CN115725599A - 大豆nac转录因子基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300及其应用，属于基因工程技术领域，所述大豆NAC转录因子基因核苷酸包括如下核苷酸序列的一种或几种：(a)SEQIDNo.2所示的核苷酸序列；(b)SEQIDNo.4所示的核苷酸序列；(c)与SEQIDNo.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列；(d)与SEQIDNo.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列。本发明的研究发现，Glyma.02G109800和Glyma.01G051300不仅能参与调控大豆的根系发育，还能参与大豆对ABA以及逆境胁迫的响应。本发明对植物的根系发育及逆境胁迫研究提供了理论依据。

Description

大豆NAC转录因子基因及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及大豆NAC转录因子基因及其应用。

背景技术

土壤盐碱化是全球性的生态问题，是限制植物生长发育以及造成农作物减产的重要原因，对农业生产产生了极大的负面影响。大豆的种子中含有丰富的蛋白、高品质的植物油、矿物质和维生素等，是一种重要的可食用经济作物。1984年，Lauchli等根据高盐条件下植物盐胁迫耐受性分级，将大豆划分为盐敏感的甜土作物，因此，开展大豆耐盐分子机理研究，鉴定出相关的抗逆性基因并获得抗逆性增强的植物具有重要的意义。

转录因子能直接调控植物体内抗逆基因表达，参与多种生理生化过程，从而提高植物的综合抗逆性。目前，已发现大豆基因组中约12％的基因是转录因子家族成员，其中NAC转录因子家族是植物中一个较大的转录因子家族，在模式植物拟南芥中研究发现，NAC转录因子家族成员在非生物胁迫应答中发挥着重要作用。大豆中有226个基因是NAC转录因子家族成员，但由于大豆基因组庞大且复杂，有关NAC转录因子家族基因在盐胁迫应答中的研究非常有限。

逆境胁迫，包括盐碱、干旱、冷害等非生物胁迫和病虫害侵染等生物胁迫，影响植物的生长发育，是农林生产的最大制约因素之一。因此通过基因改良的方法提高植物对逆境的抗性是目前分子育种中最为常用的方法。脱落酸(ABA)是最为重要的植物激素之一，与种子萌发、根系发育、植株衰老等生长发育过程密切相关，尤为重要的是，ABA在调控植物对非生物胁迫的适应方面起着非常重要的作用，外源ABA处理可以提高植物对非生物胁迫的抗性，而盐碱、干旱、冷害等非生物胁迫可以促进ABA的合成，从而激活ABA信号途径，诱导ABA响应基因的表达，调控植物的抗逆性。但很多ABA响应基因属于功能未知基因。

到目前为止，已经发现包括MYB、NAC、bZIP等多个家族的转录因子参与ABA信号转导，但通常是过量表达相关的转录因子基因可以增强植物的抗逆性，因此在植物的分子育种中具有潜在的应用价值。但是，基因的过量表达涉及到转基因植物的监管问题，这严重制约了已知参与ABA信号转导的转录因子的商用价值。

CRISPR/Cas9技术是近些年发展起来的新一代基因编辑技术，该技术发挥功能的原理：CRISPR簇经过转录加工形成成熟的crRNA，与tracrRNA和Cas9形成复合体，结合匹配到靶DNA序列并切割目标DNA链，生物体在进行DNA链断裂修复时产生碱基插入或缺失，这种插入或缺失主要是被编辑的生物体内源DNA序列的插入或缺失。与锌指核酸内切酶(ZFN)和类转录因子效应物核酸酶(TALEN)相比，CRISPR/Cas9系统具有成本低、效率高、操作简单等优点。尤为重要的是，通过CRISPR/Cas9基因编辑可以通过筛选获得非转基因突变体，因此，在植物中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，这对植物基础研究和作物改良有重要意义。但能够用于CRISPR/Cas9基因编辑提高植物抗逆性的靶基因非常有限。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大豆NAC转录因子基因及其应用，该大豆NAC转录因子基因能够用于调控根系发育和/或抗逆境胁迫。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种大豆NAC转录因子基因，所述大豆NAC转录因子基因核苷酸包括如下序列中的一种或几种：

