CN102268451A - 一种含有人胰岛素基因的表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种含有人胰岛素基因的表达载体及其构建方法与应用，主要是在植物双元表达载体pBI121的限制性内切酶酶切位点HindIII和SacI的之间插入以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白基因-人胰岛素基因组成的融合蛋白表达盒，得到发明中所述的植物表达载体pBINOI。另外，提供了一种利用该表达载体转化油葵构建植物生物反应器制备人胰岛素的方法，该方法不仅可以提高人胰岛素的产率，而且大大降低生产成本，适合工业化生产。

Description

一种含有人胰岛素基因的表达载体及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种含有人胰岛素基因的表达载体及其构建方法与应用，特别是涉及一种含有人胰岛素基因的表达载体及其构建方法和利用该载体在油葵中制备人胰岛素的方法。
背景技术
近年来，糖尿病的发病率逐年升高，呈现流行势态。糖尿病已成为世界上许多国家的常见病和多发病。世界卫生组织的近期数字指出，全世界每年约有320万人死于糖尿病，即每分钟6个人。
在糖尿病用药中，胰岛素是最有效的治疗药物之一，也是I型糖尿病患者唯一的治疗药物。此外，还有30％～40％的II型糖尿病患者最终需要使用胰岛素。目前，全球胰岛素市场基本由诺和诺德公司、礼来公司和赛诺菲-安万特公司所垄断。三大巨头都采用微生物发酵的方法生产人胰岛素类产品，但利用微生物发酵技术生产有其局限性，如成本高，难以扩大再生产。相比之下，植物生物反应器就凸显出其特有的优势：成本低廉，且易于规模化生产。
利用转基因植物生产具有医用和商业价值的外源蛋白质，特别是用于医疗和诊断的药用蛋白，在近年来受到人们的广泛关注。利用植物种子表达目的蛋白，再将种子经粉碎→液体抽提→离心处理→回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开，再经进一步纯化获得目的蛋白。这样大大简化了目的蛋白的提取纯化过程，克服了目前微生物表达系统难以规模化生产、安全性差的困难，并且大幅度降低了生产成本，表达具有高保真性，是生物工程制药领域中的一场重要革命。在国内，中国农业科学院利用转基因工程技术将一种新型鲑鱼降钙素类似物成功地在油菜和棉花种子中进行了表达，获得了转基因植株和株系。
目前，加拿大赛姆生物系统遗传公司已率先开展了在转基因红花中生产胰岛素的研究，把嵌合核酸构建体导入红花中，在种子中表达胰岛素。该项研究已经完成了全部的临床前工作，并获得FDA注册。已在英国申请了I期和II期临床试验。但是红花植物其种子体积较小，整株植物含油率较低，导致最终产物蛋白的量少，成本高。
因此，现有技术仍然需要一种方法稳定、产率高、成本低、步骤简单的制备胰岛素的方法。
发明内容
本发明的申请人通过长期研究，付出大量的创造性劳动，通过构建一种含有人胰岛素基因的特异型的表达载体，并选择油葵作为生物反应器，稳定、高效地生产出人胰岛素，从而完成了本发明。
本发明涉及以重组DNA技术生产人胰岛素的方法，特别涉及以油葵作为宿主生产人胰岛素的方法。具体的说，本发明涉及利用花生油体蛋白与人胰岛素的融合蛋白基因在油葵油体中表达从而可以大量生产制备治疗糖尿病的重要药物胰岛素。
首先，本发明提供了一种种子特异型表达载体，含有人胰岛素与花生油体蛋白融合基因，其中，该载体的启动子为油菜油体蛋白基因启动子。以上载体用以在油葵中制备人胰岛素。
另外，本发明还提供了一种构建上述种子特异型表达载体的方法，包括如下步骤：
1)分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体蛋白基因；
2)按照植物偏爱的密码子设计合成人胰岛素基因；
3)构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与人胰岛素融合基因的植物表达载体。
具体步骤包括：
1)分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体蛋白基因采用PCR方法自油菜(Brassica campestris)基因组DNA中扩增20kD油体蛋白基因的启动子，并将该启动子克隆到pUC19(购自MBI公司)上得到重组质粒pUCN，以花生基因组DNA为模板PCR方法扩增终止密码子缺失的花生油体蛋白基因。其中，油菜品种可以是目前现有技术中已经公开或使用的油菜品种，例如，可以是青油14品种、互丰101、耐寒高油王、早油100天和秦油2号等，优选青油14品种。以上油菜油体蛋白启动子可以克隆到pUC19的适合位点之间，优选克隆到pUC19的HindIII和BamHI位点之间。所述的花生品种可以是目前现有技术中已经公开或使用的花生品种，例如，可以是冀花4号、冀油7号、白沙、鲁花11、海花和丰花1号等，优选冀花4号。
