CN116162646A - 一种NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆性中的应用 - Google Patents

一种NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆性中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆性中的应用。所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后获得多个非转基因的多突变体，用于提高烟草抗逆性。编辑敲除NtAITRs基因在提高烟草非生物胁迫抗性中的应用。本发明通过利用CRISPR/Cas9基因编辑构建分离获得了非转基因的四及五突变体，发现多突变体对干旱的耐受性显著提高。结果说明NtAITRs敲除能够提供烟草的抗逆性，因此NtAITRs可作为利用CRISPR/Cas9基因编辑提高烟草抗逆性的靶基因。本发明相比于现有技术在可显著提高烟草的耐干旱性，且获得的突变体是非转基因植物。

Description

一种NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆性中的应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆性中的应用。
背景技术
烟草属一年生或有限多年生草本植物，是我国主要的经济作物之一，同时作为重要的模式植物，许多植物分子生物学研究和基因工程实验都以烟草为对象进行基因的生物学功能验证，但是对烟草自身抗逆功能基因的挖掘、鉴定和利用的研究相对匮乏。
包括干旱和盐胁迫在内的非生物胁迫是影响农作物产量和品质的重要因素。培育能抵抗干旱和盐胁迫的作物新品种对于提高农业生产力，提高水资源和土地利用率具有重要意义。烟草是一种重要的经济作物，但许多优良品质的烟草自身抗逆性并不强，不仅限制了其种植区域，还使之很容易受到突发气候灾害的影响。但利用传统的育种方法培养抗逆性增强的烟草品种耗时长且结果不可预测。因此，鉴定新的调控抗逆性的基因，利用基因工程技术通过基因改良的方法提高烟草的抗逆性将是改良烟草的重要途径。
脱落酸(ABA)是最为重要的植物激素之一，与种子萌发、根系发育、植株衰老等生长发育过程密切相关，尤为重要的是，ABA在调控植物对非生物胁迫的适应方面起着非常重要的作用，外源ABA处理可以提高植物对非生物胁迫的抗性，而干旱等非生物胁迫可以促进ABA的合成，从而激活ABA信号途径，诱导ABA响应基因的表达，调控植物的抗逆性。但很多ABA响应基因属于功能未知基因，对其进行分析研究将能够获得可用于植物抗逆性改良的基因。在模式植物拟南芥中研究表AITRs基因敲除突变体抗逆性提高，但NtAITRs能否用于烟草的抗逆性改良尚属未知。
CRISPR/Cas9技术是近些年发展起来的新一代基因编辑技术，该技术发挥功能的原理：CRISPR簇经过转录加工形成成熟的crRNA，与tracrRNA和Cas9形成复合体，结合匹配到靶DNA序列并切割目标DNA链，生物体在进行DNA链断裂修复时产生碱基插入或缺失，这种插入或缺失主要是被编辑的生物体内源DNA序列的插入或缺失。与锌指核酸内切酶(ZFN)和类转录因子效应物核酸酶(TALEN)相比，CRISPR/Cas9系统具有成本低、效率高、操作简单等优点。尤为重要的是，通过CRISPR/Cas9基因编辑可以通过筛选获得非转基因突变体，避免转基因植物应用于生产中所面临的严格监管。因此，在植物中应用CRISPR/Cas9基因编辑技术，这对植物基础研究和作物改良有重要意义。但能够用于CRISPR/Cas9基因编辑提高烟草植物抗逆性的靶基因非常有限。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有技术中，利用传统育种技术提高烟草抗逆性耗时长、结果不可预期，而利用转基因提高烟草抗逆性在生产应用中有面临严格监管。
(2)现有技术没有利用NtAITRs可作为CRISPR/Cas9基因编辑靶基因提高烟草抗逆性，也不能为该家族基因表达受到植物激素脱落酸的(ABA)的诱导，其编码蛋白具有转录抑制活性的理论依据。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题，本发明公开实施例提供了一种NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆性中的应用。
所述技术方案如下：一种NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后在提高烟草抗逆性上的应用。
在一个实施例中，所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后获得多个非转基因的多突变体，用于提高烟草抗逆性。
在一个实施例中，所述NtAITRs转录因子家族基因的DNA被切断后，随机将一个或多个核苷酸进行插入或缺失，获得多个非转基因的多突变体。
在一个实施例中，所述多突变体包括但不限于一个四突变体和两个五突变体，均用于提高烟草抗逆性。
在一个实施例中，所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后在调控烟草种子非生物胁迫中的应用。
在一个实施例中，所述非生物胁迫包括但不限于干旱胁迫。
