CN109593773A - 一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法 - Google Patents

一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法。所述方法包括：1)表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种的构建；2)采用摇瓶发酵或者发酵罐进行诱导培养；3)蛋白纯化。本发明提供了一种新的sST2重组蛋白表达和纯化方法，通过酵母表达系统表达sST2重组蛋白，利用发酵罐技术提高产量，并且证明酵母源sST2具有良好的生物学活性，稳定性良好，应用验证显示其可以作为sST2化学发光检测试剂盒校准品。此外，本发明还建立了一种全新的表达量检测方法，完成了诊断试剂盒的应用验证，解决了目前sST2规模化生产方面的多个难点，能够满足诊断试剂领域对sST2需求，为sST2规模化生产提供新思路。

Description

一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白 的方法
技术领域
本发明涉及一种可溶性生长刺激表达基因2(Soluble growth stimμlationexpressed gene 2,sST2)蛋白的表达方法，特别涉及一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法。本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
生长刺激表达基因2蛋白(growth stimulation expressed gene 2，ST2)是IL-1受体超家族成员，最先由Tominaga在1989年发现，长期以来被认为是一个孤儿受体与炎症和免疫性疾病相关，到2005年发现了它的特异性配体IL-33，于是对ST2的研究扩展到一个新的领域。人ST2的基因位于染色体2q12，约40KD，表达于肥大细胞、巨噬细胞、激活的辅助性T细胞2(Th2)、心肌细胞和心肌成纤维细胞。
ST2基因有4种转录产物，其中2个最重要的亚型是跨模型ST2(ST2L)和可溶性ST2(sST2)，是由启动子选择性剪切和3′端加工形成的。ST2L包括一个胞外结构域是由3个连续的免疫球蛋白模体组成、一个跨膜结构域和一个Toll/IL-1受体(TIR)胞内结构域；与ST2L相比，sST2缺失跨膜及胞内结构域，仅由一个含9个氨基酸的C末端序列组成，可以分泌到细胞外。ST2基因在心肌细胞和心肌成纤维细胞遭受机械张力时均会上调表达，ST2L/IL33信号通路的正常激活能保护心血管，避免心肌由于过度牵拉造成的损伤，sST2作为IL-33的诱骗受体，与IL-33结合后阻断IL-33与ST2L的结合，减弱其下游通路激活所起的心脏保护作用，进而加重心肌重塑和心功能障碍，并与增加心衰、心肌梗死、心血管性死亡等不良心血管事件的发生。血液中sST2浓度常被用于评估急性心梗患者预后情况，在体外诊断领域，sST2常被用作相应检测试剂盒的校准品。sST2也被用于一些科学研究中，例如：ST2/白细胞介素-33的信号转导。
天然的sST2蛋白提取难度较大，尚未见相关报道。sST2重组蛋白在原核表达时以包涵体形式存在，经过变性复性处理，生物学活性较低，不能用作ST2检测试剂盒校准品，应用范围窄。酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统是常见的真核表达系统，目前市面上有哺乳动物细胞表达的sST2重组蛋白和昆虫细胞表达的sST2出售，产量有限，售价昂贵，同时缺乏相应的诊断试剂相关的评测数据，是否适用于诊断试剂领域有待考察。因此，目前在诊断试剂领域，缺少成本可控、活性良好并且评测完整的sST2生产方案，规模化生产受阻，限制了ST2相关检测项目的发展。
因此，急需建立一种能够低成本、高效率表达有生物活性的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法，以满足当前对可溶性生长刺激表达基因2蛋白相关研究以及应用的需求。
发明内容
本发明的目的是建立一种能够低成本、高效率表达有生物活性的可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2(sST2)蛋白的方法，包括以下步骤：
1)表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种的构建
人工合成编码sST2融合蛋白的DNA序列，合成时在其C端引入6个组氨酸标签，在N端和C端预留酶切位点，目的片段和载体经过双酶切后进行连接，构建含有可溶性生长刺激表达基因2的重组质粒；质粒先进行线性化，然后通过电转的方式转入酵母菌感受态中，构建得到表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种；
