CN115851825B - Lsu2基因在拟南芥抗逆中的应用 - Google Patents
Lsu2基因在拟南芥抗逆中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115851825B CN115851825B CN202211470572.7A CN202211470572A CN115851825B CN 115851825 B CN115851825 B CN 115851825B CN 202211470572 A CN202211470572 A CN 202211470572A CN 115851825 B CN115851825 B CN 115851825B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lsu2
- cadmium
- arabidopsis
- gene
- arabidopsis thaliana
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 title claims abstract description 20
- 101150092895 LSU2 gene Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 claims abstract description 60
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 60
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims abstract description 34
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims abstract description 34
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 claims abstract description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 22
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims abstract description 19
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims abstract description 19
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 abstract description 19
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 abstract description 10
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 40
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 17
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 17
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 13
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 11
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 6
- 108010076986 Phytochelatins Proteins 0.000 description 6
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 6
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 5
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 5
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N Malondialdehyde Chemical compound O=CCC=O WSMYVTOQOOLQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 229940118019 malondialdehyde Drugs 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000008638 plant developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 229960000268 spectinomycin Drugs 0.000 description 3
- UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N spectinomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](NC)[C@@H](O)[C@H]([C@@H]([C@H]1O1)O)NC)[C@]2(O)[C@H]1O[C@H](C)CC2=O UNFWWIHTNXNPBV-WXKVUWSESA-N 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108010016634 Seed Storage Proteins Proteins 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 108090000104 Actin-related protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101100236201 Arabidopsis thaliana LSU2 gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101100326757 Drosophila melanogaster Capr gene Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 239000012880 LB liquid culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- HUKFCVYEXPZJJZ-UHFFFAOYSA-N cadmium;hydrate Chemical compound O.[Cd] HUKFCVYEXPZJJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 235000020774 essential nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000010842 industrial wastewater Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 231100000783 metal toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000033116 oxidation-reduction process Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000029553 photosynthesis Effects 0.000 description 1
- 238000010672 photosynthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229930010796 primary metabolite Natural products 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000005068 transpiration Effects 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000004383 yellowing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开LSU2基因在拟南芥抗逆中的应用，属于植物育种技术领域。本发明为了提供一种能去除土壤中的镉元素的技术问题。本发明提供一种培育促进镉吸收的拟南芥的方法，所述方法的具体步骤如下：步骤1：将SEQ ID NO.1所示的基因与pGWB402Ω表达载体连接，获得重组载体；步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入拟南芥中获得转基因拟南芥，鉴定后获得阳性的转基因拟南芥植株。过表达LSU2基因的拟南芥在吸收土壤中的镉元素和缺硫胁迫中的应用。
Description
技术领域
本发明属于植物育种的技术领域，具体涉及LSU2基因在拟南芥抗逆中的应用。
背景技术
镉元素位于第五周期IB族,天然土壤中的镉元素主要来源于成土母质,全世界土壤镉的质量分数范围为0.01～2.00mg/kg,中值为0.35mg/kg,我国土壤镉含量为0.017～0.332mg/kg,镉含量随土壤母质的不同而发生变化"。在水环境体系中,绝大多数淡水镉的质量浓度低于1μg/L,海水平均质量浓度为0.15μg/L。镉是生物非必需元素,由于它有很强的毒性和可迁移性,其在体内生物半哀期长达10～30年,因此镉极易通过食物链进入人体并在体内蓄积,对人类的肾、肺、肝、睾丸、脑、骨髓及血液系统均产生伤害,被美国管理委员会(ATSDR)列为第6位危害人体健康的有毒物质,世界卫生组织规定人体镉的最大允许摄入量为1ug/(kg.d)。在我国,镉也作为排放总量控制的重点监控指标之一由于现代工业的发展,工业废水排放的日益增加,农业中含镉农药的大量使用,使我国土壤镉污染状况日益严重。据统计,我国镉污染土壤面积已达20万km2。土壤中镉含量的上升不仅降低植物的生产力,同时,通过食物链影响人类身体健康。目前,如何有效地清除污染土壤中的镉已成为科学家共同关注的难题,植物修复技术以其潜在的高效、廉价及环境友好性越来越受到重视。近年来,植物对镉的吸收、转运、及解毒机制研究方面取得了很大进展,为植物修复镉污染土壤莫定了基础。镉是一种植物生长的非必需重金属元素,若镉的存在浓度过高,植物则停止生长甚至出现失水枯萎的现象"。镉对植物造成毒害机制是多方面、多水平的。镉能通过改变土壤中其它物质的活性或者减少土壤中微生物的数量而改变植物对其它营养物质的吸收。例如:研究发现镉能影响植物对Ca、Mg、P、K和水的吸收及转运。镉能影响植物的光合作用、气孔的开放、蒸腾作用,镉能导致植物体内大量的活性氧自由基的产生,这些活性氧自由基在高浓度水平下能氧化蛋白质、脂类、核酸,导致细胞结构受到破坏在所有植物中，所以能利用镉元素的植株或者去除土壤中的镉元素是现在亟需解决的问题。
硫作为植物生长发育过程中必不可少的营养元素，不仅参与氨基酸及谷胱甘肽等合成过程，而且在调节植物体内的氧化还原和蛋白活性等生物过程中均具有十分重要的作用。土壤缺硫对植物生长发育过程危害极大，研究发现当拟南芥遭受缺硫胁迫时，其种子贮藏蛋白中含硫蛋白质的含量降低。由于种子贮藏蛋白是种子萌发时氮、碳和硫的重要来源，因此，种子中含硫蛋白质含量的降低会直接影响种子的萌发过程，此外植物在缺硫土壤中生长时叶片发黄、鲜重显著下降，造成减产，严重影响经济效益。因此，若能通过分子设计育种手段培育出在缺硫或少硫土壤中正常生长的植物，是现在亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种能去除土壤中的镉元素的技术问题和提高植物抗缺硫的应用。
本发明提供一种LSU2基因在拟南芥抗逆中的应用。