(a)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

(b)SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列；

(d)与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列。

本发明还提供了上述大豆NAC转录因子基因在调控根系发育和/或抗逆境胁迫中的应用。

优选的，所述大豆NAC转录因子基因氨基酸包括如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列或SEQ ID No.3所述的氨基酸序列。

优选的，所述应用是敲除上述大豆NAC转录因子基因获得双突变体植株，以促进根系发育和提高抗逆境胁迫的能力。

优选的，所述逆境胁迫为非生物胁迫，所述非生物胁迫包括盐胁迫。

本发明还提供了一种促进植物根系发育和/或提高抗逆境胁迫方法，包括如下步骤：

利用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示核苷酸序列筛选靶序列构建两个靶向敲除大豆NAC转录因子基因的sgRNA，然后构建含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，将上述CRISPR/Cas9基因编辑载体转化至根瘤农杆菌中，然后将含有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌侵染野生型大豆，收获T1代转基因种子，种植后筛选鉴定得到不含T-DNA的/无Cas9的纯化双突变体植株。

优选的，所述sgRNA的基因靶序列如SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

优选的，所述表达载体是以pYLCRISPR/Cas9P_ubi-B为骨架。

优选的，所述植物优选的包括Wm82大豆品种。

优选的，所述根瘤农杆菌为GV3101农杆菌。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了大豆NAC转录因子基因在调控根系发育和/或抗逆境胁迫中的应用，本发明大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300，两者编码NAC转录因子，属于NAC转录因子家族成员，本发明首次报道了大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300的功能，丰富了大豆中NAC转录因子基因功能。本发明的研究发现，Glyma.02G109800和Glyma.01G051300不仅能参与调控大豆的根系发育，还能参与大豆对ABA以及逆境胁迫的响应。本发明对植物的逆境胁迫研究提供了理论依据。

本发明通过利用CRISPR/Cas9基因编辑构建分离获得了无Cas9的双突变体植株，结果表明双突变体植株根系更为健壮，抗盐胁迫能力提高。

附图说明

图1为大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300的氨基酸序列比对，其中相同的氨基酸用黑色表示，相似的用灰色表示，下划线表示NAC结构域；

图2为大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300对ABA和盐胁迫响应结果；

图3为Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白的亚细胞定位；

图4为Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白的转录活性；

图5中，A为Glyma.02G109800和Glyma.01G051300靶序列的位置，其中直线代表内含子，灰色框代表外显子，B为双突变体中Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编辑方式，下划线为PAM位点，数字代表其在CDS中的相对位置，C为双突变体中Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白的氨基酸序列比对，数字表示其在全长氨基酸序列中的相对位置；

图6为NaCl对Wm82野生大豆及双突变体大豆植株的影响，A为NaCl处理前后野生型和双突变体的根长，比例尺5cm，B为野生型大豆及双突变体大豆植株的初始根长统计，C为NaCl处理后野生型大豆及双突变体大豆植株的根长抑制率。

具体实施方式

本发明提供了两个高度同源的大豆NAC转录因子基因，所述大豆NAC转录因子基因核苷酸包括如下核苷酸序列中的一种或几种：

(a)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

(b)SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列；

(d)与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列。

本发明还提供了上述两个高度同源的大豆NAC转录因子基因在调控根系发育和/或抗逆境胁迫中的应用。

在本发明中，本发明的大豆NAC转录因子基因优选的包括Glyma.02G109800和Glyma.01G051300，作为一优选的的实施方式，所述大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述大豆NAC转录因子基因Glyma.01G051300编码的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。本发明对Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因的获得方式没有特殊限定，采用本领域公知的方法即可。