2)将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种划线培养后，接种培养基，进行一级种子和二级种子的培养；将得到的二级种子接种于摇瓶或发酵罐中，继续诱导培养，获得发酵液；将发酵液转移至离心桶中，离心，收集上清；
3)纯化
对收集的上清进行纯化，得到纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白。
其中，优选的，步骤1)中所述的编码sST2融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
其中，优选的，步骤1)中所述的载体为pPIC9K载体，所述的酵母菌为GS115毕赤酵母表达菌。
其中，优选的，步骤2)中，采用摇瓶培养时，按照以下步骤进行：
将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至80ml的YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为二级种子；将40ml的二级种子接种至2L的BMGY培养基中，混匀后平均分装到10个1L的三角瓶中，30℃160rpm震荡培养；连续培养4天，每24h添加1.5v/v％的甲醇诱导表达，第7天结束发酵；发酵液转移至离心桶中，10000g离心10min，收集上清。
其中，优选的，步骤2)中，采用发酵罐培养时，按照以下步骤进行：
将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至400ml的BMGY培养基中160rpm 30℃震荡培养24h，待OD600达到6时即可作为二级种子；选择5L发酵罐，发酵罐中预先装入2L的初始BMGY培养基并灭菌；灭菌结束后，无菌加入300ml MgSO4，300ml 10*YNB，标定溶氧为100％，加入准备好的400ml二级种子开始发酵；0-96h始终保持30℃，PH始终保持6.0，0-22h补甘油248ml，流速控制在11.27ml/min，0-7h DO和转速串联，保证DO>30％，转速控制在200-800rpm之间，7h后取消串联，改为自动布控，每小时增加转速50rpm，达到800rpm后维持至发酵结束；发酵24h后补加混合氮源，24h-72h流速控制在1ml/h/L，72h-96h控制流速在1.2ml/h/L；发酵24h开始甲醇诱导，23h-27h控制流速在1ml/h/L，27h-29h控制流速在2ml/h/L，29h-48h控制流速在3ml/h/L，48h-60h控制流速在4ml/h/L，60h-66h控制流速在4.5ml/h/L，66h-72h控制流速在5ml/h/L，72h-96h控制流速在5.5ml/h/L直至发酵结束；发酵48h时，转速调至950rpm/min，保证DO≥30％，直至发酵结束。
其中，优选的，步骤3)中，所述的纯化是采用超滤浓缩、Ni柱亲和纯化以及SP柱捕获的方法进行蛋白的纯化。
其中，优选的，所述的超滤浓缩是将发酵上清用0.8um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，选择50cm2 10kD膜包，膜包用去离子水冲洗后，加入滤好的样品，将样品的体积浓缩到50-100ml。浓缩样品用2L的超滤缓冲液(0.15M PBS，pH7.4)平衡洗涤至透过液无色，最终保证样品终体积小于100ml，收集置换过缓冲液的样品，添加0.05w/v％NaN3，2-8℃短期保存。
其中，优选的，所述的Ni柱亲和纯化是选择5ml Ni柱，A液为0.15M PBS pH7.4，B液为0.15M PBS+0.5M咪唑pH7.4；预先用A液平衡Ni柱，将超滤处理过的酵母上清上样，上样完成后用A液再次平衡，然后依次用5％B液、25％B液、50％B液和100％B液洗脱，收集洗脱峰。
其中，优选的，所述的SP柱捕获是将SP柱预先用10mM PB pH6.0平衡，平衡好后将收集的样品洗脱峰上样，一步100％pH6.0含1M NaCl的10mM PB溶液洗脱，收集洗脱峰。
其中，优选的，所述的方法还包括对纯化后的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白进行活性检测的步骤：在ELISA板上包被IL-33，优选的，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白，用HRP标记的ST2单抗进行检测。
相较于现有技术，本发明的有益效果是：