进一步地限定，所述LSU2基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定，所述抗逆为提高镉吸收和抗缺硫胁迫。
进一步地限定，缺硫胁迫的具体步骤：将拟南芥放置在不含有的硫元素的1/2MS培养基中生长。
进一步地限定，提高镉吸收的具体步骤：将拟南芥放置在含有150μM氯化镉的1/2MS培养基中生长。
本发明提供一种超表达LSU2基因的拟南芥植株在提高拟南芥抗逆中的应用，所述LSU2基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地限定，所述抗逆为提高镉吸收和抗缺硫胁迫。
本发明提供一种培育促进镉吸收的拟南芥的方法，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：将SEQ ID NO.1所示的基因与pGWB402Ω载体连接，获得重组载体；
步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；
步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入拟南芥中获得转基因拟南芥，鉴定后获得阳性的转基因拟南芥植株。
本发明提供一种培育抗缺硫胁迫的拟南芥的方法，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：将SEQ ID NO.1所示的基因与pGWB402Ω载体连接，获得重组载体；
步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；
步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入拟南芥中获得转基因拟南芥，鉴定后获得阳性的转基因拟南芥植株。
本发明提供含有SEQ ID NO.1所示的基因的载体或含有SEQ ID NO.1所示的基因的重组微生物细胞在拟南芥育种中的应用。
有益效果：过表达LSU2株系可以促进镉的吸收，且镉处理后过表达LSU2株系中丙二醛(MDA含量)明显下降，保护酶：超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)含量均明显升高，过表达LSU2的受害程度明显减弱，镉处理下过表达LSU2的鲜重高于野生型。同时，镉处理后，过表达LSU2植物体内谷胱甘肽(GSH)和植物螯合素(PCs)的含量明显升高，进一步证明过表达LSU2的受害程度减弱。
同时，缺硫胁迫时，过表达LSU2株系的长势明显好于野生型，MDA含量明显下降，3种保护酶(SOD、POD和CAT酶活性)明显升高且植物体内半胱氨酸(Cys)和GSH含量明显升高，两种初生代谢产物含量的增加更有利于植物的生长。
附图说明
图1过表达LSU2株系的RNA水平鉴定；
图2为过表达LSU2在非生物胁迫下的表型分析；图A：表型分析；图B：鲜重；图C：根长。使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系；
图3为过表达LSU2在非生物胁迫下的生理指标分析；图A：丙二醛含量；图B：超氧化物歧化酶活性；图C：过氧化物酶活性；图D：过氧化氢酶活性。使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系；
图4为过表达LSU2在非生物胁迫下谷胱甘肽含量分析；使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系；
图5为过表达LSU2在非生物胁迫下植物螯合素或半胱氨酸含量分析；使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系。
具体实施方式
1/2MS培养基配制(1L)：1/2MS粉(购自于北京酷来搏科技有限公司，货号PM1061-50L)2.289g，蔗糖10g，琼脂8g，pH 5.8(先调pH后加琼脂)，121℃灭菌20min。
含镉1/2MS培养基：等待1/2MS培养基降温至50-60℃时，加入150μM的氯化镉。
缺硫1/2MS培养基配制(1L)：缺硫1/2MS粉(购自于北京酷来搏科技有限公司，货号PM1061-S-4×250g)2.342g，蔗糖10g，琼脂8g，pH 5.8(先调pH后加琼脂)，121℃灭菌20min。
实施例1.克隆LSU2基因和构建重组载体
1.目的基因名称：LSU2(response to low sulfur gene 2)(低硫响应基因2)
拟南芥LSU2序列(序列已知，285bp)：atggg gaaaggagga aactatgtga cggtggcggcttccgaagtg gacgagctac gacggaagaa cggagagatg gagaaagctg tggaggagat gaagaaagagatgttgcagt tgtggcggcg gacacaggtg gcggaagaag cggaggagcg tctctgctca cagctagccgagcttgaagc agaatcttta gaccaggctc gtgattacca ctctcgtatc atctttctca tgaacgagctctctcgtctt tcttcagact ctgcctctgc ctctccgtag(SEQ ID NO.1)
2.引物名称：LSU2-上游：atggg gaaaggaggaaactatg(SEQ ID NO.2)，LSU2-下游：ctacggagaggcagaggcag(SEQ ID NO.3)。
3.PCR程序：
PCR体系
PCR反应条件如下所示：
4.目的片段的回收及克隆载体的连接
胶回收过程使用QIAquick胶回收试剂盒(QIAGEN)，具体方法如下所示：
(1)对切下来的胶进行称重后放入Ep管中，加入3倍体积的Buffer QG。
(2)将Ep管置于50℃水浴锅中加热10min，至胶完全溶解。
(3)加入与胶重等体积的异丙醇后，混匀。
(4)将溶液加入到QIAquick spin column中，在13000×g离心1min后，丢掉废液。
(5)重复步骤(4)，将所有溶液全部离心。
