM咪唑溶液洗脱，透析袋透析脱盐纯化，-70℃冷冻干燥，即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株重组的毕赤酵母菌(GS115-ppic9-novQ)，其于2016年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016105。
2.一种如权利要求1所述的重组的毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)构建重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ：
提取雪白色链霉菌总DNA，PCR扩增获取含novQ基因完整开放阅读框的片段；通过PCR在novQ开放阅读框5’端接上ppic9质粒分泌信号肽α因子C端基因同源片段，3’端切除终止密码子，接上六聚组氨酸标签和ppic9质粒插入位点下游同源序列片段；使用限制性内切酶将ppic9质粒切割线性化；使用ezfusion同源重组酶将改造后的novQ基因片段连入ppic9质粒，得到重组毕赤酵母表达载体ppic9-novQ；
(2)构建重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ：
通过大肠杆菌扩增后获取足量ppic9-novQ载体，经限制性内切酶线性化后，转入毕赤酵母菌GS115，得到重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ。
3.一种如权利要求1所述的重组的毕赤酵母菌的应用，其特征在于，所述重组的毕赤酵母菌用于生产芳香族异戊烯基转移酶，包括以下步骤：
(1)将重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ在种子培养基中震荡培养，得到活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ；
(2)将活化的重组毕赤酵母菌GS115-ppic9-novQ接入生长培养基中，震荡培养，离心除去培养基，得到菌体；
(3)离心后的菌体重悬于同离心前体积的诱导发酵培养基中，震荡培养，培养期间加入诱导剂；
(4)诱导培养结束后，将发酵液离心，取上清液，将上清液纯化即可得到可溶性的重组芳香族异戊烯基转移酶NovQ。
4.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母菌的应用，其特征在于，步骤(1)所述种子培养基为MGY培养基、BMGY培养基、YPD培养基、SOC培养基中的一种；培养温度为20～35℃；摇床转速为180～300rpm；培养时间为24～48h。
5.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母菌在生产芳香族异戊烯基转移酶中的应用，其特征在于，步骤(2)所述生长培养基为MGY培养基、BMGY培养基、YPD培养基、OC培养基中的一种；接种体积比为5～20％；培养温度为20～35℃；摇床转速为180～300rpm；培养时间为24～48h；离心参数为2000～8000g，离心时间10～30min。
6.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母菌的应用，其特征在于，步骤(3)所述诱导发酵培养基为BMMY培养基；培养温度为20～30℃；摇床转速为180～300rpm；培养时间为48～144h；诱导剂为甲醇，每24h加入0.5％～3％(v/v)。
7.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母菌在生产芳香族异戊烯基转移酶中的应用，其特征在于，步骤(4)所述离心参数为2000～8000g，离心时间10～30min，；纯化是使用亲和层析柱纯化。
8.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母菌的应用，其特征在于，步骤(1～3)所述震荡培养装液量为5～25％。
9.根据权利要求3所述的重组毕赤酵母菌的应用，其特征在于，步骤(1)中培养温度为28℃；摇床转速为250rpm；培养时间为36h；步骤(2)中接种体积比为10％；培养温度为28℃；摇床转速为250rpm；培养时间为36h；离心参数为为4000g，15min；步骤(3)中培养温度为25℃；摇床转速为250rpm；培养时间为96h；诱导剂每24h加入1％(v/v)；步骤(4)中离心参数为4000g，15min；纯化是使用Ni-NTA His Bind Resin镍柱。
10.根据权利要求1或8所述的重组毕赤酵母菌的应用，其特征在于，步骤(1～3)所述震荡培养装液量为10％。
CN201610392406.8A 2016-05-31 2016-05-31 一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用 Pending CN106047738A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610392406.8A CN106047738A (zh) 2016-05-31 2016-05-31 一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610392406.8A CN106047738A (zh) 2016-05-31 2016-05-31 一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106047738A true CN106047738A (zh) 2016-10-26

