CN116410305A - 一种用于检测宫颈癌病理组织中hpv16 e6蛋白的单克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种识别HPV16 E6蛋白的单克隆抗体及其应用，该抗体能够高特异性、高灵敏度地检测宫颈组织细胞中的HPV16 E6致癌蛋白，从而能够明显区分由HPV16持续感染所引起的宫颈上皮内病变及癌变，有助于对肿瘤组织的鉴别、分级、及疾病进展情况评估，为医生准确诊断相关病例提供有效的辅助检测信息。

Description

一种用于检测宫颈癌病理组织中HPV16 E6蛋白的单克隆抗体

技术领域

本发明属于生物诊断及医药领域，具体地说，本发明涉及一种用于检测宫颈癌病理组织中HPV16 E6蛋白的单克隆抗体。

背景技术

宫颈癌(前)病变的最终诊断是以病理组织细胞形态学作为金标准。宫颈病变即：宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)，其病变级别分为CIN1、CIN2和CIN3，及原位癌和浸润癌。其中低度上皮内瘤变CIN1通常是人乳头瘤病毒HPV急性感染的表现，病变消退转为正常组织的概率很高。高度上皮内瘤变CIN3具有进展为癌的显著风险，因此临床治疗方案明确。目前临床上对CIN2的处理存在争议，因为精确诊断有困难，适合的治疗方案也不确定。观察者对CIN2诊断有较大程度的差异，即使是在受训严格的美国，对CIN2的判读也存在明显不一致。CIN2不仅仅是一种独立的中间病变，似乎更是低级别和高级别病变的混合，而通过组织学很难对此进行简单和明确的区分。因此如何区分低级别和高级别病变，精确诊断宫颈恶性病变，为临床干预和治疗提供更精准的信息，成为临床宫颈诊疗中亟待解决的问题。

因此，本领域技术人员致力于开发一种不依赖于病理组织细胞形态学的检测方法和技术，以检测由HPV16引起的宫颈癌，特别是高度宫颈上皮内瘤变。同时一方面区分非恶性病变的细胞发育异常，另一方面也可提示具有高度恶变风险的早期宫颈病变，为临床诊疗提供更为客观、精准的诊断方案。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测宫颈癌病理组织中HPV16 E6蛋白的单克隆抗体。

在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:5所示的HCDR1，

SEQ ID NO:6所示的HCDR2，和

SEQ ID NO:7所示的HCDR3。

在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。

在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。

在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区。

在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:8所示的LCDR1，

SEQ ID NO:9所示的LCDR2，和

SEQ ID NO:10所示的LCDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。

在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。

在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。

在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的。

在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或

(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：

如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链。

在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV16抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV16 E6蛋白的抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。

在另一优选例中，所述抗体为IgG型抗体。

在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HPV；优选地，特异性抗HPV16；更优选地，特异性抗HPV16 E6蛋白。

在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，其编码选自下组的多肽：

(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；或

(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。

在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:2、4、11、12、13、14、15或16所示的序列。

在本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明的第七方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。

在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。

在本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：

(a)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：

(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物；以及

(ii)药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。

在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：生殖道、呼吸道和消化道癌症，较佳地包括：宫颈癌、肛门癌、生殖器癌症、口腔癌、头颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌或肺癌。

在本发明的第十二方面，提供了如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；

所述试剂、检测板或试剂盒用于：

(1)检测样品中HPV E6蛋白；和/或

(2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV E6蛋白；和/或

(3)检测表达HPV E6蛋白的肿瘤细胞；和/或

(4)鉴别HPV E6蛋白的类型；

所述药剂用于治疗或预防表达HPV E6蛋白的肿瘤。

在另一优选例中，所述HPV E6蛋白包括HPV16 E6蛋白和/或HPV18 E6蛋白，优选含有HPV16 E6蛋白。

在另一优选例中，所述样品中含有HPV18 E6蛋白和HPV16 E6蛋白，优选含有HPV16E6蛋白。

在另一优选例中，所述肿瘤包括：泌尿生殖系统的肿瘤、肛门癌、口腔癌、头颈癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。

在另一优选例中，所述“泌尿生殖系统的肿瘤”包括：宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、或阴茎癌。

在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

在本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中HPV E6蛋白的方法，所述方法包括步骤：

(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；

(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E6蛋白。

在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。

在另一优选例中，所述HPV E7蛋白包括HPV16 E6蛋白和/或HPV18 E6蛋白，优选含有HPV16 E6蛋白。

在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对HPV E6蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPV E6蛋白的抗体中的至少一种为本发明第五方面所述的抗体。

在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。

在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述本发明第五方面的结合表位不同。

在另一优选例中，所述在步骤(1)中，将样品与本发明第五方面所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗所述第一抗体的第三抗体，并且在步骤(2)中检测“抗原-第一抗体-第三抗体”复合物的形成。

在另一优选例中，所述第一抗体、所述第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记。

在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。

在另一优选例中，所述样品来源于宫颈癌组织，优选宫颈癌病理组织，更优选HPV16型宫颈鳞癌病理组织。

在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。

在另一优选例中，所述方法为体外方法。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤，(3)分析抗体和抗原的亲和力。

在本发明的第十四方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明的第五方面所述的抗体或本发明的第十方面所述的免疫偶联物。

在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。

在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。

在本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的第五方面所述的抗体；和/或

(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明的第五方面所述的抗体的二抗；和/或

(3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；

或者，

所述试剂盒含有本发明的第十四方面所述的检测板。

在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。

在另一优选例中，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。

在本发明的第十六方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：

(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第九方面所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第五方面所述的抗体或本发明的第六方面所述的重组蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了蛋白电泳结果。