在本发明中，作为一优选的实施方式，所述应用是利用大豆NAC转录因子基因获得双突变体植株，以促进根系发育和提高抗逆境胁迫的能力。所述逆境胁迫优选为盐胁迫。本发明所述的双突变体植株耐受NaCl的浓度≤250mM。在本发明中，所述双突变体植物的制备方法优选的包括如下步骤：利用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示核苷酸序列筛选靶序列构建两个靶向敲除大豆NAC转录因子基因的sgRNA，然后构建含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，将上述CRISPR/Cas9基因编辑载体转化至根瘤农杆菌中，然后将含有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌侵染野生型大豆，收获T1代转基因种子，种植后筛选鉴定得到不含T-DNA的/无Cas9的纯化双突变体植株。

本发明中，利用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示核苷酸序列筛选靶序列构建两个靶向敲除大豆NAC转录因子基因的sgRNA。本发明选择两个靶点构建同时靶向Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因的两个sgRNA即sgRNA1和sgRNA2，所述sgRNA1的靶基因序列优选的如SEQ ID No.5所示，所述sgRNA2的靶基因序列优选的如SEQ ID No.6所示，结果表明，只有sgRNA1的靶序列被编辑。在本发明中，构建含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，所述载体优选的是以pYLCRISPR/Cas9P_ubi-B为骨架。本发明中，将上述CRISPR/Ca9基因编辑载体转化至根瘤农杆菌中，所述根瘤农杆菌优选的是GV3101农杆菌，所述的转化方式优选为热激，如42℃热激90s。本发明中，然后将含有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌侵染野生型大豆，所述植物优选的包括Wm82大豆品种。本发明对Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因靶序列及CRISPR/Cas9基因编辑载体构建方式没有特殊限定，采用本领域公知的方法即可。

本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术进行基因编辑，可有效的缩短获得纯合双突变体植株的过程和时间，操作简便、快捷。结果表明，本发明得到的双突变体植株能够促进根系发育和提高抗逆境胁迫能力，尤其是抗盐胁迫能力。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

为了探究大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300在大豆ABA和盐胁迫响应中的作用，先进行转录组测序，筛选得到同时受ABA和盐胁迫调控的基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300，然后利用RT-PCR检测确定它们对ABA和盐胁迫的响应。

大豆的培养和生长：

用于ABA处理和耐盐性测定、ABA处理和耐盐性基因表达的Williams82(Wm82)野生型大豆种子生长在含有1/2MS液体培养基湿润的滤纸表面的培养皿或植物生长袋中，放在生长室中生长。生长室的生长条件为25℃，长日照条件(16h光照/8h黑暗)，光照强度为～600μmolm^-2s^-1。

对生长两周的大豆幼苗分别用100μM ABA溶液、甲醇对照组(0μMABA)、水对照组(0mM NaCl)和200mM NaCl溶液黑暗处理4小时后，立即将幼苗的根和叶子在液氮中冷冻和-80℃下贮藏，提取RNA后部分送样进行转录组测序，部分进行反转录成cDNA，用于RT-PCR检测，GmEF-1α的表达量作为内参。

利用BioEdit软件对大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白全长氨基酸序列进行比对，结果见图1。

由图1可知，Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码NAC转录因子，Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白的氨基酸序列高度相近，氨基酸序列相似度为99％。

其中，大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800编码蛋白的氨基酸序列为：

MENRTSSVLPPGFRFHPTDEELIVYYLCNQATSRPCPASIIPEVDIYKFDPWELPEKTDFGEKEWYFF SPRERKYPNGVRPNRATVSGYWKATGTDKAIYSGSKHVGVKKALVFYKGKPPKGLKTDWIMHEYRLIGSRRQANRQ VGSMRLDDWVLCRIYKKKNIGKSMEAKEEYPIAQINLTPANNDSEQEMVKFPRTSSLTHLLEMDYLGPISHILSDATYNSTFDFQINTANGGIDPFVKPQPVEIPYAADSGKYQVKQNSTINPTIFVNQVYYQRG(SEQ ID No.1)，其中下划线部分为NAC结构域。

大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800的核苷酸序列为：

ATGGAGAACAGAACAAGCTCTGTACTCCCACCTGGCTTCAGGTTTCATCCCACTGATGAAGAACTAATTGTTTACTATCTTTGCAACCAAGCCACATCAAGACCATGCCCTGCATCAATCATCCCAGAAGTGGATATCTATAAGTTTGATCCATGGGAATTACCTGAAAAAACAGACTTTGGAGAAAAGGAGTGGTACTTCTTTAGTCCACGAGAGAGGAAGTATCCAAATGGGGTGAGGCCTAATAGAGCAACCGTGTCTGGGTATTGGAAGGCCACTGGCACAGATAAAGCAATCTATAGTGGGTCTAAGCATGTAGGGGTGAAGAAGGCTTTGGTTTTTTATAAGGGTAAGCCACCAAAGGGTCTCAAGACAGATTGGATTATGCATGAGTATAGATTAATTGGATCAAGAAGACAAGCCAATAGACAAGTTGGATCCATGAGGCTAGACGACTGGGTCTTGTGTAGGATCTACAAGAAGAAGAACATTGGAAAGTCAATGGAGGCAAAAGAGGAATACCCAATAGCCCAAATCAATCTTACACCAGCAAACAATGACAGTGAACAAGAAATGGTGAAATTTCCAAGGACTAGTTCCCTTACTCATCTTTTGGAAATGGATTACTTGGGTCCAATATCACATATATTATCTGATGCCACATACAATTCAACCTTTGATTTTCAAATTAACACTGCCAATGGTGGAATAGACCCGTTCGTAAAACCACAGCCGGTTGAAATCCCTTATGCAGCAGATTCAGGGAAGTACCAAGTGAAACAAAATAGCACCATCAACCCCACCATATTTGTGAACCAAGTGTATTATCAAAGAGGATAA(SEQ ID No.2)。

大豆NAC转录因子基因Glyma.01G051300编码蛋白的氨基酸序列为：

MENRTSSVLPPGFRFHPTDEELIVYYLCNQASSRPCPASIIPEVDIYKFDPWELPDKTDFGEKEWYFF SPRERKYPNGVRPNRATVSGYWKATGTDKAIYSGSKHVGVKKALVFYKGKPPKGLKTDWIMHEYRLIGSRRQANRQ VGSMRLDDWVLCRIYKKKNIGKSMEAKEDYPIAQINLTPANNNSEQELVKFPRTSSLTHLLEMDYLGPISHILPDASYNSTFDFQINTANGGIDPFVKPQLVEIPYATDSGKYQVKQNSTINPTIFVNQVYDQRG(SEQ ID No.3)，其中下划线部分为NAC结构域。

大豆NAC转录因子基因Glyma.01G051300的核苷酸序列为：

ATGGAGAATAGAACAAGCTCTGTACTCCCACCTGGCTTCAGGTTTCACCCCACTGATGAGGAACTAATTGTGTACTACCTTTGCAACCAAGCCTCATCAAGGCCATGCCCTGCATCAATCATTCCAGAAGTGGATATCTATAAGTTTGATCCATGGGAATTACCTGATAAAACAGACTTTGGAGAAAAGGAGTGGTACTTCTTTAGCCCACGAGAGAGGAAGTATCCAAATGGGGTGAGGCCTAATAGAGCAACCGTGTCTGGGTATTGGAAGGCCACTGGGACAGATAAAGCAATCTATAGTGGGTCTAAGCATGTAGGGGTGAAGAAGGCTTTGGTTTTTTACAAGGGTAAGCCACCAAAGGGTCTCAAGACAGATTGGATTATGCATGAGTATAGATTAATTGGATCAAGAAGACAAGCCAATAGACAAGTTGGATCCATGAGGCTAGATGACTGGGTCTTGTGTAGGATTTACAAGAAGAAGAATATTGGAAAATCAATGGAGGCAAAAGAGGACTACCCAATAGCCCAAATCAACCTTACACCAGCAAACAATAACAGTGAACAAGAATTGGTGAAATTTCCAAGGACTAGTTCCCTTACTCATCTTTTGGAAATGGATTACTTGGGTCCAATATCACATATATTACCTGATGCCTCATACAATTCAACCTTTGATTTTCAAATTAACACTGCCAATGGTGGAATAGACCCGTTCGTAAAACCACAGCTGGTTGAAATCCCTTATGCAACAGATTCAGGGAAGTACCAGGTGAAACAGAATAGCACCATCAACCCCACCATATTTGTGAACCAAGTGTATGATCAAAGAGGATAA(SEQ ID No.4)。

