CN105866420A - 一种检测免疫原的方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测免疫原的方法和装置，具体地，本发明提供的方法包括步骤：将固定化的第一检测抗体与样品中的所述免疫原接触，形成第一复合物；将所述第一复合物与第二检测抗体接触形成第二复合物；检测所述第二复合物；第一检测抗体中包含至少2种针对所述免疫原的单克隆抗体；所述第二检测抗体带有检测标记。本发明还提供了根据上述方法的检测板和试剂盒。本发明的方法能够降低传统ELISA方法中对单克隆抗体亲和力的要求，使得常规ELISA方法中无法使用的特异性、亲和力较低的单克隆抗体也能够用于对抗原的检测。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体地说，本发明涉及一种检测免疫原的方法和装置。
背景技术
宫颈癌是全球女性第二大常见恶性肿瘤，据统计2008年全球新发病例约为53万例，其中85％发生在发展中国家。临床试验、分子生物学研究和病原学研究表明，高危型HPVs的持续感染是宫颈癌的主要因素[zur Hausen H.Papillomavirusesand cancer:from basic studies to clinical application.Nat Rev Cancer 2002；2:342–50]，而高危型HPV中又以16/18型常见，其中超过2/3的宫颈癌与其感染有关。
HPV病毒持续感染后，病毒DNA整合进入人体基因组，在宿主细胞内表达致癌蛋白(HPV癌蛋白、HPV蛋白)。高危型E6，E7蛋白在HPV相关疾病的诱导，演变和恶性转化中起重要作用，在宫颈高度病变和癌症患者的宫颈上皮细胞中E6，E7蛋白一般呈过度表达。因此，合适的E6或E7抗体能够成为HPV诱导疾病的有效筛选和检测工具。
目前市场上常用的HPV的检测和诊断方法主要有：(1)细胞学检测，如仍沿用60年代制定的宫颈涂片巴氏染色以及新的新柏氏液基细胞学技术(LBC)；(2)HPV DNA检测，杂交捕获II(HCII)是目前唯一获得美国FDA认证的HPV-DNA检测方法；(3)免疫组化检测，采用HPVL1和替代靶标p16INK4A,Ki67，hTERT为检测对象。
在形态学检查中，产生损害的原因可以是炎症或肿瘤疾病，不同特性引起的损害的区别是困难的。因此，对与细胞学检测，细胞学者和病理学者不得不进行特殊训练，并且检测结果基于检查者对诊断标准的主观解释。作为结果，假阳性和假阴性的比例往往导致筛选检测结果非常令人不满意，阳性检出率仅在30％～50％。
现有技术中的从LBC样本中检测HPV核酸的方法，使用LBC样本作为分析的基础。在裂解LBC样本含有的细胞之后实施对HPV核酸的检测。在此方法中对于从相同LBC样本制备的细胞学标本获得的信息，使用了将用于生化的非细胞基础的HPV核酸检测的非标准化量的LBC样本。因此该方法仅仅限于定性检测，且无法区分HPV是瞬时感染或是持续感染，而HPV的持续感染是肿瘤恶性演变进程中所必须的。
目前免疫组化(IHC)检测HPV感染的蛋白靶标有HPVL1和替代靶标p16INK4A,Ki67，hTERT等。Valentina Faoro等研究表明E7和最为常用的替代靶标p16INK4A在IHC检测低度宫颈上皮内瘤样病变(L-CIN)、高度宫颈上皮内瘤样病变(H-CIN)以及宫颈癌(SCC)时在免疫学方面得到的结果基本一致[Valentina F,Renzo B,,Serena B,Davide B,Sandro S,and Giorgio S.Detection of HPV E7Oncoviral Protein inCervical Lesions by a New Antibody[J].Appl Immunohistochem Mol Morphol,2013,21(4):341-350]。虽然研究表明p16INK4A与宫颈疾病的严重性相关，但是p16INK4A检测的可重复性受限于检测的标准化制定[Martin CM,O’Leary JJ.Histology ofcervical intraepithelial neoplasia and the role of biomarkers.Best Pract Res Clin ObstetGynaecol.2011；25:605–615.]。而E7抗体用于IHC时，即使在少量病变细胞时仍能呈现清晰的染色，能够检测出CIN1到CIN3不同阶段的病变细胞。
因此，本发明的目标是提供一种能够对HPV感染相关肿瘤疾病如宫颈癌以及其前体阶段进行前期和可靠的诊断的方法。通过本方法应该可以区分关于良性炎症或(组织)转化的改变不良损害和早期癌等肿瘤疾病之间的差别。另外，现有技术中的各种检测HPV的方法，交叉反应严重，特异性差，无法区分具体的HPV类型。由于HPV18比HPV16具有更高的致癌风险，因此在某些情况下本领域需要一种能够特异性区分HPV18和HPV16病毒感染的诊断方法，以对癌症的预防和/或治疗提供针对性更强的医疗方案。而且本发明提供在生化的基础上用从溶解的样本中检测癌症的方法。样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何种类，如用于基于细胞学的液体。
本领域技术人员致力于开发一种能够快速区分HPV感染及其类型、特异性强、结果稳定可靠的检测HPV的技术方案。ELISA凭借其高度的灵敏度、良好的特异性、检测速度快及低检测成本等优势已被广泛应用于体外诊断的分析检测中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测免疫原的方法和装置。