2)按照植物偏爱的密码子设计合成人胰岛素基因，按照油葵密码子使用频率优化人胰岛素合成基因，优选优化的基因为人胰岛素基因，频率小于10％的密码子一律认为是稀有密码子被排除，其余的各密码子按油葵密码子使用频率优化，并在基因的5’端添加了胰蛋白酶识别序列Klip27，构建成klip27-insulin，327bp。优化前基因的分子量为201.6，优化前后序列的一致性为大于60％，优选大于65％，最优选为73％，优化后基因的分子量优选为201.6。油葵密码子使用频率可参考http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4232。
3)构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与人胰岛素融合基因的植物表 达载体利用重叠PCR技术将花生油体蛋白基因和klip27-insulin基因构建成融合基因Ole-klip27-insulin，将该融合基因连入pUCN得到重组质粒pUCNOI，优选连入的位点为pUCN的BamHI和SacI酶切位点之间，双酶切重组质粒pUCNOI，优选HindIII和SacI双酶切重组质粒pUCNOI，回收1779bp的外源片段，并将该外源片段连入植物转基因工程中常用的植物双元表达载体pBI121的HindIII和SacI位点之间获得pBINOI，即油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与人胰岛素融合基因的植物表达载体。
最后，本发明还提供了利用以上种子特异型植物表达载体制备人胰岛素的方法，包括如下步骤：
1)将上述构建表达载体导入受体植物外植体内；
2)将上述受体植物材料培养为完整的植株，得到种子；
3)从上述种子中分离纯化得到人胰岛素。
其中，所述的受体植物优选为油葵。
具体步骤包括：
1)将携带人胰岛素基因的种子特异型植物表达载体导入油葵恢复系外植体。将种子特异型植物表达载体导入油葵恢复系的方法可以是本领域常规的导入方法，包括但不限于基因枪法、花粉管通道法、子房注射法和农杆菌介导法，优选的是农杆菌介导法。农杆菌介导法中，将携带人胰岛素基因的种子特异型植物表达载体导入农杆菌，由农杆菌介导转化油葵恢复系外植体。所述外植体包括无菌苗茎尖、子叶、子叶节、去掉一片子叶的实生株四种形式，其中优选去掉一片子叶的实生株；
2)转基因后获得的再生植株经抗性筛选得到抗性苗，待抗性苗生根后移栽入温室进行培养，直至成熟收获种子。其中，抗性苗生根后移栽入温室进行蛭石和营养土混合物培养，在幼苗期进行PCR检测和Southern blotting检测，收获籽粒后进行油体蛋白和人胰岛素融合蛋白的Western blotting检测；
3)将含人胰岛素的种子在缓冲液中研磨，离心将油体和种子的其他成分分离，洗涤油体，通过酶切反应将人胰岛素自油体表面释放，经HPLC纯化获得人胰岛素，并对其进行鉴定。
在本发明的载体和方法中，选择了油菜油体蛋白基因启动子。经实验研究表明，该启动子可大大提高人胰岛素基因的表达效率。优选地，在油体蛋白基因起始密码子周围还可以设计Kozak序列表达控制元件，可以更加进一步提高基因表达效率。
在本发明的载体和方法中，还选择了油体蛋白和人胰岛素的融合表达。目的蛋白在转基因植物中是以融合蛋白的形式与油体蛋白共同在油体中特异表达，利用油体亲脂疏水的特性，将转基因植物种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开，可去除90％以上的种子蛋白。优选地，在油体蛋白和人胰岛素之间设计了胰蛋白酶识别序列Klip27，用以从油体上释放人胰岛素，简化了表达产物的纯化工艺，提高了纯化效率。其中，优选的油体蛋白为花生油体蛋白。花生油体蛋白和人胰岛素的融合表达，表达效率高，效果好。
本发明公开的载体和发方中，为了提高人胰岛素基因的表达效率，根据人胰岛素基因序列和油葵偏爱的密码子、GC含量对人胰岛素基因密码子进行了优化和全基因的人工合成。
在本发明公开的人胰岛素的生产方法中，优选的植物生物反应器为油葵。油葵作为我国一种重要的油料作物，在我国具有悠久的种植历史，具有其它作物不可替代的优势。油葵产量高，作为耐旱作物，可以在盐碱地、干旱地区甚至沙漠等恶劣环境下种植，因此适于大面积推广种植，不仅不会与粮食“争地”，而且还有利于提高我国山岭薄地、干旱贫瘠之地的利用率，缓解国家耕地紧张的压力。因此，选择油葵作为生物反应器，大规模地生产人胰岛素是适合我国国情的生产药用蛋白的方式。最有优势的是，采用油葵作为生物反应器，与目前已作为人胰岛素生产反应器的大豆和红花相比，具有显著的生产效率提高，产率增加的效果。
采用此发明方法生产人胰岛素具有以下优点：
1、植物表达的外源蛋白，类似于哺乳动物表达的蛋白，能够进行正确的折叠，这对于必须具有体内活性的药用蛋白的生产尤为重要。
2、采用植物生物反应器生产的人胰岛素更安全，因为避免了大肠杆菌中的内毒素和动物病原菌的的污染。
