CN117778415A - HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用 - Google Patents
HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117778415A CN117778415A CN202410083865.2A CN202410083865A CN117778415A CN 117778415 A CN117778415 A CN 117778415A CN 202410083865 A CN202410083865 A CN 202410083865A CN 117778415 A CN117778415 A CN 117778415A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- hvjaz2
- gene
- barley
- seq
- drought resistance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 47
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 title description 2
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 claims abstract description 45
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 7
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 15
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 abstract description 3
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 abstract description 2
- 101150038500 cas9 gene Proteins 0.000 abstract description 2
- 238000012214 genetic breeding Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 21
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000024346 drought recovery Effects 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N jasmonic acid Chemical compound CC\C=C/C[C@@H]1[C@@H](CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-HWKXXFMVSA-N 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 4
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 101150073246 AGL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000008641 drought stress Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 2
- ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N jasmonic acid Natural products CCC=CCC1C(CC(O)=O)CCC1=O ZNJFBWYDHIGLCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 2
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- 101100537118 Arabidopsis thaliana TIFY10B gene Proteins 0.000 description 1
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 101100459261 Cyprinus carpio mycb gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102100030667 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000732336 Homo sapiens Transcription factor AP-2 gamma Proteins 0.000 description 1
- 101000802094 Homo sapiens mRNA decay activator protein ZFP36L1 Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101150065635 MYC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 101150067543 TIFY5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 101100239644 Xenopus laevis myc-b gene Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100024723 Zinc finger protein 346 Human genes 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000009412 basement excavation Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000004790 biotic stress Effects 0.000 description 1
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000015784 hyperosmotic salinity response Effects 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000004069 plant analysis Substances 0.000 description 1
- 230000008121 plant development Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229910052902 vermiculite Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019354 vermiculite Nutrition 0.000 description 1
- 239000010455 vermiculite Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用。本发明提供了一种序列如SEQ ID NO.2所示的新基因HvJAZ2，并通过向受体材料中导入cas9:HvJAZ2基因编辑载体，成功敲除HvJAZ2，利用该材料证实了HvJAZ2基因的负调控作用可以有效地提高大麦苗期抗旱性，因此在大麦苗期抗旱性的遗传改良上有广阔的应用前景，并且创制的大麦种质资源为作物改良提供了种质资源，在大麦适应和遗传育种中具有一定的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用。
背景技术
大麦(Hordeum vulgare L.)是全球广泛栽培的主要禾谷类作物，其种植面积和总产量仅次于水稻、小麦和玉米。大麦用途广泛，主要用作饲料和酿造，少量食用。大麦种植区域广，生长生态环境迥异，在生长发育过程中时常遭受各种生物与非生物胁迫。其中，高频率和高强度的干旱是制约大麦生产的最主要因素之一。干旱胁迫不仅降低大麦产量，并导致品质恶化。培育与推广抗旱品种是稳定与提高缺水干旱环境下大麦产量的最有效途径，挖掘与利用耐旱基因是培育耐旱大麦品种的重要基础。
JASMONATE ZIM-DOMAIN(JAZ)蛋白属于TIFY(Zinc-finger expressed ininflorescence meristem)超家族的一个亚家族，该家族所有成员因存在ZIM(最初命名为在花序分生组织中表达的锌指蛋白)结构域内高度保守的TIF[F/Y]XG基序而得名。JAZ蛋白除了在中间区域都含有一个27个氨基酸的ZIM结构域外，C末端附近还含有一个核定位信号的Jas结构域。JAZ家族仅存在于植物中，参与植物发育、非生物胁迫和植物激素反应的调控。对jaz多倍突变体(即多个JAZ基因缺陷)的分析表明，JAZs敲除或沉默越多，植物对JA-Ile的敏感性越强(Campos et al.2016；Guo et al.2018)。在拟南芥中，JAZ蛋白可以通过与MYC2的互作，抑制ERF1对其下游GCC-box、DRE-box以及DRE/C-repeat genes的转录激活活性，从而影响植株对干旱、盐渍和高温的耐性(Kazan 2015)。水稻中也已有报道，JAZ成员通过调节JA和ABA信号传导而降低抗旱性(Fu et al.2019)。
发明内容
本发明的目的在于提供HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用。
具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供了HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用，所述HvJAZ2基因的转录本cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述HvJAZ2基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述应用的途径为：通过破坏HvJAZ2基因的功能，以提高大麦苗期抗旱性。
进一步地，所述破坏的方法为敲除大麦的HvJAZ2基因。
本申请的发明人在对大麦极端耐旱和极端旱敏感材料的转录组分析中鉴定到一个响应干旱胁迫的大麦茉莉酸ZIM结构域蛋白基因(HvJAZ2)，进一步通过CRISPR/Cas9敲除，验证了该候选基因的功能，发现敲除该基因后大麦苗期的耐旱性显著提高。
本发明克隆得到一个新的大麦茉莉酸ZIM结构域蛋白基因，命名为HvJAZ2，其转录本cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
第二方面，本发明提供了所述的基因在抗旱大麦育种中的应用。
第三方面，本发明提供了一种由HvJAZ2基因编码的蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
第四方面，本发明提供了所述的编码蛋白在提高大麦苗期抗旱性中的应用。