本发明的第一方面，提供了一种免疫原(抗原)的检测方法，所述方法中包括步骤：
(i)将固定化的第一检测抗体与样品中的所述免疫原接触，形成第一复合物；
(ii)将所述第一复合物与第二检测抗体接触形成第二复合物；
(iii)检测所述第二复合物；
其中，所述步骤(i)中，所述第一检测抗体中包含至少2种(优选地为2-5种，更优选地为2或3种)针对所述免疫原的单克隆抗体；所述第二检测抗体带有检测标记。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中的不同种单克隆抗体分别针对所述免疫原的不同抗原表位。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中的不同种单克隆抗体针对所述免疫原的相同抗原表位。
在另一优选例中，所述第二检测抗体为带有检测标记的所述第一检测抗体。
在另一优选例中，所述免疫原为疾病标志性蛋白。
在另一优选例中，所述疾病包括但不限于：病毒或病菌感染、炎症、肿瘤、心脑血管疾病。
在另一优选例中，所述免疫原为病毒壳体蛋白或其片段。
在另一优选例中，所述免疫原为HPV蛋白。
在另一优选例中，所述HPV选自下组中的一种或多种亚型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV68。
在另一优选例中，所述HPV蛋白选自下组：HPV E6蛋白、HPV E7蛋白、HPV L2蛋白。
在另一优选例中，所述单克隆抗体选自申请号为201210033918.7、201110384361.7、201410503512.X和201410508253.X中披露的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中包含2种单克隆抗体。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中包含第一单克隆抗体和第二单克隆抗体以及任选地第三单克隆抗体，所述第一单克隆抗体与所述第二单克隆抗体的重量比为1-3：3-1。
在另一优选例中，所述第二检测抗体中包含带检测标记的所述第一单克隆抗体和带检测标记的所述第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体与所述第二单克隆抗体的重量比为1-3：3-1。
在另一优选例中，所述步骤(i)中，所述“固定化的第一检测抗体”为包被于酶标板的所述第一检测抗体。
在另一优选例中，所述“包被于酶标板的所述第一检测抗体”包被浓度为2-6μg/ml，优选地为3-5μg/ml，如3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml。
在另一优选例中，所述第二检测抗体的使用浓度为0.5-3μg/ml，优选地为1-2μg/ml。
在另一优选例中，所述HPV E7蛋白为HPV18 E7蛋白，其序列如SEQ ID NO.:1所示。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中的至少一种单克隆抗体结合位点为SEQ ID NO.:1中的第44－58位氨基酸。
在另一优选例中，所述HPV E7蛋白为HPV16 E7蛋白，其序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中的2种单克隆抗体组合选自下组：H11单克隆抗体和F1单克隆抗体、E8单克隆抗体和H11单克隆抗体、E8单克隆抗体和F1单克隆抗体。
在另一优选例中，所述单克隆抗体为能够特异性区分HPV18E7蛋白和HPV16E7蛋白的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记、或纳米粒子标记。
在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、宫颈脱落细胞、TCT固定细胞样本。
在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。所述非诊断性的目的包括但不限于：药物筛选。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：
(a)提供固定化的单克隆抗体组；
(b)使待测样品与所述固定化的单克隆抗体组接触；
(c)提供带标记的单克隆抗体组；
(d)检测是否形成“固定化的单克隆抗体-抗原-带标记的单克隆抗体”复合物，
其中，所述单克隆抗体组中包含至少两种针对待测抗原的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述“单克隆抗体”包括H11单克隆抗体、F1单克隆抗体和E8单克隆抗体中的至少两种。
本发明的第二方面，提供了一种用于免疫原检测的检测板，所述的检测板固定有第一检测抗体，所述第一检测抗体中包含至少2种(优选地为2-5种，更优选地为2或3种)针对所述免疫原的单克隆抗体，所述至少2种单克隆抗体分别针对所述免疫原的不同抗原表位。
在另一优选例中，所述检测板为酶标板。
在另一优选例中，所述检测板为侧流式检测板，所述侧流式检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述测试条上固定有所述第一检测抗体。