3、利用转基因植物的油体表达系统表达人胰岛素，大大简化了纯化工艺，降低了成本，有利于将来的产业化。较之已经被SemBioSys Genetics公司采用的拟南芥以及红花具有很大的优势。
4、采用本发明的种子特异型植物表达载体和制备方法，大大提高了人胰岛素的表达量，能达到种子总蛋白含量的1.3％。
5、采用农杆菌介导法，不仅可以降低成本、提高转化效率，还提高了转基因植株的遗传稳定性。
本发明是利用转基因技术开发高效表达的植物生物反应器，所生产人胰岛素是治疗糖尿病的特效药物。
除有特殊说明，在本发明中出现术语均具有本领域通常的含义，其中的缩写代表的内容如下：
pUC19(购自MBI公司)：常用的大肠杆菌克隆载体
pBI121：植物转基因工程中常用的植物双元表达载体
pUCN：携带油菜油体蛋白基因启动子(NOP)的pUC19载体，插入位点HindIII和BamHI
Oleosin-klip27-insulin：花生油体蛋白、klip27和人胰岛素融合基因
pUCNOI：携带油菜油体蛋白基因启动子(NOP)驱动的花生油体蛋白、klip27和人胰岛素融合基因的pUC19载体，插入位点HindIII和SacI
pBINOI携带油菜油体蛋白基因启动子(NOP)驱动的花生油体蛋白、klip27和人胰岛素融合基因的pBI121载体，插入位点HindIII和SacI
附图说明
图1种子特异型植物表达载体pBINOI结构示意图；
图2种子特异型植物表达载体pBINOI构建流程示意图；
图3pUCN载体的酶切鉴定及PCR检测；
图4Oleosin-klip27-insulin融合基因的构建；
图5pUCNOI载体的酶切鉴定；
图6种子特异型植物表达载体pBINOI的酶切鉴定；
图7转基因油葵nptII基因的PCR检测；
图8转基因油葵的Oleosin-klip27-insulin融合基因的PCR检测；
图9转基因油葵PCR-Southern杂交结果；
图10转基因油葵籽粒油体中油体蛋白-人胰岛素融合蛋白的Western检测；
图11油葵作为生物反应器和红花作为生物反应器制备人胰岛素的比较
具体实施方式
以下具体实施方式仅是对于本发明进行进一步说明，并不用于限定本发明的范围。在了解本发明的内容后，本领域技术人员在不背离本发明精神的前提下对本发明进行改变，这些技术方案均落在本发明的保护范围之内。
除有特殊说明外，下列实施例中所述的方法均为本领域的常规方法。
实施例1：种子特异型植物表达载体
本发明中首先采用PCR方法扩增了油菜油体蛋白基因启动子(NOP)，将该启动子插入pUC19的HindIII和BamHI酶切位点之间得到pUCN。同时依据人胰岛素基因序列和油葵偏爱的密码子设计并人工合成了人胰岛素基因，并将该合成的基因插入花生油体蛋白基因(Ole)的3’末端，获得花生油体蛋白和人胰岛素融合基因，同时在花生油体蛋白基因和人胰岛素基因之间添加了胰蛋白酶识别序列Klip27。进而将该融合基因插入pUCN的BamHI和SacI酶切位点之间得到pUCNOI，HindIII和SacI双酶切pUCNOI，琼脂糖凝胶回收1779bp的外源片段，并将该外源片段插入植物双元表达载体pBI121的HindIII和SacI酶切位点之间，获得本发明提供的植物表达载体pBINOI，pBINOI的表达盒为以油菜油体蛋白基因启动子(NOP)驱动的Ole-Klip27-insulin融合基因，pBINOI结构如图1所示，1：油菜油体蛋白基因启动子，2：花生油体蛋白基因，3：KLIP-27，4：人胰岛素基因。将pBINOI进行测序获得表达盒的序列，长度为1779bp。
实施例2：种子特异型植物表达载体pBINOI的构建
植物表达载体pBINOI构建流程如图2所示，具体步骤如下：
油菜油体蛋白基因启动子的克隆，油菜是重要的油料作物，含油量高(42～45％)，而且油菜油体中20kD油体蛋白的量为24kD油体蛋白量的10倍。根据油菜油体蛋白启动子核苷酸序列(Genbank No.AF134411)设计正向引物pBINOI-1：CCC AAG CTT TTC AAC GTGGTC GGA TCA TGA CG(SEQ ID NO：1)和反向引物pBINOI-2：CGC-GGA TCC GAA TTGAGA GAG ATC GAA GAG(SEQ ID NO：2)，用于PCR扩增油菜20kD油体蛋白基因的启动子，在引物上分别引入了HindIII和BamHI酶切位点(下划线表示酶切位点)，以油菜(Brassicacampestris)品种青油14基因组DNA为模板，以pBINOI-1和pBINOI-2为引物，PCR的条件为：94℃1min、63-73℃1min、68℃1min，30个循环后，68℃延伸10min，扩增油菜油体蛋白基因启动子。