图2显示了单抗的兔血清效价ELISA检测。

图3显示了ELISA检测6株重组单克隆抗体结合HPV E6蛋白不同位点的实验结果。

图4A显示了宫颈癌组织阵列的分布方式。

图4B显示了A3E1克隆上清免疫组织化学染色法检测宫颈癌组织中的HPV16 E6蛋白的实验结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，获得了一株亲和力高、特异性强的抗HPV16 E6单抗。本发明的抗HPV16 E6单抗能识别宫颈癌变组织中HPV16特异性的E6癌蛋白，并且能明显区分由HPV16感染和基因整合导致的宫颈上皮内病变及癌变，有助于疾病进展的评估。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明人通过从免疫的动物(兔子)外周血PBMC中分离淋巴B细胞，通过B细胞在经过E6抗原蛋白包板处理的培养皿中结合E6抗原达到富集和筛选可以结合E6蛋白抗原的特异性B细胞。最后将富集的B细胞经过有限稀释，将细胞悬浮液分配到50盘96孔板中，以致达到在每个孔中培养单个B细胞(或每孔中少于10个B细胞)并实现单克隆B细胞扩增的目的。培养7天之后，取B细胞培养液上清，检测ELISA活性梯度。通过使用GST-融合蛋白抗原包板进行ELISA检测，培养液中含B细胞分泌的抗体，其结合目的抗原的活性及特异性可以通过ELISA作为初步筛选。初筛结果，在大约4800个B细胞克隆的上清液样本中，获得43株ELISA活性较高的B细胞克隆。

对ELISA阳性的43株B细胞克隆，扩大培养并收集培养上清液，含有分泌的抗体样本，进行第二轮实验筛选检测，通过免疫组化等方法检测抗体克隆识别宫颈癌组织中内源E6蛋白的能力。通过在宫颈组织及其它组织切片上进行免疫组化应用鉴定抗体克隆，从43株抗体克隆中筛选了12株后选抗体。对12株候选克隆进行抗体免疫球蛋白IgG基因克隆。通过提取B细胞total RNA，用专用IgG重链和轻链引物扩增可变区基因并完成可变区测序，最后通过生物工程构建蛋白表达载体，在工程菌株CHO中生产重组抗体蛋白，并用Protein A亲和纯化柱纯化IgG。

第三轮筛选和鉴定，通过对重组抗体样本的细胞免疫检测法、免疫组织化学检测法，进一步筛选和鉴定，最终获得一株高亲和力、高特异性的抗HPV16 E6单抗A3 E1。

宫颈癌和HPV病毒

在人类所有肿瘤中，宫颈癌是目前病因唯一明确的肿瘤，同时也是唯一可以预防的肿瘤。在一过性HPV感染中，病毒外壳基因的复制，没有影响到宿主正常的细胞周期，细胞不会增殖失控。而在HPV持续性感染的高度病变患者中，HPV将其基因整合到寄主基因组中并由寄主细胞表达该致癌基因产物E6/E6蛋白。HPV来源的癌蛋白，其功能是以破坏表皮干细胞的正常细胞周期导致细胞永生化，即：癌变。癌蛋白E6/E6的大量表达状态与癌变恶化程度呈正相关。E6基因是高危型人乳头瘤病毒(hrHPV)重要的致癌基因之一，其基因产物E6蛋白具有致癌功能，故称为E6 Oncoprotein。E6蛋白由大约150个氨基酸组成，其蛋白存有Cys-x-x-Cys序列为两种锌指结构，与恶性转化、转录激活、细胞蛋白相互作用等密切相关。高危HPV介导的E6癌蛋白功能可通过多种途径调节细胞通路。目前已明确，E6可有效抑制p53活性，一方面通过泛素(ubiquitin)依赖的蛋白酶系统(UPS)促进p53的降解，另一方面可直接与p53蛋白结合，导致抑癌功能丧失，染色体稳定性下降，细胞无法纠正DAN损伤。E6还能激活端粒酶活性，使细胞逃避衰老过程中的增殖限制，最终导致细胞永生化。此外，E6能靶向其他参与细胞凋亡的蛋白，以抑制细胞凋亡信号通路。研究表明，高危型HPV的E6蛋白C端存在一个特有的PDZ结合基元(PBM)，通过与胞内多种蛋白的PDZ结构域结合，发挥维持病毒拷贝数和增殖、破坏宿主稳态和极性、促进细胞持续性感染等多重作用形成致癌性转化。多种通路与机制协同作用，在细胞环境中建立长期感染的可能，导致宿主基因突变，最终转化为恶性肿瘤。

HPV是一种小DNA病毒，具有很强的嗜鳞状上皮的特性，主要侵犯鳞状上皮的基底层细胞和位于宫颈转化区的化生细胞。目前已知的有一百多个型别，根据致癌性，分为高危型HPV和低危型HPV两类。与人类肿瘤相关的高危型HPV有四十几种，其中常见的主要包括HPV18、HPV16等13种型别。在肛门-生殖器癌症、口腔癌、头颈癌等疾病中均检测出相关HPV的基因组信息，因此对于HPV相关癌症中E6、E6癌蛋白的研究具有重要临床意义。

抗体

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

本发明还包括具有所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')₂片段；抗体重链；抗体轻链。

如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括以下三个互补决定区HCDR：

HCDR1，其氨基酸序列为ANYWIY(SEQ ID NO:5)，其编码核苷酸序列为，GCCAACTACTGGATATAT(SEQ ID NO.3)；

HCDR2，其氨基酸序列为SIFTSDGETHYATWAKG(SEQ ID NO.6)，其编码核苷酸序列为，

TCCATTTTTACTAGTGACGGTGAGACTCACTACGCGACCTGGGCGAAAGGC(SEQ ID NO.5)；

HCDR3，其氨基酸序列为GGAL(SEQ ID NO.7)，其编码核苷酸序列为，GGAGGGGCCTTG(SEQ ID NO.13)。

在另一优选例中，所述重链可变区的氨基酸序列为：

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGGLVTPGGTLTLTCTASGIDFSANYWIYWVRQTPGKGLEWIASIFTSDGETHYATWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTATYFCATGGALWGPGTLVTVSS(SEQ ID NO.1)；

其编码核苷酸序列为：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCACGCCTGGAGGAACCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGAATCGACTTCAGTGCCAACTACTGGATATATTGGGTCCGCCAGACTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGCATCCATTTTTACTAGTGACGGTGAGACTCACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTCCAAATGACCAGCCTGACAGCCGCGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCGACAGGAGGGGCCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.2)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区，所述重链恒定区可以为鼠源或人源。

如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：

LCDR1，其氨基酸序列为QASEDIENYLA(SEQ ID NO:8)，其编码核苷酸序列为，CAGGCCAGTGAGGACATTGAAAACTATTTAGCC(SEQ ID NO.14)；