在另一优选例中，所述测试条自上游至下游依次分布有抗原加样区、所述第二检测抗体、所述第一检测抗体，所述第一检测抗体固定于所述测试条，所述第二检测抗体可流动的设置于所述测试条。所述“固定”是指进行检测时所述第一检测抗体不会随液体在所述检测板上流动。所述“可流动”是指，进行检测时所述第二检测抗体可以随液体在所述检测板上流动。
在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。
本发明的第三方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
本发明第二方面所述的检测板，或者
用于形成所述检测板的酶标板和独立包装的所述第一检测抗体，以及任选的缓冲液和细胞裂解试剂。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：
第二检测抗体，所述第二检测抗体中包含针对所述免疫原的带有检测标记的单克隆抗体。
在另一优选例中，所述第一检测抗体中包含至少2种(优选地为2-5种，更优选地为2或3种)针对所述免疫原的单克隆抗体，所述至少2种单克隆抗体分别针对所述免疫原的不同抗原表位。
在另一优选例中，所述第二检测抗体中包含至少2种单克隆抗体。
在另一优选例中，所述第二检测抗体为带有检测标记的所述第一检测抗体。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括说明书，所述说明书中记载有本发明第一方面所述的检测方法。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1多抗体包被夹心ELISA中抗体抗原HPV18 E7蛋白结合特异性检测结果。
图2多抗体包被夹心ELISA检测抗体配对结果。图2A为单克隆抗体E8包被，H11和F1分别检测结果。图2B为单克隆抗体F1包被，E8和H11分别检测结果。图2C为单克隆抗体H11包被，E8和F1分别检测结果。
图3多抗体包被夹心ELISA中抗体包被浓度选择的检测结果。
图4多抗体包被夹心ELISA中抗原HPV18 E7蛋白结合标准曲线。
图5对从宫颈癌细胞株Hela细胞和阴性对照细胞CHO细胞获得溶解标本进行HPV癌蛋白特异性检测的多抗体包被夹心ELISA分析。
图6对从宫颈细胞株Hela细胞获得的溶液标本中的HPV癌蛋白进行定量分析以确定多抗体包被夹心ELISA分析的最低癌细胞检出量。
图7从宫颈癌细胞株Hela细胞和阴性对照细胞CHO细胞获得溶解标本进行不同比例混合后，对HPV癌蛋白进行定量分析以确定多抗体包被夹心ELISA分析的最低癌细胞检出量。
具体实施方式
本发明人通过HPV癌蛋白广泛而深入的研究，意外地获得一种高灵敏度、高特异性的检测免疫原蛋白的方法，将至少两种单克隆抗体固定化后加入抗原进行反应，然后再加入携带可检测标记的同样的两种单克隆抗体，反应后进行检测，实验结果表明，该方法检测灵敏、特异性高、稳定性好。而且，在常规双抗体夹心方法中无法使用的单克隆抗体，能够应用于本发明的方法中进行检测，极大的降低了对抗体亲和力的要求。本发明还提供了基于上述方法的试剂盒以及检测板。
术语
抗体
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
本发明的术语“单克隆抗体”还包括该单克隆抗体的活性片段和活性衍生物等变异形式。
这些变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明术语“单克隆抗体”还包括与本发明述及的抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
杂交瘤细胞株
本发明的单克隆抗体较佳地由杂交瘤细胞株产生，在获得生产本发明的HPV蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株之后，本领域技术人员可以方便地利用该杂交瘤细胞株制备抗体。
此外，本领域技术人员还可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过重组方法来制备适用于本发明的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备
适用于本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T CellHybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。
代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type CultureCollection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体[Kozbor，J.Immunol.，133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体的生产技术和应用(Monoclonal Antibodies ProductionTechniques and Applications)，51-63页(Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)]。