本发明提供了一种新的sST2重组蛋白表达和纯化方法，通过酵母表达系统表达sST2重组蛋白，利用发酵罐技术提高产量，并且证明酵母源sST2具有良好的生物学活性，稳定性良好，应用验证显示其可以作为sST2化学发光检测试剂盒校准品。此外，本发明还建立了一种全新的表达量检测方法，完成了诊断试剂盒的应用验证，解决了目前sST2规模化生产方面的多个难点，能够满足诊断试剂领域对sST2需求，为sST2规模化生产提供新思路。
附图说明
图1为sST2纯度鉴定；
图2为标准曲线。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1sST2的摇瓶发酵
1、实验材料
pPIC9K载体质粒、GS115菌种、pPIC9K-ST2GS115菌种、IL33和6B11单抗由本公司保存；YNB购自北京索莱宝科技有限公司；蛋白胨和酵母粉购自OXOID LTD；生物素购自Sigma；Ni柱和SP柱购自常州天地人和生物科技有限公司；Hf酶和酶切Buffer购自NEB(北京)有限公司。
2、试验方法
1)pPIC9K-ST2GS115菌种的构建
人工合成编码sST2融合蛋白的DNA序列(SEQ ID NO.1所示)，合成时在其C端引入6个组氨酸标签，对应的氨基酸序列见(SEQ ID NO.2所示)，在N端和C端预留酶切位点，目的片段和载体经过SnaB I与Not I双酶切后进行连接，构建pPIC9K-ST2重组质粒。质粒先进行线性化，然后通过电转的方式转入GS115感受态中，通过MD平板筛选和菌落PCR鉴定，找到构建成功的菌种，命名为pPIC9K-ST2GS115。
2)pPIC9K-ST2GS115菌种的摇瓶发酵
将pPIC9K-ST2GS115菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子。将一级种子按1：100接种至80ml的YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为二级种子。将40ml的二级种子接种至2L的BMGY培养基中，混匀后平均分装到10个1L的三角瓶中，30℃160rpm震荡培养。连续培养4天，每24h添加1.5v/v％的甲醇诱导表达，第7天结束发酵。发酵液转移至离心桶中，10000g离心10min，收集上清，弃菌泥，上清合并后总体积为1.9L。
3)纯化工艺
3.1超滤浓缩
发酵上清用0.8um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，选择50cm2 10kD膜包(Millipore)，膜包用去离子水冲洗后，加入滤好的样品，将样品的体积浓缩到50-100ml。浓缩样品用2L的超滤缓冲液(0.15M PBS，pH7.4)平衡洗涤至透过液无色，最终保证样品终体积小于100ml，收集置换过缓冲液的样品，添加0.05％NaN3，2-8度短期保存。
3.2Ni柱亲和纯化
选择5ml Ni柱，A液为0.15M PBS pH7.4，B液为0.15M PBS+0.5M咪唑pH7.4。预先用A液平衡Ni柱，将超滤处理过的酵母上清上样，上样完成后用A液再次平衡，然后依次用5％B液、25％B液、50％B液和100％B液洗脱，收集洗脱峰。
3.3SP柱捕获
SP柱预先用10mM PB pH6.0平衡，平衡好后将上步收集的样品洗脱峰上样，一步100％B(pH6.0含1M NaCl的10mM PB溶液)洗脱，收集洗脱峰。
4)重组sST2蛋白检测
4.1纯度检测
取30μl上步纯化得到的样品，加入4μl的10*Denature Buffer，100℃水煮10min，然后取出。样品冷却到室温后加入4μl的10*G5Buffer，1μl的Hf酶和1μl的ddH2O，加完后充分混匀，37℃反应1h。Hf酶切完成后加入10μl的5*蛋白上样Buffer，水煮10min后通过SDS-PAGE检测。
结果显示：纯化得到的sST2具有很高的糖基化程度，蛋白大小约35kD，与预期结果一致(图1)。
4.2重组sST2和配体结合活性的检测
在ELISA板上包被IL-33，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的ST2重组蛋白，用HRP标记的ST2单抗检测，结果显示：纯化得到的ST2能够和配体结合(表1)。
表1IL-33/ST2结合活性检测(吸光值(OD值))
5)重组sST2试剂盒应用验证
将sST2稀释成工作浓度，用sST2化学发光检测试剂盒完成定标，结果显示：本发明利用酵母表达系统表达的sST2能作为该项目校准品使用(表2、图2)。
表2试剂盒应用验证
浓度ng/ml(X值) RLU(Y值)
0 10608.62
5.3 82375.41
20.8 312800
54 834677.5
157 2661721
320 5335008
6)基于IL33与sST2特异性单抗的ELISA方法的建立
