CN113249390A - 拟南芥agp30基因在降低植物镉吸收中的应用 - Google Patents

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高建伟
李景娟
张一卉
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Abstract

本发明涉及拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用。本发明通过以AGP30基因为模板进行PCR扩增，得到AGP30基因，然后将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，完成降低镉吸收植物株的构建。转AGP30基因的拟南芥与野生型相比具有很好的抗镉胁迫性以及降低镉胁迫吸收的能力。并且转AGP30基因只在根的表皮部表达，在根的表皮部位就能防止镉离子进入植物体，且不需要消耗ATP，有效地克服了现有镉转运蛋白AtPDR8因为需要消耗ATP而导致影响植物生长的问题。同时AGP30基因的适用范围极其广泛，为培育低镉植物、低镉农作物新品种提供理论依据和来源。

Description

拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用
技术领域
本发明涉及拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用，属于植物基因工程领域。
背景技术
近几十年来，由于工业污染的加剧，农药、化肥在农业生产中的不合理使用等原因，重金属污染物在土壤中积累的数量逐年增加，给农业的绿色生产和人民群众的健康带来了严重的威胁。在众多的重金属元素中，镉是最具代表性的重金属元素之一，被世界卫生组织列为Ⅰ类致癌物。同时，镉也是土壤重金属污染的主要元素，全国点位超标率达到7.0％，远高于其它被测无机污染物(全国土壤污染状况调查公报，2014)。在自然界中，镉元素多以离子状态存在，大多数镉化合物易溶于水，很容易被植物吸收，从而可以通过食物链严重影响动物和人类的健康。
目前，运用分子生物学手段改良植物，是应对植物镉污染的有效手段。近十几年来，植物学家、作物学家在不同的植物中，筛选到了许多镉转运蛋白，比如ABC蛋白家族、HMA蛋白家族、NRAMP蛋白家族等，并将它们应用到植物、作物改良过程中。但是，这些蛋白绝大多是将镉离子转运至植物的液泡或植物的某一部位，仅仅是将镉离子隔离起来，这就对食物链造成了镉污染的风险。例如，人类已发现的镉离子外排转运蛋白AtPDR8是一种典型的ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白，但是该蛋白不仅需要消耗大量的能量，并且外排镉离子的能力比较有限。在低镉作物的分子育种过程中，科研工作者往往通过基因编辑技术，敲除能够转运镉离子的转运蛋白基因(如NRAMP5、HMA3等)来培育低镉作物。这种做法，在降低转运蛋白转运镉的同时，也影响了其转运其它的有益营养物质、离子，从而导致植物体自身的品质和产量下降。
2003年，《The Plant Journal》首次报道了AGP30：一种位于拟南芥主根细胞壁中的阿拉伯半乳糖蛋白，可以调控根的再生以及种子的萌发(Van Hengel and Roberts,2003)。然而，之后的十几年中未见有关AGP30功能的其它报道。关于AGP30基因如何参与降低植物镉吸收也未见说明。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用，本发明通过AGP30基因与黑芥子酶基因启动子pPYK10获得AGP30基因根部特异表达载体，并进而获得AGP30基因的根部特异过表达株系，该过表达株系具有很好的抗镉胁迫性以及降低镉胁迫吸收的能力。
本发明技术方案如下：
拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用，或拟南芥AGP30在制备/培育具有降低镉吸收性能的转基因植物中的应用，所述AGP30基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述应用包括步骤如下：
先构建含有拟南芥AGP30基因的重组载体，然后将重组载体转化到植物或植物细胞中，最后筛选获得成功降低镉吸收的转基因植物。
根据本发明优选的，所述应用包括具体步骤如下：
(1)以拟南芥AGP30基因为模板进行PCR扩增，然后将启动子pPYK10和AGP30基因连接至pBI121质粒载体，得到重组载体pPYK10::AGP30；
(2)将步骤(1)中构建的重组载体pPYK10::AGP30通过农杆菌侵染法转化拟南芥；
(3)将步骤(2)中转化后的拟南芥经过抗性筛选后，取根部的组织进行qPCR鉴定，过表达AGP30基因的拟南芥即为具有降低镉吸收性能的转基因拟南芥。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
AGP30 ORF F：5'ATGGGAATCATTGGTAAGAGTG 3'