对杂交瘤细胞生长于其中的培养基进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，AcademicPress(1986)59-103页)。为了达到这一目的而使用的适合的培养基包括，例如，DMEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可在动物体内作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺为例如，蛋白A-琼脂糖法(proteinA-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用培养杂交瘤细胞方法制备。取杂交瘤细胞培养的上清液，经饱和硫酸铵沉淀法粗提出IgG,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Balb/C小鼠腹水生产单克隆抗体的方法制备。将约杂交瘤细胞接种到致敏的小鼠腹腔内，2-4周内可见腹部明显胀大。抽取腹水，经饱和硫酸铵沉淀法粗提后,再将粗提的抗体经亲和层析柱(Protein G-Sephrose)纯化。
适用于本发明方法的单克隆抗体可以是市售的抗体，也可以是公开文献中已经记载的抗体。优选是抗HPV E7抗体，更优选是抗HPV16 E7和/或HPV18E7单克隆抗体，尤其优选自申请号为201210033918.7、201110384361.7、201410503512.X和201410508253.X中公开的单克隆抗体或是与该些单克隆抗体具有同等结合活性的单克隆抗体，或者是通过上述申请文本中记载的单克隆抗体的制备方法所制备的单克隆抗体。
标记的免疫球蛋白
在本发明的一个优选例中，所述免疫球蛋白(抗体)带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。
标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，HPV蛋白的单克隆抗体用胶体金或生物素标记。
HPV蛋白
HPV是一种具有种属特异性的嗜上皮病毒，属双链闭环的小DNA病毒，包含约8000个碱基对。其中包括8个早期开放读码框架(E1-E8)、2个晚期读码框架和1个非编码长控区。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要。Ziegent(2003)等研究已证实HPV E6、E7基因具有细胞转化功能,是潜在的癌基因,编码HPV E6、E7蛋白为癌蛋白,在体外能转化小鼠上皮细胞,也能使人类上皮细胞发生永生化,而且HPV E6、E7蛋白的持续表达是维持体外培养细胞永生化所必需的。因此，高危型HPV的早期表达蛋白E6和E7在宫颈癌的发生中起着重要作用。癌症发生过程中病毒DNA整合入人体细胞基因组内，随着E6和E7蛋白表达控制的缺失，在高度宫颈非典型增生和宫颈癌病人的上皮细胞内持续表达E6和E7蛋白。E7是肿瘤原性蛋白，且具有较强的抗原性，能够使肿瘤抑癌基因pRb失活，最终引起细胞生长失控，导致细胞永生化而发生癌变。这使得E7可作为高度宫颈损伤和宫颈癌检测的一个肿瘤标志物。
目前临床免疫组化检测HPV感染主要是采用HPV L1和其他一些辅助生物标志，如p16INK4A，Ki67,hTERT等。临床HPV检测没有合适的抗体主要有三个原因：1，HPV蛋白在临床组织或细胞样本中表达量较低，需要度高亲和力的抗体进行检测；2，HPV病毒在现有的标准组织培养技术下不能在实验室培养存活；3，E7蛋白本身存在免疫抑制，使得采用E7蛋白免疫动物不能获得很好的免疫反应，另外使制备得到的抗体往往与其他的HPV蛋白存在交叉反应对E7蛋白不具有特异性。
本发明人经过通过HPV癌蛋白广泛而深入的研究，意外地获得一种高灵敏度、高特异性的检测免疫原蛋白的方法，将至少两种单克隆抗体固定化后加入抗原进行反应，然后再加入携带可检测标记的同样的两种单克隆抗体，反应后进行检测，实验结果表明，该方法检测灵敏、特异性高、稳定性好。而且，在常规双抗体夹心方法中无法使用的单克隆抗体，能够应用于本发明的方法中进行检测，极大的降低了对抗体亲和力的要求。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV18 E7蛋白的氨基酸序列如下：
MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID NO.:1)。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述HPV16 E7蛋白的氨基酸序列如下：
HGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID NO.:2)。
检测板及其材料
本发明的检测板可采用本领域常用的检测板材料，采用常规的检测板制备方法制成。
本发明检测HPV蛋白的免疫检测板，包括测试条和支撑测试条的支撑板，如可采用PVC聚脂胶板等；所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成，搭接部位可以采用常规的方法，如胶带等固定连接；其中：层析材料预包被胶体金标记或有色标记的HPV蛋白单克隆抗体，优选被胶体金标记的HPV蛋白单克隆抗体，硝酸纤维素膜上吸附检测线和质控线；
在一个优选的方案中：层析材料上预包被胶体金标记的HPV蛋白单克隆抗体是采用浓度为0.5-1.5mg/ml胶体金标记的HPV蛋白单克隆抗体溶液进行预包被的，包被量为50μl/cm2；优选的浓度为0.5或1.5mg/ml，50μl/cm2。
检测方法与结果判定
平放检测板，将试样滴在滤样纸上，试样约120μl，反应完成后观察层析结果。根据出现的条纹位置来判断结果。
阴性：质控区、检测区均出现明显的色带，示为阴性；