在ELISA板上包被IL-33，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的sST2重组蛋白，用HRP标记的ST2单抗6B11检测，结果显示：纯化得到的sST2能够和配体结合，并呈剂量依赖性(表1)。因此，IL-33和6B11单抗可以成功配对，形成类似夹心ELISA方法定量检测sST2的表达。
实施例2sST2的发酵罐发酵
1)pPIC9K-ST2GS115菌种的构建
同实施例1。
2)sST2的发酵罐发酵
将pPIC9K-ST2GS115菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子。将一级种子按1：100接种至400ml的BMGY培养基中160rpm 30℃震荡培养24h，待OD600达到6时即可作为二级种子。选择上海保兴5L发酵罐，发酵罐中预先装入2L的初始培养基并灭菌。灭菌结束后连接发酵罐和控制器、通气系统、冷凝系统、PH、溶氧、补料瓶、酸碱瓶，无菌加入300ml MgSO4，300ml 10*YNB，标定溶氧为100％，加入准备好的400ml二级种子开始发酵。温度自动控制：0-96h始终保持30℃，PH自动控制，始终保持6.0。甘油补料：0-22h补248ml，流速控制在11.27ml/min。转速控制：0-7h DO和转速串联，保证DO>30％，转速控制在200-800rpm之间，7h后取消串联，改为自动布控，每小时增加转速50rpm，达到800rpm后维持至发酵结束。发酵24h后补加混合氮源，24h-72h流速控制在1ml/h/L，72h-96h控制流速在1.2ml/h/L。发酵24h开始甲醇诱导，23h-27h控制流速在1ml/h/L，27h-29h控制流速在2ml/h/L，29h-48h控制流速在3ml/h/L，48h-60h控制流速在4ml/h/L，60h-66h控制流速在4.5ml/h/L，66h-72h控制流速在5ml/h/L，72h-96h控制流速在5.5ml/h/L直至发酵结束。发酵48h时，转速调至950rpm/min，保证DO≥30％，直至发酵结束。
3)纯化工艺
同实施例1。
4)重组sST2蛋白检测
发酵结束后，通过实施例1建立的ELISA方法检测表达量，结果显示目的蛋白大量表达(表3)。按照摇瓶纯化工艺纯化，最终获得约60mg的目的蛋白，比摇瓶提高20倍。
表3 5L发酵罐表达检测
序列表
<110>北京利德曼生化股份有限公司
<120> 一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的方法
<160>2
<170>Patent-In 3.5
<210>1
<211>965
<212>DNA
<213> growth stimulation expressed gene 2
<400>1
tacgtaaagt tcagcaagca gagttggggt cttgagaacg aagcactgat cgttcgttgt 60
ccacgtcaag gtaagccaag ctacactgtg gattggtact acagccagac caacaagagc 120
atcccaactc aggaacgtaa ccgtgtgttc gcaagtggtc agcttctgaa gttccttcca 180
gcagcagttg cagatagtgg tatctacacc tgcatcgtgc gtagtccaac cttcaaccgt 240
actggttacg caaacgtgac catctacaag aagcagagcg attgcaacgt gccagactac 300
ctgatgtaca gcactgtgag tggtagcgag aagaacagca agatctactg tccaaccatc 360
gatctgtaca actggactgc accactggaa tggttcaaga actgccaggc actgcagggt 420
agtcgttatc gtgcacacaa gagcttcctg gtgatcgaca acgtgatgac cgaagatgca 480
ggtgactaca cctgcaagtt catccacaac gagaacggtg caaactacag cgtgactgca 540
actcgtagct tcaccgtgaa ggatgaacag ggtttcagcc tgttcccagt gatcggtgca 600
ccagcacaga acgagatcaa ggaagtggag atcggaaaga acgcaaacct gacctgcagt 660
gcatgcttcg gtaagggtac tcagttcctg gcagcagttc tgtggcaact gaacggtacc 720
aagatcaccg atttcggtga accacgtatc cagcaggaag aaggtcagaa ccagagcttc 780