由图2可知，大豆NAC转录因子基因Glyma.02G109800和Glyma.01G051300表达受ABA诱导，但受NaCl抑制。

为了研究Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白的亚细胞定位情况，构建了pUC19-GFP-Glyma.02G109800、pUC19-GFP-Glyma.01G051300载体：将经NdeⅠ、SacⅠ双酶切的Glyma.02G109800和Glyma.01G051300目的RT-PCR片段，经纯化后连接到经相同酶切的pUC19-GFP载体中，经过转化大肠杆菌DH5α，分别挑取单克隆、摇菌、小提质粒后对pUC19-GFP-Glyma.02G109800、pUC19-GFP-Glyma.01G051300载体质粒DNA进行酶切检测，大小符合预期，表达载体构建成功。

将构建好的pUC19-GFP-Glyma.02G109800和pUC19-GFP-Glyma.01G051300质粒DNA分别与pUC19-NLS-RFP核定位载体质粒DNA共转染拟南芥原生质体，转染后置于室温黑暗中培养20～22h，在荧光显微镜下观察GFP和RFP荧光。

由图3可知，绿色荧光信号集中在细胞核中，说明Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白都定位于细胞核。

确定Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白都定位于细胞核中后，进一步检测Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白是否具有转录活性。将报告基因pUC19-Gal4:GUS和效应基因pUC19-GD-Glyma.02G109800或pUC19-GD-Glyma.01G051300质粒共转染拟南芥原生质体，转染后室温黑暗中培养20～22h，用酶标仪测定GUS酶活性，以pUC19-GD共转染为对照作为对照。数据表示三次重复的平均值±标准差。

由图4可知，pUC19-GD-Glyma.02G109800或pUC19-GD-Glyma.01G051300共转染组的GUS活性大幅上升，说明Glyma.02G109800和Glyma.01G051300编码蛋白具有转录激活活性。

实施例2

实施例1所述的Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因编辑双突变体的获得

(1)将Glyma.02G109800和Glyma.01G051300的外显子核苷酸序列用于靶序列分析(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de/species.html)，选取同时靶向两个基因的靶序列，在Glyma.02G109800和Glyma.01G051300的DNA序列中确定两组同时靶向两个基因的靶位点序列，分别用于构建sgRNA1和sgRNA2，具体构建到sgRNA中的靶序列见表1。将sgRNA1和sgRNA2克隆到pYLCRISPR/Cas9P_ubi-B载体中，构建出同时靶向Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因编辑载体。

表1 sgRNA中的靶序列

(2)将同时靶向Glyma.02G109800和pYLCRISPR/Cas9的pYLCRISPR/Cas9P_ubi-B基因编辑载体转化到GV3101农杆菌感受态细胞中，侵染Wm82野生型大豆，获得阳性植株，提取叶片DNA进行PCR扩展，测序检测基因编辑情况，收获T1代种子。将T1代种子种于土中，提取幼苗的DNA并进行PCR检测，筛选到无Cas9的植株，再测序检测基因编辑情况，获得Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因的无Cas9纯合双突变体。最终获得两个株系的无Cas9纯合突变体，双突变体-c1或双突变体-c2(double mutant-c1和double mutant-c2)。