(6)加入750μL Buffer PE，13000×g离心1min，弃掉废液。
(7)将QIAquick column重新放入新的Ep管中，在QIAquick column中接入50μL的Buffer EB，室温静置1min，13000×g离心1min，获得胶回收产物。
(8)使用Nanodrop(Invitrogen)对DNA浓度进行测定。
克隆载体连接使用Cloning试剂盒，反应体系如下图所示：
克隆载体连接体系
(1)按照上述反应体系混匀后，室温下静置5min获得与克隆载体相连接的连接产物。
(2)将其置于冰上，以用于下一步进行大肠杆菌转化。
5.含有克隆载体的重组质粒转大肠杆菌
(1)取2μL上述连接产物(实施例1获得的连接产物)加入到One E.coli细胞中，并轻柔地吸打混匀。
(2)置于冰上5min。
(3)在42℃条件下热激上述混合物30s。
(4)在室温条件下，加入250μL S.O.C.溶液(Invitrogen)。并在37℃条件下，放入摇床中，摇晃1h。
(5)取50-200μL混合物，将其涂抹在含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基中，过夜培养。
(6)第2日，取大肠杆菌单菌落进行菌落PCR鉴定，将条带长度正确的单菌落重新加入LB液体培养基摇匀后，送至公司测序。
(7)测序结果正确的含有克隆载体的质粒将用于下一步进行表达载体的连接，并获得含有克隆载体的重组质粒。
6.重组表达载体的制备过程：
(1)在室温条件下，加入上述含有克隆载体的质粒(50-150ng)，pGWB402Ω表达载体1μL，TE buffer(pH 8.0)至总体积为8μL。
(2)将LR ClonaseTM II enzyme mix从-80℃取出，置于冰上2min，并进行2次震荡混匀(每次约2s)。
(3)在步骤(1)的每个样品中加入2μL的LR ClonaseTM，震荡混匀，在25℃条件下反应1h。
(4)在每个样品中加入1μL的Proteinase K溶液用于终止反应，震荡混匀后，在37℃条件下反应10min。将LSU2基因连接到pGWB402Ω表达载体中获得35S::LSU2重组表达载体。
(5)同理将重组表达载体转入大肠杆菌。LB培养基的抗性为100mg/L的壮观霉素。将测序正确的含有表达载体的重组质粒转入农杆菌。
实施例2.构建重组菌
(1)取制备好的农杆菌感受态GV3101，放置于冰上融解。
(2)将重组质粒(35S::LSU2重组表达载体)(150ng)加入至农杆菌感受态中，迅速放置于液氮中冻结。
(3)从液氮中取出后放置于37℃水浴中4min。
(4)向Ep管内加入1mL S.O.C.溶液，并在28℃条件下，放入摇床中，摇晃2h。
(5)在28℃条件下，5000rpm离心5min。
(6)将其涂抹在含有利福平(30mg/L)、庆大霉素(40mg/L)和壮观霉素(100mg/L)的LB固体培养基中，培养2-3d后取单菌落进行菌落PCR鉴定。
实施例3.构建转基因拟南芥
1.重组载体(35S::LSU2重组表达载体)导入宿主的方法：拟南芥花序侵染法。
(1)将含有目的质粒的农杆菌GV3101加入至15mL含有壮观霉素(100mg/L)和利福平(30mg/L)的LB液体培养基中，培养24h。
(2)第2d集菌，在4℃条件下，3000rpm离心5min。
(3)将上清舍弃，加入15mL提前准备好的侵染用水溶液(15mL水中加入0.75g蔗糖和7.5L的Sillwet L-77)。
(4)将拟南芥未开花的花芽浸入上述溶液中30s。
(5)将植物放入袋中保持湿润状态，遮光处理1d后，将植物移至正常状态下继续生长。
(6)种子收获后，将其播种于含15mg/L Basta的1/2MS固体培养基中，约14d后，将可以正常生长的拟南芥移植到土壤中，并进行RNA水平鉴定，获得LSU2株系。
2.拟南芥过表达株系的鉴定
使用半定量反转录PCR方法对过表达株系中LSU2的基因表达水平进行鉴定。以拟南芥内参基因ACTIN2(上游:CCATCCTCCGTCTTGACCTT(SEQ ID NO.4)；下游:ACTTGCCCATCGGGTAATTC(SEQ ID NO.5))作为对照，采用半定量反转录PCR方法，观察过表达LSU2株系中LSU2的基因表达是否提高。与野生型相比，过表达LSU2中的LSU2基因表达量有十分明显的提升，结果表明：我们成功地获得了过表达LSU2的株系(图1)。
利用以下实验验证实验效果：
(1)镉处理及缺硫胁迫下过表达LSU2的生长状况分析：过表达LSU2的2个株系，在正常1/2MS板上生长7天后，每个株系分别选择9株分别转移至含有150μM氯化镉，缺硫1/2MS(缺硫1/2MS培养基基盐)和正常1/2MS中生长7天后观察表型。
结果：镉处理及缺硫处理时LSU2过表达株系的长势明显优于野生型(图2A)，且鲜重明显高于野生型(图2B)，根长明显长于野生型(图2C)。
(2)镉处理时过表达LSU2的株系植物体内镉含量分析：在正常1/2MS板上生长7天后，转移至含有150μM氯化镉的1/2MS中生长7天后，对植物体内镉含量进行分析。与野生型相比，过表达LSU2植物中地上和地下部分镉的含量明显高于野生型，且每株过表达植物中地上和地下部分镉的积累高于野生型，过表达株系中生物浓缩系数(BCF值)既植物体内镉的总量与培养基中添加的镉总量之比明显高于野生型，过表达株系中镉的总量与植物的根重之比(CAPR)明显高于野生型。依据上述结果可知，35S::LSU2促进了镉的吸收。如表1所示：
表1：过表达株系中镉积累情况分析
注：WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系。BCF值：生物浓缩系数既植物体内镉的总量与培养基中添加的镉的总量；CAPR：植物体内镉的总量与根重之比。
(2)非生物胁迫下生理指标的测定：在正常1/2MS板上生长7天后，分别转移至含有150μM氯化镉、缺硫1/2MS和正常1/2MS培养基中生长7天后测定生理指标。非生物胁迫后过表达LSU2株系中丙二醛(MDA含量)明显下降(图3A，表2)，超氧化物歧化酶(SOD)(图3B，表2)、过氧化物酶(POD)(图3C，表2)、过氧化氢酶(CAT)(图3D，表2)含量均明显升高，表明过表达LSU2的受害程度明显减弱。