琼脂糖凝胶电泳并回收扩增产物，进而用HindIII和BamHI双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收所得产物，并将其与HindIII和BamHI双酶切的pUC19连接，将连接产物与200μL DH5α感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min，冰浴3min，加入800μL LB培养基37℃培养45min，涂布含50μg/mL氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜。PCR方法筛选转化子，pBINOI-1和pBINOI-2为引物，PCR的条件为：94℃1min、60-73℃1min、72℃1min，30个循环后，72℃延伸10min，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测筛选结果，将阳性转化子命名为pUCN，将阳性转化子进行液体震荡培养，提取质粒，将质粒进行HindIII单酶切鉴定和HindIII、BamHI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果如图3所示，M：DNA Molecular Weight MarkerλDNA/EcoT14I，L1：HindIII酶切pUCN质粒的产物为3565bp的片段，L2：HindIII和BamHI双酶切pUCN质粒的产物为2662bp的载体片段和903bp的启动子，L3：PCR检测pUCN质粒得到903bp的启动子。将pUCN质粒进行测序，测序步骤如下：(1)以pUCN为模板，pUC19通用测序引物进行PCR反应，得到PCR产物；(2)纯化PCR产物，以去除酶、荧光染料、引物和其他离子；(3)纯化后的PCR产物经变性和冰浴处理后上3730测序仪(ABI公司)进行测序；(4)仪器自动分析并打印出彩色测序图谱和DNA序列。pUCN中外源片段长度为903bp，序列如SEQ ID NO：3所示，分子量为556.7kDa。酶切结果和测序结果表明：已将油菜油体蛋白基因启动子成功克隆到pUC19上。
人胰岛素的人工合成，依据人胰岛素基因序列(SEQ ID NO：4，ABI63346.1)，氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，同时参照油葵密码子使用频率http://www.kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi？species＝4232设计优化人胰岛素合成基因，并在基因的5’端添加了胰蛋白酶识别序列(Klip27)，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：7所示(klip27-insulin的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，327bp，分子量为201.6，氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，分子量为11.752kDa)经密码子优化并人工合成后的klip 27-insulin基因核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，分子量为201.6，密码子优化前后基因的一致性为73％。
Oleosin-klip27-insulin融合蛋白基因的扩增，依据花生油体蛋白基因序列(Genbank No.AF325917)和klip27-insulin基因序列(SEQ ID NO：10)设计了两对特异性引物pBINOI-3/pBINOI-4和pBINOI-5/pBINOI-6(分别如SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12，SEQ IDNO：13，SEQ ID NO：14)pBINOI-3和pBINOI-6中分别引入BamHI和SacI酶切位点(带下划线的碱基为酶切位点)，且pBINOI-3引物中在油体蛋白基因起始密码子周围设计了Kozak序列(序列中加粗部分，功能是提高转录和表达效率)；pBINOI-4和pBINOI-5互为反向互补序列。
pBINOI-3：CGC GGA TCC
Figure BSA00000506623100071
ATG
Figure BSA00000506623100072
CT ACT GCT ACT GAT CG
pBINOI-4：AGG CTG AAA TTT AGA CGA TGA TGA TGA CCT CTT AAC
pBINOI-5：GTT AAG AGG TCA TCA TCA TCG TCT AAA TTT CAG CCT
pBINOI-6：C GAG CTC TTA GTT GCA GTA ATT TTC TAG