第五方面，本发明提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌包括编辑HvJAZ2基因的CRISPR/Cas9载体；所述HvJAZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
第六方面，本发明提供了所述的基因工程菌在提高大麦苗期抗旱性中的应用，包括以下步骤：
(1)设计HvJAZ2基因的靶序列，构建CRISPR/Cas9载体；
(2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
(3)用步骤(2)所述基因工程菌转化大麦，最终获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合单突变体株系。
进一步地，所述靶序列包括HvJAZ2-sgF1、HvJAZ2-sgR1、HvJAZ2-sgF2、HvJAZ2-sgR2；所述HvJAZ2-sgF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述HvJAZ2-sgR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述HvJAZ2-sgF2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述HvJAZ2-sgR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明在所述SEQ ID NO.2序列的第41～63位和第76～98位设计sgRNA，构建敲除重组载体，成功敲除受体材料中HvJAZ2基因。并利用该材料证实了该基因的负调控作用可以有效地提高大麦苗期的耐旱性，因此在耐旱育种上有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种新基因HvJAZ2，公布了该基因的核苷酸序列，并通过向受体材料中导入cas9:HvJAZ2基因编辑载体，成功敲除HvJAZ2，利用该材料证实了HvJAZ2基因的负调控作用可以有效地提高大麦苗期抗旱性，因此在大麦苗期抗旱性的遗传改良上有广阔的应用前景，并且创制的大麦种质资源为作物改良提供了种质资源，在大麦适应和遗传育种中具有一定的应用价值。
附图说明
图1是HvJAZ2基因编辑材料的突变类型。(A)jaz2-1,2-2为sg1靶点的一个A碱基或C碱基的插入突变；(B)jaz2-3为sg2靶点的一个A碱基的缺失突变。
图2为基因敲除植株与野生型(Golden Promise,GP)苗期植株比较。(A)正常和干旱条件下基因敲除植株与野生型植株的比较；(B)植株干重比较；(C)植株含水量比较。WT表示野生型(Golden Promise,GP)植株；jaz2-1、jaz2-2和jaz2-3分别表示不同突变类型的JAZ2基因敲除转基因阳性植株；**表示敲除植株与野生型植株的差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
为了使本领域技术人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。应该指出，以下详细说明都是示例性的，且仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本发明实施例中所用的实验材料均为本领域常规的实验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法使按照常规实验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。
本发明中HvJAZ2基因的转录本cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；HvJAZ2基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示；HvJAZ2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
SEQ ID NO.1
TGCCCGCGAAACAGGAATTAGGCCTATTCTTTACTGGTCCAGCTGTACGCGCCCGCGAAAAGAGAGAGAGGCGGCCGAGACTTAACCCCCCGCCGGACGGACGCACACATACGTACCTCGGCGGGCACGGGCCTCGTCGGTTCCTTCCGCGCCAGATCGTTCGACTTCGACATGGGAGCGGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGGCCAAGGCCGCTGGCGGCAGCAGGTTGGCCGCGGCGTTTGGGCTGCTCCGGCAGTACATCAAGGAGCAGCCCGGCGGCGTGGTCACCATGGGCCTCATGCCGGGCGGCGGGGATGGTGTTCAGGCGGTGGCGTCGGAGGAGAGGATCCGGACCATGGAGCTCTTCCCCCAGCACGCCGGCATGGTCAGGGCCTCCCACGACAGGTACGTGCGCGCGCGCGCGCGAACTAGAGCTTCGATCGTGCCGGCCAGTCTTGCTCATGCCGGGAGACCGGAGCACGTCGTGAGCTCTTCGAAAATACTCGCTCCTGTTTGATGCTTGTGCTGTTTTTGATTAGGACGGGGCCTGAGAGAGCGCCGCTGACCATCTTCTACGGCGGGAGGACGGTGGTGTTCGACGACTTCCCCGCCGAGAAGGCCGGGGAGCTCATGCAGCTCGCCGGCTCCTTCATCGCGCCGCCGCCCGCCTCCGACGCCGCCGCCGAGCCCGTCTGCCAGAGCGCGCCGGGGCAGCCTTGGTTGGCAGGTAAGGATCGCGCTACGCTCGTATTATATTACAAATCAAAATCCATACTGTCCGTGCTCCGCTGACGAAGGCTTTGCGGCGTGCGCGCGCTTGTCCAGACCTGCCGATCGCGAGGAAGGCGTCGCTCCACAGGTTCCTCGAGAAGAGGAAGAGCAGGCTCGCCACGGTCGATCCGTACCCTGCGCCGTTGGCGGCGCCAGGGGCTGCGGCGGCCAAGGAGACGGCCGGCGGCAAGCGTGCGCCGGAAGACGGCGGCGCGCCGTGGCTCGGCGTCAACTCCGCGCTCCAGCTGAACTGAAGGATTTGACGAGCCCCGGAGAGGAATAAATCGCTGCCTTGCTGCTTCTCCACGTAGTAGCGTATACTGTAGTAGTAGTAGTACTCTGCTACGTGGATCCTTAATTGTTGCCGTTTTTATCTTACGCCCGCTAATTAACCGCGTGCCCCTGGGTAAATATATACCCTCGGCTAAGTAGTGGGGT。
SEQ ID NO.2
ATGGGAGCGGAGCAGCAGCAGCAGCAGCAGGCGGCCAAGGCCGCTGGCGGCAGCAGGTTGGCCGCGGCGTTTGGGCTGCTCCGGCAGTACATCAAGGAGCAGCCCGGCGGCGTGGTCACCATGGGCCTCATGCCGGGCGGCGGGGATGGTGTTCAGGCGGTGGCGTCGGAGGAGAGGATCCGGACCATGGAGCTCTTCCCCCAGCACGCCGGCATGGTCAGGGCCTCCCACGACAGGACGGGGCCTGAGAGAGCGCCGCTGACCATCTTCTACGGCGGGAGGACGGTGGTGTTCGACGACTTCCCCGCCGAGAAGGCCGGGGAGCTCATGCAGCTCGCCGGCTCCTTCATCGCGCCGCCGCCCGCCTCCGACGCCGCCGCCGAGCCCGTCTGCCAGAGCGCGCCGGGGCAGCCTTGGTTGGCAGACCTGCCGATCGCGAGGAAGGCGTCGCTCCACAGGTTCCTCGAGAAGAGGAAGAGCAGGCTCGCCACGGTCGATCCGTACCCTGCGCCGTTGGCGGCGCCAGGGGCTGCGGCGGCCAAGGAGACGGCCGGCGGCAAGCGTGCGCCGGAAGACGGCGGCGCGCCGTGGCTCGGCGTCAACTCCGCGCTCCAGCTGAACTGA。
SEQ ID NO.3
MGAEQQQQQQAAKAAGGSRLAAAFGLLRQYIKEQPGGVVTMGLMPGGGDGVQAVASEERIRTMELFPQHAGMVRASHDRTGPERAPLTIFYGGRTVVFDDFPAEKAGELMQLAGSFIAPPPASDAAAEPVCQSAPGQPWLADLPIARKASLHRFLEKRKSRLATVDPYPAPLAAPGAAAAKETAGGKRAPEDGGAPWLGVNSALQLN。
以下各实施例进行扩增时：
PCR反应体系(50μL)：25μL 2×Phanta Max Master Mix(Dye Plus)，各2μL上游和下游引物(10μM)，2μL cDNA(100ng/μL)，19μL灭菌双蒸水。
PCR程序：95℃预变性3min，(95℃变性15s，Tm-3℃退火15s，延伸72℃60s/Kb)35个循环,彻底延伸72℃5min。扩增产物纯化后送测序，留取部分备用。
实施例1HvJAZ2基因及其编码区的克隆
(1)HvJAZ2基因的克隆
大麦黄金希望(GP)发芽一周后，剪2cm左右叶片进行DNA提取。使用CTAB法提取DNA，得到GP基因组DNA备用；从植物基因组数据库(https://plants.ensembl.org/index.html)获得HvJAZ2基因序列；以GP基因组DNA为模板，使用2×Max MasterMix(Dye Plus)高保真DNA聚合酶(P525，Vazyme，中国)进行基因扩增。扩增引物为：
HvJAZ2-dnaF：5’-TGCCCGCGAAACAGGAATTA-3’
HvJAZ2-dnaR：5’-ACCCCACTACTTAGCCGAGG-3’
(2)HvJAZ2基因编码区的克隆
大麦GP发芽一周后，取整株苗液氮冷冻，备用。采用MiniBest植物RNA提取试剂盒(9769，Takara，日本)对提取大麦总RNA，提取步骤见参考说明书，操作过程中防止RNase污染；使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA)对提取的RNA进行纯度和浓度测定，测定后备用。使用RNA反转录试剂盒PrimeScripTMII 1st Strand cDNASynthesis Kit(RR037A，Takara，日本)，以总RNA为模板，进行第一链反转录DNA合成。根据HvJAZ2数据库参考序列设计引物，使用高保真DNA聚合酶扩增基因cDNA。扩增引物为：HvJAZ2-cdsF:5’-ATGGGAGCGGAGCAGCAGCAG-3’
HvJAZ2-cdsR:5’-TCAGTTCAGCTGGAGCGCGGAGT-3’。
实施例2敲除载体的构建与功能验证
(1)Cas 9:HvJAZ2基因编辑载体的构建
利用BsaIHF-V2限制性内切酶(R3733L，NEB，美国)对U6载体进行线性化处理，对酶切产物进行快速CIP去磷酸化处理(M0525V，NEB，美国)，防止载体自连；