阳性：只在质控区出现明显色带，而在检测区无色带，示为阳性；
无效：质控区、检测区无任何色带或在质控区未出现色带而在检测区出现色带，表明检测方法错误或检测板变质或失效，应重新换取检测板检测。
方法和样本
本发明涉及用于在以细胞和/或组织溶解的样本检测宫颈癌的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中HPV癌蛋白的水平。本发明方法所使用的样本可以是存在于细胞保存液中的包括细胞的任何样本，正如在液基细胞检测法中所使用的。
本发明可以用于HPV感染相关癌症中HPV癌蛋白的检测，其中HPV感染相关的癌症例如宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。
根据本发明，使用HPV癌蛋白分子标记可以支持或甚至取代细胞学和/或组织学检测方法。在特殊病例中，蛋白分子标记可以被用作诊断工具而不需要进一步的基于细胞的形态检测的支持。因为在没有基于细胞信息支持的情况下，仅仅在蛋白分子水平上对癌症的诊断方法受限于病例，其中标记或标记的水平应该对将要检测的情况有特异性。而如果生物标记是非人源的物质，那么这样的检测是完全可区分的。本发明所采用的生物标记是HPV癌蛋白，该生物标记来源于病毒，因为组织中病毒存在的标记特性不会发生在未感染的人组织中，因此对HPV感染的检测可以在样本溶液中完成。
本发明中所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。细胞或组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可以获得保存介质(福尔马林、Cytyc“PreservCyt”或Tripath Imaging“Cytorich”等)。合适的细胞保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。
另外，在本文公开的方法中可以使用获得后立即进行细胞裂解的样本。样本获得后立即进行裂解，在此过程中形态学信息已丢失，而样本的蛋白分子信息被保存。样本可以直接从个体的躯体转移到含有合适的去垢剂和保存剂的溶液中。在裂解介质中使用合适的试剂，可以保存原材料的分子组分，并且不发生降解。例如通过使用酶抑制剂而是酶活力降解最小化。因此，在该裂解介质中的检测样本的溶液可以在溶解时显示检测样本的蛋白分子特性。
根据本发明，样本可以溶解在任何合适的裂解介质中。该裂解介质例如可以是尿素、甲酰胺，去垢剂的水溶液，例如阴离子去垢剂(如SDS，N-十二烷醇肌酸钠，去氧胆酸钠，烷芳基磺酸盐，长链(脂肪族)醇硫酸盐，烯烃硫酸盐和磺酸盐，α-烯烃硫酸盐和磺酸盐，硫酸盐甘油—酸酯，硫酸醚，硫代琥珀酸盐，链烷基磺酸盐，磷酸酯，烷基异硫代硫酸盐，蔗糖酯)，阳离子去垢剂(如，氯化十六烷基三甲基铵)，非离子去垢剂(如，吐温20，Nonidet P-40，Triton X-100，NP-40，lgepal CA-630，N-辛基-配糖物)或两性去垢剂(如，CHAPS，3-十二烷基-二甲基胺-丙烷-1-磺酸，十二烷醇二甲基胺氧化物)和/或氢氧化物碱，例如氢氧化钠或氢氧化钾。通常任何合适的液体可以用作本发明裂解介质的溶剂。液体可以是有机或无机的，并且可以是纯液体，液体混合物或含物质溶液的液体并可以含有其他物质以增强溶剂的性质。在本发明的实施方案中，裂解介质的配方是50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％NP-40,0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS。
根据本发明用于溶解样本的裂解介质可以进一步含有一个或多个防止原材料中组分降解的试剂。该组分例如包括酶抑制剂，例如蛋白酶抑制剂。在本发明的实施方案中，样本直接裂解。蛋白酶抑制剂例如可以包括丝氨酸蛋白酶抑制剂，半胱氨酸蛋白酶抑制剂，天门冬氨酸蛋白酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，酸性蛋白酶抑制剂，碱性蛋白酶抑制剂或中性蛋白酶抑制剂。在本发明的实施方案中，蛋白酶抑制剂采用的是Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)，Leupeptin(亮抑制肽)，(抑蛋白酶肽)以及100μg/ml PMSF(苯甲基磺酰氟)。
试剂盒
本发明还提供了一种基于本发明方法的含有单克隆抗体的或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明进一步设计用于检测HPV癌蛋白水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别HPV癌蛋白的单克隆抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV E7抗体，更优选是抗HPV16 E7和/或HPV18 E7单克隆抗体，尤其优选自申请号为201210033918.7、201110384361.7、201410503512.X和201410508253.X中公开的单克隆抗体或是与该些单克隆抗体具有同等结合活性的单克隆抗体。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明进一步设计开发用于对来自溶液样本的HPV感染相关情况评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本溶液中的HPV癌蛋白，其中保存样本的细胞保存液可以是诸如液基细胞检测法中的细胞保存液。将细胞溶解在合适的裂解介质中，并且被用于开发在基于非细胞分析基础上的对来自溶解的样本的HPV感染相关肿瘤进行检测的检测试剂盒和体外诊断装置。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述试剂盒中包括：