AGP30 ORF R：5'TCATTTGGGGCAGGTAGGT 3'
PCR扩增体系(50μL)如下：
Figure BDA0003124729940000021
PCR扩增程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，(35个循环)；72℃延伸5-10min；最后4℃保温。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述启动子pPYK10的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
根据本发明优选的，步骤(1)中，所述启动子pPYK10是按照如下方法获得：
以黑芥子酶(PYK10)基因为模板进行PCR扩增，将其扩增产物进行回收和纯化后，克隆到T载体pMD20-T上，获得启动子pPYK10；
其中，PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
pPYK10 F：5'GTGCGAGTTCCACATCAG 3'
pPYK10 R：5'GGGCAAACAGGTCCATCT 3'
PCR扩增体系(50μL)如下：
Figure BDA0003124729940000031
PCR扩增程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，(35个循环)；72℃延伸5-10min；最后4℃保温。
根据本发明优选的，所述植物包括农作物。
进一步优选的，所述农作物包括玉米、水稻、番茄、马铃薯、花生、大豆、棉花、烟草、黄瓜、甜瓜、西瓜、白菜、油菜、娃娃菜、菠菜、萝卜中的任意一种或多种。
有益效果：
1、本发明首次公开了拟南芥AGP30基因在降低降低植物镉吸收中的应用，通过以AGP30基因为模板进行PCR扩增，得到AGP30基因，然后将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥，完成降低镉吸收植物株的构建。转AGP30基因的拟南芥与野生型相比具有很好的抗镉胁迫性以及降低镉胁迫吸收的能力。
2、本发明所述AGP30基因只在根的表皮部表达，因此转AGP30基因的拟南芥在根的表皮部位就能防止镉离子进入植物体，且不需要消耗ATP，有效地克服了现有镉转运蛋白AtPDR8因为需要消耗ATP而导致影响植物生长的问题。并且AGP30基因的适用范围极其广泛，为培育低镉植物、低镉农作物新品种提供理论依据和来源。
附图说明
图1：本发明转基因拟南芥种子在正常的1/2MS培养基上萌发3天，再转移至含有50μMCdCl2的1/2MS培养基上生长7天后幼苗表型的光学照片。
图中：WT：对照组；OE1：实验组1；OE2：实验组2。
图2：本发明转基因拟南芥的根长统计，每个根长的数值来自5棵随机挑选的幼苗的根长平均值。误差线表示三次独立重复实验的±SD统计。其中，*P<0.05。
图中：横坐标为分组，纵坐标为根长(cm)；
WT：对照组；OE1：实验组1；OE2：实验组2。
图3：拟南芥种子在含有50μM CdCl2的1/2MS培养基上生长10天后，放置于测量缓冲液中的根部光学显微镜图片。
图中：WT：对照组；OE1：实验组1；OE2：实验组2。
图4：根部镉离子电流统计图，误差线代表多次独立重复测试的±SD统计。
图中：横坐标为时间(min)，纵坐标为镉电流强度(pmol/cm2/s)；
WT：对照组；OE1：实验组1；OE2：实验组2。
图5：根部在含有50μM CdCl2的电极液中镉离子电流的平均值统计图。误差线代表三次独立重复测试的±SD统计。T检验的P值：转基因株系的值与野生型对比。***P<0.001。
图中：纵坐标为镉电流强度(pmol/cm2/s)；
WT：对照组；OE1：实验组1；OE2：实验组2。
图6：野生型拟南芥与AGP30根部特异表达转基因拟南芥根部细胞的ATP含量，误差线表示三次独立重复实验的±SD统计。
图中：横坐标为时间(min)，纵坐标为ATP含量(pmol/μg)；
WT：对照组；OE1：实验组1；OE2：实验组2。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。
本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1拟南芥AGP30基因的克隆
从拟南芥信息资源数据库(TAIR)中获得AGP30基因的CDS序列，其长度是720bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
(1)CTAB法提取拟南芥基因组DNA
CTAB提取液：CTAB 4g，NaCl 16.364g，加入1M Tris-HCl(pH 8.0)20mL，0.5MEDTA8mL，双蒸水定容至200mL后灭菌。
①、取少量拟南芥的叶片研磨，加入CTAB提取液(0.2％巯基乙醇)；
②、分装入若干1.5mL的离心管中，水域65℃，30min；
③、以12000rpm离心12min；