本发明的另一目的在于提供一种非转基因的突变体的构建方法，所述非转基因的多突变体的构建方法包括以下步骤：
S1，NtAITRs基因靶序列的位置选取：将NtAITRs转录因子家族基因的外显子核苷酸序列用于靶序列分析，选取多个靶序列，每个靶序列至少靶向NtAITRs转录因子家族基因中的两个；
S2，选取的多个靶序列搭载在CRISPR/Cas9载体上，利用pHEE进行构建，并加入能促进植物早花的FT基因表达框作为非转基因突变体的筛选标记；
S3，进行烟草转化筛选获得多个多突变体。
在一个实施例中，在步骤S1中，多个靶序列核苷酸序列包括但不限于SEQIDNO：17～SEQIDNO：20。
本发明的另一目的在于提供一种如所述非转基因的突变体的构建方法在除烟草外非转基因管状花目植株构建筛选上的应用。
本发明的另一目的在于提供一种所述非转基因的多突变体的构建方法构建的对ABA敏感性提高、对耐干旱性具有改善的烟草非转基因的多突变体。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明发现烟草中共有8个基因编码NtAITRs，并提供了其核苷酸和氨基酸序列，发现其基因表达受到植物激素脱落酸的(ABA)的诱导，其氨基酸序列高度同源，具有转录抑制活性。本发明通过利用CRISPR/Cas9基因编辑构建分离获得了非转基因的四及五突变体，发现多突变体对干旱的耐受性显著提高。结果说明NtAITRs敲除能够提高烟草的抗逆性，因此NtAITRs可作为利用CRISPR/Cas9基因编辑的靶基因，用于构建抗逆性提高的多突变体烟草。
第二、把技术方案看作一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明通过NtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应实验，表明NtAITRs基因编辑多突变体对ABA敏感性显著提高，说明NtAITRs功能丧失影响烟草对ABA的敏感性，而无需敲除所有NtAITRs即可显著提高烟草对ABA的敏感性。
本发明通过干旱对NtAITRs基因编辑四及五突变体的影响进行实验，表明其在耐干旱性上具有明显改善，说明无需敲除所有NtAITRs基因就可以显著提高烟草的抗逆性。
第三、作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在本发明的技术方案在生产上极易实现，具有广阔的商业价值。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本公开的实施例，并与说明书一起用于解释本公开的原理。
图1是本发明实施例提供的非转基因的多突变体的构建方法；
图2是本发明实施例提供的NtAITRs的氨基酸序列比对图；
图3是本发明实施例提供的NtAITRs是ABA响应基因图；
图4是本发明实施例提供的.NtAITRs是转录抑制子图；
图5是本发明实施例提供的NtAITRs基因编辑多突变体的构建选用的靶序列、载体实验及多突变体中基因编辑情况图；
图6A是本发明实施例提供的NtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应中ABA对NtAITRs基因编辑多突变体种子萌发率的影响图；
图6B是本发明实施例提供的NtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应中对照板上NtAITRs基因编辑多突变体绿苗的情况图；
图6C是本发明实施例提供的NtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应中ABA对NtAITRs基因编辑多突变体绿苗率的影响图；
图6D是本发明实施例提供的NtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应中ABA板上NtAITRs基因编辑多突变体绿苗的情况图；
图7A是本发明实施例提供的干旱对NtAITRs基因编辑四及五突变体的影响中进行干旱处理前幼苗效果图；
图7B是本发明实施例提供的干旱对NtAITRs基因编辑四及五突变体的影响中进行干旱处理20天后效果图；
图7C是本发明实施例提供的干旱对NtAITRs基因编辑四及五突变体的影响中复水5天后效果图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其他方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一、解释说明实施例：
实施例1
本发明实施例提供一种NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后在提高烟草抗逆性上的应用。
在一优选实施例中，所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后获得多个非转基因的多突变体，用于提高烟草抗逆性。
所述NtAITRs转录因子家族基因的DNA被切断后，随机将一个或多个核苷酸进行插入或缺失，获得多个非转基因的多突变体，即如图5中的C所示,因为多个基因被编辑，所以获得了多个多突变体，因为基因编辑的原理就是DNA被切断后随机修复会引入突变，而多突变体中NtAITRs基因编辑方式均为1个或多个核苷酸的插入或缺失，都造成了氨基酸序列的变化。