表2：过表达LSU2在非生物胁迫下的生理指标分析
注：使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系。
(3)非生物胁迫下谷胱甘肽含量分析：当植物遭受非生物胁迫时会产生大量的活性氧造成氧化胁迫，而谷胱甘肽(GSH)可以有效地清除植物体内的活性氧，减缓氧化胁迫对植物的危害。在正常1/2MS板上生长7天后，分别转移至含有150μM氯化镉、缺硫1/2MS和正常1/2MS培养基中生长7天后测定谷胱甘肽含量。发现过表达LSU2植物体内谷胱甘肽(GSH)含量均高于野生型(如图4，表3所示)。表明过表达LSU2株系可以提高对镉毒性的清除，提高植物对逆境的抗性。
表3：过表达LSU2在非生物胁迫下谷胱甘肽含量分析
注：使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系。
(4)镉胁迫下植物螯合素和缺硫胁迫下半胱氨酸含量分析：谷胱甘肽是植物螯合素(PCs)的直接前体，植物螯合肽可与镉形成螯合物减轻植物体内的毒害，因此植物螯合素在缓解重金属毒害方面也具有重要作用。在正常1/2MS板上生长7天后，分别转移至含有150μM氯化镉和正常1/2MS中生长7天后测定植物螯合素含量。发现镉处理时过表达LSU2植物体内植物螯合素含量均高于野生型(图5A，表4)。表明过表达LSU2株系可以提高对镉毒性的清除，提高植物对镉的抗性。半胱氨酸(Cys)是植物生长发育过程中重要的含硫氨基酸，与植物生长发育过程密切相关。在正常1/2MS板上生长7天后，分别转移至缺硫和正常1/2MS中生长7天后测定半胱氨酸含量。发现缺硫胁迫时，过表达LSU2植物体内半胱氨酸含量明显高于野生型(图5B，表4)，更有利于植物的生长，与图1的表型结果相对应。
表4：过表达LSU2在非生物胁迫下植物螯合素或半胱氨酸含量分析
注：使用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析(p<0.05)。WT：野生型；35S::LSU2-A和35S::LSU2-B为LSU2过表达的2个独立株系。
Claims (6)
1.LSU2基因在拟南芥抗逆中的应用，其特征在于，所述抗逆为提高镉吸收和抗缺硫胁迫；所述LSU2基因的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，缺硫胁迫的具体步骤：将拟南芥放置在不含有的硫元素的1/2MS培养基中生长。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，提高镉吸收的具体步骤：将拟南芥放置在含有150μM氯化镉的1/2MS培养基中生长。
4.一种培育促进镉吸收的拟南芥的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：将SEQ ID NO.1所示的基因与pGWB402Ω载体连接，获得重组载体；
步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；
步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入拟南芥中获得转基因拟南芥，鉴定后获得阳性的转基因拟南芥植株。
5.一种培育抗缺硫胁迫的拟南芥的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：
步骤1：将SEQ ID NO.1所示的基因与pGWB402Ω载体连接，获得重组载体；
步骤2：将步骤1所述的重组载体转化至农杆菌中，获得重组农杆菌；
步骤3：将步骤2所述的重组农杆菌转入拟南芥中获得转基因拟南芥，鉴定后获得阳性的转基因拟南芥植株。
6.含有SEQ ID NO.1所示的基因的载体或含有SEQ ID NO.1所示的基因的重组微生物细胞在拟南芥提高镉吸收和抗缺硫胁迫育种中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211470572.7A CN115851825B (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | Lsu2基因在拟南芥抗逆中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211470572.7A CN115851825B (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | Lsu2基因在拟南芥抗逆中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115851825A CN115851825A (zh) | 2023-03-28 |
| CN115851825B true CN115851825B (zh) | 2024-01-30 |
Family
ID=85665152
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211470572.7A Active CN115851825B (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | Lsu2基因在拟南芥抗逆中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115851825B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012153277A1 (en) * | 2011-05-11 | 2012-11-15 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same |
| CN113249390A (zh) * | 2021-06-21 | 2021-08-13 | 山东省农业科学院 | 拟南芥agp30基因在降低植物镉吸收中的应用 |
-
2022