agcaacggtc tggcatgcct ggatatggtg ctgcgtatcg cagatgtgaa ggaagaagat 840
ctgcttctgc agtacgattg cctggcactg aacctgcatg gtctgcgtcg tcatactgtg 900
cgtctgagtc gtaagaaccc aatcgatcac catagccatc atcaccacca ccactaagcg 960
gccgc 965
<210>2
<211>316
<212>PRT
<213>growth stimulation expressed gene 2
<400>2
Lys Phe Ser Lys Gln Ser Trp Gly Leu Glu Asn Glu Ala Leu Ile Val Arg Cys Pro Arg 20
Gln Gly Lys Pro Ser Tyr Thr Val Asp Trp Tyr Tyr Ser Gln Thr Asn Lys Ser Ile Pro 40
Thr Gln Glu Arg Asn Arg Val Phe Ala Ser Gly Gln Leu Leu Lys Phe Leu Pro Ala Ala 60
Val Ala Asp Ser Gly Ile Tyr Thr Cys Ile Val Arg Ser Pro Thr Phe Asn Arg Thr Gly 80
Tyr Ala Asn Val Thr Ile Tyr Lys Lys Gln Ser Asp Cys Asn Val Pro Asp Tyr Leu MET 100
Tyr Ser Thr Val Ser Gly Ser Glu Lys Asn Ser Lys Ile Tyr Cys Pro Thr Ile Asp Leu 120
Tyr Asn Trp Thr Ala Pro Leu Glu Trp Phe Lys Asn Cys Gln Ala Leu Gln Gly Ser Arg 140
Tyr Arg Ala His Lys Ser Phe Leu Val Ile Asp Asn Val MET Thr Glu Asp Ala Gly Asp 160
Tyr Thr Cys Lys Phe Ile His Asn Glu Asn Gly Ala Asn Tyr Ser Val Thr Ala Thr Arg 180
Ser Phe Thr Val Lys Asp Glu Gln Gly Phe Ser Leu Phe Pro Val Ile Gly Ala Pro Ala 200
Gln Asn Glu Ile Lys Glu Val Glu Ile Gly Lys Asn Ala Asn Leu Thr Cys Ser Ala Cys 220
Phe Gly Lys Gly Thr Gln Phe Leu Ala Ala Val Leu Trp Gln Leu Asn Gly Thr Lys Ile 240
Thr Asp Phe Gly Glu Pro Arg Ile Gln Gln Glu Glu Gly Gln Asn Gln Ser Phe Ser Asn 260
Gly Leu Ala Cys Leu Asp MET Val Leu Arg Ile Ala Asp Val Lys Glu Glu Asp Leu Leu 280
Leu Gln Tyr Asp Cys Leu Ala Leu Asn Leu His Gly Leu Arg Arg His Thr Val Arg Leu 300
Ser Arg Lys Asn Pro Ile Asp His His Ser His His His His His His *** 316

Claims (10)

1.一种应用酵母表达系统表达可溶性生长刺激表达基因2(sST2)蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种的构建
人工合成编码sST2融合蛋白的DNA序列，合成时在其C端引入6个组氨酸标签，在N端和C端预留酶切位点，目的片段和载体经过双酶切后进行连接，构建含有可溶性生长刺激表达基因2的重组质粒；质粒先进行线性化，然后通过电转的方式转入酵母菌感受态中，构建得到表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种；
2)将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种划线培养后，接种培养基，进行一级种子和二级种子的培养；将得到的二级种子接种于摇瓶或发酵罐中，继续诱导培养，获得发酵液；将发酵液转移至离心桶中，离心，收集上清；
3)纯化