本领域技术人员可知，在本申请NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后获得多个非转基因的多突变体技术启示下，任何可能在SEQIDNO：1～SEQIDNO：8的核苷酸中进行基因编辑获取的多突变体，均可落入本申请保护范围内。
实施例2
在本发明实施例中，所述多突变体包括但不限于一个四突变体和两个五突变体，均用于提高烟草抗逆性。一个四突变体和两个五突变体中基因编辑及氨基酸序列变化如图5中的C所示。
实施例3
在本发明实施例中，所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后在调控烟草非生物胁迫中的应用。
在一优选实施例中，所述非生物胁迫包括但不限于干旱胁迫。
本领域技术人员可知，在本申请调控烟草种子非生物胁迫中的应用技术启示，与烟草非生物胁迫有关的胁迫条件，均落入本申请保护范围内。
实施例4
如图1所示，本发明实施例提供一种非转基因的突变体的构建方法包括以下步骤：
S101，NtAITRs基因靶序列的位置选取：将NtAITRs转录因子家族基因的外显子核苷酸序列用于靶序列分析，选取多个靶序列，每个靶序列至少靶向NtAITRs转录因子家族基因中的两个；所述NtAITRs转录因子家族基因包括序列为SEQIDNO：1～SEQIDNO：8的核苷酸；序列为SEQIDNO：1～SEQIDNO：8的核苷酸编码的蛋白氨基酸序列分别为SEQIDNO：9～SEQIDNO：16；
S102，选取的多个靶序列搭载在CRISPR/Cas9载体上，利用pHEE进行构建，并加入能促进植物早花的FT基因表达框作为非转基因突变体的筛选标记；
S103，进行烟草转化筛选获得多个多突变体。
在一优选实施例中，在步骤S101中，多个靶序列核苷酸序列包括但不限于：
SEQIDNO：17～SEQIDNO：20。
实施例5
本发明发现烟草中共有8个基因编码NtAITRs，其基因表达受到植物激素脱落酸的(ABA)的诱导，其氨基酸序列高度同源，具有转录抑制活性。
如图2NtAITRs的氨基酸序列比对所示。利用BioEdit软件对NtAITRs的全长氨基酸序列进行比对。相同的氨基酸用黑色表示，相似的用灰色表示。下划线表示部分保守的LxLxL抑制基序。
由图2可知，8个NtAITRs转录因子编码蛋白的氨基酸序列高度同源，氨基酸序列一致性为33.9％-93.9％。
实施例6
如图3所示，为探究NtAITRs对ABA响应，本发明实施例进行如下步骤：对生长两周的烟草幼苗分别用50μM ABA黑暗处理4小时，甲醇为对照。提取RNA后进行反转录成cDNA，用于RT-PCR检测，NtGAPHD的表达量作为内参。
由图3可知，NtAITRs基因表达受到ABA的诱导。
实施例4
如图4所示，本发明实施例为利用拟南芥原生质体转染探究NtAITRs的转录抑制活性，进行如下步骤：
报告基因LexA-Gal4:GUS、激活子基因LD-VP和效应基因GD-NtAITRs质粒共转染拟南芥原生质体。转染后室温黑暗中培养20～22h，用酶标仪测定GUS酶活性，以GD共转染为对照作为对照。数据表示三次重复的平均值±标准差。
由图4可知，NtAITRs具有转录抑制活性。
实施例7
图5为非转基因的突变体的构建方法原理，获得NtAITRs基因的编辑敲除后多突变体。
其中，图5中A为NtAITRs基因靶序列的位置。将NtAITRs的外显子核苷酸序列用于靶序列分析(https://cctop.cos.uni-heidelberg.de/species.html)，选取4个靶序列，每个靶序列至少靶向两个基因。
图5中B为靶向NtAITRs基因的CRISPR/Cas9载体结构示意图。载体系用pHEE构建(可通过现有技术)，并加入了能够促进植物早花的FT基因表达框(可通过现有技术获取)，便于缩短材料的获取时间，并作为筛选非转基因突变体的标记。
图5中C为所获得3个多突变体中NtAITRs基因编辑方式(左)及对应的氨基酸序列(右)。多突变体系用上述载体转化K326野生型烟草后筛选获得。核苷酸序列中最后3个核苷酸为PAM位点。数字在核苷酸序列中表示其在CDS中的相对位置，在氨基酸序列中表示其在全长氨基酸序列中的相对位置。
由图5可知，经构建筛选获得了一个四突变体及两个五突变体。
在本发明上述实施例中，涉及的基因序列以及氨基酸序列如下：
SEQIDNO：1
NtAITRs基因的CDS及其编码的氨基酸序列(括号内为基因的Locus number)
NtAITR1(LOC107760464)
ATGGACGGTGGAAATGGTTGGCCCGCCGCTAGATACGCCGGTGGACCGCAGGATACGACGATAAAGAACCGGATAATGCTAAGATTCCGACCGATCGCACCTAAACCGGTCGCCGGGGGTTCATCTCCTGGTTCAACACCGGAAGGAAACAAGATAGAACTTGTTACCAAACGAAGAGTCAAAAGAAAGTACGTTAGAGTTAAGAAAAATAGCAAGTTCAAAAGTAACAAAGAAGAAGAAGGAGAAAAGGACGGATCCTTACAGTTTACTGATAGTCAAACTGTTTTAACCCTTCAGTTGATGCCTGAAAGCAGTAGCAGCGTTAAGAACTCTTTAGAAAATATCGGATCTAGACCTTTTTGGATGAATTTTCAGAAACCGGAGAATAACGATGTTTTAACAGAAGGATCAGTGGATCGGATAGATCGGACGGTGGAGATACAGAAGAAAAGGGTTATAGAGTCATGGGTGATGGTGGATAAAATGACAAACACGTTGGTAGATGGAGAAGCGTTAGGGAGTACGGACATGGATAAGATGAAGAATCTGGAAGCTGACACGTGTCCAGGGCTCATATCGGACGGCTTAGATAGGGTTCAGTGGGTGAATCTGACGTATAGGAGATTGGTTGATCCTCTAGAAGGGTCTGGAACGCCGCCGGAGCTGGTGACGTGGCTGGTAGTGAAGGAGAAAATAAATTTGCCTTCTTCTTTGCCAGCTTTTGCATGCACTGTAAGGATACTGTATATGAAGCACTCACAGACAATGCCGTGTGATGTGTGGAAGATGGATTTTGGAGGATTATTTGCATGGAGATTTGATGCTAAAGCTGCACTTAGTTTGGGTCGTTGA。
SEQIDNO：9
MDGGNGWPAARYAGGPQDTTIKNRIMLRFRPIAPKPVAGGSSPGSTPEGNKIELVTKRRVKRKYVRVKKNSKFKSNKEEEGEKDGSLQFTDSQTVLTLQLMPESSSSVKNSLENIGSRPFWMNFQKPENNDVLTEGSVDRIDRTVEIQKKRVIESWVMVDKMTNTLVDGEALGSTDMDKMKNLEADTCPGLISDGLDRVQWVNLTYRRLVDPLEGSGTPPELVTWLVVKEKINLPSSLPAFACTVRILYMKHSQTMPCDVWKMDFGGLFAWRFDAKAALSLGR。
SEQIDNO：2
NtAITR2(LOC107761277)
ATGAGACAGAGCTCTTCAACAGGTATGGATGTTGGGGATGGTGGGCCCTCCGATGGATGCCACGTTGGACCTTATGATACGACGATAATGAACCGGATAATGTTAAGATTCCGGCCGATTGCGCCGAAACCTGTTGCCGACGGTTCAGGTCCTGGTTCTAAACCGAAGAGTGAAAAGGCTGAACCGGTCAGCAAACGGAGAGGGAAGAGAAAGTACGTTAGAGTTAAGAAAAGTAGGAAGTGTACTAACAATAGTACAGAGAAAGAAGAAAGAAAATTAGATGGATCTTTGAAGAAGTTTAATGATAATGGAAGTGTAGTAACTCTTCAGCTACTACCGGAAAGTAGCAGCAGCACTACTAACCTTCCAGATAATGGATCTTTTCAAAAGGAAATCACTTTCTCTGAGCTAGATCTGAAGGTGGCTATGGAGACACCAAAAATGGTAGAATCTTGGGTGATGGTGGAAGGTATGACAAAAATGTTTGTAGATCGAGAAGCTTTAGGAAGTACAGATACAGAGAAGATGAAGAATCTAGAGAAAGACACCTGTCCAGGGTTGATATCTGATGCCCTAAATAGGGTTCAGTGGGTGAATCCGGCATACCGGAGAATGGTGAATCCTCTAGAAGGCGGAGGAGCACCGGCGAAGATGGTGGTGAGGTTGGTTGTGAGGAAGGAGGAAAAAAGTGAAGAGTTGCCAAATTTTGCATGCACTGTGAGGGTAGTGTATACATTGAAGAATAAGAACTCACAAACAATACCCTGTGATGTGTGGAAGATGGAGTTTGGAGGATTTGCATGGAGGCTTGATACTAAGACTGTACTTAGATTGGGTTGTTAA。
SEQIDNO：10
MRQSSSTGMDVGDGGPSDGCHVGPYDTTIMNRIMLRFRPIAPKPVADGSGPGSKPKSEKAEPVSKRRGKRKYVRVKKSRKCTNNSTEKEERKLDGSLKKFNDNGSVVTLQLLPESSSSTTNLPDNGSFQKEITFSELDLKVAMETPKMVESWVMVEGMTKMFVDREALGSTDTEKMKNLEKDTCPGLISDALNRVQWVNPAYRRMVNPLEGGGAPAKMVVRLVVRKEEKSEELPNFACTVRVVYTLKNKNSQTIPCDVWKMEFGGFAWRLDTKTVLRLGC。
SEQIDNO：3
NtAITR3(LOC107767518)
ATGGACGGTGGAAATGGTTGGCCAGCCGCTAGATACGCCGGTGGACCGCAGGATACAATGATAATGAACAATATAATGCTAAGATTCCGACCGATCGCACCTAAACCGGTCGCCGGGGGTTCATCTCCTGGTTCAACACCGGAAGGAAACAAGATAGAACTTGTTACCAAACGAAGAGTCAAAAGAAAGTACGTTAGAGTTAAGAAAAATAGCAAGTGCAAAAGTAACAAAGAAGAAGGAGAAAAGGACGGATCCTTACAGTTTACTGATAGTAAAACTGTTTTAACCCTTCAGTTGATGCCTGAAAGCAGCAGCAGCGTTAAGAACTCTCTAGAAAATATCGGATCTAGACCTTTTTGGATGAATTTTCAGAAATCGGAGAATAACGATGTTTTAGCCGTAGGATCAGTGGATCAGATAGATCGGACGGTGGAGATGCAGAAGAAAAGGGTTATAGAGTCATGGGTGATGGTGGATAAAATGTCAAACACGTTGGTAGATGGAGAAGCGCTAGGGAGTACGGACATGGAGAAGATGAAGAATTTGGAAGCTGACACGTGTCCAGGGCTCATATCAGACGGCTTAGATAGGGTGCGGTGGGTGAATCTGGCGTATAGGAGATTGGTGGATCCTCTAGAAGGTTCTGGAACACCGCCGGAGCTGGTGACGTGGCTGGTTGTGAAGGAGAAAATAAATTTGCCTTCTTTGCCAGCTTTTGCATGCACTGTAAGGATACTGTATATGAAGCACTCACCGACAATGCCGTGTGATGTGTGGAAGATGGATTTTGGAGGATTATTTGCATGGAGATTTGATGCTAAAGCTGCACTTAGTTTGGGTCGTTGA。
SEQIDNO：11
MDGGNGWPAARYAGGPQDTMIMNNIMLRFRPIAPKPVAGGSSPGSTPEGNKIELVTKRRVKRKYVRVKKNSKCKSNKEEGEKDGSLQFTDSKTVLTLQLMPESSSSVKNSLENIGSRPFWMNFQKSENNDVLAVGSVDQIDRTVEMQKKRVIESWVMVDKMSNTLVDGEALGSTDMEKMKNLEADTCPGLISDGLDRVRWVNLAYRRLVDPLEGSGTPPELVTWLVVKEKINLPSLPAFACTVRILYMKHSPTMPCDVWKMDFGGLFAWRFDAKAALSLGR。
SEQIDNO：4
NtAITR4(LOC107770126)
ATGGACATCGAAAACAATTGGGCCGGCCCAGAATACTCAGGCGCACCAAAAGATATGACAATAATCAACAAGATGATGCTAAGATTCCGGCCGATTGCGCCGAAACCCGTCGCTAATTCTTCAGGCTCTGGCTCTACGATCGAGACTCACGAGATTGAAGTGGTTAGCAAAAGAAGAACAAAGAGAAAGTACGTTAGAGTTAAGAAAAATAGCAACTACAAGAATAAAAAAGAAGACAAAGAAACAAAAGATGGATCCTTAGTTTTGGATGATCATGGAACAGTTGTAACACTACAACTACTGCCAGAAAGTAGTGGAGGAGTTAAACGCTCACCAGATAACAGATCTTTCCCAAAAACCATCAATTTTTGGATGAATTTTGATAAATCTGAGAATATCGATATTTTATCAATCGGTGCACCGAATCTGTTAGATCGGACGGCGGAGATGCGATCTGCGAAGGTAGTGGAGTCATGGGTGATGGTTGATGGTATAACAAACACTTTGGTAGATTTATCAGCCTTAGGAAGTACGGATACGGAGAAGATGAAGAATCTGGAAGCTGACACGTGTCCAGGTATGATATCGGACGGCTTAGATAGGGTACAGTGGGTGAATCTAGCGTATCGGAGAATGATAGATCCGTTAGAAGACGGAGGAGCGCCGCCGGAGATGGTGGTGAGGTTAGTTTTGAAGGAGAAAAAAACTGTACGATTATCAGCTTTTGCATGCACTGTGAGAGTTGTTTATACAATGAATAAGGTGAAACAGACAAGGACAATGCCTTGTGACGTGTGGAAGATGGATTTTGGAGGATTTGCATGGAGATTTGATGCTAAGGCTGCACTTACTTTGGGGATTTGA。
SEQIDNO：12
MDIENNWAGPEYSGAPKDMTIINKMMLRFRPIAPKPVANSSGSGSTIETHEIEVVSKRRTKRKYVRVKKNSNYKNKKEDKETKDGSLVLDDHGTVVTLQLLPESSGGVKRSPDNRSFPKTINFWMNFDKSENIDILSIGAPNLLDRTAEMRSAKVVESWVMVDGITNTLVDLSALGSTDTEKMKNLEADTCPGMISDGLDRVQWVNLAYRRMIDPLEDGGAPPEMVVRLVLKEKKTVRLSAFACTVRVVYTMNKVKQTRTMPCDVWKMDFGGFAWRFDAKAALTLGI。
SEQIDNO：5
NtAITR5(LOC107791551)
ATGGATGGTAGAGGAGGGTGTTGTATTGCTAGGTACGCAGGGGGTGGTGCGTACGATATGTCAAAAGTGGACCGGATTATGCTCAGATTCAGACCCATCGCTCCTAAACCAGCCGCTGGTGGGTCTGTTTCCGGTGCTTCTACTCCGCCACAAAAGACTGAGGTTCCTGTTCGTACGGGTCGGTGGAAACGAAGGTACGTCAAAGATAATAAAAGTAGTACTAGTAGCTCTAACAAGAGGTCTAGTAGTGGAAGTCGTAGTCCTGCTGGTCGAAAAAGGAAGGCACCTTCGCCTGAGGAAAATGAGTCCAACGGTAAGACTGTATCTGGTGGTACAGTTTCTGGGGGCCAAGCGGTAGTTACCTTACCCTTATTATCCGAGTCTCCTGAAAGGAAGGGTTCTCCTGTCGATCATTCAGTAGGTTTTGTGATAAAACCAGAAAAATATGCTCCGATATGGTTAAACTTTGGTAGCCAAGGGAATAATAATAATGATAATAGTCTGTTGCAGGGTTACGGAGGGGTTGGTATGGATCGTTCAGTAGTGATGTTGCCTCAGCCAGTAAGGGTAGTGGGGTCATGGGTAAAGGTGGAAAGCGTGACTGACGCGTGGGCGGAAGGGTATGGGCTAGGACGTACGGATGAGGACAAACTGGTGAATCTAGAGCGGGACAGCTGTCCAGGGTTTGTATCAGACGGTTTAAACAGAGTTAGGTGGGCCAATAGGGCGTACAAGGAGATGGTAAGTGAGGGAGGCGTAGCAGAGGGGGAAGTTGTTGTTTGGCTGGTGATGAAAGAAGATCTACGGCTGCCGGAAAGCAAAAACACGGCGGCGTTCACGTGCCGGGTTAGGGTTATCAAAAGCGGGAAGGAGAAAAACTCACTGATTCTGCCGTGTGATGTGTGGAGAATGGACGGCGGAGGATATGCATGGAGGTTGGATACAAAGGCAGCTCTCTCTTTGGGCCGGTAG。
SEQIDNO：13
MDGRGGCCIARYAGGGAYDMSKVDRIMLRFRPIAPKPAAGGSVSGASTPPQKTEVPVRTGRWKRRYVKDNKSSTSSSNKRSSSGSRSPAGRKRKAPSPEENESNGKTVSGGTVSGGQAVVTLPLLSESPERKGSPVDHSVGFVIKPEKYAPIWLNFGSQGNNNNDNSLLQGYGGVGMDRSVVMLPQPVRVVGSWVKVESVTDAWAEGYGLGRTDEDKLVNLERDSCPGFVSDGLNRVRWANRAYKEMVSEGGVAEGEVVVWLVMKEDLRLPESKNTAAFTCRVRVIKSGKEKNSLILPCDVWRMDGGGYAWRLDTKAALSLGR。
SEQIDNO：6
NtAITR6(LOC107804873)
ATGGATGGTAGAGGAGGGTGTTGTATTGCTAGGTACGCAGGGGGTGGTGCGTACGATATGTCAAAAGTGGACCGGATAATGCTCAGATTCAGACCCATCGCTCCTAAACCAGCCGCTGGTGGGTCTGTTTCCGGCGCTTCTACTCCTCCACAAAAGACTGAGGCTCCTGTTCGTACGGGCCGTTGGAAGCGAAGGTACGTTAAAGATAATAAAAACACTAGTAGCACTTCTAACAAGAGATCTAGTAGCGGAAGTCGTAGTCCTAGTGGTAGAAAAAGGAAGGCATCTTCACCTGAGGAAAATGAGTCCAACGGTAAGACTGTATCTGGTGGGCAAGCTGTAGTTACCTTACCCTTATTATCAGAGTCTCCTGAACGGAAGGACTCTCCTGGCGATCATTCAGTAGGTTTGGTGAAAAAACCAGAAAAATATACTCCGATCTGGTTAAACTTTGGTAGCCAAGGGAATAGTAATGATAATAGTCAGTTGCAGGGTTACGGAGGGGTTGGTATGGATCGTTCAGTACTTATGTTGCCTCAGCCAGTAAGGGTAGTGGGGTCATGGGTAAAGGTGGAAAGCGTGACTGACGCGTGGGTAGAAGGGTATGGGCTAGGACGTACAGATGAGGAGAAACTGGTAAATCTAGAGCTGGACAGCTGTCCAGGGTTTGTATCAGACGGTTTAAATAGAGTTAGGTGGGCCAATAAGGCGTACAAGGAGATGGTGAGCGAGGGTGGCGTAGCAGAAGGAGAAGTGGTTGTTTGGCTGGTGATGAAAGAAGATCTACGGCTGCCGGAGAACAAAAACACGGCTGCGTTCACGTGCCAGGTTAGGGTGATTAGAAGTGGGAAGGAGAAAAACTCGCTGATTCTGCCGTGTGATGTGTGGAGAATGGACGGTGGCGGATATGCATGGAGGTTGGATACAAAGGCAGCTCTCTCTTTGGGCCGGTAG。
SEQIDNO：14
MDGRGGCCIARYAGGGAYDMSKVDRIMLRFRPIAPKPAAGGSVSGASTPPQKTEAPVRTGRWKRRYVKDNKNTSSTSNKRSSSGSRSPSGRKRKASSPEENESNGKTVSGGQAVVTLPLLSESPERKDSPGDHSVGLVKKPEKYTPIWLNFGSQGNSNDNSQLQGYGGVGMDRSVLMLPQPVRVVGSWVKVESVTDAWVEGYGLGRTDEEKLVNLELDSCPGFVSDGLNRVRWANKAYKEMVSEGGVAEGEVVVWLVMKEDLRLPENKNTAAFTCQVRVIRSGKEKNSLILPCDVWRMDGGGYAWRLDTKAALSLGR。
SEQIDNO：7
NtAITR7(LOC107815750)