以pBINOI-3/pBINOI-4为引物，花生(品种冀花4号)基因组DNA为模板扩增终止密码子缺失的花生油体蛋白基因，PCR的条件为：94℃ 1min、56-60℃ 1min、68℃ 1min，30个循环后，68℃延伸10min；以pBINOI-5/pBINOI-6为引物，优化后的klip27-insulin基因为模板扩增klip27-insulin基因，PCR的条件为：94℃ 1min、55-73℃ 1min、68℃ 1min，30个循环后，68℃延伸10min；琼脂糖凝胶电泳并回收两种PCR产物合并作为模板，以pBINOI-3/pBINOI-6为引物进行重叠PCR，获得Olesin-klip27-insulin融合基因(PCR的条件为：94℃1min、68.5℃ 1min、68℃ 1min，30个循环后，68℃延伸10min)，琼脂糖凝胶电泳并回收扩增产物获得Oleosin-klip27-insulin融合基因。Oleosin-klip27-insulin融合基因的构建如图4所示，M：DNA Molecular Weight Marker DL2000，L1：pBINOI-3/pBINOI-4为引物，花生(品种冀花4号)基因组DNA为模板扩增终止密码子缺失的花生油体蛋白基因528bp的片段，L2：以pBINOI-5/pBINOI-6为引物，优化后的klip27-insulin基因为模板扩增klip27-insulin基因327bp，L3：以pBINOI-3/pBINOI-6为引物进行重叠PCR，获得的Oleosin-klip27-insulin融合基因855bp。将Oleosin-klip27-insulin融合基因进行测序，测序结果如SEQ ID NO：15所示，长855bp，分子量527.1kDa。预测的氨基酸序列如SEQ ID NO：16所示，由284个氨基酸残基组成，分子量30.161kDa。Oleosin-klip27-insulin融合基因的构建结果和测序结果表明：已得到Oleosin-klip27-insulin融合基因。
中间载体pUCNOI的构建，将Oleosin-klip27-insulin融合基因进行BamHI和SacI双酶切后与同样双酶切的pUCN连接，将连接产物与200μLDH5α感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min，冰浴3min，加入800μL LB培养基37℃培养45min，涂布含50μg/mL氨苄霉素的LB平板，37℃培养过夜。PCR方法筛选转化子，pBINOI-3和pBINOI-6为引物，PCR的条件为：94℃1min、60-73℃1min、72℃1.5min，30个循环后，72℃延伸10min，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测筛选结果，将阳性转化子命名为pUCNOI，将阳性转化子进行液体震荡培养，碱裂解法提取质粒，将质粒进行HindIII单酶切鉴定、HindIII和BamHI双酶切鉴定以及BamHI和SacI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果如图5所示，M：DNA Molecular Weight MarkerλDNA/EcoT14I，L1：HindIII酶切pUCNOI质粒的产物为4426bp的片段，L2：HindIII和SacI双酶切pUCNOI质粒的产物为2647bp的载体片段和1799bp的外源片段(包含油菜油体蛋白基因启动子和Oleosin-klip27-insulin融合基因)L3：BamHI和SacI双酶切pUCNOI质粒的产物为3571bp的载体片段和855bp的外源片段(Oleosin-klip27-insulin融合基因)。将pUCNOI质粒进行测序，测序结果SEQ ID NO：17。全长1779bp，分子量1096.8kDa。，包括油菜油体蛋白基因启动子和Oleosin-klip27-insulin融合基因。酶切结果(如图5所示)和测序结果(如序列表中SEQ ID NO：17所示)表明：已获得了油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与人胰每素融合基因的表达盒，并已将该表达盒成功克隆到载体pUC19上。
种子特异型植物表达载体pBINOI的构建，碱裂解法提取pUCNOI质粒DNA，用HindIII和SacI双酶切，回收1779bp的外源片段，将其与经HindIII和SacI双酶切的pBI121连接，将连接产物与200μL DH5α感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司)混匀，冰浴30min，42℃热击1.5min，冰浴3min，加入800μL LB培养基37℃培养45min，涂布含100μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培养过夜。