LCDR2，其氨基酸序列为KASTLAS(SEQ ID NO:9)，其编码核苷酸序列为，AAGGCATCCACTCTGGCATCT(SEQ ID NO.15)

LCDR3，其氨基酸序列为QSNYYNFGSNYGSFA(SEQ ID NO:10)，

其编码核苷酸序列为，

CAAAGCAATTATTATAACTTTGGTAGTAATTATGGTTCGTTTGCT(SEQ ID NO.16)

在另一优选例中，所述的轻链可变区的氨基酸序列为：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADIVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASEDIENYLAWYQQKPGQPPKRLIYKASTLASGVPSRFKGSGSGTDFTLTISDLECADAATYYCQSNYYNFGSNYGSFAFGGGTEVVVK(SEQ IDNO.3)，

其编码核苷酸序列为：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTACTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCTGACATTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGAAAACTATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCGCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCAATTATTATAACTTTGGTAGTAATTATGGTTCGTTTGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA(SEQ ID NO.4)。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HPV16 E6蛋白的抗体，例如具有重链和/或轻链的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

在另一优选例中，所述的抗体为抗HPV16E6蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有HPV16E6蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

表A

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQID NO.2、4、11、12、13、14、15或16所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

组合物

本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合HPV16E6蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

单克隆抗体的制备

根据抗体制备方式不同，主要有多克隆抗体(Polyclone Antibody,pAb)，单克隆抗体(mAb)和重组抗体(Recombination Antigen,rAb)三种形式。多克隆抗体制备方法简单，费用低，是早期免疫分析应用较多的抗体形式。单克隆抗体亲和力高、特异性强、不同批次之间差异小，杂交瘤细胞株一经建立，抗体的供应源源不断，适合在免疫学方法检测中应用，因此，近年来单克隆抗体在免疫分析中的应用逐渐增多。随着技术的进步，又将重组抗体技术应用越来越广泛，如早在2001年Moghaddam等就报道了一种重组抗体的研制，2010年Min等人又报道了一种由大肠杆菌表达的单链抗体。pAb、mAb均属于传统抗体，在免疫分析中应用广泛，重组抗体是一种新兴的抗体，目前尚处于理论研究和实验室研发阶段。

本发明的单克隆抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术平台进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物BALB/c小鼠以诱导单克隆抗体的产生。对于单克隆抗体，可利用杂交瘤技术来制备，噬菌体展示技术，Single B Cell cloning平台或可用重组DNA法(美国专利号4,816,567)制备。

代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体。

对杂交瘤细胞生长的培养基上清进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法培养单克隆抗体。适宜于杂交瘤细胞生长的培养基，例如，DMEM(高糖)或RPMI-1640培养基或无血清培养基。此外，可通过在动物体内注射杂交瘤细胞作为腹水瘤生长。

由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺包括，蛋白A/G-琼脂糖法(protein A/G-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。

噬菌体展示技术筛选单链抗体的原理是采用基因工程手段将抗体重链(VH)、轻链可变区(VL)基因片段通过一个连接臂连接后插入噬菌体或噬菌粒的信号肽编码区，使得插入片段与噬菌体膜蛋白融合，并展示在噬菌体衣壳蛋白的表面，建立噬菌体展示抗体库，通过“吸附-洗脱-富集”的生物淘选过程，筛选得到阳性噬菌体展示单链抗体。

根据噬菌体(粒)载体上的插入片段来源不同，噬菌体展示抗体库可分为三大类：免疫抗体库、天然抗体库以及人工合成抗体库。免疫抗体库是以经抗原免疫后的动物血液中mRNA作为模板，合成抗体可变区，将可变区基因插入到特定的载体上，由于经过抗原免疫，可刺激动物机体淋巴细胞分泌产生特异性抗体，因此，这种抗体库含有大量诱导的特异性抗体的基因，可以有针对性的筛选高亲和力抗体，筛选出阳性抗体的几率较大；直接提取未经免疫的动物骨髓干细胞、外周淋巴细胞和脾脏B细胞中的mRNA，反转录为cDNA，将抗体可变区基因扩后与载体连接，得到的抗体库为天然抗体库。未经免疫的动物血液mRNA决定了抗体库的多样性，应用范围更广，不局限于某一种或几种抗原；抗原-抗体的特异性反应主要取决于可变区的空间构相，在分子层面，取决于抗体重链、轻链可变区CDR(Complementarity Determining Region)的DNA序列，通过基因工程手段对CDR区域基因序列进行人工改造，可大大提高抗体库的多样性，这种通过对抗体序列进行基因改造的方法得到的抗体库为人工合成抗体库。

本发明中实验步骤，首先以HPV16亚型的E6蛋白构建成MBP-16E6作为免疫原，对Balb C小鼠进行免疫，并通过杂交瘤制备和筛选技术分离阳性杂交瘤克隆，其目的是通过筛选、分离、鉴定杂交瘤克隆分泌的免疫球蛋白IgG，达到获得高质量、高特异性和亲和力的抗E6蛋白的单克隆抗体试剂。实验流程通过免疫3只Balb C小鼠，ELISA检测三免后血清，1:4000稀释后对应OD值大于1.0为阳性cut-off值。选择免疫效果最好的一只小鼠进入细胞融合，经过两次亚克隆筛选最终获得48个阳性克隆，将所有克隆腹水生产并Protein G纯化抗体。经过对这些抗体进行病理组化实验检测FFPE病理切片，以免疫化学方法(immunohistochemistry，IHC)对宫颈癌组织标本、病理活检标本，及阴性对照组织样本进行测试。实验结果，该试验未获得可以特异性结合FFPE样本中宫颈癌细胞表达的内源E6癌蛋白的单克隆抗体。