对收集的上清进行纯化，得到纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的编码sST2融合蛋白的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述的载体为pPIC9K载体，所述的酵母菌为GS115毕赤酵母表达菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用摇瓶培养时，按照以下步骤进行：
将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至80ml的YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为二级种子；将40ml的二级种子接种至2L的BMGY培养基中，混匀后平均分装到10个1L的三角瓶中，30℃160rpm震荡培养；连续培养4天，每24h添加1.5v/v％的甲醇诱导表达，第7天结束发酵；发酵液转移至离心桶中，10000g离心10min，收集上清。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，采用发酵罐培养时，按照以下步骤进行：
将构建得到的表达可溶性生长刺激表达基因2蛋白的酵母菌种在MD平板上划线接种，挑取单菌落接种至20ml YPD培养基，160rpm 30℃震荡培养24h，达到对数生长期，作为一级种子；将一级种子按1：100接种至400ml的BMGY培养基中160rpm 30℃震荡培养24h，待OD600达到6时即可作为二级种子；选择5L发酵罐，发酵罐中预先装入2L的初始BMGY培养基并灭菌；灭菌结束后，无菌加入300ml MgSO4，300ml 10*YNB，标定溶氧为100％，加入准备好的400ml二级种子开始发酵；0-96h始终保持30℃，PH始终保持6.0，0-22h补甘油248ml，流速控制在11.27ml/min，0-7h DO和转速串联，保证DO>30％，转速控制在200-800rpm之间，7h后取消串联，改为自动布控，每小时增加转速50rpm，达到800rpm后维持至发酵结束；发酵24h后补加混合氮源，24h-72h流速控制在1ml/h/L，72h-96h控制流速在1.2ml/h/L；发酵24h开始甲醇诱导，23h-27h控制流速在1ml/h/L，27h-29h控制流速在2ml/h/L，29h-48h控制流速在3ml/h/L，48h-60h控制流速在4ml/h/L，60h-66h控制流速在4.5ml/h/L，66h-72h控制流速在5ml/h/L，72h-96h控制流速在5.5ml/h/L直至发酵结束；发酵48h时，转速调至950rpm/min，保证DO≥30％，直至发酵结束。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的纯化是采用超滤浓缩、Ni柱亲和纯化以及SP柱捕获的方法进行蛋白的纯化。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的超滤浓缩是将发酵上清用0.8um、0.45um和0.22um的滤膜过滤，选择50cm2 10kD膜包，膜包用去离子水冲洗后，加入滤好的样品，将样品的体积浓缩到50-100ml。浓缩样品用2L的超滤缓冲液(0.15M PBS，pH7.4)平衡洗涤至透过液无色，最终保证样品终体积小于100ml，收集置换过缓冲液的样品，添加0.05w/v％NaN3，2-8℃短期保存。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的Ni柱亲和纯化是选择5ml Ni柱，A液为0.15M PBS pH7.4，B液为0.15M PBS+0.5M咪唑pH7.4；预先用A液平衡Ni柱，将超滤处理过的酵母上清上样，上样完成后用A液再次平衡，然后依次用5％B液、25％B液、50％B液和100％B液洗脱，收集洗脱峰。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的SP柱捕获是将SP柱预先用10mM PBpH6.0平衡，平衡好后将收集的样品洗脱峰上样，一步100％pH6.0含1M NaCl的10mM PB溶液洗脱，收集洗脱峰。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对纯化后的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白进行活性检测的步骤：在ELISA板上包被IL-33，优选的，包被浓度为2μg/ml，然后加入梯度稀释的纯化后的可溶性生长刺激表达基因2蛋白，用HRP标记的ST2单抗进行检测。
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