④、将上清液倒入另外若干1.5mL离心管中；
⑤加等体积氯仿，混匀，以12000rpm离心5min，取上清；
⑥加2倍体积无水乙醇，沉淀5-10min，以12000rpm离心12min；
⑦使用70％乙醇洗3次，风干5-10min，得到拟南芥DNA；
⑧向拟南芥DNA中加入30-50μL TE缓冲液，溶解拟南芥DNA，得到拟南芥DNA溶液。
(2)以拟南芥基因组DNA为模板，根据AGP30基因的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后用天根生化科技(北京)有限公司的DNA回收试剂盒(货号：DP209)按照其说明回收扩增出的DNA片段。
其中，引物序列如下：
AGP30 ORF F：5'ATGGGAATCATTGGTAAGAGTG 3'；
AGP30 ORF R：5'TCATTTGGGGCAGGTAGGT 3'；
PCR扩增体系(50μL)如下：
Figure BDA0003124729940000051
PCR扩增程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，(35个循环)；72℃延伸5-10min；最后4℃保温。
(3)将PCR产物测序送交生工公司进行测序，测序结果如SEQ ID NO.1所示，长度为720bp，确定克隆的目的片段为拟南芥AGP30基因。
实施例2重组表达载体的构建与转基因植物的制备
(1)重组表达载体的构建
i)从拟南芥信息资源数据库(TAIR)中获得黑芥子酶(PYK10)基因的CDS序列的前2000bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
ii)以实施例1提取的拟南芥基因组DNA为模板，根据黑芥子酶(PYK10)基因前2000bp的核苷酸序列设计引物，进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后用天根生化科技(北京)有限公司的DNA回收试剂盒(货号：DP209)按照其说明回收扩增出的DNA片段，并测序验证，该扩增产物即为AGP30基因的启动子；
其中，引物序列如下：
pPYK10 F：5'GTGCGAGTTCCACATCAG 3'
pPYK10 R：5'GGGCAAACAGGTCCATCT 3'
PCR扩增体系(50μL)如下：
Figure BDA0003124729940000061
PCR扩增程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，(35个循环)；72℃延伸5-10min；最后4℃保温。
iii)将实施例1得到的AGP30基因和步骤(2)得到的启动子pPYK10，通过DNA连接酶连接到pMD20-T载体(购买自TAKALA公司)；将连接产物转化大肠杆菌后，取转化菌液涂在含有卡纳抗性的LB平板上，挑取菌落至含相应抗生素培养基溶液中摇菌培养确认后提取阳性克隆的质粒，酶切，电泳并将目的条带回收。回收的目的条带连入到双子叶植物双元表达载体pCambia3300(本实验室保存)。反应产物转化大肠杆菌后涂板、筛选阳性克隆、提取质粒，然后进行农杆菌转化等实验。
(2)电击法转化农杆菌
i)取出根癌农杆菌GV3101感受态细胞于冰上冻融。
ii)加入2μL步骤(1)得到的质粒DNA于100μL根癌农杆菌GV3101感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌均匀；
iii)取出细胞与质粒的混合物转入电击杯中，预冷后在2500V高压下电击；
iv)取出电击杯，加入800μL预冷的LB培养基，轻轻吹打混匀，吸出菌液转入1.5mL离心管中，28℃，200rpm振荡培养5h；
v)取出30-40μL菌液涂在含有相应抗生素的LB固体培养基上，28℃倒置培养1.5-2天，然后筛选抗利福平和卡那霉素的农杆菌进行菌落PCR，挑选阳性的菌落摇菌，扩大培养。
(3)培养转基因植株
拟南芥种子用1：13的次氯酸钠消毒两次，共8min，再用无菌水洗6次，共6min，种于1/2MS培养基上。含有种子的1/2MS培养基放入4℃冰箱中冷处理3天，然后置于光照培养箱中以20℃，16h(光)/20℃，8h(暗)为一光周期培养。培养10天后将幼苗移至含有营养土：蛭石：珍珠岩＝4：3：3的塑料盒中定期浇水培养。将步骤(2)培养的农杆菌用花絮侵染法浸染拟南芥。
(4)转基因植物筛选
在含100μg/mL除草剂(PPT)的1/2MS培养基上筛选T0的种子(T1代幼苗)，取T1代和Col野生型植株，oxs2-1突变体与o2l1-1突变体的叶片提取DNA，以野生型与突变体为阴性对照进行PCR鉴定，选取阳性株。每种转基因拟南芥得到大约十株T1代植株，随机选取其中的3株作为后续研究的材料。提取转基因植株、野生型植株与突变体植株的RNA，以野生型和突变体为阴性对照进行RT-PCR鉴定，将RT-PCR鉴定的阳性植株的T2代种子做为试验材料。
实施例3镉胁迫下，拟南芥AGP30基因对拟南芥幼苗生长表型的影响