本发明的采取的另一套实验技术路线，采用兔子免疫结合单个B细胞筛选、分离及分子克隆技术，通过筛选和鉴定抗体克隆针对FFPE制备的宫颈癌组织样本及非宫颈癌组织样本的反复筛选测试，获得了一株针对癌组织表达内源E6蛋白的单克隆抗体。本发明提供了一种针对肿瘤细胞内源表达的E6蛋白的兔源单克隆抗体的开发技术。在本发明的一个优选的方案中，兔子单克隆抗体采用分离Single B Cell的方法制备。B细胞的获得通过采集兔外周血，进行无菌分离和培养外周血分离的单核细胞(PBMC)中的抗体分泌型B细胞。根据B细胞携带membrane-associated IgG原理，E6抗体阳性B细胞克隆可以通过与吸附在固相(固体表面上)的抗原相结合，从而达到对B细胞进行捕捉或富集的效果。富集的含有E6抗体分泌活性的B细胞pool，通过limited dilution方法，分装到96孔板细胞培养板中培养，达到单细胞水平的分离、培养扣增。经过对B细胞培养上清液(含分泌的抗体)进行分析与筛选，从而精准、高效的筛选出分泌目标抗体分子的B细胞。

本发明的一个优选的方案中，从ELISA检测结果OD值大于1.0的细胞培养盘阳性孔内提取细胞中的total RNA，可使用商业化RNA提取试剂(诺唯赞，R701-01/02)，并利用商业化通用引物将total RNA其逆转录为cDNA(Prime Script^TM 1^st Strand cDNA SynthesisKit，Takara)。随后通过兔免疫球蛋白IgG重链或轻链信号肽和恒定区特异性引物扩增兔免疫球蛋白的重链和轻链V-区域片段。将所得的PCR片段通过同源重组至pCDNA3.4载体中，使用载体特异性引物对插入片段进行单细胞测序。该技术路线采用功能活性检测作为筛选步骤，结合高通量模式对B细胞克隆进行筛选，可提高对不同结合特征和亲和力的抗体分子筛选和鉴定提高覆盖率和通量100倍以上。

本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用重组DNA方法组建真核表达系统，瞬转HEK293细胞来表达抗体或者构建CHO-S稳转细胞系，再将分泌于培养基中的抗体经亲和层析柱(Protein A/G-Sephrose)进行纯化，纯度可达95％以上。

本发明研制的抗E6抗体，克服了目前已有技术的不足。已有研发数据证明，本实验室购买的商业化抗体试剂Sigma公司anti-E6抗体(克隆号：C1P5)，经测试验证，ELISA上较弱识别E6真核转染蛋白，而对宫颈癌肿瘤细胞株(CaSki，Hela)等样本均不识别，且对临床病理组织标本，即：浸润性宫颈鳞癌、宫颈腺癌、CINⅡ级以上宫颈样本等，均无特异性和高亲和力反应。另外，从BIOSS厂家购买的E6抗体克隆，货号bs-1719R，对FFPE处理的宫颈癌组织样本不能识别或者出现非特异性染色，不能达到研究试剂或者临床诊断试剂盒的开发和研究的要求和标准。目前，市场上尚无高危HPV E6蛋白特异性的抗体单克隆，作为治疗药物研究或者免疫组织化学诊断试剂。

方法和样本

本发明涉及用于在组织样本检测宫颈癌的方法。该方法步骤大致如下：获得组织样本；检测在所述样本中肿瘤细胞内源E6癌蛋白的水平。本发明方法所使用的样本是临床病理通常应用的福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)的宫颈组织切片。

本发明可以用于HPV导致相关癌症中E6癌蛋白的检测，其中由高危致癌亚型HPV导致的癌症例如宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。

根据本发明，使用E6癌蛋白分子标记可以支持或甚至取代组织学检测方法。在特殊病例中，蛋白分子标记可以被用作诊断工具而不需要进一步的基于细胞的形态检测的支持。本发明所采用的生物标记是E6癌蛋白，该生物标记来源于病毒，因为组织中病毒存在的标记特性不会发生在未感染的人组织中，因此对HPV相关癌症的样本的检测具有特异性。

本发明中所采用的样本(样品)包括组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。

本发明中使用的样本可以包括固定的或保存的组织样本。组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可以获得保存介质(福尔马林、Cytyc“PreservCyt”或Tripath Imaging“Cytorich”等)。合适的保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。

试剂盒

本发明还提供了一种只含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明进一步设计用于检测高危型HPV E6癌蛋白的检测试剂，该试剂为识别高危型HPV E6癌蛋白的单克隆抗体。

本发明进一步设计开发用于对来自宫颈活检样本的HPV感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本中的高危型HPV E6癌蛋白。将组织进行福尔马林固定,石蜡包埋处理，并且被用于开发在基于非细胞形态分析基础上的对样本的HPV感染相关肿瘤进行检测的检测试剂盒和体外诊断装置。

本发明的目的之一在于提供一种检测HPV16 E6蛋白表达的方法，并且所述的方法可用于检测HPV感染相关癌症特别是宫颈癌的检测。

本发明的发明人等制作了针对人乳头瘤病毒HPV16 E6蛋白质的单克隆抗体A3E1并研究其反应性。使用此抗HPV16 E6单克隆抗体A3E1对HPV16感染阳性的宫颈癌组织样本进行免疫组织化学染色，结果发现A3E1在肿瘤细胞中有强染色反应,同时肿瘤细胞旁间质细胞和反应性细胞背景干净。

也就是说，本发明的方法是检测肿瘤标记物的方法，其特征在于：包括检测样本中的HPV16 E6的步骤。

在本发明的方法中，所述检测样本优先是宫颈上皮损伤有可能患宫颈病变的患者，也可以是宫颈已经发生病变的患者。

所述HPV16 E6优选是HPV16 E6蛋白质或其片段。在此情况时，检测所述的HPV16E6的步骤优选是使用HPV16 E6的免疫组织化学染色分析。所使用的抗HPV16 E6抗体优选是抗HPV16 E6单克隆抗体。

所述方法免疫检测所采用的来自HPV16 E6癌基因表达的蛋白作为HPV16相关的恶性或恶变前细胞发生的可靠指标。本发明最有用的方面之一是在对子宫颈癌、鳞状上皮细胞损伤和腺癌及与致癌HPV16感染相关的任何上皮细胞异常的诊断中的应用，所示的致癌HPV16感染包括中空细胞病；角化过度症；包括上皮内瘤形成或上皮内病变的癌前期病症；高度发育不良；和侵染性或恶性癌症。除宫颈癌外，对HPV16 E6的检测对检测膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤也是有用的。