ATGGATGTTGAGAATAGTGGGCCCTCCTATGGATGCCACGTTGGACCACAAGATAGGATGATAATGAACCGGATAATGTTAAGATTCCGGCCGATTGCACCGAAACCGGTCGCCGACGGTTCAGGTCCGGGTTCTAAACCGGAGAATGAAAAGGCAGAACCGGTTAGCAGACGAAGAGGGAAGAGAAAGTACGTTAGAGTTAAGAAAAATAGGAAGTGTAAGAATAGTGCAGAGAAAGAAGAAAGAAAAGATGGATCTGATAATAATGGATCTATTGTAACCCTTCAGTTACTTCCGGAGAGTAGCAGCAGTGTTACAAACCCGACAGATAACGTTTCTTTTCAAAAAGAAATCTCTTTCTCTGAGCTAGATCAACCCCAATGGATGAGTTTTCATGAATATGATAATAATGGTATATCCGCCTTCAGTTCAACGGATCGGTTAGATCTGAAGGTGACAACGCAGACACCAAGAATGGTAGAGTCTTGGGTGATGGTGGATAGAATAACAAACATATTTGTGGATAGTGAAGGCTTAGGAAGTACGGACATGGAGAAAATGAAGAATCTGGAGACGGACACGTATCCAGGGCTCGTGTCGGATAGCTCAGATAGGGTGCGGTGGGTGAATCCGGCGTACCGGAGAATGGTGAATCCTCTAGAAGACGGAGGAGTGACGGCGGAGATGGTGGTGAAGATGGTTGTGAAGGAGAAAATAAGAGAGGAAGAATTACCTGCAGCTTTTGCATGCATTGTGAGGTTAGTGTATACATGGAAGAATAAGAAAAACTCACGAACAATGCCTTGTGATGTGTGGAAAATGGAGTTTGGAGGGTTTGCATGGAGGTTTGATTCTAATGCTGCACTTAGCTTGGGTCGTTAA。
SEQIDNO：15
MDVENSGPSYGCHVGPQDRMIMNRIMLRFRPIAPKPVADGSGPGSKPENEKAEPVSRRRGKRKYVRVKKNRKCKNSAEKEERKDGSDNNGSIVTLQLLPESSSSVTNPTDNVSFQKEISFSELDQPQWMSFHEYDNNGISAFSSTDRLDLKVTTQTPRMVESWVMVDRITNIFVDSEGLGSTDMEKMKNLETDTYPGLVSDSSDRVRWVNPAYRRMVNPLEDGGVTAEMVVKMVVKEKIREEELPAAFACIVRLVYTWKNKKNSRTMPCDVWKMEFGGFAWRFDSNAALSLGR。
SEQIDNO：8
NtAITR8(LOC107829869)
ATGGACGTCGGAAACAATTGGGCCGGGTCTGGCTACCCCGGTGCACCTAAAGATATGACGATAATCAACAAGATGATGCTAAGATTCCGGCCGATTGCGCCGAAGCCCGTCGCTAATTCTTCGGGCTCTGGCTCTACGATCGAGACTCATAAGATTGAAGTGGTTAGCAAAAGAAGAACAAAGAGAAAGTACGTTAGAGTTAAGAAAAATAGCAATTACAAGAATAAAAAAGAAAACAGAGAAAAAAAAGAAGGATCTTTAGTTTTGGATGATCATGGAACTATTGTAACACTTCAGCTACTGCCAGAAACTAGTGGAGGAGTTAAAAACTCACCAGAGAACAGATCTTACCCAAAAACCATCAATTTTTGGATGAATTTTGATAAATCTGAGAACAACGATATTTTATCAGTCGGTGCACCGAATCTGTTAGATCAGACGGTGGAGATGCGATCTGCCAAGGTAGTGGAGTCATGGGTGATGGTTGATGGTATAACAAATACTTTGGTAAGTTTATCAGCCTTAGGAAATACGGATACGGAGAAGATGAAGAATCTGGAAGCTGACACGTGTCCAGGACTCATATCGGACGGCTTAGATAGGGTACAGTGGGTGAATCTAGCGTATCGGAGAATGATAGATCCGTTAGAAGACGGCGGAGAGCCACCGGAGATGGTGGTGCGGTTAGTTTTGAAGGAGAAAAAAACTGTACCATTATTATTATTACCAGCTTTTGCATGCACTGTGAGAGTTGTGTATACAATGAATAATGTGAAGCAGACAAGGACAATGCCTTGTGACGTGTGGAAGATGGATTTTGGAGGATTTGCATGGAGATTTGATGCTAAAGCTGCACTTAGTTTGGGGATTTGA。
SEQIDNO：16
MDVGNNWAGSGYPGAPKDMTIINKMMLRFRPIAPKPVANSSGSGSTIETHKIEVVSKRRTKRKYVRVKKNSNYKNKKENREKKEGSLVLDDHGTIVTLQLLPETSGGVKNSPENRSYPKTINFWMNFDKSENNDILSVGAPNLLDQTVEMRSAKVVESWVMVDGITNTLVSLSALGNTDTEKMKNLEADTCPGLISDGLDRVQWVNLAYRRMIDPLEDGGEPPEMVVRLVLKEKKTVPLLLLPAFACTVRVVYTMNNVKQTRTMPCDVWKMDFGGFAWRFDAKAALSLGI。
SEQIDNO：17
GCACCTAAACCGGTCGCCGGGGG；
SEQIDNO：18
GCTCCTAAACCAGCCGCTGG TGG；