Family

ID=57169491

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610392406.8A Pending CN106047738A (zh) 2016-05-31 2016-05-31 一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106047738A (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913672A (zh) * 2018-07-26 2018-11-30 中国海洋大学 一种新型异戊烯转移酶及其应用
CN109593773A (zh) * 2018-11-22 2019-04-09 北京利德曼生化股份有限公司 一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法
CN109750053A (zh) * 2019-03-12 2019-05-14 中国科学院合肥物质科学研究院 一种利用重组毕赤酵母表达芳香族异戊烯基转移酶合成维生素k2的方法
CN109762834A (zh) * 2019-03-12 2019-05-17 中国科学院合肥物质科学研究院 一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TARO OZAKI等: "NovQ is a prenyltransferase capable of catalyzing the addition of a dimethylallyl group to both phenylpropanoids and flavonoids", 《THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS》 *
吴锡华等: "毕赤酵母Gpn12 异戊烯基转移酶NovQ 催化合成MK-3", 《生物工程学报》 *
娄瑞娟等: "巴斯德毕赤酵母表达系统的研究进展和前景展望", 《生物学杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108913672A (zh) * 2018-07-26 2018-11-30 中国海洋大学 一种新型异戊烯转移酶及其应用
CN108913672B (zh) * 2018-07-26 2021-10-01 中国海洋大学 一种新型异戊烯转移酶及其应用
CN109593773A (zh) * 2018-11-22 2019-04-09 北京利德曼生化股份有限公司 一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法
CN109750053A (zh) * 2019-03-12 2019-05-14 中国科学院合肥物质科学研究院 一种利用重组毕赤酵母表达芳香族异戊烯基转移酶合成维生素k2的方法
CN109762834A (zh) * 2019-03-12 2019-05-17 中国科学院合肥物质科学研究院 一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法
CN109762834B (zh) * 2019-03-12 2022-04-29 中国科学院合肥物质科学研究院 一种获取芳香族异戊烯基转移酶的发酵和一步纯化方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106047738A (zh) 一株重组的毕赤酵母菌、构建方法及其应用
CN104524564B (zh) 一种鲫鱼疱疹病毒病复合疫苗制剂及制备方法和应用
CN109825444B (zh) 一种提高红曲黄酒食品安全的菌株及其酿造方法
CN111073883B (zh) 一种类球红细菌的接合转移方法
CN103898153A (zh) 一种多拷贝的金属硫蛋白重组表达载体及其高效表达金属硫蛋白的方法
CN102321631B (zh) 人工合成鸡干扰素基因序列及其重组工程菌的构建与应用
CN104263744B (zh) 一种人工改造的葡萄糖氧化酶基因及其表达应用
CN107794274A (zh) 一种人源溶菌酶蛋白生产工艺
CN103966110B (zh) 一种用于提高丝状真菌蛋白表达的草酸青霉宿主菌
CN116509764A (zh) 一种含有重组17型人胶原蛋白的酵母发酵产物滤液
CN102898512B (zh) 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途
CN114214208B (zh) 一株高耐硒灵芝突变体菌株及其应用
CN103044533B (zh) 与己糖转运相关的蛋白及其编码基因与应用
CN101979591A (zh) 一种以水稻为生物反应器生产人溶菌酶的方法
CN108102934A (zh) 一种高产果胶裂解酶的黑曲霉菌株
CN106834270A (zh) 一种离子束注入裂盖马鞍菌全基因组突变及定向进化的方法
CN113430146A (zh) 高效表达石杉碱甲的苏云金芽孢杆菌hw1株及其应用
CN103045626B (zh) 高产叶黄素转基因小球藻及其制备方法
CN107641155A (zh) 一种在植物中表达重组人血清白蛋白的方法
CN110606884A (zh) 一种猪α-干扰素的后提取工艺
CN104381010B (zh) 冬虫夏草子实体的培养方法及其组合物和应用
CN102268451A (zh) 一种含有人胰岛素基因的表达载体及其构建方法与应用
WO2024109169A1 (zh) 合成HMOs的成熟多肽序列及应用
CN114525211B (zh) 一株杂色曲霉zlh-1、蛋白酶及其制备方法和应用
WO2024103822A1 (zh) 一种合成寡糖的成熟多肽

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161026

RJ01 Rejection of invention patent application after publication