取8颗实施例2制备的转基因拟南芥种子等分为实验组1和实验组2；取4颗和转基因拟南芥种子一批收取的野生型拟南芥种子作为对照组。
将以上3组拟南芥种子分别在1/2培养基上萌发3天，然后转移至含有50μM CdCl2的1/2MS培养基上继续生长7天至长成拟南芥幼苗，观察其生长情况，结果如图1和图2所示。
由图1和图2可知，实验组1的转基因拟南芥种子在镉胁迫下生长后的根长达到了3.9cm，实验组的转基因拟南芥种子在镉胁迫下生长后的根长达到了4.0cm，而对照组的野生型拟南芥种子在镉胁迫下生长后的根长不足3.5cm，说明转基因拟南芥种子的在镉胁迫下生长情况明显优于野生型拟南芥种子。
实施例4镉胁迫下，拟南芥AGP30基因对拟南芥幼苗生长表型的影响
取10颗实施例2制备的转基因拟南芥种子等分为实验组1和实验组2；取5颗和转基因拟南芥种子一批收取的野生型拟南芥种子作为对照组。
将以上3组拟南芥种子分别在含有50μM CdCl2的1/2MS培养基上生长10天至长成拟南芥幼苗，然后放置在缓冲液(0.1mM KCl，0.05mM CdCl2，0.3mM MES，pH 5.8)中，使用光学显微镜观察其根部，结果如图3所示。然后向缓冲液中的拟南芥幼苗根部进行非损伤微测电生理技术(NMT)检测，结果如图4和图5所示。
具体非损伤微测电生理技术(NMT)检测方法如下：采用非损伤微测系统(NMT100；YoungerUSA)仪器，将其电极置于拟南芥根部伸长区(距根尖400μm)，表皮细胞旁1-2μm处，测量表皮处的Cd2+电流，6s记录一次测量数值，测量时间为3min。
由图3～5可知，在不同时间点下，转基因拟南芥所测的伸长区电流值和电流平均值要明显低于野生型拟南芥，表明Cd胁迫下，转基因拟南芥外排或是阻挡Cd2+的能力发生了明显增强，说明AGP30基因具有降低拟南芥镉吸收的能力。
实施例4镉胁迫下，拟南芥AGP30基因对拟南芥幼苗生长过程中ATP使用的影响
取20颗实施例2制备的转基因拟南芥种子等分为实验组1和实验组2；取10颗和转基因拟南芥种子一批收取的野生型拟南芥种子作为对照组。
将以上3组拟南芥种子分别在1/2MS培养基上萌发3天，然后转移至含有50μMCdCl2的1/2MS培养基上继续生长7天至长成拟南芥幼苗，将幼苗根部切成小段，再在酶解液(1.5％[w/v]纤维素酶，0.1％[w/v]离析酶，0.8M甘露醇，0.2M KCl,and 0.1M MES,pH 5.7)中室温浸泡3小时。细沙网过滤酶液中的杂质，100g离心5分钟收集根部细胞。使用W5溶液(3MNaCl,1M CaCl2,0.2M KCl,0.1Glc,and 0.1M MES,pH 5.7)将所得细胞洗两次，然后分为两份，分别浸入W5溶液、以及含有50mM CdCl2的W5溶液中2小时。为了避免ATP的代谢性降解，根部细胞用2.5％(v/v)的三氯乙酸重悬，再使用0.75M的Tris-乙酸缓冲液调PH值为7.75。之后，根部细胞的ATP水平使用ENLITEN rLuciferase/Luciferin reagent(Promega)试剂盒测量。测量仪采用单通道酶标仪(centro XS3LB 960；Berthold Technologies)。同等份的细胞悬浮液采用超声破碎，采用比色法测定细胞的蛋白浓度，计算每单位蛋白的ATP含量。结果如图6所示。
由图6可知，实验组1、2的转基因拟南芥幼苗在镉胁迫下的ATP水平与野生型拟南芥幼苗在镉胁迫下的ATP水平较为一致，均为35p molμg-1prot，说明在镉胁迫下，转基因拟南芥幼苗可以降低镉吸收，并且ATP的水平并没有受到影响。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东省农业科学院
<120> 拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 720
<212> DNA
<213> 拟南芥
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tgcaagtacg cgggcgtcaa caacgtccaa ggcgctaaac ccgttaaaga tgcggtggtg 420
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tgttttgact tttttctttt tctttatatt atctgaaaat tctagactgc agctgaaaca 1020
tgtgatatgg attaaaggcg tatccagtat ccacataaag aggagtggtg tcgctcaccc 1080
agtcaccctt gttacttgtt agatagcatt aatacatttg taagcaacag cttatctgat 1140
agacatgtct taattgggaa atatgctcta agatgataca accatggttc caactgttga 1200
ccaccatagc tgataacatg ttgattacat tttttctttt cagttataac gattactttt 1260