SEQIDNO：19
GCCGTGTGATGTGTGGAAGATGG；
SEQIDNO：20
GCCGTGTGATGTGTGGAGAATGG；
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述或记载的部分，可以参见其它实施例的相关描述。
二、应用实施例：
应用例1
本发明应用例提供一种所述用于调控烟草抗逆性NtAITRs转录因子家族基因在调控烟草抗逆中的应用。
所述抗逆境胁迫为非生物胁迫，所述非生物胁迫包括干旱胁迫。
所述应用还包括：通过对所述的用于调控烟草抗逆性NtAITRs转录因子家族基因敲除，获得多个非转基因的多突变体包括一个四突变体及两个五突变体，提高烟草抗逆性。
应用例2
本发明应用例提供一种所述NtAITRs基因编辑突变体的构建筛选方法在非转基因烟草多突变体植株筛选上的应用。
三、实施例相关效果的证据：
实验1
为了探究本发明实施例提供的NtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应，本发明进行如下实验:
图6ANtAITRs基因编辑四及五突变体对ABA的响应中ABA对NtAITRs基因编辑突变体种子萌发率(在对照板上的绿苗情况(Control)的影响图。将K326野生型(Wild type)、在ntaitr1236-c1突变体筛选过程中分离出的野生型(Wild type-I)及3个多突变体播种于含2μMABA的1/2MS培养基上，低温纯化后转移至培养室中，在转移后不同时间统计种子萌发数，并计算萌发率。
图6B NtAITRs基因编辑多突变体对ABA的响应中对照板上NtAITRs基因编辑多突变体绿苗情况。种子萌发实验结束后拍照。
图6C NtAITRs基因编辑多突变体对ABA的响应中ABA对NtAITRs基因编辑多突变体绿苗率的影响。种子萌发实验结束后统计绿苗数，并计算绿苗率。
图6D NtAITRs基因编辑多突变体对ABA的响应中对ABA处理板上NtAITRs基因编辑多突变体绿苗(在ABA板上的绿苗)情况。种子萌发实验结束后拍照。
结果说明NtAITRs基因编辑多突变体对ABA的敏感性升高，并且说明不需要敲除所有NtAITRs基因就能够显著提高烟草对ABA的敏感性。
实验2
为了探究干旱对NtAITRs基因编辑多突变体的影响，本发明进行如下实验:
将K326野生型(Wild type)、在ntaitr1236-c1突变体筛选过程中分离出的野生型(Wildt ype-I)及3个多突变体播种于土中，萌发后10天进行干旱处理，处理20天后进行复水。其中，图7A是本发明实施例提供的干旱对NtAITRs基因编辑多突变体的影响中进行干旱处理前幼苗情况图；
图7B是本发明实施例提供的干旱对NtAITRs基因编辑多突变体的影响中进行干旱处理后效果图；
图7C是本发明实施例提供的干旱对NtAITRs基因编辑多突变体的影响中复水5天后效果图。
上述结果说明，NtAITRs基因编辑多突变体对干旱的抗性提高，并且说明不需要敲除所有NtAITRs基因就能够显著提高烟草的抗旱性。
以上所述实验例，仅为本发明较优的具体的实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后在提高烟草抗逆性上的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后获得多个非转基因的多突变体，用于提高烟草抗逆性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述NtAITRs转录因子家族基因的DNA被切断后，随机将一个或多个核苷酸进行插入或缺失，获得多个非转基因的多突变体。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多突变体包括但不限于一个四突变体和两个五突变体，均用于提高烟草抗逆性。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NtAITRs转录因子家族基因编辑敲除后在调控烟草种子非生物胁迫中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述非生物胁迫包括但不限于干旱胁迫。
7.一种非转基因的突变体的构建方法，其特征在于，所述非转基因的多突变体的构建方法包括以下步骤：
S1，NtAITRs基因靶序列的位置选取：将NtAITRs转录因子家族基因的外显子核苷酸序列用于靶序列分析，选取多个靶序列，每个靶序列至少靶向NtAITRs转录因子家族基因中的两个；
S2，选取的多个靶序列搭载在CRISPR/Cas9载体上，利用pHEE进行构建，并加入能促进植物早花的FT基因表达框作为非转基因突变体的筛选标记；
S3，进行烟草转化筛选获得多个多突变体。
8.根据权利要求7所述的非转基因的多突变体的构建方法，其特征在于，在步骤S1中，多个靶序列核苷酸序列包括但不限于SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20。
9.一种如权利要求7所述非转基因的突变体的构建方法在除烟草外非转基因管状花目植株构建筛选上的应用。
10.一种如权利要求7所述非转基因的多突变体的构建方法构建的对ABA敏感性提高、对耐干旱性具有改善的烟草非转基因的多突变体。
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