PCR方法筛选转化子，pBINOI-1和pBINOI-6为引物，PCR的条件为：94℃1min、60-73℃1min、72℃1.5min，30个循环后，72℃延伸10min，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测筛选结果，将阳性转化子命名为pBINOI，将阳性转化子进行液体震荡培养，碱裂解法提取质粒，将质粒进行HindIII单酶切鉴定以及HindIII和SacI双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳显示鉴定结果如图6，M：DNA Molecular Weight MarkerλDNA/EcoT14I，L1：HindIII酶切pBINOI质粒的产物为13782bp的片段，L2：HindIII和SacI双酶切pBINOI质粒的产物为12003bp的载体片段和1779bp的外源片段(包含油菜油体蛋白基因启动子和Oleosin-klip27-insulin融合基因)。将pBINOI质粒进行测序，测序结果SEQ IDNO：17，整个表达盒长1779bp，分子量为1096.8kDa，包括油菜油体蛋白基因启动子和Oleosin-klip27-insulin融合基因。载体的全长核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。油菜油体蛋白基因启动子是种子特异型的强启动子，在转基因植物的种子中驱动人胰岛素以融合蛋白的形式与花生油体蛋白共同在油体中特异表达，花生油体蛋白携带人胰岛素锚定在油体表面。利用油体亲脂疏水的特性，将转基因植物种子粉碎，液体抽提，离心处理，回收上层油相即可将融合蛋白与细胞内其它组分分开，可去除90％以上的种子蛋白。并在花生油体蛋白和人胰岛素之间设计了胰蛋白酶酶切位点，用以从油体上释放人胰岛素。
实施例3：利用该载体制备人胰岛素
3.1上述构建的种子特异型表达载体导入受体植物外植体内；
3.1.1农杆菌感受态细胞的制备
(1)挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3mL的YEB液体培养基(含链霉素Sm 125mg/L)中，28℃振荡培养过夜；
(2)取过夜培养菌液500μL接种于50mL YEB(Sm 125mg/L)液体培养基中，2g℃振荡培养至OD600为0.5；
(3)5,000rpm，离心5min；
(4)加10mL 0.15M NaCl悬浮农杆菌细胞，5,000rpm，离心5min；
(5)1mL预冷的20mM CaCl2悬浮细胞，冰浴，24h内使用，或分装成每管200μL，液氮中速冻1min，置-70℃保存备用。
3.1.2种子特异型植物表达载体向农杆菌感受态细胞的转化
取200μL感受态细胞，加入1μg构建好的质粒DNA，液氮中速冻1min，37℃水浴5min，然后加入1mLYEB培养基，28℃慢速振荡培养4h；1,000rpm离心30sec，弃上清，加入0.1mLYEB培养基重新悬浮细胞，涂布于含有100mg/L Kan和125mg/L Sm的YEB平板上，28℃培养约48h。
阳性克隆的鉴定
挑取平板上长出的单菌落，接种于YEB液体培养液(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)中，28℃振荡培养过夜；碱裂解法小量提取质粒DNA，以质粒DNA为模板，pBINOI-1和pBINOI-6为引物，进行PCR扩增鉴定，PCR的条件为：94℃1min、60-73℃1min、72℃1.5min，30个循环后，72℃延伸10min，将PCR产物进行琼脂糖电泳检测筛选结果获得阳性转化子。
用于转化油葵的农杆菌菌液的准备
从平板上挑取含pBINOI质粒的农杆菌单菌落，接种到5mLYEB液体培养基中(含有100mg/L Kan和125mg/L Sm)，振荡培养过夜，取1mL菌液接种到100-200mL YEB液体培养基(含有100mg/L Kan和125mg/LSm)中，剧烈振荡培养至OD600为0.4～0.8，3500rpm离心10min，菌体用MS(不含植物生长调节剂和抗生素)液体培养基重悬，使OD600为0.6左右，以进行侵染。
3.1.3农杆菌介导的油葵外植体的遗传转化
将发芽3～4d的油葵种子实生幼苗的茎尖、子叶、子叶节和去掉一片子叶的实生株四种形式的外植体，在上述农杆菌菌液中浸泡6～8min，转至MS固体培养基上共培养3d(25℃黑暗)。其中优选的方式是去掉一片子叶的实生株。
3.2将上述受体植物材料培养为完整的植株，得到种子并进行目的基因和蛋白的检测；
3.2.1受体植物材料培养为完整的植株，得到种子
将上述转化过的外植体到含头孢霉素300mg/L的MS培养基上继续进行培养，约7d后，转至MS含头孢霉素300mg/L和卡那霉素70mg/L的抗性筛选培养基上选择培养，每15～20d更换培养基，筛选三次后获得抗性芽，将2～3厘米抗性芽转至生根培养基MS2(MS+IBA0.1mg/L+Kan 70mg/L+cef 300mg/L)，待抗性苗生根后移栽入温室进行蛭石和营养土混合物培养，直至成熟收获种子。
3.2.2目的基因和蛋白的检测
在幼苗期对油体蛋白和人胰岛素融合基因进行PCR检测和PCR-Southern blotting检测，收获籽粒后对油体蛋白和人胰岛素融合蛋白进行Western blotting检测。
转基因油葵幼苗的PCR检测和PCR-Southern blotting检测
采用SDS法提取抗性油葵幼苗幼嫩真叶的基因组DNA作为模板，以nptIIF/nptIIR和pBINOI-3/pBINOI-6两对引物进行PCR扩增检测，引物序列分别为：nptIIF：ATG AAC TGCAGG ACG AGG(SEQ ID NO：19)nptIIR：GCG ATA CCG TAA AGC ACG(SEQ ID NO：20)nptIIF/nptIIR和pBINOI-3/pBINOI-6的PCR扩增的条件均为为：94℃ 1min、60℃ 1min、72℃1min，30个循环后，72℃延伸10min，分别扩增出预期为567bp的片段(部分nptII基因)和855bp的Ole-klip27-insulin融合基因片段。结果如图7和图8所示。图7中，M：DNAMolecularWeight Marker DL2000，L1-L3：nptIIF/nptIIR为引物，以自卡那抗性的油葵所提基因组DNA为模板扩增出567bp的片段，即为抗性植株。L4：pBINOI作模板进行PCR作为阳性对照，增出567bp的片段。L5：以自非抗性油葵所提基因组DNA为模板作为阴性对照。图8中，M：DNA Molecular Weight Marker DL2000，L1-L3：pBINOI-3/pBINOI-6为引物，以自卡那抗性的油葵所提基因组DNA为模板扩增出855bp的片段，即为阳性植株L4：以pBINOI作模板进行PCR作为阳性对照，增出855bp的片段。L5：以自非抗性油葵所提基因组DNA为模板作为阴性对照。
PCR-Southern blotting检测
1)采用SDS法提取nptII和Oleosin-klip27-insulin均为阳性的转基因油葵幼苗真叶的基因组DNA，以pBINOI-3/pBINOI-6为引物对基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃1min、60℃1min、72℃1min，30个循环后，72℃延伸10min。
2)将PCR产物从凝胶转移至尼龙膜，电泳完毕，进行变性、中和后，进行半干转膜，将膜晾干，真空80℃干烤1.2hrs。
3)DNA探针标记
回收pBINOI质粒的BamHI和SacI双酶切片段，取3μgDNA用于标记
4)杂交
63℃预杂交膜30mins，63℃杂交过夜，用充足的2×SSC，0.1％SDS洗膜2次；用预热到65℃的0.5×SSC，0.1％SDS条件下洗膜2次。
5)检测
杂交和洗过的膜用冲洗缓冲液冲洗，简单淋洗一次；在100mL 封闭液中浸泡30min；在20mL抗体溶液中浸泡30min；用100mL冲洗缓冲液冲洗2次，各15min；在20mL检测缓冲液中平衡2-5min；将膜的DNA面向上放到杂交袋中，加入1mLCSPD；37℃温浴湿润的膜10min，以使化学荧光充分反应；在X光片上室温曝光。结果如图9所示，M：DL2000，L1-L3：以PCR检测阳性植株基因组为模板以pBINOI-3/pBINOI-6为引物扩增产物的Southern blotting结果，0.85kb处显示杂交信号，与预期结果一致，表明Oleosin-klip27-insulin融合基因已经整合到油葵基因组中，L4：以pBINOI作模板进行PCR产物作为阳性对照，L5：以自非抗性油葵所提基因组DNA为模板作为阴性对照。
转基因油葵籽粒中油体蛋白和人胰岛素融合蛋白的Western blotting检测
将转基因油葵籽粒子5V研磨缓冲液(50mM Tris-HCl pH 7.5，0.4M sucrose，0.5M NaCl)中研磨，离心10×g 30min，分为三部分，取油相，重新悬浮于等体积的研磨缓冲液中，混匀，轻轻加入5V预冷的50mM Tris-HCl pH 7.5缓冲液，离心10×g 30min，取油相。将上述过程重复2次，用以进一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，得到纯净的油体(油体的成分包括：中性脂类磷脂、油体蛋白)。在油体中加入2V乙醚，离心，中性脂类留在了上层乙醚相中，磷脂在下层的水相中，取中间的蛋白层，以0.1M的蔗糖缓冲液重悬，加入氯仿甲醇(2∶1)混合物，抽提两次，取中间蛋白层，乙醚抽提一次，溶于无菌水中，进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜后用山羊抗兔人胰岛素的多克隆抗体进行Western blotting分析。结果如图10所示，M：蛋白分子量标准，L1：为自转基因油葵的种子中提取的油体蛋白，有胰岛素的表达，表达产物大小约为30kDa，与预期的大小一致(花生油体蛋白18.4kDa+Oleosin-klip27-insulin 11.7kDa)L2：非转基因油葵对照。胰岛素表达量占种子总蛋白的1.3％，超过了重组药物蛋白在植物中表达的最低商业化要求(1％)，因此利用植物油体表达系统来实现胰岛素的产业化，具有可行性和广阔的应用前景。