用于形成所述检测板的酶标板和独立包装的所述第一检测抗体，以及任选的缓冲液和细胞裂解试剂，其中，所述第一检测抗体中包含至少2种(优选地为2-5种，更优选地为2或3种)针对所述免疫原的单克隆抗体，所述至少2种单克隆抗体分别针对所述免疫原的不同抗原表位。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括：
第二检测抗体，所述第二检测抗体中包含针对所述免疫原的带有检测标记的单克隆抗体。
在较佳地实施方式中，所述第二检测抗体中包含至少2种单克隆抗体。
在更佳地实施方式中，所述第二检测抗体为带有检测标记的所述第一检测抗体。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的方法能够降低传统ELISA方法中对单克隆抗体亲和力的要求，使得常规ELISA方法中无法使用的特异性、亲和力较低的单克隆抗体也能够用于对抗原的检测。
(2)本发明提供的方法稳定性高、特异性强、灵敏度高。
(3)本发明提供的检测方法及装置，适用于相关癌症的早期诊断，也可用于非诊断的目的如大规模的病人筛查、检测样本是否有被微生物污染、药物筛选等，并可用于监测复发病人。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料和方法
1、以下实施例中所涉及的细胞及主要试剂：人宫颈癌细胞系Hela、中国仓鼠卵巢细胞CHO购自中国科学院细胞库。6-8周龄BALB/c小鼠购买于扬州大学实验动物中心。RMPI 1640、DMEM、胎牛血清购买自Hyclone公司，0.25％胰酶购自Gibco Invitrogen公司；EZ-LinkTMSulfo-NHS-LC-Biotin and Labeling KitsProduct#21327购自Thermo Scientific公司；Pierce High sensitivityStreptavidin-HRP Product#21130购自Thermo Scientific公司；脱氧胆酸钠，BSA，SDS，TMB，Tween-20购自Amresco，各单克隆抗体可以购自艾托金生物医药(苏州)有限公司。其他常规化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司，其它生物学试剂如无特别说明，均可从市售渠道获得。
2、以下实施例中所涉及的主要仪器：MULTISKAN MK3酶标仪(Thermo公司)；WellWASK4MK2洗板机(购自Thermo公司)；酶标板(COSTAR公司)。
3、HPV18E7单克隆抗体的制备方法请见中国专利申请“HPV18E7单克隆抗体、相关杂交瘤细胞株和应用”(申请号：CN201210033918.7，申请日2012年2月16日)，其它的单克隆抗体的制备方法可以参考中国专利申请文件，申请号：201110384361.7、201410503512.X、201410508253.X。
实施例1 HPV18 E7蛋白的特异性鉴定
本实施例中以单克隆抗体H11和F1为例，说明本实施例中的具体实验方法。
检测单克隆抗体H11和F1对His-HPV18 E7和His-HPV16 E7两种蛋白的反应，采用的多抗体包被夹心ELISA方法进行鉴定：
(1)纯化的F1和H11抗体用pH9.6的碳酸盐包被缓冲液(取碳酸钠(Na2CO3)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO3)2.93g叠氮钠(NaN3)0.2g，10M NaOH调pH值到9.6，蒸馏水加至1000ml。)稀释至各自浓度为2μg/ml混合后进行包被，100μl/孔，4℃过夜。
(2)1x PBST(1xPBS配方为：氯化钠(NaCl)5g氯化钾(KCl)0.125g磷酸二氢钾(KH2PO4)0.125g磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)1.81g蒸馏水加至1000ml。用1M HCl调pH至7.2，配制成1xPBS。临用前Tween-201mL，加入到1000ml 1xPBS中，搅拌混匀，为1xPBST洗液。)洗涤一次，拍干。
(3)加入5％脱脂奶粉/PBS封闭，300μl/孔，37℃，2h。
(4)1x PBST洗涤三次，拍干。
(5)每孔分别加入100μl浓度为2μg/ml的His-HPV16 E7和His-HPV18 E7蛋白作为抗原，并设置空白对照，37℃孵育1h。
(6)1x PBST洗涤三次，拍干。
(7)每孔加入5％BSA/PBS稀释的生物素化的H11和F1(H11-Bio，F1-Bio)各1μg/ml，37℃孵育1h。
(8)1x PBST洗涤三次，拍干。
(9)加入Pierce High sensitivity Streptavidin-HRP进行检测，采用5％BSA/PBS1:10,000进行稀释，100μl/孔，37℃孵育30min。
(10)1x PBST洗涤三次，拍干。
(11)TMB显色:TMB A液(取醋酸钠(CH3COONa)13.6g，柠檬酸(C6H8O7.H2O)1.6g，双氧水(H2O230％)0.3ml，蒸馏水加至500ml)和B液(取乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)0.2g，柠檬酸(C6H8O7.H2O)0.95g，四甲基联苯胺(TMB)0.2g，蒸馏水加至500ml)等体积混合，100μl/孔，室温5min。
(12)2M H2SO4，50μl/孔终止，用酶标仪OD450nm处读数。
结果发现：单克隆抗体H11和F1仅与His-HPV18E7结合而与另一个高危亚型致癌蛋白HPV16E7无结合，具有较强的抗原特异性，结果如图1所示。
采用上述同样的方法，验证常规ELISA检测HPV18 E7蛋白的特异性，结果如图2所示，单独采用抗HPV18E7的单克隆抗体E8、F1或者H11作为固定化(包被)抗体，包被液中抗体浓度为4μg/ml，然后分别使用H11或者F1、E8或者H11、F1或者E8作为检测抗体，均不能特异性检出HPV18 E7蛋白。
综上所述，见表1，其中，“+”表示该抗体对能检测出HPV18E7蛋白或HPV16E7蛋白，“－”表示该抗体对不能检测出HPV18E7蛋白或HPV16E7蛋白。
表1 HPV18E7多抗体包被夹心ELISA检测中单抗特异性鉴定结果
实施例2 多抗体包被夹心ELISA检测中包被抗体的浓度的选择
混合的H11和F1抗体分别稀释至2.0μg/ml(H11和F1浓度分别为1.0μg/ml)，3.0μg/ml(H11和F1浓度分别为1.5μg/ml)和4.0μg/ml(H11和F1浓度分别为2.0μg/ml)进行包被，重组His-HPV16E7，His-HPV18E7蛋白浓度为2μg/ml作为抗原，检测抗体H11-Bio和F1-Bio的浓度各为1μg/ml，每个样品设置两个复孔，100μl/孔，按照实施例1的步骤进行检测，如图3所示，当H11和F1的包被总浓度为4μg/ml时，即两者各自的浓度为2μg/ml时，能够明显的区分阴性和阳性蛋白。故选择H11和F1抗体包被总浓度为4μg/ml进行后续试验。
实施例3 确定多抗体包被夹心ELISA检测重组His-HPV18E7蛋白范围
将纯化的重组His-HPV18E7标准蛋白进行5倍稀释，从1μg/ml开始稀释，连续稀释6个浓度，1μg/ml，0.2μg/ml，0.04μg/ml，0.008μg/ml，0.0016μg/ml，0.00032μg/ml，每个样品设置两个复孔，100μl/孔，按照实施例1的步骤对单克隆抗体H11和F1进行检测，如图4所示，重组HPV18E7蛋白与抗体(F1和H11)的反应具有良好的浓度依赖关系，当HPV18E7浓度为0.2μg/ml时，结合趋于平缓。将重组His-HPV18E7标准蛋白(200ng/ml)用1xPBS作2倍稀释，设置2个复孔，得出标准蛋白各个稀释点的平均值与空白组OD值有统计学差异的最高稀释倍数为64倍，即HPV18E7多抗体包被夹心ELISA结合的抗原浓度在3.125ng/ml时与空白组仍有统计学差异。
实施例4 多抗体包被夹心ELISA检测人宫颈癌细胞系Hela中的内源HPV18E7蛋白
根据文献报道，人宫颈癌细胞系Hela中存在HPV18E7癌蛋白,而CHO细胞为中国仓鼠卵巢细胞不表达HPV蛋白。分别收集Hela和CHO细胞，加入细胞裂解液(细胞裂解液配方为：50mM Tris-HCl,150mM NaCl,1％NP-40,0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS。临用前加入1ug/ml Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂)，0.5mg/ml Leupeptin(亮抑制肽)，1μg/ml Aprotinin(抑蛋白酶肽)以及100μg/mlPMSF(苯甲基磺酰氟))，置于冰上裂解30min，离心取裂解液上清作为抗原。将细胞裂解根据细胞数目做3个浓度稀释，分别为2.5x105，1x105和5x104。⑴各取100μl裂解上清加到混合包被有H11和F1的酶标板中，4℃孵育过夜。⑵1x PBST洗涤三次，拍干。⑶每孔加入5％BSA/PBS稀释的生物素化的H11和F1各1μg/ml，37℃孵育1h。⑷1x PBST洗涤三次，拍干。⑸加入Pierce Highsensitivity Streptavidin-HRP进行检测，采用5％BSA/PBS 1:10,000进行稀释，100μl/孔，37℃孵育30min。⑹1x PBST洗涤三次，拍干。⑺TMB显色:TMBA液和B液等体积混合，100μl/孔，室温5min。⑻2M H2SO4，50μl/孔终止，用酶标仪OD450nm处读数。结果如图5所示，当Hela细胞数目为5x104时得到的OD值基本上趋于平缓，在HPV18E7多抗体包被夹心ELISA检测中呈明显阳性而阴性对照CHO细胞即使在最大细胞数2.5x105时仍呈阴性。因此，该多抗体包被夹心ELISA方法能够特异的识别人宫颈癌细胞中HPV18E7蛋白。
实施例5 确定多抗体包被夹心ELISA检测宫颈癌细胞系Hela细胞数目的范围
收集人宫颈癌细胞系Hela细胞进行裂解，将细胞裂解液进行一系列稀释，细胞数目分别为5x104，2.5x104，1x104，5x103,2.5x103,1x103，每个样品设置两个复孔，100μl/孔，按照实施例3的步骤检测H11和F1抗体的检测效果，如图6所示当Hela细胞数目为1x103时与空白组的OD值仍有统计学差异，表明HPV18E7多抗体包被夹心ELISA能够检测的Hela细胞数目的下限在1000以下。