本发明的另一个目的通过本发明的方法提供一种检测试剂盒。该试剂盒可以是诊断试剂盒或研究试剂盒。

本发明的试剂盒是用以检测肿瘤标记物的试剂盒，其特征在于具有抗HPV16 E6单克隆抗体。本发明的试剂盒优先是具有用以检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV16 E6抗体，更优选是抗HPV16 E6单克隆抗体，尤其优选是通过重组DNA技术，获得用于真核表达系统的抗HPV16 E6单克隆抗体基因重组表达载体。由真核表达系统产生的抗HPV16 E6兔单克隆抗体或是与该抗HPV16 E7兔单克隆抗体具同等的结合活性的单克隆抗体。

本发明提供了一种方法通过检测细胞内源的HPV16 E6蛋白，区分宫颈非恶性病变的肿瘤细胞，并且在临床上广泛采用的中性福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片中匹配使用，从而能够在癌症演变的早期作出诊断，为及时治疗提供依据。

进一步，本发明还提供一种采用该检测方法所形成的检测试剂盒。

本发明的主要优点包括

(1)本发明提供的针对HPV16 E6蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。

(2)本发明提供的针对HPV16 E6蛋白的抗体能够特异性的与HPV16 E6蛋白进行结合，因此该抗体能够用于鉴定由HPV16亚型感染引起的宫颈癌病变的细胞和组织。

(3)本发明提供的检测HPV E6蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性好，检测灵敏度极高。

(4)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期诊断，并有助于对肿瘤组织的鉴别、分级、及疾病进展情况评估。

下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1人乳头瘤病毒HPV16 E6单抗制备

1.1抗原设计

通过基因工程手段分别将HPV16/18E6全长序列插入原核表达载体pGEX-4T-1，使得HPV16/18E6蛋白与Maltose binding protein(MBP)或Glutathione S-transferase(GST)标签构建成融合蛋白，质粒活化后转化原核大肠杆菌表达，经IPTG低温诱导后，菌液超声裂解，蛋白纯化并鉴定浓度、纯度。

蛋白电泳结果，如图1：4种GST-N/C HPV16/18E6重组蛋白预估分子量35kDa左右，2种MBP-HPV16/18E6重组融合蛋白分子量60kDa左右，条带位置与蛋白分子量理论值接近，E6蛋白诱导后表达量正常。

相关蛋白如下表所示：

表1.

其中，表中示出的相关序列为标签(MBP、GST)后连接的抗原序列。

多肽序列设计，通过对蛋白序列进行分析，并使用免疫位点分析软件ImmuneEpitope Database and Analysis Resource(http://www.iedb.org)。设计多条肽链的氨基酸序列：HPV16 E6的肽1、肽2、肽3、肽4、HPV18 E6的肽1、肽2、肽3、肽4(见上表)，并通过化学合成获得各多肽。

1.2动物免疫

取4只6个月新西兰大白兔，选定2只以免疫原全长MBP-HPV16 E6蛋白，免疫程序见表2；选定另外2只常规免疫方案，以多肽1-KLH免疫1只兔子，多肽2-KLH免疫1只兔子，见表3。全部采用GST标签混合重组蛋白(1μg/ml)作为检测抗原包被，第四次免疫7天后，间接ELISA法检测兔血清效价，以此确定免疫应答的水平。如果免疫动物能够达到针对检测原的免疫应答水平(OD值>1.0，效价达到1:64,000)，则进行B细胞克隆筛选。结果Rb16-1和Rb16-2两只兔血清效价最高，达到克隆筛选标准(图2)。

表2动物免疫实验时间表(重组抗原蛋白)

步骤	时间表	剂量
			免疫前采血	第－4天
第一次免疫	第0天	200μg/只
			第二次免疫	第14天	200μg/只
采血检测	第21天
			第三次免疫	第28天	200μg/只
采血检测	第35天
			第四次免疫	第42天	1*10^7/只
采血检测	第49天
			终免	待定	400μg/只
B细胞分离、培养	终免4天后

表3动物免疫实验时间表(多肽抗原)

步骤	时间表	剂量
			免疫前采血	第－4天
第一次免疫	第0天	500μg/只
			第二次免疫	第14天	500μg/只
采血检测	第21天
			第三次免疫	第28天	500μg/只
采血检测	第35天
			第四次免疫	第42天	1*10^7/只
采血检测	第49天
			终免	待定	1000μg/只
B细胞分离、培养	终免4天后

1.3B细胞分离及克隆筛选

从2只兔子中采集15～30ml新鲜外周血，使用无菌管采血，然后采用抗原GST-E6融合蛋白包板，通过表达膜外抗体的B细胞与E6抗原蛋白结合，对特异性B细胞进行富集。富集后的细胞按照一定的细胞密度铺到提前铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中。将板在37℃下在5％CO₂中孵育。6天的孵育之后，更换新鲜的培养基，第7天收集培养过夜的上清，开始使用下文所述的ELISA结合来测试针对E6蛋白抗体的存在情况。

1.4ELISA结合检测方法

间接ELISA用于评估上清液中抗体对于E6蛋白的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中2μg/ml的重组E6蛋白在4℃下包被过夜。用PBST(0.05％吐温)洗涤板，并将其用300μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭1小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μl B细胞培养上清液，然后在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗，37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液并在室温下在黑暗中孵育13分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(国药，10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。选择OD值大于1.0的阳性孔进行后续实验。

1.5单克隆抗体的可变区测序

使用RNA提取试剂(诺唯赞，R701-01/02)提取OD值大于1.0的孔内总细胞的RNA，并利用通用引物(Prime Script^TM1^stStrand cDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过抗体信号肽和恒定区特异性引物扩增兔免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段通过同源重组至pCDNA3.4载体中，使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获取了克隆的独特V-区域蛋白氨基酸序列及质粒。

1.6小规模转染表达

免疫球蛋白基因可变区V区序列克隆到IgG重链HC和轻链框架的哺乳动物表达载体上进行表达，然后进行扩大规模瞬时转染CHO细胞(ExpiFectamine CHO TransfectionKit，gibco)。细胞培养48小时之后，收集含有分泌型免疫球蛋白IgG的上清培养液。采用Protein A/G亲和层析方法纯化抗体，收集蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用紫外分光光度计OD260/OD280测定抗体蛋白浓度，间接ELISA检测抗体效价。