ttggggaaat tattgatata atatgattca ttggatgatc cgatatcatg catataaagt 1320
tgtatctcgt gaaacacgag atagtattat actccattct ttcattatcg gagtatgttt 1380
aaaatttgaa aacaaataca gacacggacc gtggtcttta ccttcagaaa aaaaaagaga 1440
aaaaaaaaac aatccactgt ttattatagg agttgtagaa aatcgggcaa cgatattcga 1500
tatgagttat tattagggcc ttattattat atggtattac tggatattac taaataaaat 1560
aatcatataa atttcacatt ttaatataca ctcgttggac acgcggaata ttatatgttc 1620
taaatgttaa aaaaatcaaa agaaatacaa cgatcgacgg atctagagtc tagaccatgc 1680
aaataaatca tcctatttaa atataataac tgtgcatata gtttagtcaa ataaaaaggt 1740
aaagaaacaa tatacaacct ataacgtcaa tatccatgta cgtagtaata attaggatat 1800
gacagaaaac acgatatctt gatatataca aaatgaaaac ttaaaaattg attaatatgg 1860
cctggctggg tatattatta taaaaacata aagagagatc aataattgat tcgaagatca 1920
ctatataaag aacgtcttcg atatgtaaaa gaaccatcct aaacattttt tcttgaataa 1980
aatcagaatt acaaacaaaa 2000

Claims (8)

1.拟南芥AGP30基因在降低植物镉吸收中的应用，或拟南芥AGP30在制备/培育具有降低镉吸收性能的转基因植物中的应用，其特征在于，所述AGP30基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，包括步骤如下：
先构建含有拟南芥AGP30基因的重组载体，然后将重组载体转化到植物或植物细胞中，最后筛选获得成功降低镉吸收的转基因植物。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括具体步骤如下：
(1)以拟南芥AGP30基因为模板进行PCR扩增，然后将启动子pPYK10和AGP30基因连接至pBI121质粒载体，得到重组载体pPYK10::AGP30；
(2)将步骤(1)中构建的重组载体pPYK10::AGP30通过农杆菌侵染法转化拟南芥；
(3)将步骤(2)中转化后的拟南芥经过抗性筛选后，取根部的组织进行qPCR鉴定，过表达AGP30基因的拟南芥即为具有降低镉吸收性能的转基因拟南芥。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
AGP30 ORF F：5'ATGGGAATCATTGGTAAGAGTG 3'
AGP30 ORF R：5'TCATTTGGGGCAGGTAGGT 3'
PCR扩增程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，(35个循环)；72℃延伸5-10min；最后4℃保温。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述启动子pPYK10的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述启动子pPYK10是按照如下方法获得：
以黑芥子酶(PYK10)基因为模板进行PCR扩增，将其扩增产物进行回收和纯化后，克隆到T载体pMD20-T上，获得启动子pPYK10；
其中，PCR扩增的引物核苷酸序列如下：
pPYK10 F：5'GTGCGAGTTCCACATCAG 3'
pPYK10 R：5'GGGCAAACAGGTCCATCT 3'
PCR扩增程序：98℃预变性30sec；98℃变性10sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，(35个循环)；72℃延伸5-10min；最后4℃保温。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物包括农作物。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述农作物包括玉米、水稻、番茄、马铃薯、花生、大豆、棉花、烟草、黄瓜、甜瓜、西瓜、白菜、油菜、娃娃菜、菠菜、萝卜中的任意一种或多种。
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