实施例6 确定多抗体包被夹心ELISA检测细胞混合裂解液中宫颈癌细胞系Hela细胞数目的范围
分别收集人宫颈癌细胞系Hela和中国仓鼠卵巢细胞CHO，将细胞分别进行裂解后，离心取裂解液上清按不同的比例进行混合。细胞的总数目为1x104，Hela和CHO细胞混合的比例分别为1：1,1:9,1:19,1:49四个梯度。其中1x104个Hela细胞为阳性对照，1x104个CHO细胞为阴性对照，空白为仅加入细胞裂解液。每个样品设置两个复孔，100μl/孔，按照实施例3的步骤检测H11和F1抗体的检测效果，结果如图7所示当Hela细胞与CHO细胞的比例为1:9时，即Hela细胞数目为1000，CHO细胞数目为9000时所得的OD值与阴性对照和空白对照均具有统计学差异，而当Hela细胞与CHO细胞的比例为1:19时，即当Hela细胞数目为500，CHO细胞数目为9500时所得的OD值与阴性对照和空白对照无统计学差异，即为阴性。因此，当HPV18E7多抗体包被夹心用于正常细胞和肿瘤细胞混合裂解液检测时，检测的肿瘤细胞的最低数目介于500-1000之间。
实施例7 试剂盒
本实施例中试剂盒包括独立存放的F1单克隆抗体、H11单克隆抗体；生物素化的F1抗体；生物素化的H11抗体；细胞裂解试剂(50mM Tris-HCl,150mMNaCl,1％NP-40,0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)；以其其它缓冲溶液。
按照实施例3所记载的方法使用本试剂盒。
另外，该试剂盒还包括说明书，在说明书中记载该试剂盒的使用方法。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种免疫原(抗原)的检测方法，其特征在于，所述方法中包括步骤：
(i)将固定化的第一检测抗体与样品中的所述免疫原接触，形成第一复合物；
(ii)将所述第一复合物与第二检测抗体接触形成第二复合物；
(iii)检测所述第二复合物；
其中，所述步骤(i)中，所述第一检测抗体中包含至少2种(优选地为2-5种，更优选地为2或3种)针对所述免疫原的单克隆抗体；所述第二检测抗体带有检测标记。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一检测抗体中的不同种单克隆抗体分别针对所述免疫原的不同抗原表位。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二检测抗体为带有检测标记的所述第一检测抗体。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述免疫原为疾病标志性蛋白；优选地，所述疾病包括但不限于：病毒或病菌感染、炎症、肿瘤、心脑血管疾病；更优选地，所述免疫原为病毒壳体蛋白或其片段；最优选地，所述免疫原为HPV蛋白。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一检测抗体中包含2种单克隆抗体。
6.如权利要求1所述的方法，其中，所述第一检测抗体中包含第一单克隆抗体和第二单克隆抗体以及任选地第三单克隆抗体，所述第一单克隆抗体与所述第二单克隆抗体的重量比为1-3：3-1。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(i)中，所述“固定化的第一检测抗体”为包被于酶标板的所述第一检测抗体；优选地，所述“包被于酶标板的所述第一检测抗体”包被浓度为2-6μg/ml，优选地为3-5μg/ml，如3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述第二检测抗体的使用浓度为0.5-3μg/ml，优选地为1-2μg/ml。
9.一种用于免疫原检测的检测板，其特征在于，所述的检测板固定有第一检测抗体，所述第一检测抗体中包含至少2种(优选地为2-5种，更优选地为2或3种)针对所述免疫原的单克隆抗体，所述至少2种单克隆抗体分别针对所述免疫原的不同抗原表位。
10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：
权利要求9所述的检测板，或者
用于形成所述检测板的酶标板和独立包装的所述第一检测抗体，以及任选的缓冲液和细胞裂解试剂。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CN201510032961.5A CN105866420B (zh) | 2015-01-22 | 2015-01-22 | 一种检测免疫原的方法和装置 |
Applications Claiming Priority (1)
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Denomination of invention: A method and device for detecting immunogens Granted publication date: 20181116 Pledgee: Suzhou Beiming Intelligent Manufacturing Co.,Ltd. Pledgor: ATTOGEN BIOMEDICAL (SUZHOU) Inc.,Ltd. Registration number: Y2024990000122 |
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