使用在线网站(//skl.scau.edu.cn/targetdesign/)设计HvJAZ2基因的sgRNA靶位点，然后在网站(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)上进行脱靶检测，最后结合它们的靶点敲除位置和脱靶检测确定两个sgRNA序列，并设计靶点引物如下：
HvJAZ2-sgF1：5’-CTTGGCCAACCTGCTGCCGCCAG-3’
HvJAZ2-sgR1：5’-AAACTGATGTACTGCCGGAGCAG-3’
HvJAZ2-sgF2：5’-CTTGGCCAACCTGCTGCCGCCAG-3’
HvJAZ2-sgR2：5’-AAACCTGGCGGCAGCAGGTTGGC-3’
将靶点引物分别溶解于TE缓冲液，终浓度为100μM/L，利用PCR仪90℃退火1-2min；靶点引物退火产物加T4PNK(M0201S，NEB，美国)进行磷酸化处理；用T4连接酶(M0202L，NEB，美国)将U6线性化载体、退火磷酸化产物进行连接，获得Cas9-U6-HvJAZ敲除载体。将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态，使用引物5’-GCGATTAAGTTGGGTAACGC-3’及HvJAZ2-sgR1以及HvJAZ2-sgR2进行单克隆验证并测序，将序列正确的阳性克隆进行过夜培养抽提质粒，得到Cas9-U6-HvJAZ2载体。
(2)转基因植株的获取
将测序正确的敲除重组载体转化农杆菌AGL1，筛选阳性重组子，得到含敲除重组载体的AGL1农杆菌菌株。用农杆菌介导法将基因编辑载体转化至大麦Golden Promise幼胚中，经潮霉素筛选后，获得数十株转基因候选植株。再依次提取转基因候选植株和野生型GP的DNA，通过PCR扩增并测序验证方法获得转基因阳性植株，其中验证引物为JAZ2-yzF(5’-CGAAAAGAGAGAGAG GCGGC-3’)和JAZ2-yzR:(5’-TCAGGCCCCGTCCTAATCAA-3’)，扩增片段大小为498bp，繁种后，收获足量的转基因种子，T1代种子经阳性鉴定后可用于后续步骤。
(3)转基因植株分析
基因敲除共获得三种不同突变类型的转基因材料，如图1所示，即jaz2-1(在靶点1处有一个A碱基敲入)，jaz2-2(在靶点2处有一个C碱基敲入)和jaz2-3(在靶点2处有一个A碱基敲除)，且这三种突变类型均造成了基因氨基酸的改变。
对纯合转基因材料和野生型进行耐旱性评价，将配比为营养土：蛭石＝2:1的栽培土，填充进相同孔径和深度的32孔穴盆(每个穴孔上口径5.40cm、底部2.80cm、高11.00cm)，确保每个穴孔栽培土体积相同。将三种突变类型的转基因材料和野生型(Golden Promise，GP)材料播种在穴盘中，每穴孔播种1粒种子，每个基因型播种8粒。播种完成后确保栽培土浇水充足，并确保栽培环境温度与光照均一稳定。出苗后，每个基因型保留4株长势一致植株。播种后10天，停止浇水，开始干旱处理；停止浇水14天后,作为对照的野生型材料地上部出现明显萎蔫，此时进行地上部取样。将所取得地上部样品称量鲜重(Fresh Weight,FW)，之后于60℃烘箱中烘至恒重并称量干重(Dry weight,DW)，记录数据，并计算地上部含水量(Water Content,WC)，计算方式为：
WC＝(FW-DW)/FW。
结果如图2所示，可以看出，在正常供水条件下，野生型和HvJAZ2基因敲除的3个突变株系的地上部生长状态、干重和含水量均无显著差异，停止浇水14天后,作为对照的野生型材料地上部出现明显萎蔫；断水14天后，野生型地上部平均含水量下降到70.3％，而三个突变株系的含水量分别为85.3％、85.0％和82.2％，说明HvJAZ2基因负调控大麦耐旱性。因此，大麦中敲除HvJAZ2基因可以提高植株抗旱性。
Claims (9)
1.HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用，其特征在于：所述HvJAZ2基因的CDS序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述应用的途径为：通过破坏HvJAZ2基因的功能，以提高大麦苗期抗旱性。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述破坏的方法为敲除大麦的HvJAZ2基因。
4.如权利要求1所述的基因在抗旱大麦育种中的应用。
5.如权利要求1所述基因编码的蛋白，其特征在于：所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。
6.如权利要求5所述的编码蛋白在提高大麦苗期抗旱性中的应用。
7.一种基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌包括编辑HvJAZ2基因的CRISPR/Cas9载体；所述HvJAZ2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
8.如权利要求7所述的基因工程菌在提高大麦苗期抗旱性中的应用，其特征在于：包括以下步骤：
(1)设计HvJAZ2基因的靶序列，构建CRISPR/Cas9载体；
(2)构建含步骤(1)所述CRISPR/Cas9载体的农杆菌基因工程菌；
(3)用步骤(2)所述基因工程菌转化大麦，最终获得不含外源Cas9蛋白且稳定遗传的纯合单突变体株系。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述靶序列包括HvJAZ2-sgF1、HvJAZ2-sgR1、HvJAZ2-sgF2、HvJAZ2-sgR2；所述HvJAZ2-sgF1的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，所述HvJAZ2-sgR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，所述HvJAZ2-sgF2的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，所述HvJAZ2-sgR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410083865.2A CN117778415A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202410083865.2A CN117778415A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117778415A true CN117778415A (zh) | 2024-03-29 |
Family
ID=90396457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410083865.2A Pending CN117778415A (zh) | 2024-01-19 | 2024-01-19 | HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117778415A (zh) |
-
2024
- 2024-01-19 CN CN202410083865.2A patent/CN117778415A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110904071B (zh) | Raf49蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| CN111996181B (zh) | Drk蛋白及其编码基因在植物抗旱中的应用 | |
| CN110684796B (zh) | CRISPR-Cas9特异性敲除大豆脂肪氧化酶基因的方法及其应用 | |
| US20240158787A1 (en) | USE OF miRNA408 IN REGULATION OF CADMIUM ACCUMULATION IN CROP | |
| CN107880099B (zh) | 水稻种子休眠性调控基因OsMPK7及其应用 | |
| Sun et al. | Jasmonic acid biosynthetic genes TgLOX4 and TgLOX5 are involved in daughter bulb development in tulip (Tulipa gesneriana) | |
| CN108047319B (zh) | 水稻种子休眠性调控基因OsMPK14及其应用 | |
| Kang et al. | A robust genome-editing method for wild plant species Nicotiana attenuata | |
| CN105802931B (zh) | Crk4蛋白及其编码基因在调控植物茎叶生长中的应用 | |
| US20230340509A1 (en) | TOMATO GLUTAREDOXIN SlGRXC9 GENE AND ITS APPLICATION | |
| CN109485710B (zh) | 水稻种子休眠性调控基因OsAnn3及其编码的蛋白和应用 | |
| CN109371041B (zh) | 一种增加穗粒数的水稻基因OsHGN及其应用 | |
| CN116286861A (zh) | 转录抑制因子OsSMAX1基因及其在水稻抗褐飞虱中的应用 | |
| WO2022213453A1 (zh) | 一种调控植物抗铝性的铝离子受体alr1基因或蛋白的应用 | |
| CN117778415A (zh) | HvJAZ2基因在提高大麦苗期抗旱性中的应用 | |
| CN104450739B (zh) | 一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用 | |
| CN114807072B (zh) | 番茄SlDAO2基因及其应用 | |
| CN115287290B (zh) | 组蛋白去甲基化酶基因OsJMJ718及其编码蛋白在调控水稻种子活力中的应用 | |
| CN116875631B (zh) | 生长素糖基转移酶基因ugt74e2在抑制植物炭疽病中的应用 | |
| CN110129338B (zh) | 玉米转录因子ZmEREB160基因及其应用 | |
| CN117070515A (zh) | 一种水稻生物钟基因OsPRR37启动子区引导RNA双靶点序列及其应用 | |
| CN117904137A (zh) | 一种调节玉米耐旱的正向调控因子ZmGID1L2及其应用 | |
| US20210269813A1 (en) | Delivery of developmental regulators to plants for the induction of meristematic tissue with genetic alterations | |
| CN117187258A (zh) | OsBEE1基因在增强水稻抗旱性中的应用 | |
| Rasmussen | Molecular Genetics, Genomics and Biotechnology of Crop Plants Breeding |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |