CN107765014A - 一种检测人sST2蛋白的方法以及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于检测人sST2蛋白的非诊断性双抗体夹心法，该方法具体步骤为：a)从人细胞株中提取ST2基因全长编码区，经双酶切后，克隆入pcDNA3.1载体中，构建真核表达载体pcDNA3.1‑ST2；b)将真核表达载体pcDNA3.1‑ST2转入酿酒酵母中进行表达，并纯化获得重组人sST2蛋白；c)使用重组人sST2蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化，获得鼠抗人sST2单抗；d)重组人sST2蛋白免疫兔制备兔血清，并纯化获得兔抗人sST2多抗；e)在固相载体上包被鼠抗sST2单抗，使用生物放大系统标记的兔抗人sST2多抗作为二抗；f)建立双抗体夹心检测sST2的方法。

Description

一种检测人sST2蛋白的方法以及试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地说涉及一种检测人sST2蛋白的的方法。

本发明还涉及上述检测方法的试剂盒。

背景技术

心力衰竭(Heart failure，HF)是严重威胁人类健康的临床综合征，是多种心血管疾病的终末阶段。随着人口的老龄化，心力衰竭的发病率逐年增加。据报道，因HF住院的患者约占住院心血管病患者的1/6，在过去的20年冠心病引起的心力衰竭由原来的36.8％增至45.6％。因此，HF的早期诊断、危险分层以及心血管事件风险预测对决策治疗及改善患者的生活质量，延长其寿命至关重要。

ST2作为HF的新兴标志物与其他心衰标志物联合检测可提高诊断和预后判断的精确度。ST2基因表达于肥大细胞、激活的辅助性T细胞2(Th2)、巨噬细胞和心肌细胞。人的ST2基因约40kb，位于人类染色体2q12，可编码一种可溶性蛋白(sST2)和一种跨膜形式蛋白(ST2L)，两者的转录分别受到不同的启动子调控。

血清可溶性ST2蛋白(sST2)属于白介素-1受体家族成员，由培养的单核细胞受到机械张力时产生，是机械应力诱导产生的一种心肌蛋白。sST2拮抗白介素-33(IL-33)通路的激活，IL-33具有抗心肌细胞肥大、心肌纤维化作用，ST2通过拮抗IL-33在血管炎症和动脉粥样硬化病理生理过程中发挥重要作用。已有研究证明严重心衰患者sST2水平升高，是心衰不良结局的独立预测因子。

sST2是心脏生物力学受损的标志物，既往研究显示在不同心脏疾病状况下测得的血清sST2水平增加。行冠脉结扎的小鼠心肌梗死后血清sST2短暂升高，梗死后第一天循环中升高的sST2水平与肌酸激酶呈正相关，与左室射血分数负相关，而且血清sST2基础水平较高时可以预测急性心肌梗死30天后发生充血性心力衰竭和死亡的危险性。急诊呼吸困难患者血清sST2水平升高，血清基础sST2水平是这些患者1年后死亡率的强有力的独立预测指标。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测人sST2蛋白的方法。

本发明另一个目的提供一种利用上述方法实现检测的试剂盒。

为了实现上述目的本发明提供了一种用于检测人sST2蛋白的非诊断性双抗体夹心法，该方法具体步骤为：

a)从人细胞株中提取ST2基因全长编码区，经双酶切后，克隆入pcDNA3.1载体中，构建真核表达载体pcDNA3.1-ST2；

b)将真核表达载体pcDNA3.1-ST2转入酿酒酵母中进行表达，并纯化获得重组人sST2蛋白；

c)使用重组人sST2蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化，获得鼠抗人sST2单抗；

d)重组人sST2蛋白免疫兔制备兔血清，并纯化获得兔抗人sST2多抗；

e)在固相载体上包被鼠抗sST2单抗，使用生物放大系统标记的兔抗人sST2多抗作为二抗；

f)建立双抗体夹心检测sST2的方法。

其中c)中使用重组人sST2直接免疫小鼠能获得大部分sST2抗体识别表位，满足将该单抗作为双抗夹心法包被于固相载体上的捕获抗体所需要的，更优的选择多个纯化后的单抗混合后作为e)中固相载体上包被单抗，相对于直接单个单抗包被，能提供多达10％阳性检出值上升，而阴性检出值基本无变化。

另外更进一步对重组人sST2进行使用胰蛋白水解后与sST2混合后免疫小鼠将大大提高sST2更多表位的暴露，从供更多的表位供纯化单抗作为选择，经过实验，纯化单抗混合后作为e)中固相载体上包被单抗，相对于直接单个单抗包被，能提供多达30％的阳性检出值上升，而阴性检出值基本无变化。

在e)步骤中，经过对醋酸纤维膜条、96孔酶标板、磁片三种酶联实验常用固相载体进行进行包被后三种固相载体都能达到检测要求，其中优选96孔酶标板。通过使用辣根过氧化物酶放大系统，生物素-亲和素加放大辣根过氧化物酶放大系统进行实验，都能达到相同的阳性检出率，生物素-亲和素加放大辣根过氧化物酶放大系统，放大值过导致信噪比低于直接使用辣根过氧化物酶放大系统，优选辣根过氧化物酶放大系统。

本发明为了更好实施上述方法，公开了一种检测人sST2蛋白的酶联免疫试剂盒，该试剂盒包括：包被有鼠抗人sST2蛋白单抗酶联板，sST2临界对照品，HRP酶标记兔抗人sST2蛋白抗体，TMB底物显色液。为了更好的检测效果，本发明对实验条件进行了优化，加入样本稀释液、洗涤液和终止液，可以使实验获得更加稳定的结果，样本稀释液加入后减小的整体检测系统的本底值，进一步对双抗夹心法样本反应完后成与二抗反应完成后使用洗涤液进行洗涤，使实验本底值进一步减少，并大大提高阳性与阴性样本的信噪比，最后补入终止液，使结果判定过程更加稳定。

其补入试剂配方如下：

样本稀释液为1％～10％山羊血清，0.01～0.1％吐温-20溶于pH 6.0～pH 8.0磷酸盐缓冲液，

洗涤液为0.01％～0.1％吐温-20溶于pH 6.0～pH 8.0磷酸盐缓冲液，

终止液为1～4M的硫酸。

为了更一进步满足定量检测需要，本发明进一步增加了sST2蛋白参考品，以供使用时同步生成标准曲线用于对样本中sST2的含量进行定量测定。sST2蛋白参考品由至少两个含有不同sST2蛋白浓度的缓冲液组成，用于同步检测生成标准曲线，进行定量测定，优先为三种不同浓度的sST2蛋白缓冲液组成，浓度区间分别1～10ng/ml、20～50ng/ml、100～500ng/ml。、

具体实施方式

下列实施例是为了更详细的解释本发明，但不应理解释为本发明局限于此。

实施例1：

本实放例涉及一种用于检测人sST2蛋白的非诊断性双抗体夹心法，包括以下步骤：

1.真核表达载体的构建：通过PCR方法从人细胞种获得ST2基因全长编码区经双酶切后，克隆入pcDNA3.1载体中，构建真核表达载体pcDNA3.1-ST2；

2.将真核表达载体pcDNA3.1-ST2转化到酿酒酵母中进行表达，挑选阳性克隆，扩大培养后，用质粒抽屉试剂盒提取所需质粒，进行鉴定，挑选阳性。

3.培养阳性克隆，收集细胞培养上清纯化，获得得sST2重组蛋白。

4.取sST2使用胰酶45℃消化4小时，获得sST2水解混合物。

5.取sST2与sST2水解混合物，分别免疫小鼠，得取B淋巴细胞，制备杂交瘤表达单抗，分别筛选，鉴定后，各选取最优获得3株细胞株，分别制备单克隆抗体，sST2免疫获得的单克隆抗体分别命名为s1，s2，s3。sST2水解混合物分别命名为m1，m2，m3。

6.取sST2免疫兔，耳静脉取血，制备血清，并纯化得到免抗人sST2多抗，使用辣根过氧化物酶标记免抗人sST2多抗，获得酶标免抗人sST2多抗。

7.取s1，s2，s3，m1，m2，m3各10μg/ml，100μl/孔包被到96孔酶标板上，使用10％山羊血清300μl/孔进行封闭，每孔加入待测样本100ul，反应1小时，洗涤液洗板后加入100μl酶标免抗人sST2多抗，反应1小时，洗涤液洗板后加入TMB底物显色液，反应10min后使用酶标仪630nm连续读取OD 5分钟，通过读取计算反应速率，计算获得样本中sST2浓度。反应15min时使用终止液100μl/孔终止反应，使用酶标仪读取450nm OD数据，直接计算获得sST2浓度。

8.结果：使用反应速率计算与使用终止液计算结果一致，对于20疾病组样中S1-S3的阳性率分别为10/20、10/20、9/20，其中s1、s2、s3共同阳性为9例，s1、s2、s3综合阳性率为11/20，混合阳性相较于s1、s2提升10％，m1、m2、m3阳性率分别为5/20、3/20、6/20，与s1-s3综合阳性率13/20。

Claims (7)

1.一种用于检测人sST2蛋白的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，该方法具体为：

1)从人细胞株中提取ST2基因全长编码区，经双酶切后，克隆入pcDNA3.1载体中，构建真核表达载体pcDNA3.1-ST2；

2)将真核表达载体pcDNA3.1-ST2转入酿酒酵母中进行表达，并纯化获得重组人sST2蛋白；

3)重组人sST2蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体并纯化，获得鼠抗人sST2单抗；

4)重组人sST2蛋白免疫兔制备兔血清，并纯化获得兔抗人sST2多抗；

5)在固相载体上包被鼠抗sST2单抗，使用生物放大系统标记的兔抗人sST2多抗作为二抗；

6)建立双抗体夹心检测sST2的方法。

2.根据权利要求1所述的用于检测人sST2的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述的步骤3)中用于免疫小鼠的蛋白为重组人sST2蛋白与重组人sST2经过胰蛋白酶水解产物的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的用于检测人sST2的非诊断性双抗体夹心法，其特征在于，所述的步骤5)中所述固相载体为96孔酶标板，所述的生物放大系统为过氧化物酶标记放大系统。

4.一种检测人sST2蛋白的酶联免疫试剂盒，包括酶联板，sST2临界对照品，HRP酶标记兔抗人sST2蛋白抗体，TMB底物显色液，其特征在于：所述酶联板上包被有鼠抗人sST2蛋白单抗。

5.根据权利要求4所述检测人sST2蛋白的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述的鼠抗人sST2蛋白单抗为多个不同表位的鼠抗人sST2单抗混合物。

6.根据权利要求5或4所述检测人sST2蛋白的酶联免疫试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包含样本稀释液、洗涤液、sST2蛋白参考品和终止液，

其中：

样本稀释液为1％～10％山羊血清，0.01～0.1％吐温-20溶于pH 6.0～pH 8.0磷酸盐缓冲液，

洗涤液为0.01％～0.1％吐温-20溶于pH 6.0～pH 8.0磷酸盐缓冲液，

sST2蛋白参考品由至少两个含有不同sST2蛋白浓度的缓冲液组成，

终止液为1～4M的硫酸。

7.根据权利要求5所述的检测人sST2蛋白的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的sST2蛋白参考品为三种不同浓度的sST2蛋白缓冲液组成，浓度区间分别1～10ng/ml、20～50ng/ml、100～500ng/ml。