双突变体中Glyma.02G109800和Glyma.01G051300靶序列的位置及其编辑方式，如图5所示。

由图5结果表明，在双突变体中，只有靶序列sgRNA1是被编辑的，其中，Glyma.02G109800基因有一种编辑方式，在双突变体-c1或双突变体-c2中Glyma.02G109800核苷酸序列都是在299bp处有1个碱基的缺失，导致Glyma.02G109800编码氨基酸序列有几个氨基酸发生改变并提前终止。而Glyma.01G051300基因有两种编辑方式，双突变体-c1中Glyma.01G051300核苷酸序列在298bp和299bp处有2个碱基的缺失，导致Glyma.01G051300编码氨基酸序列提前终止。双突变体-c2中Glyma.01G051300核苷酸序列在297～300bp处有4个碱基的缺失，导致Glyma.01G051300编码氨基酸序列有几个氨基酸发生改变并提前终止。

因此，本发明成功获得了Glyma.02G109800和Glyma.01G051300基因的纯合双突变体，即双突变体-c1和双突变体-c2。

实施例3

Glyma.02G109800和Glyma.01G051300调控植物对逆境胁迫的响应

为了探究Glyma.02G109800和Glyma.01G051300在大豆对逆境胁迫响应中的作用，进一步证明检测Glyma.02G109800和Glyma.01G05130调控大豆对NaCl的响应。

收取相同生长条件下同一时间获得的Wm82野生型及实施例2中的双突变体-c1和双突变体-c2的种子，经过消毒处理后，将种子种到含1/2MS液体培养基中的植物生长袋中培养出幼苗，将幼苗转移到新的含1/2MS液体培养基(对照组)和含有200mM NaCl的1/2MS培养基(实验组)的植物生长袋中，继续培养，对对照组和实验组植物的根长进行观察和统计，结果如图6所示。

由图6结果表明，在对照组中，即没有盐胁迫存在的情况下，与野生型相比，双突变体主根长度明显缩短，但侧根发达，根系更为健壮。在实验组中，即存在盐胁迫的情况下，双突变体仍比野生型主根短且侧根发达，根系健壮，但根长受抑程度明显低于野生型。因此，本发明双突变体根系更为健壮，显著提高了对NaCl的耐受性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.大豆NAC转录因子基因，其特征在于，所述大豆NAC转录因子基因核苷酸包括如下核苷酸序列的一种或几种：

(a)SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；

(b)SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；

(c)与SEQ ID No.2所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列；

(d)与SEQ ID No.4所示的核苷酸序列编码的氨基酸具有至少95％同源性的蛋白的编码核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的大豆NAC转录因子基因在调控根系发育和/或抗逆境胁迫中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述大豆NAC转录因子基因编码氨基酸包括如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列或SEQ ID No.3所述的氨基酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是敲除大豆NAC转录因子基因获得双突变体植株，以促进根系发育和提高抗逆境胁迫的能力。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述逆境胁迫为非生物胁迫，所述非生物胁迫包括盐胁迫。

6.一种促进植物根系发育和/或提高抗逆境胁迫方法，其特征在于，包括如下步骤：

利用如SEQ ID No.2和SEQ ID No.4所示核苷酸序列筛选靶序列构建两个靶向敲除大豆NAC转录因子基因的sgRNA，然后构建含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9基因编辑载体，将上述CRISPR/Cas9基因编辑载体转化至根瘤农杆菌中，然后将含有CRISPR/Cas9基因编辑载体的农杆菌侵染野生型大豆，收获T1代转基因种子，种植后筛选鉴定得到不含T-DNA的/无Cas9的纯化双突变体植株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述两个sgRNA的基因靶序列如SEQ IDNo.5和SEQ ID No.6所示。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达载体是以pYLCRISPR/Cas9P_ubi-B为骨架。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述植物包括Wm82大豆品种。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述根瘤农杆菌为GV3101农杆菌。

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