实施例2单抗的鉴定

2.1兔血清效价ELISA检测:

包被抗原选用GST-HPV18 E6 C端、GST-HPV18 E6 N端、GST-HPV16 E6 C端和GST-HPV16 E6 N端4种重组蛋白混合包被，2μg/ml包板，4℃过夜。同时设置空白对照(包被抗原，加空白抗体稀释液)。次日PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉室温封闭2h，PBST洗涤拍干后，分别加入Rb16-1、Rb16-2、Rb16-3、Rb16-4(1#、2#、3#、4#)，E6免疫前和免疫后兔血清，梯度倍比稀释(1:200,1:400,1:800,1:1.6K,1:3.2K,1:6.4K,1:12.8K倍比稀释)，GST抗体(ZFanti,ZF0055,1:5000)，37℃孵育1h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:2500)，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干后加TMB solution，37℃反应10min后2M H₂SO₄终止显色，于酶标仪OD450nm处读数。

结果见图2：Rb16-1、Rb16-2兔血清的在同一浓度下的OD值均高于其余两只，在稀释比在1:200时OD值均高于3.000，稀释比到达1:1600时OD值也高于2.000，故其效价高于Rb16-3、4血清。最终选定Rb16-1、2兔血清进行下一步B细胞筛选。

2.2克隆上清免疫组织化学染色法检测宫颈癌组织中的HPV16 E6蛋白

宫颈癌组织阵列的分布方式如图4A，具体的位点信息见表4。分别以克隆上清10D6，4C7，A3E1，77B5，11H1，44C1为一抗对宫颈正常组织和宫颈癌组织阵列，进行免疫组织化学染色，设置实验体系质控,加E7-IHC抗体检测试剂盒(艾托金生物医药(苏州)有限公司，克隆号AT-RMA034/AT-RMA039)。方法如下：将病理石蜡切片先浸泡在二甲苯中两次，每次10分钟；然后依次浸泡在100％乙醇、95％乙醇、90％乙醇、80％乙醇、70％乙醇中，各5分钟，最后去离子水洗两次；将组织切片放入煮沸的0.01M枸橼酸钠缓冲溶液(pH6.0)中，水浴20分钟；室温冷却30分钟，PBST洗三次，每次3分钟；为了使内源过氧化物酶失活,加入3％H₂O₂室温处理10分钟；PBST洗涤3次，每次3分钟；分别加入上述6株抗体和E7-IHC一抗，室温孵育1小时；经充分洗涤后滴加免疫显色试剂，室温孵育30分钟；经充分洗涤后DAB染色液显色2-6分钟(显微镜下观察)，纯水浸洗3分钟；苏木素复染1分钟，自来水冲洗干净并返蓝；分步脱水，依次70％乙醇、80％乙醇、95％乙醇、无水乙醇各浸泡5分钟；最后二甲苯浸泡两次，每次5分钟；再中性树胶封片；最后显微镜观察拍照。

表4：宫颈癌组织阵列1信息

结果见图4B：抗体克隆A3E1在宫颈癌组织阵列1中的HPV16型宫颈鳞癌(B)和HPV16/18型宫颈鳞癌(D)样本中有明显的棕色染色，染色部位主要为细胞核染色。A和C样本无染色，且正常宫颈组织样本中背景较干净；10D6、4C7在宫颈癌组织阵列的癌变细胞中有明显的棕色染色，同时在组织中间质细胞和反应性细胞也存在较明显的棕色背景着色；77B5、11H1、44C1在宫颈癌组织阵列中的4例组织均染色很弱。

综上所述，克隆上清A3E1能够特异的识别宫颈癌组织中的HPV16 E6蛋白从而使宫颈癌变细胞呈棕色染色，且染色定位于胞核与胞质中。

2.3ELISA检测6株克隆结合HPV E6蛋白不同位点分析

抗原分别选用GST-HPV18 E6 C端、GST-HPV18 E6 N端、GST-HPV16 E6 C端、GST-HPV16 E6 N端4种重组蛋白，分开包被，同时设置空白对照(包被抗原，加空白抗体稀释液)。2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，分别加入克隆上清10D6，4C7，A3E1，77B5，11H1，44C1(1:1稀释)，GST抗体(ZFanti,ZF0055,1:5000)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:2500)，37℃反应30min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止OD450nm处读数。

结果见图3：A3E1能特异性的结合GST-HPV16 E6 N端，即A3E1能够相对特异性结合HPV16亚型的E6蛋白N段片段。

2.4细胞免疫学ICC检测抗体克隆上清液染色CaSki宫颈癌细胞系、HeLa/阴性临床样本、阳性临床样本：

表达HPV16 E6蛋白的宫颈癌细胞株CaSki细胞，在此用作高度子宫颈病变状态中的E6蛋白过表达的肿瘤细胞模型(阳性对照)。同样表达HPV16 E6蛋白的宫颈癌细胞株HeLa细胞混合阴性临床样本，在此作为阴性对照，以阳性临床样本作为另一阳性对照。用克隆上清A3E1分别对这三种细胞进行免疫细胞化学染色试验。具体实验方法如下：

CaSki，HeLa细胞分别复苏培养后，在离心管内加入适量细胞保存液，用宫颈采样刷刷取培养皿内的细胞，并在离心管内涮洗采样刷，用细胞计数板计数后4℃保存待用，其中CaSki采用自然沉降法制片(每片5000个以上细胞),HeLa细胞混合阴性临床样本、阳性临床样本均采用离心制片法(每片5000个以上细胞)；制片结束后95％乙醇固定20分钟，50％乙醇复水10分钟后EDTA(pH 9.0)热修复，冷却后加入3％H₂O₂室温处理10min，甩干；加入PBST洗液洗3min，甩干；分别加入克隆上清A3E1与E7-ICC一抗(体系质控)，室温孵育30分钟；加入PBST洗液洗3次，每次3分钟，甩干；加入免疫显色试剂室温孵育30分钟；加入PBST洗液洗3次，每次3min，甩干；加入DAB显色液,室温反应，显微镜下观察染色结果，蒸馏水洗涤终止反应。显微镜下观察结果并记录。

结果：A3E1在CaSki样本上染色较弱，HeLa染色较弱，阳性样本上几无特异性染色，阴性样本和阳性样本上背景均较高。故此克隆不适用细胞样本的免疫细胞化学染色。

2.5单抗Ig亚类的鉴定：

纯化单抗采用PBS 1:10 000稀释，按照Sigma公司的亚型鉴定试剂盒说明书操作。

2.6ELISA检测单克隆抗体交叉反应：

选定13种HPV亚型E6癌蛋白抗原，序列见下表5。

表5.

名称	序列(GenBank)
		Flag-HPV16 E6	AYV61474.1
Flag-HPV18E6	AGG40787.1
		Flag-HPV31E6	ASU09811.1
Flag-HPV33E6	ACL12326.1
		Flag-HPV35E6	QJD37939.1
Flag-HPV6 E6	QEE83769.1
		Flag-HPV11E6	QEE83815.1
Flag-HPV39E6	AGU90551.1
		Flag-HPV51E6	AMK51250.1
Flag-HPV52E6	AFC35296.1
		Flag-HPV58E6	AWA45985.1
Flag-HPV59E6	ACL12334.1
		Flag-HPV68E6	ACX32377.1

融合蛋白以2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入单抗(1μg/ml)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再加入羊抗鼠-HRP二抗(Sigma A2554)(1:10 000)37℃反应30min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H₂SO₄终止，OD450nm处读数。

2.7抗体重链可变轻链可变区、及CDR序列信息：

选择最优抗体克隆A3E1，通过基因克隆技术，获得免疫球蛋白IgG的重链可变区序列，轻链可变区序列及其CDR的序列如下：

Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4

表6.序列信息

讨论：

本发明人采用上述方法制备HPV16 E6兔源单克隆抗体，通过B细胞克隆培养上清液在抗原蛋白E6及标签无关蛋白的初步筛选，并进行免疫组化方法检测鉴定抗体克隆识别FFPE处理的宫颈癌组织中内源E6蛋白能力。含阳性抗体的B细胞克隆用于提取RNA，扩增和分子克隆技术及测序技术，获取免疫球蛋白基因，重链可变区和轻链可变区序列。最后通过生物工程技术在抗体表达工程细胞株株(CHO，293T细胞)中生产全长免疫球蛋白IgG。纯化的抗体克隆通过在宫颈组织及其它组织切片上进行免疫组化应用鉴定，筛选了6株抗体最终拿到一株亲和力高，能高亲和力的特异性结合Flag-HPV16 E6单抗的A3E1，并且能识别宫颈癌变组织中HPV16阳性的E6癌蛋白。

常用的高通量ELISA方法通常可以检测抗体分子对天然构象蛋白抗原的结合，而经过FFPE处理的组织病理切片，其标本中含有的目的蛋白经化学反应偶联或固定、石蜡包埋处理之后，可能引起巨大的蛋白立体构像改变，使得抗体原本可以结合天然蛋白的位点，由于蛋白变性和构象改变导致抗体结合位点被破坏或消失，以至抗体亲和力大大减弱，无法与抗原表面结合位点或氨基酸线性序列结构形成有效的免疫结合物。本发明通过摸索候选抗体克隆在各种实验反应条件下对抗原蛋白的免疫亲和活性，对FFPE标本经过不同物理和化学方法处理以达到抗原修复最佳条件。为达到组织切片内抗原的不同暴露方式以及对抗体结合的不同反应情况，实验尝试条件包括：对比不同修复方式(酶法、微波、高温高压、酸性pH缓冲液、或碱性pH缓冲液，等)，对于抗原修复效果以抗体结合的情况及信号放大为评估标准。最后，鉴定出柠檬酸(低pH)缓冲液配制的抗原修复液，采用水浴法是暴露FFPE组织中E6抗原表位,以达到抗体克隆高亲和力结合靶点E6蛋白的最佳修复方式。进一步优化抗体结合试验条件还包括匹配的高灵敏度、高特异性的二抗检测反应系统(酶标葡聚糖链合物二抗、灵敏型DAB显色剂)。经过优化的实验方法可以多重放大信号，使抗体在组织细胞中的染色定位更准确清晰，阳性结果更稳定，最终目的是使E6抗体检测试剂盒有助于病理医师精准诊断。

本研究表明A3E1克隆可以特异性结合宫颈癌变细胞中的HPV16 E6致癌蛋白，通过二抗信号放大和催化DAB色原底物显色，使宫颈癌组织切片中的恶性癌变细胞呈现胞核/质特异性棕色染色，使癌变细胞直观、客观的被标记出来。

宫颈由HPV持续感染最终进展为宫颈癌一般需要10年左右的时间，整个宫颈病变进展过程分为宫颈上皮内瘤变(CIN)、原位癌和浸润癌。宫颈上皮内瘤变(CIN)根据病变程度又分为低度病变(CINI)、中度病变(CINII)和高度病变(CINIII)，而宫颈癌早期干预的最佳治疗窗口是CINII和CINIII。目前临床宫颈组织病理诊断金标准仍是细胞形态学诊断，因此病理诊断结果的准确性往往取决于病理医生的经验和水平，特别是对CINII级别样本的诊断上，即使是在受训严格的美国，CINII样本的判读仍存在较明显的不一致性。中国病理医生缺乏，而有经验的病理医生更是少之又少，因此对CIN特别是CINII样本的诊断迫切需要更有效的辅助手段，能客观的辅助临床诊断。在中国，导致宫颈鳞癌的HPV感染主要型别仍为HPV16和HPV18，占到宫颈鳞癌中HPV感染型别的85％左右。本发明提供免疫组化染色抗体试剂和方法，可以特异性标记宫颈上皮内瘤变细胞及癌变细胞中表达的内源性E6致癌蛋白，提示宫颈癌变存在，且疾病发展有高风险。以致癌功能蛋白E6为靶点的免疫组化检测对宫颈癌早期诊断，降低漏诊和过度诊疗都有明显的临床应用意义。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 艾托金生物医药（苏州）有限公司

<120> 一种用于检测宫颈癌病理组织中HPV16 E6 蛋白的单克隆抗体

<130> P2021-3328

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Cys Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Pro

20 25 30

Gly Gly Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser

35 40 45

Ala Asn Tyr Trp Ile Tyr Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Ala Ser Ile Phe Thr Ser Asp Gly Glu Thr His Tyr Ala

65 70 75 80

Thr Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr

85 90 95

Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr

100 105 110

Phe Cys Ala Thr Gly Gly Ala Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

115 120 125

Val Ser Ser

130

<210> 2

<211> 393

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60

tcgttggagg agtccggggg aggcctggtc acgcctggag gaaccctgac actcacctgc 120

acagcctctg gaatcgactt cagtgccaac tactggatat attgggtccg ccagactcca 180

gggaaggggc tggagtggat cgcatccatt tttactagtg acggtgagac tcactacgcg 240

acctgggcga aaggccgatt caccatctcc aaaacctcgt cgaccacggt gactctccaa 300

atgaccagcc tgacagccgc ggacacggcc acctatttct gtgcgacagg aggggccttg 360

tggggcccag gcaccctggt caccgtctcc tca 393

<210> 3

<211> 136

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ala

20 25 30

Ser Val Glu Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala

35 40 45

Ser Glu Asp Ile Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

50 55 60

Gln Pro Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly

65 70 75 80

Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

85 90 95

Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

100 105 110

Ser Asn Tyr Tyr Asn Phe Gly Ser Asn Tyr Gly Ser Phe Ala Phe Gly

115 120 125

Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

130 135

<210> 4

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctac tgctctggct cccaggtgcc 60

agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccagcctccg tggaggcagc tgtgggaggc 120

acagtcacca tcaagtgcca ggccagtgag gacattgaaa actatttagc ctggtatcag 180

cagaaaccag ggcagcctcc caagcgcctg atctacaagg catccactct ggcatctggg 240

gtcccatcgc ggttcaaagg cagtggatct gggacagatt tcactctcac catcagcgac 300

ctggagtgtg ccgatgctgc cacttactac tgtcaaagca attattataa ctttggtagt 360

aattatggtt cgtttgcttt cggcggaggg accgaggtgg tggtcaaa 408

<210> 5

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Ala Asn Tyr Trp Ile Tyr

1 5

<210> 6

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Ile Phe Thr Ser Asp Gly Glu Thr His Tyr Ala Thr Trp Ala Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 7

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Gly Ala Leu

1

<210> 8

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Ala Ser Glu Asp Ile Glu Asn Tyr Leu Ala

1 5 10

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<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 10

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Ser Asn Tyr Tyr Asn Phe Gly Ser Asn Tyr Gly Ser Phe Ala

1 5 10 15

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccaactact ggatatat 18

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tccattttta ctagtgacgg tgagactcac tacgcgacct gggcgaaagg c 51

<210> 13

<211> 12

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggaggggcct tg 12

<210> 14

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caggccagtg aggacattga aaactattta gcc 33

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaggcatcca ctctggcatc t 21

<210> 16

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caaagcaatt attataactt tggtagtaat tatggttcgt ttgct 45

<210> 17

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro

1 5 10 15

Gly Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

20 25 30

Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu

35 40 45

Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly

50 55 60

Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile

65 70 75 80

<210> 18

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu

1 5 10 15

Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn

20 25 30

Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys

35 40 45

Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met

50 55 60

Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

65 70 75

<210> 19

<211> 80

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp

1 5 10 15

Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys

20 25 30

Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala

35 40 45

Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala

50 55 60

Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His

65 70 75 80

<210> 20

<211> 78

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr

1 5 10 15

Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu

20 25 30

Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His

35 40 45

Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg

50 55 60

Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val

65 70 75

<210> 21

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp

1 5 10 15

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Leu Leu Arg Arg Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys

1 5 10 15

<210> 23

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Gln Gln Tyr Asn Lys

1 5 10 15

<210> 24

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu

1 5 10

<210> 25

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu

1 5 10 15

<210> 26

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala

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<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly

1 5 10 15

Leu Tyr Asn Leu

20

<210> 28

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu

1 5 10 15

<210> 29

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

atgcaccaaa agagaactgc aatgtttcag gacccacagg agcgacccag aaagttacca 60

cagttatgca cagagctgca aacaactata catgatataa tattagaatg tgtgtactgc 120

aagcaacagt tactgcgacg tgaggtatat gactttgctt ttcgggattt atgcatagta 180

tatagagatg ggaatccata tgctgtatgt gataaatgtt taaagtttta ttctaaaatt 240

<210> 30

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

agtgagtata gacattattg ttatagtttg tatggaacaa cattagaaca gcaatacaac 60

aaaccgttgt gtgatttgtt aattaggtgt attaactgtc aaaagccact gtgtcctgaa 120

gaaaagcaaa gacatctgga caaaaagcaa agattccata atataagggg tcggtggacc 180

ggtcgatgta tgtcttgttg cagatcatca agaacacgta gagaaaccca gctgtaa 237

<210> 31

<211> 240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa 60

ctgaacactt cactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagac agtattggaa 120

cttacagagg tatttgaatt tgcatttaaa gatttatttg tggtgtatag agacagtata 180

ccgcatgctg catgccataa atgtatagat ttttattcta gaattagaga attaagacat 240

<210> 32

<211> 237

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tattcagact ctgtgtatgg agacacattg gaaaaactaa ctaacactgg gttatacaat 60

ttattaataa ggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc cagcagaaaa acttagacac 120

cttaatgaaa aacgacgatt tcacaacata gctgggcact atagaggcca gtgccattcg 180

tgctgcaacc gagcacgaca ggaacgcctc caacgacgca gagaaacaca agtataa 237

Claims (10)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:5所示的HCDR1，

SEQ ID NO:6所示的HCDR2，和

SEQ ID NO:7所示的HCDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。

2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。

3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述的轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：

SEQ ID NO:8所示的LCDR1，

SEQ ID NO:9所示的LCDR2，和

SEQ ID NO:10所示的LCDR3；

其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。

4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。

5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：

(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或

(2)如权利要求3所述的轻链可变区；

或者，所述抗体具有：

如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。

6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：

(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及

(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

7.一种多核苷酸，其特征在于，其编码选自下组的多肽：

(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或

(2)如权利要求6所述的重组蛋白。

8.一种载体，其特征在于，它含有本发明权利要求7所述的多核苷酸。

9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。

10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：

(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；和

(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。

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