3.3从上述种子中分离纯化得到人胰岛素。
第一步：将油体与种子中的其它成分分开
将种仁于5V研磨缓冲液(50mMTris-HCl pH 7.5，0.4M蔗糖，0.5M NaCl)中研磨，离心(10×g)30min，分为三部分：最底部是不可溶沉淀(籽壳、纤维质材料、不溶糖、蛋白质和其它不溶性污物)，中间是水相，内含可溶的细胞成分(储藏蛋白)，最上层是油体和与之结合的油体蛋白。
第二步：洗涤油体
取第一步所得油相，重新悬浮于等体积的研磨缓冲液中，混匀，加入5V预冷的50mMTris-HCl pH 7.5缓冲液，离心(10×g)30min，取油相。将上述过程重复2次，用以进一步去除剩余的水溶性成分和不溶性成分，洗涤过的油体重悬于等体积预冷的50mM Tris HCl pH7.5中，这样所得的油体是基本纯净的油体制品，仅存的蛋白质是油体蛋白。
第三步：酶切反应释放人胰岛素
用胰蛋白酶酶切缓冲液洗涤油体两次，加入适量的胰蛋白酶，37℃过夜，离心，人胰岛素存在于水相中。
第四步：HPLC纯化人胰岛素
上反相色谱柱C18(5μ，0.24*25cm)，紫外波长214nm，缓冲液A(10％乙腈0.1％三氟乙酸)平衡柱子，将上一步所得水相上样，对柱子施以19min缓冲液B(5-50％乙腈0.1％三氟乙酸)线性梯度洗脱，得人胰岛素，纯度高于99.8％。
实施例4：油葵作为生物反应器和和红花作为生物反应器制备人胰岛素的产率比较
取相同质量(280mg)的转人胰岛素基因的油葵种子和红花种子，依据实施例3分离纯化获得人胰岛素，上样量为所得总量的十分之一，进行Western blotting检测，结果如图11所示，M：蛋白分子量标准，L1：自转基因油葵纯化的胰岛素，大小为5.7kDa，与预期大小一致，定量为60ng。L2：自转基因红花纯化的人胰岛素，大小为5.7kDa，与预期大小一致，定量为50ng，由此推算1kg转基因油葵种子可获得0.996g胰岛素，同等条件下1kg转基因红花种子可获得0825g胰岛素。而且油葵的亩产量约250kg.红花的亩产量约200公斤，无论是从种子胰岛素产率还是单位面积种植作物的胰岛素的产量来看，油葵都要优先于红花。
Figure ISA00000506623300011
Figure ISA00000506623300021
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Claims (15)

1.一种表达载体，含有人胰岛素与花生油体蛋白融合基因，其中启动子为油菜油体蛋白基因启动子。
2.根据权利要求1的载体，其具有SEQ ID NO：17所示序列。
3.一种构建权利要求1所述的表达载体的方法，其包括如下步骤：
1)分离克隆油菜油体蛋白基因启动子和花生油体蛋白基因。
2)按照植物偏爱的密码子设计合成人胰岛素基因，其特征是按照油葵偏爱的密码子优化人胰岛素基因。
3)构建以油菜油体蛋白基因启动子驱动的花生油体蛋白与人胰岛素融合基因植物表达载体。
4.根据权利要求3的方法，其中的油菜油体蛋白启动子可以克隆到pUC19的HindIII和BamHI位点之间。
5.根据权利要求4的方法，在步骤(2)中将频率小于10％的密码子一律认为是稀有密码子被排除，其余的各密码子按油葵密码子使用频率优化。
6.根据权利要求5的方法，优化前后的一致性大于60％。
7.根据权利要求6的方法，优化前后的一致性为73％。
8.根据权利要求7的方法，在步骤(3)中利用重叠PCR技术将花生油体蛋白基因和人胰岛素基因构建成融合基因Ole-klip 27-insulin，将该融合基因连入pUCN得到重组质粒pUCNOI，优选连入的位点为pUCN的BamHI和SacI酶切位点之间，双酶切重组质粒pUCNOI，优选HindIII和SacI双酶切重组质粒pUCNOI，回收1779bp的外源片段，并将该外源片段连入植物表达载体的HindIII和SacI位点之间。
9.一种制备人胰岛素的方法，其包括如下步骤：
1)将权利要求1或2所述表达载体导入受体植物外植体内；
2)将上述受体植物材料培养为完整的植株，得到种子；
3)从上述种子中分离纯化得到人胰岛素。
10.根据权利要求9所述的方法，其中受体植物为油葵。
11.根据权利要求10所述方法，其中所述油葵种子为卡那霉素抗性表型。
12.根据权利要求9所述的方法，所制备的是人胰岛素。
13.根据权利要求9所述方法，其中步骤1)中的导入方法为农杆菌介导法转化。
14.根据权利要求9所述方法，其中所述纯化方法为高效液相色谱法。
15.根据权利要求9所述方法，其中的分离纯化方法包括将含人胰岛素的种子在缓冲液中研磨，离心将油体和种子的其他成分分离，洗涤油体，通过酶切反应将人胰岛素自油体表面释放，经HPLC纯化获得人胰岛素。
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