- 2022-11-23 CN CN202211470572.7A patent/CN115851825B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012153277A1 (en) * | 2011-05-11 | 2012-11-15 | Basf Plant Science Company Gmbh | Plants having enhanced yield-related traits and method for making the same |
| CN103533827A (zh) * | 2011-05-11 | 2014-01-22 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| CN113249390A (zh) * | 2021-06-21 | 2021-08-13 | 山东省农业科学院 | 拟南芥agp30基因在降低植物镉吸收中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Evolutionary and Gene Expression Analyses Reveal New Insights into the Role of LSU Gene-Family in Plant Responses to Sulfate-Deficiency;Felipe Uribe 等;《Plants》;第2页第2和4段 * |
| Felipe Uribe 等.Evolutionary and Gene Expression Analyses Reveal New Insights into the Role of LSU Gene-Family in Plant Responses to Sulfate-Deficiency.《Plants》.2022,第2页第2和4段. * |
| Overexpression of LSU1 and LSU2 confers cadmium tolerance by manipulating sulfur metabolism in Arabidopsis;Rui Li 等;《Chemosphere》;第1-10页 * |
| Tabata,S. 等.Arabidopsis thaliana response to low sulfur 2 (LSU2), mRNA.《GenBank Database》.2022,Accession NO:NM_122375.3. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115851825A (zh) | 2023-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7741540B2 (en) | Compositions comprising D-amino acids | |
| Sun et al. | Over-expression of StAPX in tobacco improves seed germination and increases early seedling tolerance to salinity and osmotic stresses | |
| CN113621625B (zh) | 芝麻SiERF103基因在增强植物抗性中的应用 | |
| CN105131098A (zh) | 一种与植物光合作用活性相关的hpe109蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN101748144B (zh) | 一种火把梨耐盐基因PpGST及其应用 | |
| CN115851825B (zh) | Lsu2基因在拟南芥抗逆中的应用 | |
| CN115896045A (zh) | 杜梨E3泛素连接酶基因PbrATL18在植物抗干旱和炭疽病遗传改良中的应用 | |
| CN103667315A (zh) | 小麦耐盐、抗旱基因TaDHN1、重组质粒及应用 | |
| CN107663232A (zh) | 植物抗逆相关蛋白OsIAA18及其编码基因与应用 | |
| CN113736798B (zh) | 一种来源于黑孢块菌的耐锌镉基因TmZRC1S及应用 | |
| CN111607604B (zh) | 棉花ghpsat2基因在促进植物开花中的应用 | |
| CN114277035B (zh) | 木薯MeRS40基因及其蛋白和应用 | |
| CN114717160B (zh) | 肠杆菌和菌剂以及其应用 | |
| CN108018307B (zh) | AtNIA1基因在提高杭白菊苗抗重金属污染和抗氧化活性中的应用 | |
| CN118006658A (zh) | TaMAT1基因及其用途 | |
| RU2587623C2 (ru) | Трансгенное растение березы с устойчивостью к гербицидам | |
| CN104450780B (zh) | 一种来源于假单胞菌的汞转运蛋白基因在培育耐汞拟南芥中的应用 | |
| CN118147202A (zh) | 水稻低温敏感基因Psb27的应用 | |
| CN115896124A (zh) | 紫花苜蓿MsFER1编码基因及其蛋白与应用 | |
| CN114703208A (zh) | 马铃薯StGAPC基因在提高马铃薯淀粉含量上的用途 | |
| CN115820668A (zh) | 水稻铅转运蛋白基因OsNRAMP5在降低水稻铅吸收上的应用 | |
| CN115354044A (zh) | 水稻rlk突变体在促进植物生长或稻油轮作中的应用 | |
| CN116083386A (zh) | 绢毛委陵菜PsSPMS基因及其应用 | |
| CN110499326A (zh) | Rgga在调控作物农艺性状中的应用 | |
| CN117143892A (zh) | 一种促进银杏褪黑素合成且增强植物耐热性的关键基因GbSNAT及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |