CN116410306A - 一种检测宫颈癌蛋白hpv e6的单克隆抗体及应用 - Google Patents

一种检测宫颈癌蛋白hpv e6的单克隆抗体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测宫颈癌蛋白HPV E6的单克隆抗体及应用。本发明提供了一种特异性高、亲和力强、能够稳定表达、重复性良好、能特异性的识别HPV E6蛋白尤其是HPV18 E6蛋白的单克隆抗体，具有用于制备防治宫颈癌、阴茎癌、会阴部癌、阴道癌、肛门癌及口咽部癌等癌症的药物的潜力。

Description

一种检测宫颈癌蛋白HPV E6的单克隆抗体及应用
技术领域
本发明属于生物诊断及医药领域，具体地说，本发明涉及一种检测宫颈癌蛋白HPVE6的单克隆抗体及应用。
背景技术
宫颈癌的早期诊断应采用“三阶梯”程序，即：子宫颈细胞学检测、阴道镜检查、组织病理学检查。细胞学检测为“三阶梯”的第一步，是宫颈癌预防和筛查的关键环节。尽管细胞学筛查在减少宫颈癌发生上取得了巨大的成就，但是大量的临床实践证明，宫颈癌筛查面临着细胞学检测敏感度较低(50～70％)，受取样、制片、染色、阅片水平等多种因素影响。细胞学判读要求有形态学依据具有不可规避的主观性，并造成病理医生工作负担极其繁重。因此，在宫颈癌早期诊断领域，对于初筛中发现的细胞形态学不确定(低度鳞状上皮内病变(LSIL)，无明确意义的非典型鳞状上皮细胞(ASCUS)等)人群进行分流是目前的临床瓶颈问题，急需提供更精确的检测手段。
基于宫颈癌特异性蛋白标志物E6/E7癌蛋白在宫颈细胞中表达作为筛查诊断和精准治疗的技术领域属于宫颈癌领域的研究热点，也是未来宫颈癌精准诊断和靶向治疗的方向。目前国内和国外临床检验还未有以HPV E6和E7癌蛋白作为检测标志物的相关技术产品。
因此，本领域需要开发一种检测宫颈癌蛋白HPV E6的单克隆抗体及应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测宫颈癌蛋白HPV E6的单克隆抗体及应用。
在本发明的第一方面，提供了一种抗体的重链可变区，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
HCDR1：SSYWIC SEQ ID NO:5；
HCDR2：CIYSGDGDAYYASWAKG SEQ ID NO:6；和
HCDR3：DRVYDSSSGHGL SEQ ID NO:7。
在另一优选例中，所述重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。
在本发明的第二方面，提供了一种抗体的重链，所述的重链具有如本发明的第一方面所述的重链可变区和重链恒定区。
在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的。
在另一优选例中，所述重链恒定区为人源抗体重链IgG1恒定区。
在本发明的第三方面，提供了一种抗体的轻链可变区，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
LCDR1：QASENIYSNLA SEQ ID NO:8；
LCDR2：GTSDLPS SEQ ID NO:9；和
LCDR3：QSYYYRSSSAYGWD SEQ ID NO:10。
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。
在另一优选例中，所述的轻链可变区具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
在本发明的第四方面，提供了一种抗体的轻链，所述的轻链具有如本发明的第三方面所述的轻链可变区和轻链恒定区。
在另一优选例中，所述轻链恒定区为人源或鼠源或兔源的。
在本发明的第五方面，提供了一种抗体，所述抗体具有：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区；和/或
(2)如本发明的第三方面所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：
如本发明的第二方面所述的重链；和/或如本发明的第四方面所述的轻链。
在另一优选例中，所述的抗体为特异性抗HPV的抗体；优选地，所述抗体为特异性抗HPV16和/或HPV18的抗体；更优选地，所述抗体为特异性抗HPV16 E6蛋白和/或HPV18 E6蛋白的抗体。
在另一优选例中，所述的抗体包括：单链抗体、双链抗体、单克隆抗体、嵌合抗体(如人鼠嵌合抗体)、鼠源抗体、或人源化抗体。
在另一优选例中，所述抗体为IgG型抗体。
在本发明的第六方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。
在另一优选例中，所述的重组蛋白特异性抗HPV；优选地，特异性抗HPV16、HPV18、HPV58、HPV 31、HPV 33、HPV 39；更优选地，特异性抗HPV18，最优选地，抗HPV18 E6蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种多核苷酸，其编码选自下组的多肽：
(1)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；或
(2)如本发明的第六方面所述的重组蛋白。
在另一优选例中，所述的多核苷酸具有SEQ ID NO:2、4、11、12、13、14、15或16所示的序列。
在本发明的第八方面，提供了一种载体，它含有本发明本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中，所述的载体包括：细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在本发明的第九方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明的第八方面所述的载体或基因组中整合有本发明的第七方面所述的多核苷酸。
在本发明的第十方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有：
(a)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在本发明的第十一方面，提供了一种药物组合物，它含有：
(i)如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第一方面0所述的免疫偶联物；以及
(ii)药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为注射剂型。
在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备治疗肿瘤的药物，所述的肿瘤选自下组：生殖道、呼吸道和消化道癌症，较佳地包括：宫颈癌、肛门癌、生殖器癌症、口腔癌、头颈癌、阴茎癌、阴道癌、外阴癌或肺癌。
在本发明的第十二方面，提供了如本发明的第一方面所述的重链可变区、如本发明的第二方面所述的重链、如本发明的第三方面所述的轻链可变区、如本发明的第四方面所述的轻链、或如本发明的第五方面所述的抗体、如本发明的第六方面所述的重组蛋白、或如本发明的第十方面所述的免疫偶联物的用途，用于制备药剂、试剂、检测板或试剂盒；
所述试剂、检测板或试剂盒用于：
(1)检测样品中HPV E6蛋白；和/或
(2)检测肿瘤细胞中内源性的HPV E6蛋白；和/或
(3)检测表达HPV E6蛋白的肿瘤细胞；和/或
(4)鉴别HPV E6蛋白的类型；
所述药剂用于治疗或预防表达HPV E6蛋白的肿瘤。
在另一优选例中，所述HPV E6蛋白包括选自下组的蛋白：HPV16 E6蛋白、HPV18 E6蛋白、HPV58 E6蛋白、HPV 31 E6蛋白、HPV 33 E6蛋白、HPV 39 E6蛋白、或其组合；更优选地，特异性抗HPV18 E6蛋白。
在另一优选例中，所述样品中含有HPV16 E6蛋白、HPV18 E6蛋白、HPV58 E6蛋白、HPV 31 E6蛋白、HPV 33 E6蛋白和/或HPV 39 E6蛋白，优选HPV18 E6蛋白和/或HPV16 E6蛋白，更优选HPV18 E6蛋白。
在另一优选例中，所述肿瘤包括：泌尿生殖系统的肿瘤、肛门癌、口腔癌、头颈癌、小细胞肺癌、黑色素瘤、头颈肿瘤、胃癌、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、或肾上腺肿瘤。
在另一优选例中，所述“泌尿生殖系统的肿瘤”包括：宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、或阴茎癌。
在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。
在本发明的第十三方面，提供了一种检测样品中HPV E6蛋白的方法，所述方法包括步骤：
(1)将样品与本发明的第五方面所述的抗体接触；
(2)检测是否形成抗原-抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在HPV E6蛋白。
在另一优选例中，在步骤(2)中通过ELISA法进行检测。
在另一优选例中，所述HPV E7蛋白包括HPV16 E6蛋白和/或HPV18 E6蛋白。
在另一优选例中，在步骤(1)中，将样品与两种针对HPV E6蛋白的抗体接触，并且在步骤(2)中通过ELISA法进行检测，所述两种针对HPV E6蛋白的抗体中的至少一种为本发明第五方面所述的抗体。
在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述第一抗体的结合表位不同。
在另一优选例中，所述“抗原-抗体复合物”为“第一抗体-抗原-第二抗体”三元复合物，其中，所述第一抗体是本发明第五方面所述的抗体，并且所述第二抗体的结合表位与所述本发明第五方面的结合表位不同。
在另一优选例中，所述在步骤(1)中，将样品与本发明第五方面所述的抗体接触后，在反应体系中再加入抗所述第一抗体的第三抗体，并且在步骤(2)中检测“抗原-第一抗体-第三抗体”复合物的形成。
在另一优选例中，所述第一抗体、所述第二抗体或所述第三抗体上带有可检测标记。
在另一优选例中，所述可检测标记为生物素标记、胶体金标记、辣根过氧化物酶标记、放射性核素标记、荧光素标记。
在另一优选例中，所述样品包括：人或动物组织样品、肿瘤切除样品、脱落细胞样品。
在另一优选例中，所述样本为宫颈脱落细胞样本或活检组织样本。
在另一优选例中，所述方法用于非诊断性的目的。
在另一优选例中，所述方法为体外方法。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤，(3)分析抗体和抗原的亲和力。
在本发明的第十四方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明的第五方面所述的抗体或本发明的第十方面所述的免疫偶联物。
在另一优选例中，所述的测试条还含有抗原点样区。
在另一优选例中，所述的测试条由滤样纸、层析材料、硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接组成。
在本发明的第十五方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：
(1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的第五方面所述的抗体；和/或
(2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明的第五方面所述的抗体的二抗；和/或
(3)第三容器，所述第三容器中含有细胞裂解试剂；
或者，
所述试剂盒含有本发明的第十四方面所述的检测板。
在另一优选例中，所述第一容器中的抗体带有可检测标记。
在另一优选例中，所述第二容器中的抗体带有可检测标记。
在本发明的第十六方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包括：
(a)在适合表达的条件下，培养本发明的第九方面所述的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第五方面所述的抗体或本发明的第六方面所述的重组蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种特异性高、亲和力强、能够稳定表达、重复性良好的单克隆抗体，能特异性的识别HPV E6蛋白尤其是HPV18 E6蛋白，具有用于制备防治宫颈癌、阴茎癌、会阴部癌、阴道癌、肛门癌及口咽部癌等癌症的药物的潜力。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了蛋白电泳结果。GST-N/C HPV18 E6重组蛋白预估分子量35kDa左右，MBP-HPV18 E6重组融合蛋白分子量60kDa左右。
图2显示了单抗的兔血清效价ELISA检测。
图3A显示了E7抗体染色混在液基细胞临床阴性Pool中Hela细胞。
图3B显示了E7抗体在液基细胞临床样本Pool中染色宫颈癌细胞，验证临床样本pool有效性。
图4显示了CaSki宫颈癌细胞系、HeLa/阴性临床样本、阳性临床样本的免疫细胞化学染色试验。
图5显示了单克隆抗体结合HPV E6蛋白位点的ELISA检测结果，抗原分别为GST-HPV18 E6 C端(18C)、GST-HPV18 E6 N端(18N)、GST-HPV 16 E6 C端(16C)、GST-HPV16 E6 N端(16N)。
图6显示了A4F9克隆可以识别细胞表达可溶性蛋白HPV16 E6、HPV18 E6蛋白的ELISA结果。
图7显示了A4F9克隆结合多种高危HPV亚型E6蛋白。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，通过大量筛选，提供了一种高亲和力地结合HPVE6的单克隆抗体。本发明的抗HPV E6抗体能够识别HPV E6蛋白尤其是HPV18 E6蛋白，并且对其它几种常见高危亚型HPV E6蛋白(例如HPV58、31、33、39E6蛋白)有交叉活性。本发明的抗HPV E6抗体可用于细胞学免疫组化染色，ELISA或其它检测技术对宫颈癌细胞裂解液中E6蛋白的检测。在此基础上完成了本发明。
宫颈癌和HPV
宫颈癌致病机理明确，99％以上的宫颈癌都是由于致癌病毒HPV(高危亚型hrHPV)的持续性感染。我国妇女人口中有20-30％(因地区而异)是HPV阳性携带者。但HPV感染不等于宫颈癌，一过性感染的阳性携带者中80％以上在1～2年内可以自愈。在一过性HPV感染中，病毒外壳基因的复制，没有影响到宿主正常的细胞周期，细胞不会增殖失控。而在HPV持续性感染的高度病变患者中，HPV将其基因整合到寄主基因组中并由寄主细胞表达该致癌基因产物E7蛋白。HPV来源的癌蛋白，其功能是以破坏表皮干细胞的正常细胞周期导致细胞永生化，即：癌变。癌蛋白E7的大量表达状态与癌变恶化程度呈正相关。HPV的DNA检测虽然灵敏，但不能将一过性感染和持续性感染区分，不能将单纯的HPV感染与已经产生宫颈癌变区分。因此，宫颈癌疾病的早期准断不能依赖HPV的检测，分子检测在临床上往往造成大量的假阳性和过高的转诊率。而高度癌前病变患者不能得以诊断，如不及时治疗，则在较短时间内(2-3年)就会发展为浸润性晚期癌症。因此，宫颈癌早期诊断领域急需解决HPV分子检测初筛阳性分流的瓶颈问题。近年来虽有HPV E7/E6 mRNA的检测技术，但是由于宫颈癌的发生风险与HPV亚型种类有关，这种技术在临床应用还存在诸多问题。
在人类所有肿瘤中，宫颈癌是目前病因唯一明确的肿瘤，同时也是唯一可以预防的肿瘤。它是人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)持续感染的结果。癌症发生过程中HPV DNA整合入人体细胞基因组内，转化型细胞内开始持续表达HPV E6和E7蛋白。这两个致癌蛋白是导致宫颈癌的重要原因。E6基因是高危型人乳头瘤病毒(hrHPV)重要的致癌基因之一，其基因产物E6蛋白具有致癌功能，故称为E6 Oncoprotein。E6蛋白由大约150个氨基酸组成，其蛋白存有Cys-x-x-Cys序列为两种锌指结构，与恶性转化、转录激活、细胞蛋白相互作用等密切相关。高危HPV介导的E6癌蛋白功能可通过多种途径调节细胞通路。目前已明确，E6可有效抑制p53活性，一方面通过泛素(ubiquitin)依赖的蛋白酶系统(UPS)促进p53的降解，另一方面可直接与p53蛋白结合，导致抑癌功能丧失，染色体稳定性下降，细胞无法纠正DAN损伤。E6还能激活端粒酶活性，使细胞逃避衰老过程中的增殖限制，最终导致细胞永生化。此外，E6能靶向其他参与细胞凋亡的蛋白，以抑制细胞凋亡信号通路。研究表明，高危型HPV的E6蛋白C端存在一个特有的PDZ结合基元(PBM)，通过与胞内多种蛋白的PDZ结构域结合，发挥维持病毒拷贝数和增殖、破坏宿主稳态和极性、促进细胞持续性感染等多重作用形成致癌性转化。多种通路与机制协同作用，在细胞环境中建立长期感染的可能，导致宿主基因突变，最终转化为恶性肿瘤。
基于宫颈癌特异性蛋白标志物E6/E7癌蛋白在宫颈细胞中表达作为筛查诊断和精准治疗的技术领域属于宫颈癌领域的研究热点，也是未来宫颈癌精准诊断和靶向治疗的方向。在临床检测免疫化学技术应用方面，以抗原-抗体高特异性结合免疫反应为基础，通过酶联二抗(horse-reddish peroxidase conjugated secondary antibody，HRP-二抗)的反应原理，使酶反应底物显色用以显示癌症标志物抗原蛋白在癌变细胞中的表达情况。因此，以癌症标志物为基础的免疫检测技术，从检测机理和技术上体现优势，能够有效的避免细胞形态学检测所造成的低敏感性以及病理医师的主观性所导致的假阳性和假阴性。针对宫颈癌领域及其它由致癌高危亚型HPV导致的癌症，HPV E6和/或HPV E7蛋白检测技术中的关键试剂能够识别HPV E6或E7蛋白，而只有当HPV病毒基因整合入人体基因组后，才能通过人类寄主细胞表达E6和E7癌蛋白，所以E6和/或E7蛋白检测技术能够区别HPV的一过性感染(非癌症)和HPV导致的细胞变异(mutation)及细胞癌变。E6/E7癌蛋白检测技术从原理上避免了HPV分子检测可能产生的阳性预测值过低的缺点。同时，相比较传统细胞形态学观察检测，又能弥补其无法准确诊断，且对癌前病变灵敏度低的问题。近年来使用p16这一癌症替代性标志物(surrogate marker)为靶标的研究报道显示，p16在人体细胞中广泛存在，在多种快速生长细胞，包括宫颈上皮癌及其它癌症和部分炎症细胞中均有高表达。而本发明研究的致癌蛋白靶点检测，基于高危HPVE6/E7蛋白致癌的细胞学和分子学机理，其检测结果(即E6和/或E7癌蛋白的表达及细胞活性)与细胞癌变现象具有必然相关性。E6/E7蛋白表达和活性不但与宫颈癌的发生和发展是因果关系，而且其表达量随疾病恶化程度而成比例升高，因此相比于其它非肿瘤特异性蛋白，例如p16更具有临床诊断意义。
如本文所用，“高危亚型HPV E6蛋白”包括HPV 31、HPV 33、HPV 35、HPV 52、HPV58、HPV 39、HPV 68、HPV 51、HPV 59的E6蛋白。在本发明的优选实施例中，本发明的抗HPVE6抗体能够识别HPV E6蛋白尤其是HPV18 E6蛋白，并且对其它几种常见高危亚型HPV E6蛋白(例如HPV58、31、33、39E6蛋白)有交叉活性。而对低危、非致癌亚型(例如HPV 6、HPV 11的E6蛋白)无交叉反应。
抗体
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等(1991)，NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA,IgD,IgE,IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。
如本文所用，术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。
本发明还包括具有所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的HPV16 E6蛋白单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab')2片段；抗体重链；抗体轻链。
如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体(A4F9)的重链可变区包括包括以下三个互补决定区CDR：
HCDR1，其氨基酸序列为SSYWIC(SEQ ID NO 5)，其编码核苷酸序列为，AGCAGCTATTGGATATGC(SEQ ID NO 11)；
HCDR2，其氨基酸序列为CIYSGDGDAYYASWAKG(SEQ ID NO 6),其编码核苷酸序列为，
TGCATTTATAGTGGTGATGGTGACGCTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC(SEQ ID NO12)；
HCDR3，其氨基酸序列为DRVYDSSSGHGL(SEQ ID NO 7)，其编码核苷酸序列为，GATAGAGTGTATGATAGTAGTAGTGGGCATGGCTTG(SEQ ID NO 13)。
在本发明的一个优选的实施方式中，根据本发明的抗体(A4F9)的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
LCDR1，其氨基酸序列为QASENIYSNLA(SEQ ID NO 8)，其编码核苷酸序列为，CAGGCCAGTGAGAACATTTATAGCAATTTAGCC(SEQ ID NO 14)；
LCDR2，其氨基酸序列为GTSDLPS(SEQ ID NO 9)，其编码核苷酸序列为，GGTACATCTGATCTGCCATCT(SEQ ID NO 15)；
LCDR3，其氨基酸序列为QSYYYRSSSAYGWD(SEQ ID NO 10)，
其编码核苷酸序列为，
CAAAGCTATTATTATAGGAGTAGTAGTGCTTATGGTTGGGAT(SEQ ID NO 16)。
在另一优选例中，抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO 1)：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIACIYSGDGDAYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTAAYFCARDRVYDSSSGHGLWGPGTLVTVSS
在另一优选例中，抗体重链可变区DNA序列(SEQ ID NO 2)：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCTATTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGTTGGAGTGGATCGCATGCATTTATAGTGGTG ATGGTGACGCTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCGCGTATTTCTGTGCGCGAGATAGAGTGTATGATAGTAGTAGTGG GCATGGCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
在另一优选例中，所述抗体轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO 3)：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADIVMTQTPFSVSAAAGGTVTINCQASENIYSNLAWYQQKPGQRPKLLIYGTSDLPSGVPSRFSGSGYGTEFTLTISDLECADAATYYCQSYYYRSSSAYGWDFGGGTEVVVK
在另一优选例中，编码抗体轻链可变区编码核苷酸序列为(SEQ ID NO 4)：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCTGACATTGTGATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGCGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAG TGAGAACATTTATAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTACAT CTGATCTGCCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTTAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATTATTATAGGAGTAGTAGTGCTTATGGTTGGGATTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAG
在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的轻链包括上述轻链可变区和轻链恒定区，所述轻链恒定区可以为鼠源或人源。
在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合HPV16 E6蛋白的抗体，例如具有重链和/或轻链的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
在另一优选例中，所述的抗体为抗HPV16E6蛋白的鼠或人鼠嵌合单克隆抗体，它的重链恒定区和/或轻链恒定区可以是人源化的重链恒定区或轻链恒定区。更优选地，所述的人源化的重链恒定区或轻链恒定区为人IgG1、IgG2等的重链恒定区或轻链恒定区。
本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链和轻链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链和轻链的可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。
一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。
本发明抗体的重链和/或轻链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的单克隆抗体轻链和重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。
如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
本发明抗体指具有HPV16E6蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。
本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。
表A
Figure BDA0003451132670000121
本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO.3、5、7、9、13、15、17、19所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列，但与SEQID NO.2、4、11、12、13、14、15或16所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。
用于诊断目的的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。
可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明的药物组合物可直接用于结合HPV16E6蛋白分子，因而可用于预防和治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的单克隆抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
单克隆抗体的制备
根据抗体制备方式不同，主要有多克隆抗体(Polyclone Antibody,pAb)，单克隆抗体(mAb)和重组抗体(Recombination Antigen,rAb)三种形式。多克隆抗体制备方法简单，费用低，是早期免疫分析应用较多的抗体形式。单克隆抗体亲和力高、特异性强、不同批次之间差异小，杂交瘤细胞株一经建立，抗体的供应源源不断，适合在免疫学方法检测中应用，因此，近年来单克隆抗体在免疫治疗药物开发及免疫检测技术中的应用逐渐增多。随着技术的进步，又将重组抗体技术应用越来越广泛，如早在2001年Moghaddam等就报道了一种重组抗体的研制，2010年Min等人又报道了一种由大肠杆菌表达的单链抗体。多克隆抗体、单克隆抗体均属于传统抗体，在免疫技术应用上广泛使用。重组抗体是一种新兴的抗体，目前尚处于理论研究和实验室研发阶段。
本发明的单克隆抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术平台进行制备。例如，本发明抗原，可被施用于动物BALB/c小鼠以诱导免疫应答反应，并制备单克隆抗体。对于单克隆抗体制备，可采用杂交瘤技术路线实现，噬菌体展示技术，或者Single B Cellcloning平台制备。
杂交瘤融合技术，采用免疫动物，例如小鼠的B细胞(脾脏、骨髓、或外周血)与骨髓瘤细胞融合生成杂交瘤克隆。代表性的骨髓瘤细胞是有效融合、通过选择的抗体产生细胞支持抗体的稳定高水平产生、且对培养基(HAT培养基基质)敏感的那些骨髓瘤细胞，包括骨髓瘤细胞株，例如鼠类的骨髓瘤细胞株，包括衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的骨髓瘤细胞株(可购自Salk Institute Cell Distribution Center，圣地亚哥，加利福尼亚，美国)以及SP-2、NZ0或X63-Ag8-653细胞(可购自American Type Culture Collection，洛克维尔，马里兰，美国)。人骨髓瘤和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞株也已被描述用于产生人单克隆抗体。
对杂交瘤细胞生长的培养基上清进行分析以检测具有所需特异性的单克隆抗体的产生，如，通过体外结合分析例如，酶联免疫吸附分析(ELISA)或放射免疫分析(RIA)。表达抗体的细胞的位置可用FACS进行检测。然后，可将杂交瘤克隆通过有限稀释步骤形成亚克隆(subcloned)，并通过标准方法生长(Goding，单克隆抗体(Monoclonal Antibodies)：原则和实践(Principles and Practice)，Academic Press(1986)59-103页)。适宜于杂交瘤细胞生长的培养基，例如，DMEM(高糖)或RPMI-1640培养基或无血清培养基。此外，可通过在动物体内注射杂交瘤细胞作为腹水瘤生长。
由亚克隆分泌的单克隆抗体从培养基、腹水或血清中通过常规的免疫球蛋白纯化工艺适当地得到分离，这些纯化工艺包括，蛋白A/G-琼脂糖法(protein A/G-Sepharose)、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
噬菌体展示技术筛选单链抗体的原理是采用基因工程手段将免疫细胞(B细胞或免疫系统干细胞)中的免疫球蛋白IgG基因的重链(VH)、轻链可变区(VL)基因片段通过一个连接臂连接后插入噬菌体或噬菌粒的信号肽编码区，使得插入片段与噬菌体膜蛋白融合，并展示在噬菌体衣壳蛋白的表面，建立噬菌体展示抗体库，通过“吸附-洗脱-富集”的生物淘选过程，筛选得到阳性噬菌体展示单链抗体。
根据噬菌体(粒)载体上的插入片段来源不同，噬菌体展示抗体库可分为三大类：免疫抗体库、天然抗体库以及人工合成抗体库。免疫抗体库是以经抗原免疫后的动物血液中mRNA作为模板，合成抗体可变区，将可变区基因插入到特定的载体上，由于经过抗原免疫，可刺激动物机体淋巴细胞分泌产生特异性抗体，因此，这种抗体库含有大量诱导的特异性抗体的基因，可以有针对性的筛选高亲和力抗体，筛选出阳性抗体的几率较大；直接提取未经免疫的动物骨髓干细胞、外周淋巴细胞和脾脏B细胞中的mRNA，反转录为cDNA，将抗体可变区基因扩后与载体连接，得到的抗体库为天然抗体库。未经免疫的动物血液mRNA决定了抗体库的多样性，应用范围更广，不局限于某一种或几种抗原；抗原-抗体的特异性反应主要取决于可变区的空间构像，在分子层面，取决于抗体重链、轻链可变区CDR(Complementarity Determining Region)的DNA序列，通过基因工程手段对CDR区域基因序列进行人工改造，可大大提高抗体库的多样性，这种通过对抗体序列进行基因改造的方法得到的抗体库为人工合成抗体库。
本发明中实验步骤，首先以HPV18亚型的E6蛋白构建成GST-18 E6作为免疫原，对Balb C小鼠进行免疫，并通过杂交瘤制备和筛选技术分离阳性杂交瘤克隆，其目的是通过筛选、分离、鉴定杂交瘤克隆分泌的免疫球蛋白IgG，达到获得高质量、高特异性和亲和力的抗E6蛋白的单克隆抗体试剂。实验流程通过免疫4只Balb C小鼠，ELISA检测三免后血清，1:4000稀释后对应OD值大于1.0为阳性cut-off值。选择免疫效果最好的一只小鼠进入细胞融合，经过两次亚克隆筛选最终获得66个阳性克隆，将所有克隆腹水生产并Protein G纯化抗体，经过功能性检测实验，细胞免疫化学方法(immunocytochemistry，ICC)对宫颈癌细胞株CaSki，Hela，及阴性对照细胞株C-33A检测。实验结果，该试验未获得可以特异性结合宫颈癌细胞样本中E6癌蛋白的单克隆抗体。
本发明的另一套实验技术路线，采用兔子免疫结合单个B细胞筛选、分离及分子克隆技术，获得了一株针对HPV18 E6蛋白的兔源单克隆抗体。在本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体采用Single B Cell cloning方法制备。B细胞的获得通过采集兔子外周血进行PBMC分离，对B细胞进行单细胞水平的分离、分析与筛选，从而精准、高效的筛选出分泌目标抗体分子的B细胞(A.Winters et al.，2019)。
本发明的一个优选的方案中，从ELISA检测结果OD值大于1.0的细胞培养盘阳性孔内提取细胞中的total RNA，可使用商业化RNA提取试剂(诺唯赞，R701-01/02)，并利用商业化通用引物将total RNA其逆转录为cDNA(Prime ScriptTM 1st Strand cDNA SynthesisKit，Takara)。随后通过兔免疫球蛋白IgG重链或轻链信号肽和恒定区特异性引物扩增兔免疫球蛋白的重链和轻链V-区域片段。将所得的PCR片段通过同源重组至pCDNA3.4载体中，使用载体特异性引物对插入片段进行单细胞测序。该技术路线采用功能活性检测作为筛选步骤，结合高通量模式对B细胞克隆进行筛选，可提高对不同结合特征和亲和力的抗体分子筛选和鉴定提高覆盖率和通量100倍以上。
本发明的一个优选的方案中，单克隆抗体的表达和生产采用重组DNA方法组建真核表达系统，瞬转HEK293细胞来表达抗体或者构建CHO-S稳转细胞系，再将分泌于培养基中的抗体经亲和层析柱(Protein A/G-Sephrose)进行纯化，纯度可达95％以上。
本发明研制的抗E6抗体，克服了目前已有技术的不足。已有研发数据证明，本实验室购买的商业化抗体试剂Sigma公司anti-E6抗体(克隆号：C1P5)，经测试验证，ELISA上较弱识别E6真核转染蛋白，而对宫颈癌肿瘤细胞株(CaSki，Hela)等样本均不识别，且对临床标本，即：宫颈上皮脱落细胞经液基细胞固定液处理(例如：豪洛捷ThinPrep，BDSurepathTM,安必平LBP System&reg等常用溶液保存剂的样本)均无特异性和高亲和力反应。另外，从BIOSS厂家购买的E6抗体克隆(货号Bs-1719R)货号，对大部分液基细胞临床样本不能识别或者仅出现微弱识别，不能达到研究试剂或者临床诊断试剂盒的开发和研究的要求和标准。目前，市场上尚无高危HPV E6蛋白特异性的抗体单克隆，作为治疗药物研究或者免疫组织化学诊断试剂。
方法和样本
本发明涉及用于在肿瘤组织或细胞样本中检测宫颈癌细胞的方法。该方法步骤大致如下：获得组织样本；检测在所述样本中HPV癌蛋白的水平。本发明方法所使用的样本是有机溶剂固定的宫颈上皮脱落细胞样本，或临床病理通常应用的福尔马林固定石蜡包埋的宫颈组织切片。
本发明可以用于HPV感染相关癌症中HPV癌蛋白的检测，其中HPV感染相关的癌症例如宫颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤以及这些癌症的前期阶段。
根据本发明，使用E6癌蛋白分子标记可以支持或甚至取代组织学检测方法。在特殊病例中，蛋白分子标志物可以被用作诊断工具而不需要进一步的基于细胞的形态检测的支持。本发明所采用的生物标记是E6癌蛋白，该生物标志物来源于病毒基因组，在未感染过高危HPV或HPV基因未整合到人类寄主细胞核并引起细胞变异的情况下，人类细胞和组织中不存在E6癌蛋白标志物，因此对E6蛋白的检测具有肿瘤特异性。
本发明中所采用的样本(样品)包括宫颈脱落细胞样本和活检组织标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本可以包括固定的或保存的细胞或组织样本。组织样本可以例如被保存在标准的样本收集、储存或运输介质中，例如那些本领域技术人员已知的商业可以获得保存介质(福尔马林、Cytyc“PreservCyt”或Tripath Imaging“Cytorich”等)。合适的保存介质可以包括一个或多个选自醇、醛、酮、酸、金属离子或汞、醚等的用于保存细胞组分的混合物。醇包括甲醇、乙醇、(正或异)丙醇、(正、异或叔)丁醇或高支链或无支链的醇。醛包括甲醛、乙醛、戊二醛等。也可以使用诸如丙酮的酮类。在标准的样本介质中使用的酸包括有机酸(乙酸、三氯乙酸、水杨酸和苦味酸)或诸如铬酸的无机酸。标准的样本溶液中可以包括金属例如银、铜、铬、汞、锇和铀。诸如乙酸铀酰、二铬酸钾、硫酸铵等的盐溶液可以是保存介质的组分。
本发明中使用的液基细胞薄片包括自然沉降法、梯度离心法两种方法制备的细胞样本。例如人工培养肿瘤细胞系经缓冲液混合，在载玻片上自然沉降后，通过固定剂(常用95％乙醇)固定后形成；临床获取的脱落细胞经离心机进行梯度离心，富集有效细胞，去除杂质(如粘液、血细胞碎片等)，再进行固定形成。
本发明中使用的临床细胞样本是经过特殊前处理制成的细胞混合。例如将保存液中的临床宫颈脱落细胞进行初步混合，检测合格后冻存-80℃冰箱待用。因此冻存好的合格样本可在临检时经过复温混合使用。
试剂盒
本发明还提供了一种只含有本发明的抗体(或其片段)或本发明的检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。
本发明进一步设计用于检测高危型HPV E6癌蛋白的检测试剂盒，该试剂盒包括识别高危型HPV E6癌蛋白的抗体，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV E6癌蛋白抗体。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
本发明进一步设计开发用于对来自宫颈活检样本的HPV感染相关情况诊断评估的试剂盒，该试剂盒可以检测存在于样本中的高危型HPV E6癌蛋白。将组织进行福尔马林固定,石蜡包埋处理，并且被用于开发在基于非细胞形态分析基础上的对样本的HPV感染相关肿瘤进行检测的检测试剂盒和体外诊断装置。
本发明的目的之一在于提供一种检测多种高危HPV E6蛋白表达的方法，并且所述的方法可用于检测HPV感染相关癌症特别是宫颈癌的检测。
本发明的发明人等制作了针对人乳头瘤病毒HPV16/18在内的多种高危HPV的E6蛋白质的单克隆抗体(A4F9)并研究其免疫反应性质。使用此抗hrHPVE6单克隆抗体对宫颈脱落细胞样本进行免疫细胞化学染色,结果发现该抗体对hrHPV型病毒引起的肿瘤细胞中有强染色反应,同时正常宫颈细胞和一般炎症细胞的背景染色干净。
也就是说，本发明的方法是检测肿瘤标记物的方法，其特征在于：包括检测样本中的HPV16/18 E6的步骤。
在本发明的方法中，所述检测样本优先是宫颈上皮损伤有可能患宫颈病变的患者，也可以是宫颈已经发生病变的患者。
所述HPV16/18 E6免疫抗原优选是HPV16/18 E6全长蛋白质或其蛋白片段、或多肽片段。在此情况时，检测所述的HPV16/18 E6抗体检测试剂的使用步骤优选是使用HPV16/18E6抗体进行免疫细胞化学染色分析。所使用的抗HPV16/18 E6抗体优选是抗HPV18 E6单克隆抗体。优选地，本发明的抗体还能结合除HPV16/18 E6免疫抗原之外的其他多种高危HPV抗原，例如HPV58、31、33、39 E6蛋白抗原，优选是所述高危HPV抗原的全长蛋白质或其蛋白片段、或多肽片段。
所述方法免疫检测所采用的来自HPV16在内的高危HPV E6癌基因表达的蛋白作为致癌亚型HPV导致的恶性或恶变前细胞发生的可靠指标。本发明最有用的方面之一是在对子宫颈癌、鳞状上皮细胞损伤和腺癌及与致癌HPV感染相关的任何上皮细胞异常的诊断中的应用，所示的致癌HPV16感染包括中空细胞病；角化过度症；包括上皮内瘤形成或上皮内病变的癌前期病症；高度发育不良；和侵染性或恶性癌症。除宫颈癌外，对E6癌蛋白的检测对检测膀胱癌、子宫内膜癌、阴茎癌等泌尿生殖系统的肿瘤，小细胞肺癌、黑色素瘤以及头颈肿瘤也是有用的。
本发明的另一个目的通过本发明的方法提供一种检测试剂盒。该试剂盒可以是诊断试剂盒或研究试剂盒。
本发明的试剂盒是用以检测肿瘤标记物的试剂盒，其特征在于具有抗HPV18 E6单克隆抗体。本发明的试剂盒优先是具有用以检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、酶联标记的二抗、检测标记、检测底物等。所述的抗体优选是抗HPV16/18 E6抗体，更优选是抗多种高危HPV E6单克隆抗体，尤其优选是通过重组DNA技术，获得用于真核表达系统的抗HPV E6单克隆抗体基因重组表达载体。由真核表达系统产生的抗高危HPV E6兔单克隆抗体或是与该抗HPV E6兔单克隆抗体具同等的结合活性的单克隆抗体。
本发明提供了一种方法通过检测细胞内源的HPV E6蛋白，区分宫颈非恶性病变的肿瘤细胞，并且在临床上广泛采用的各品牌的细胞保存液固定匹配使用，从而能够在癌症演变的早期作出诊断，为及时治疗提供依据。
进一步，本发明还提供一种采用该检测方法所形成的检测试剂盒。
本发明的主要优点包括
(1)本发明提供的针对hrHPV E6蛋白的抗体，特异性高，亲和力强，并且可以大量制备、单克隆抗体质量容易控制。
(2)本发明提供的针对hrHPV E6蛋白的抗体能够特异性的与hrHPV E6蛋白进行结合，因此该抗体能够用于检测hrHPV E6蛋白。
(3)本发明提供的检测hrHPV E6蛋白的方法中使用本发明提供的抗体，稳定性好，检测灵敏度极高。
(4)本发明提供的单克隆抗体可识别经过有机溶剂固定处理之后的细胞内源表达hrHPV E6蛋白构象。
(5)本发明提供的单克隆抗体以及检测方法，适用于相关癌症的早期诊断，并可用于监测复发病人。
(6)本发明提供的针对hrHPV E6蛋白的抗体对其它几种常见高危亚型HPV E6蛋白有交叉活性。本发明的抗体针对多种常见致癌亚型HPV有交叉活性，而对非致癌亚型无交叉反应。因此，既扩大了临床应用(即：抗体可铺盖多种高危HPV病毒引起的宫颈癌及其它相关癌症)，又体现了其特异性，可区分低危HPV导致的良性病变(例如尖锐湿疣等)与高危导致的癌变。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例 人乳头瘤病毒HPV18 E6单抗制备以及活性测定
1.1抗原设计
蛋白抗原设计：
通过基因工程手段分别将HPV18 E6基因序列插入原核表达载体pGEX-4T-1，使得HPV18 E6蛋白与Maltose binding protein MBP或Glutathione S-transferase GST标签构建成融合蛋白，质粒活化后转化原核大肠杆菌表达，经IPTG低温诱导后，菌液超声裂解，蛋白纯化并鉴定浓度、纯度。
蛋白电泳结果，如图1：
GST-N/C HPV18 E6重组蛋白预估分子量35kDa左右，MBP-HPV18 E6重组融合蛋白分子量60kDa左右，条带位置与蛋白分子量理论值接近，E6蛋白诱导后表达量正常。
蛋白序列如下表1：
Figure BDA0003451132670000201
1.2动物免疫
取4只6个月新西兰大白兔，选定2只以MBP-HPV16，-18 E6蛋白混合后免疫，免疫程序见表2；选定另外2只常规免疫方案，以多肽1-KLH免疫1只兔子，多肽2-KLH免疫1只兔子，见表3。全部采用MBP标签重组蛋白(1μg/ml)作为检测抗原包被，第四次免疫7天后，间接ELISA法检测兔血清效价，以此确定免疫应答的水平。如果免疫动物能够达到针对检测原的免疫应答水平(OD值>1.0，效价达到1:64,000)，则进行B细胞分离及克隆筛选。结果Rb16-1和Rb16-2两只兔血清效价最高，达到克隆筛选标准。
表2动物免疫实验时间表(重组抗原蛋白)
步骤 时间表 剂量
免疫前采血 第-4天
第一次免疫 第0天 200μg/只
第二次免疫 第14天 200μg/只
采血检测 第21天
第三次免疫 第28天 200μg/只
采血检测 第35天
第四次免疫 第42天 1*10^7/只
采血检测 第49天
终免 待定 400μg/只
B细胞分离、培养 终免4天后
表3动物免疫实验时间表(多肽抗原)
步骤 时间表 剂量
免疫前采血 第-4天
第一次免疫 第0天 500μg/只
第二次免疫 第14天 500μg/只
采血检测 第21天
第三次免疫 第28天 500μg/只
采血检测 第35天
第四次免疫 第42天 1*10^7/只
采血检测 第49天
终免 待定 1000μg/只
B细胞分离、培养 终免4天后
1.3 B细胞分离及克隆筛选
从2只兔子中采集15～30ml新鲜外周血，使用无菌管采血，然后采用抗原MBP-E6融合蛋白包板，通过表达膜外抗体的B细胞与E6抗原蛋白结合，对特异性B细胞进行富集。富集后的细胞按照一定的细胞密度铺到提前铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中。将板在37℃下在5％CO2中孵育。6天的孵育之后，更换新鲜的培养基，第7天收集培养过夜的上清，开始使用下文所述的ELISA结合来测试针对E6蛋白抗体的存在情况。
1.4 ELISA结合检测方法
间接ELISA用于评估上清液中抗体对于E6蛋白的结合能力。将ELISA板用100μl/孔的PBS中2μg/ml的重组E6蛋白在4℃下包被过夜。用PBST(0.05％吐温)洗涤板，并将其用300μl/孔的含1％BSA的PBST在37℃封闭1小时。随后弃去封闭液，向每个板加入100μl B细胞培养上清液，然后在37℃孵育1小时。将板用PBST洗涤三次，并用100μl/孔的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(Fc-特异性)二抗，37℃孵育0.5小时。将板用PBST洗涤五次，然后加入TMB显色液并在室温下在黑暗中孵育13分钟。通过加入50μl的1M HCl终止液(国药，10011018)终止反应。使用酶标仪在450nm下读板。选择OD值大于1.0的阳性孔进行后续实验。
1.5单克隆抗体的可变区测序
使用RNA提取试剂(诺唯赞，R701-01/02)提取OD值大于1.0的孔内总细胞的RNA，并利用通用引物(Prime ScriptTM1stStrand cDNA Synthesis Kit，Takara)将其逆转录为cDNA。随后通过抗体信号肽和恒定区特异性引物扩增兔免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段，并将所得的PCR片段通过同源重组至pCDNA3.4载体中，使用载体特异性引物对插入片段进行测序。最终获取了克隆的独特V-区域蛋白氨基酸序列及质粒。
1.6小规模转染表达
免疫球蛋白基因可变区V区序列克隆到IgG重链HC和轻链框架的哺乳动物表达载体上进行表达，然后进行扩大规模瞬时转染CHO细胞(Expi Fectamine CHO TransfectionKit，Gibco)。细胞培养48小时之后，收集含有分泌型免疫球蛋白IgG的上清培养液。采用Protein A/G亲和层析方法对抗体蛋白进行纯化，收集洗脱蛋白峰流出液，用磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用紫外分光光度计OD260/OD280测定抗体蛋白浓度，间接ELISA检测抗体效价。
实施例2
2.1兔血清效价ELISA检测:
GST-HPV18 E6 N端、GST-HPV18 E6 C端、GST-HPV16 E6 N端和GST-HPV16 E6 C端4种重组蛋白混合包被，2μg/ml包板，4℃过夜。同时设置空白对照(包被抗原，加空白抗体稀释液)。次日PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉室温封闭2h，PBST洗涤拍干后，分别加入兔血清，按2倍稀释倍数梯度(1:200,1:400,1:800,1:1.6K,1:3.2K,1:6.4K,1:12.8K倍比稀释)，阳性对照加MBP抗体(1:5000)，37℃孵育1h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:2500)，37℃孵育30min，PBST洗涤拍干后加TMB显色液，37℃反应10min后2M H2SO4终止显色，于酶标仪OD450nm处读数。
结果见图2：Rb16-1、Rb16-2兔血清的在同一浓度下的OD值均高于其余两只，表明兔子对MBP-HPV18/16 E6重组蛋白产生了较强的免疫应答，稀释比在1:200时OD值均高于3.0，稀释比到达1:6400时OD值也高于1.0，故其效价高于Rb16-3、Rb16-4血清。最终选定Rb16-1、Rb16-2兔血清进行下一步B细胞筛选。
实施例2
2.2细胞免疫化学法检测液基细胞临床样本实验
2.2.1临床样本验证、混合样本库制备、及深度冷冻样本(-80℃)验证：
选取3例细胞学诊断为ASC-US及以上的临床细胞样本混合后分别分装6份(每份2ml)，样本保存条件为：①不离心，4℃冰箱保存1天和12天(对照)；②不离心，-80℃冰箱保存1天和12天；③离心取沉淀，-80℃冰箱保存1天和12天。将6份样本复温后，从每份样本取2ml液体，采用湘智离心机离心制片(1000rpm，3分钟),通过使用抗HPV E7蛋白单克隆抗体试剂检测试剂盒(艾托金生物医药)以免疫细胞化学染色法鉴定样本库含有阳性宫颈癌细胞(或/和癌前病变)的数量。经过评估6份样本库的染色强度、形态及细胞量的差异，结果显示三种保存方式染色效果、形态完整性相当，而离心组的细胞量会相对减少，故最终选择“样本不经过离心，-80℃冰箱冻存”的保存方式。
2.2.2阴性临床样本和阳性临床样本预制备:
使用医院临床检验剩余的宫颈脱落细胞在液基细胞保存液中的样本，分别为58例ASC-H，12例HSIL及73例NILM(未见宫颈上皮内病变)细胞学诊断的样本。采用2-8例同级别诊断样本混合的方式，将143例样本混合成39个中间P00L(混合液体总量≥15ml),从中间POOL中取2ml液体，采用湘智离心机离心制片(1000rpm，3分钟)，通过HPV E7蛋白单克隆抗体试剂检测试剂盒(艾托金生物医药)进行免疫细胞化学染色，同时设置质控(CaSki细胞作阳性样本对照)，评估其E7染色阳性细胞数、炎症背景、样本质量(如溶解、污染等)及制片细胞数目。结果统计如表4:
表4：中等P00L样本E7-ICC检测结果统计
Figure BDA0003451132670000231
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Figure BDA0003451132670000241
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Figure BDA0003451132670000271
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Figure BDA0003451132670000281
HeLa/阴性临床样本混合pool制片检测:将处于对数生长期的Hela细胞，用PBS漂洗一遍，加入2ml细胞保存液，用宫颈采样刷收集于离心管中固定24h，调整细胞数量为1.25×10^6/ml，备用。样本预制备时，取冻存于-80℃的6个阴性中间pool解冻后混匀作为阴性临床样本最终pool，先取2ml阴性pool中样本加到4ml离心管中，再用移液器取8ul Hela细胞加入到2ml阴性pool中，充分混匀后加入离心制片的模具中离心(800rpm，3min)。通过HPVE7蛋白单克隆抗体试剂检测试剂盒(艾托金生物医药)进行免疫细胞化学染色，同时设置质控(CaSki细胞作阳性样本对照)，评估其E7染色阳性细胞数、炎症背景、样本质量(如溶解、污染等)及制片细胞数目，结果如图3A所示。以表达HPV18 E6蛋白的宫颈癌细胞株HeLa细胞与阴性临床样本pool混合(8ul/2ml)，目的是在所制做的细胞切片上，可以观察到抗体克隆是否有对阴性对照样本中的正常宫颈上皮细胞是否有非特异性染色，同时，在同一张切片上可以观察到Hela阳性细胞作为特异性染色阳性染色。
阳性临床样本制片检测：将上述实验筛选的8个阳性Pool分别解冻，8个阳性中间Pool经混匀后作为均匀的阳性临床样本库，通过HPV E7蛋白单克隆抗体试剂检测试剂盒(艾托金生物医药)进行免疫细胞化学染色，所有被检测细胞切片含有同等数量的宫颈癌细胞和/或癌前病变阳性细胞。染色结果如图3B所示。
以上用临床上收集患者的宫颈脱落上皮细胞制备的样本库，经过测试鉴定、质量控制，可以制作成“标准样本”，以便以细胞免疫化学染色法，筛选和鉴定有高亲和力的单克隆。合格样本染色如图3A，3B所示，经过染色结果分析，以E7染色阳性细胞个数充足、炎症背景干净为质量合格的阳性样本库。使用从液基细胞临床样本中制定的Pool来检测未知抗体样本，可以检测抗体是否能结合液基细胞样本中经过保存液(含有机醇)处理而发生结构变化的E6蛋白，从而获得有临床检验用途的高质量抗体试剂。经过ICC检验，筛选出中间库序号为：1、2、3、29、31、32、34、36、37、38、39作为阳性中间Pool；6、7、9、11、12、13、14、15、16、18作为阴性中间Pool，分别装入离心管后-80℃冻存。其它不合格的中间Pool，弃掉不以于使用。
通过使用预混合处理的样本库，更能准确的辨认出在显微放大20x倍数下，每个肉眼可见的视野里有多少个阳性病变细胞。应用这些标准样本库，可以更容易检测抗体是否能够结合临床样本中经过有机溶剂固定和保存的宫颈上皮细胞中的E6蛋白。
2.3免疫细胞化学染色法检测CaSki宫颈癌细胞系、HeLa/阴性临床样本、阳性临床样本：
宫颈癌细胞株CaSki细胞表达HPV16 E6蛋白，宫颈癌细胞株Hela细胞表达HPV18E6蛋白，都可作为鉴定抗E6蛋白抗体克隆的阳性细胞系。CaSki细胞复苏培养后，在离心管内加入适量细胞保存液，用宫颈采样刷刷取培养皿内的细胞，并在离心管内涮洗采样刷，用细胞计数板计数后4℃保存待用，其中CaSki采用自然沉降法制片(每片5000个以上细胞)。将上述实验筛选的11个阳性Pool分别解冻，经混匀后作为均匀的阳性临床样本库。同时，将11个阴性中间pool解冻后混匀作为阴性临床样本最终pool，以表达HPV18 E6蛋白的宫颈癌细胞株HeLa细胞与阴性临床样本pool混合制片(8ul/2ml)。
对这三种细胞切片进行免疫细胞化学染色试验，具体实验方法如下：
CaSki采用自然沉降法制片(每片5000个以上细胞),HeLa细胞混合阴性临床样本、阳性临床样本均采用离心制片法(2ml/片，800rpm，3min)；制片结束后95％乙醇固定20分钟，50％乙醇复水10分钟后EDTA(pH 9.0)热修复，冷却后加入3％H2O2室温处理10min，甩干；加入PBST洗液洗3min，甩干；分别加入克隆上清A4F9与E7-ICC一抗(体系质控)，室温孵育30分钟；加入PBST洗液洗3次，每次3分钟，甩干；加入免疫显色试剂室温孵育30分钟；加入PBST洗液洗3次，每次3min，甩干；加入DAB显色液,室温反应，显微镜下观察染色结果，蒸馏水洗涤终止反应。显微镜下观察结果并记录。
结果见图4：克隆上清A4F9在CaSki阳性标准对照细胞上呈棕色染色，在阴性TCT样本/HeLa切片中对Hela细胞上有棕色染色，阳性信号较强，且定位在胞质染色。临床上收集HSIL/ASC-H样本中，在HSIL样本中染色27个癌细胞，且阳性病变细胞棕色着色较强，定位在胞浆。在炎性细胞、化生及正常宫颈上皮细胞中的非特异性染色较少。
2.4 ELISA检测克隆上清A4F9结合HPV E6蛋白功能性结构分析:
抗原分别选用GST-HPV18/16 E6 C端、GST-HPV18/16 E6 N端4种重组蛋白，分开包被，同时设置空白对照(包被抗原，加抗稀)，阳性对照(加GST抗体)。2μg/ml包板，4℃过夜，PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，分别加入克隆上清3A2、8A6、A4F9、22E3、70C10、43A11(1:1稀释)，GST抗体(1:5000)，37℃反应1h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:2500)，37℃反应30min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止OD450nm处读数。
结果见图5：A4F9能特异性结合重组蛋白GST-HPV16 E6 C端和GST-HPV18 E6 C端，OD值分别为2.9/0.6。其中，在GST-HPV16 E6 C端出现较强的阳性结合信号，在GST-HPV18E6 C端的阳性识别信号较弱。其它克隆8A6、22E3只结合HPV18 C片段，70C10只识别HPV18 N片段，克隆3A2、43A1信号极其微弱。
2.5 ELISA检测单克隆抗体与11种高危HPV亚型及2种低危亚型E6蛋白交叉反应：
选定13种HPV亚型E6癌蛋白抗原，序列为：
Flag-HPV16 E6(SEQ ID NO 25)：
MHQKRTAMFQDPQERPGKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSVYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL
FLAG-HPV18 E6(SEQ ID NO 26)：
MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLELTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV
FLAG-HPV31 E6(SEQ ID NO 27)：
MFKNPAERPRKLHELSSALEIPYDELRLNCVYCKGQLTETEVLDFAFTDLTIVYRDDTPYGVCTKCLRFYSKVSEFRWYRYSVYGTTLEKLTNKGICDLLIRCITCQRPLCPEEKQRHLDKKKRFHNIGGRWTGRCIVCWRRPRTETQV
FLAG-HPV33 E6(SEQ ID NO 28)：
MFQDTEEKPRTLHDLCQALETTIHNIELQCVECRNPLQRSEVYDFAFADLTVVYREGNPFGICKLCLRFLSKISEYRHYNYSVYGHTLEQTVNKPLNEILIRCIICQRPLCPREKKRHVDLNKRFHNISGRWAGRCAACWRSRRRETAL
FLAG-HPV35 E6(SEQ ID NO 29)：
MFQDPAERPYKLHDLCNEVEESIHEICLNCVYCKQELQRSEVYDFACYDLCIVYREGQPYGVCMKCLKFYSKISEYRRYRYSVYGETLEKQCNKQLCHLLIRCITCQKPLCPVEKQRHLEEKKRFHNIGGRWTGRCMSCWKPTRRETEV
FLAG-HPV6 E6(SEQ ID NO 30)：
MESKDASTSATSIDQLCKTFNLSMHTLQINCVFCKNALTTAEIYSYAYKHLKVLFRGGYPYAACACCLEFHGKINQYRHFDYAGYATTVEEETKQDILDVLIRCYLCHKPLCEVEKVKHILTKARFIKLNCTWKGRCLHCWTTCMEDLLP
FLAG-HPV11 E6(SEQ ID NO 31)：
MESKDASTSATSIDQLCKTFNLSLHTLQIQCVFCRNALTTAEIYAYAYKNLKVVWRDNFPFAACACCLELQGKINQYRHFNYAAYAPTVEEETNEDILKVLIRCYLCHKPLCEIEKLKHILGKARFIKLNNQWKGRCLHCWTTCMEDLLP
FLAG-HPV39 E6(SEQ ID NO 32)：
MARFHNPAERPYKLPDLCTTLDTTLQDITIACVYCRRPLQQTEVYEFAFSDLYVVYRDGEPLAACQSCIKFYAKIRELRYYSDSVYATTLENITNTKLYNLLIRCMCCLKPLCPAEKLRHLNSKRRFHKIAGSYTGQCRRCWTTKREDRRLTRRETQV
FLAG-HPV51 E6(SEQ ID NO 33)：
MFEDKRERPRTLHELCEALNVSMHNIQVVCVYCKKELCRADVYNVAFTEIKIVYRDNNPYAVCKQCLLFYSKIREYRRYSRSVYGTTLEAITKKSLYDLSIRCHRCQRPLGPEEKQKLVDEKKRFHEIAGRWTGQCANCWQRTRQRNETQV
FLAG-HPV52 E6(SEQ ID NO 34)：
MFEDPATRPRTLHELCEVLEESVHEIRLQCVQCKKELQRREVYKFLFTDLRIVYRDNNPYGVCIMCLRFLSKISEYRHYQYSLYGKTLEERVRKPLSEITIRCIICQTPLCPEEKERHVNANKRFHNIMGRWTGRCSECWRPRPVTQV
FLAG-HPV58 E6(SEQ ID NO 35)：
MFQDAEEKPRTLHDLCQALETSVHEIELKCVECKKTLQRSEVYDFVFADLRIVYRDGNPFAVCKVCLRLLSKISEYRHYNYSLYGDTLEQTLKKCLNEILIRCIICQRPLCPQEKKRHVDLNKRFHNISGRWTGRCAVCWRPRRRQTQV
FLAG-HPV59 E6(SEQ ID NO 36)：
MARFEDPTQRPYKLPDLSTTLNIPLHDIRINCVFCKGELQEREVFEFAFNDLFIVYRDCTPYAACLKCISFYARVRELRYYRDSVYGETLEAETKTPLHELLIRCYRCLKPLCPTDKLKHITEKRRFHNIAGIYTGQCRGCRTRARHLRQQRQARSETLV
FLAG-HPV68 E6(SEQ ID NO 37):
MALFHNPEERPYKLPDLCRTLDTTLHDVTIDCVYCRRQLQRTEVYEFAFGDLNVVYRDGVPLAACQSCIKFYAKIRELRYYSESVYATTLETITNTKLYDLSIRCMCCLKPLSPAEKLRHLNSKRRFHKIAGNFTGQCRHCWTSKREDRRRTRQETQV
通过在293T细胞中瞬时转染表达Flag-HPV E6融合蛋白。293T细胞复苏后，培养3-5代次。提前一天在10cm dish种入细胞，待次日细胞汇合度达到85％-90％进行转染。分别转染Flag-HPV E6质粒，每组转染两盘。48h后收取一组细胞制备新鲜裂解液，同时，另一组以液基细胞保存液固定处理1天，制备液基裂解液备用。用pH7.4的PBS缓冲液包被flag抗体，5ug/ml包板，4℃过夜，同时设置空白对照(空载293T细胞裂解液)，阳性对照(以Rb16-1兔血清孵育裂解液)。PBST洗涤拍干后，加入5％脱脂奶粉封闭，37℃作用2h或4℃过夜，PBST洗涤拍干后，分别每孔加入100ul细胞裂解液(HPV16新鲜裂解/液基裂解液；HPV18新鲜裂解/液基裂解液；空载293T细胞裂解液)，25℃孵育2h。PBST洗涤拍干后加入抗体克隆上清A4F9(1:1稀释)，Rb16-1兔血清(1:200)，25℃孵育2h，PBST洗涤拍干后再分别加入羊抗兔-HRP二抗(Sigma A0545)(1:2500)，37℃反应30min，PBST洗涤拍干后TMB显色和2M H2SO4终止OD450nm处读数。抗体克隆结合HPV16 E6信号为100％，结合其它亚型的交叉反应计算如下：(HPV OD450–293T阴性对照)/HPV16 OD450＝％交叉活性(表5)。
表5.
OD450 ％交叉活性
293T(阴性对照) 0.3 0.0％
HPV 31 2.9 86.1％
HPV 33 0.8 16.9％
HPV 35 0.3 -0.4％
HPV 52 0.3 -0.5％
HPV 58 2.9 87.8％
HPV 39 0.7 11.8％
HPV 68 0.5 6.3％
HPV 51 0.3 -0.6％
HPV 59 0.3 0.5％
HPV 6 0.1 -6.3％
HPV 11 0.1 -5.2％
Anti-Flag(阳性对照) 2.2 62.6％
结果见图6：A4F9克隆可以识别细胞表达可溶性蛋白HPV16 E6、HPV18 E6蛋白。
结果见图7：A4F9克隆对多种高危HPV亚型E6蛋白有反应，其中对HPV58、31、33、39结合较强，而对低危亚型HPV6、HPV11表达E6蛋白不结合。
2.6抗体可变区序列及CDR序列信息：
本发明选择最优B细胞克隆进行抗体免疫球蛋白IgG基因克隆，经过total mRNA分离、反转录成cDNA、PCR扩增、及测序。随后对兔免疫球蛋白重链和轻链V-区域片段的测序数据进行分析，最终获取了克隆的独特V-区域DNA序列和蛋白氨基酸序列及蛋白结构如下：
Signal peptide-FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4
抗体重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO 1)：
METGLRWLLLVAVLKGVQCQEQLVESGGGLVQPEGSLTLTCTASGFSFSSSYWICWVRQAPGKGLEWIACIYSGDGDAYYASWAKGRFTISKTSSTTVTLQMTSLTAADTAAYFCARDRVYDSSSGHGLWGPGTLVTVSS
抗体重链可变区DNA序列(SEQ ID NO 2)：
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGGAGCAGCTGGTGGAGTCCGGGGGAGGCCTGGTCCAGCCTGAGGGATCCCTGACACTCACCTGCACAGCCTCTGGATTCTCCTTCAGTAGCAGCTATTGGATATGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGTTGGAGTGGATCGCATGCATTTATAGTGGTG ATGGTGACGCTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGGTGACTCTGCAAATGACCAGTCTGACAGCCGCGGACACGGCCGCGTATTTCTGTGCGCGAGATAGAGTGTATGATAGTAGTAGTGG GCATGGCTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
抗体轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO 3)：
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADIVMTQTPFSVSAAAGGTVTINCQASENIYSNLAWYQQKPGQRPKLLIYGTSDLPSGVPSRFSGSGYGTEFTLTISDLECADAATYYCQSYYYRSSSAYGWDFGGGTEVVVK
抗体轻链可变区DNA序列(SEQ ID NO 4)：
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCTGACATTGTGATGACCCAGACTCCATTCTCCGTGTCTGCAGCTGCGGGAGGCACAGTCACCATCAATTGCCAGGCCAG TGAGAACATTTATAGCAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTGATCTATGGTACAT CTGATCTGCCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTTAGCGGCAGTGGATATGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAAGCTATTATTATAGGAGTAGTAGTGCTTATGGTTGGGATTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAG
抗体(A4F9)的重链可变区包括包括以下三个互补决定区CDR：
HCDR1，其氨基酸序列为SSYWIC(SEQ ID NO 5)，其编码核苷酸序列为，AGCAGCTATTGGATATGC(SEQ ID NO 11)；
HCDR2，其氨基酸序列为CIYSGDGDAYYASWAKG(SEQ ID NO 6),其编码核苷酸序列为，
TGCATTTATAGTGGTGATGGTGACGCTTACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGC(SEQ ID NO12)；
HCDR3，其氨基酸序列为DRVYDSSSGHGL(SEQ ID NO 7)，其编码核苷酸序列为，GATAGAGTGTATGATAGTAGTAGTGGGCATGGCTTG(SEQ ID NO 13)。
抗体(A4F9)的轻链可变区，具有选自下组的互补决定区CDR：
LCDR1，其氨基酸序列为QASENIYSNLA(SEQ ID NO 8)，其编码核苷酸序列为，CAGGCCAGTGAGAACATTTATAGCAATTTAGCC(SEQ ID NO 14)；
LCDR2，其氨基酸序列为GTSDLPS(SEQ ID NO 9)，其编码核苷酸序列为，GGTACATCTGATCTGCCATCT(SEQ ID NO 15)；
LCDR3，其氨基酸序列为QSYYYRSSSAYGWD(SEQ ID NO 10)，
其编码核苷酸序列为，
CAAAGCTATTATTATAGGAGTAGTAGTGCTTATGGTTGGGAT(SEQ ID NO 16)。
讨论
本发明人采用上述方法制备HPV16/18 E6兔源单克隆抗体，通过B细胞上清在HPV16/18 E6及标签无关蛋白的初步筛选，及重组生产纯化抗体在宫颈组织上的免疫组化应用筛选了6株抗体株，最终拿到一株亲和力高，能高亲和力的特异性结合Flag-HPV16 E6,HPV18 E6的单克隆抗体。本研究表明单抗A4F9可以特异性结合宫颈癌变细胞中内源E6致癌蛋白，通过二抗信号放大和催化DAB色原底物显色，使宫颈脱落细胞样本中的恶性癌变细胞呈现胞质特异性棕色染色，使癌变细胞直观、客观的被标记出来。
宫颈由HPV持续感染最终进展为宫颈癌一般需要10年左右的时间，整个宫颈病变进展过程分为宫颈上皮内瘤变(CIN)、原位癌和浸润癌。宫颈上皮内瘤变(CIN)根据病变程度又分为低度病变(CINI)、中度病变(CINII)和高度病变(CINIII)，而宫颈癌早期干预的最佳治疗窗口是CINII和CINIII。目前临床宫颈组织病理诊断金标准仍是细胞形态学诊断，因此病理诊断结果的准确性往往取决于病理医生的经验和水平，特别是对CINII级别样本的诊断上，即使是在受训严格的美国，CINII样本的判读仍存在较明显的不一致性。中国病理医生缺乏，而有经验的病理医生更是少之又少，因此对CIN特别是CINII样本的诊断迫切需要更有效的辅助手段，能客观的辅助临床诊断。在中国，导致宫颈鳞癌的HPV感染主要型别仍为HPV16和HPV18，占到宫颈鳞癌中HPV感染型别的85％左右。加上其它常见高位亚型本发明提供免疫组化染色抗体试剂和方法，可以特异性标记宫颈上皮内瘤变细胞及癌变细胞中的高危亚型HPVE6致癌蛋白，提示HPV16/18及其它主要致癌亚型HPV导致宫颈癌变的高风险，对降低漏诊和过度诊疗都有一定的临床应用意义。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 艾托金生物医药（苏州）有限公司
<120> 一种检测宫颈癌蛋白HPV E6的单克隆抗体及应用
<130> P2021-3550
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 140
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Glu Gly Ser Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe
35 40 45
Ser Ser Ser Tyr Trp Ile Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Ile Ala Cys Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Ala Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr
85 90 95
Thr Val Thr Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Asp Arg Val Tyr Asp Ser Ser Ser Gly His Gly
115 120 125
Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
130 135 140
<210> 2
<211> 420
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
gagcagctgg tggagtccgg gggaggcctg gtccagcctg agggatccct gacactcacc 120
tgcacagcct ctggattctc cttcagtagc agctattgga tatgctgggt ccgccaggct 180
ccagggaagg ggttggagtg gatcgcatgc atttatagtg gtgatggtga cgcttactac 240
gcgagctggg cgaaaggccg attcaccatc tccaaaacct cgtcgaccac ggtgactctg 300
caaatgacca gtctgacagc cgcggacacg gccgcgtatt tctgtgcgcg agatagagtg 360
tatgatagta gtagtgggca tggcttgtgg ggcccaggca ccctggtcac cgtctcctca 420
<210> 3
<211> 135
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Arg Cys Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Phe
20 25 30
Ser Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala
35 40 45
Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Arg Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Thr Ser Asp Leu Pro Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Glu Phe Thr Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln
100 105 110
Ser Tyr Tyr Tyr Arg Ser Ser Ser Ala Tyr Gly Trp Asp Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Glu Val Val Val Lys
130 135
<210> 4
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgctg acattgtgat gacccagact ccattctccg tgtctgcagc tgcgggaggc 120
acagtcacca tcaattgcca ggccagtgag aacatttata gcaatttagc ctggtatcag 180
cagaaaccag ggcagcgtcc caagctcctg atctatggta catctgatct gccatctggg 240
gtcccatcgc ggtttagcgg cagtggatat gggacagagt tcactctcac catcagcgac 300
ctggagtgtg ccgatgctgc cacttactac tgtcaaagct attattatag gagtagtagt 360
gcttatggtt gggatttcgg cggagggacc gaggtggtgg tcaag 405
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ser Ser Tyr Trp Ile Cys
1 5
<210> 6
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Cys Ile Tyr Ser Gly Asp Gly Asp Ala Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Asp Arg Val Tyr Asp Ser Ser Ser Gly His Gly Leu
1 5 10
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gln Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Thr Ser Asp Leu Pro Ser
1 5
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Gln Ser Tyr Tyr Tyr Arg Ser Ser Ser Ala Tyr Gly Trp Asp
1 5 10
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agcagctatt ggatatgc 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tgcatttata gtggtgatgg tgacgcttac tacgcgagct gggcgaaagg c 51
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gatagagtgt atgatagtag tagtgggcat ggcttg 36
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<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caggccagtg agaacattta tagcaattta gcc 33
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggtacatctg atctgccatc t 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
caaagctatt attataggag tagtagtgct tatggttggg at 42
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala
50 55 60
Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His
65 70 75 80
<210> 18
<211> 78
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr
1 5 10 15
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu
20 25 30
Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His
35 40 45
Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg
50 55 60
Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
65 70 75
<210> 19
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp Leu Cys Thr Glu Leu
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala
1 5 10
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<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr Gly
1 5 10 15
Leu Tyr Asn Leu
20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg Ala Arg Gln Glu
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
atggcgcgct ttgaggatcc aacacggcga ccctacaagc tacctgatct gtgcacggaa 60
ctgaacactt cactgcaaga catagaaata acctgtgtat attgcaagac agtattggaa 120
cttacagagg tatttgaatt tgcatttaaa gatttatttg tggtgtatag agacagtata 180
ccgcatgctg catgccataa atgtatagat ttttattcta gaattagaga attaagacat 240
<210> 24
<211> 237
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tattcagact ctgtgtatgg agacacattg gaaaaactaa ctaacactgg gttatacaat 60
ttattaataa ggtgcctgcg gtgccagaaa ccgttgaatc cagcagaaaa acttagacac 120
cttaatgaaa aacgacgatt tcacaacata gctgggcact atagaggcca gtgccattcg 180
tgctgcaacc gagcacgaca ggaacgcctc caacgacgca gagaaacaca agtataa 237
<210> 25
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Met His Gln Lys Arg Thr Ala Met Phe Gln Asp Pro Gln Glu Arg Pro
1 5 10 15
Gly Lys Leu Pro Gln Leu Cys Thr Glu Leu Gln Thr Thr Ile His Asp
20 25 30
Ile Ile Leu Glu Cys Val Tyr Cys Lys Gln Gln Leu Leu Arg Arg Glu
35 40 45
Val Tyr Asp Phe Ala Phe Arg Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Asp Gly
50 55 60
Asn Pro Tyr Ala Val Cys Asp Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Glu Tyr Arg His Tyr Cys Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu
85 90 95
Gln Gln Tyr Asn Lys Pro Leu Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Asn
100 105 110
Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys
115 120 125
Lys Gln Arg Phe His Asn Ile Arg Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met
130 135 140
Ser Cys Cys Arg Ser Ser Arg Thr Arg Arg Glu Thr Gln Leu
145 150 155
<210> 26
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Arg Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Glu Leu Asn Thr Ser Leu Gln Asp Ile Glu Ile Thr Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Lys Thr Val Leu Glu Leu Thr Glu Val Phe Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Lys Asp Leu Phe Val Val Tyr Arg Asp Ser Ile Pro His Ala Ala
50 55 60
Cys His Lys Cys Ile Asp Phe Tyr Ser Arg Ile Arg Glu Leu Arg His
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Thr
85 90 95
Gly Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Leu Arg Cys Gln Lys Pro Leu
100 105 110
Asn Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Glu Lys Arg Arg Phe His
115 120 125
Asn Ile Ala Gly His Tyr Arg Gly Gln Cys His Ser Cys Cys Asn Arg
130 135 140
Ala Arg Gln Glu Arg Leu Gln Arg Arg Arg Glu Thr Gln Val
145 150 155
<210> 27
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Met Phe Lys Asn Pro Ala Glu Arg Pro Arg Lys Leu His Glu Leu Ser
1 5 10 15
Ser Ala Leu Glu Ile Pro Tyr Asp Glu Leu Arg Leu Asn Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gly Gln Leu Thr Glu Thr Glu Val Leu Asp Phe Ala Phe Thr
35 40 45
Asp Leu Thr Ile Val Tyr Arg Asp Asp Thr Pro Tyr Gly Val Cys Thr
50 55 60
Lys Cys Leu Arg Phe Tyr Ser Lys Val Ser Glu Phe Arg Trp Tyr Arg
65 70 75 80
Tyr Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Lys Leu Thr Asn Lys Gly Ile
85 90 95
Cys Asp Leu Leu Ile Arg Cys Ile Thr Cys Gln Arg Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Arg His Leu Asp Lys Lys Lys Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Gly Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ile Val Cys Trp Arg Arg Pro Arg
130 135 140
Thr Glu Thr Gln Val
145
<210> 28
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Phe Gln Asp Thr Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Thr Ile His Asn Ile Glu Leu Gln Cys Val Glu
20 25 30
Cys Arg Asn Pro Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Ala Phe Ala
35 40 45
Asp Leu Thr Val Val Tyr Arg Glu Gly Asn Pro Phe Gly Ile Cys Lys
50 55 60
Leu Cys Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn
65 70 75 80
Tyr Ser Val Tyr Gly His Thr Leu Glu Gln Thr Val Asn Lys Pro Leu
85 90 95
Asn Glu Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Arg Glu Lys Lys Arg His Val Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Ser Gly Arg Trp Ala Gly Arg Cys Ala Ala Cys Trp Arg Ser Arg Arg
130 135 140
Arg Glu Thr Ala Leu
145
<210> 29
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
Met Phe Gln Asp Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Asn Glu Val Glu Glu Ser Ile His Glu Ile Cys Leu Asn Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Gln Glu Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Ala Cys Tyr
35 40 45
Asp Leu Cys Ile Val Tyr Arg Glu Gly Gln Pro Tyr Gly Val Cys Met
50 55 60
Lys Cys Leu Lys Phe Tyr Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg Arg Tyr Arg
65 70 75 80
Tyr Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Lys Gln Cys Asn Lys Gln Leu
85 90 95
Cys His Leu Leu Ile Arg Cys Ile Thr Cys Gln Lys Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Val Glu Lys Gln Arg His Leu Glu Glu Lys Lys Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Gly Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Met Ser Cys Trp Lys Pro Thr Arg
130 135 140
Arg Glu Thr Glu Val
145
<210> 30
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
Met Glu Ser Lys Asp Ala Ser Thr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Gln Leu
1 5 10 15
Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Met His Thr Leu Gln Ile Asn Cys Val
20 25 30
Phe Cys Lys Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ser Tyr Ala Tyr
35 40 45
Lys His Leu Lys Val Leu Phe Arg Gly Gly Tyr Pro Tyr Ala Ala Cys
50 55 60
Ala Cys Cys Leu Glu Phe His Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His Phe
65 70 75 80
Asp Tyr Ala Gly Tyr Ala Thr Thr Val Glu Glu Glu Thr Lys Gln Asp
85 90 95
Ile Leu Asp Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu Cys
100 105 110
Glu Val Glu Lys Val Lys His Ile Leu Thr Lys Ala Arg Phe Ile Lys
115 120 125
Leu Asn Cys Thr Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr Cys
130 135 140
Met Glu Asp Leu Leu Pro
145 150
<210> 31
<211> 150
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
Met Glu Ser Lys Asp Ala Ser Thr Ser Ala Thr Ser Ile Asp Gln Leu
1 5 10 15
Cys Lys Thr Phe Asn Leu Ser Leu His Thr Leu Gln Ile Gln Cys Val
20 25 30
Phe Cys Arg Asn Ala Leu Thr Thr Ala Glu Ile Tyr Ala Tyr Ala Tyr
35 40 45
Lys Asn Leu Lys Val Val Trp Arg Asp Asn Phe Pro Phe Ala Ala Cys
50 55 60
Ala Cys Cys Leu Glu Leu Gln Gly Lys Ile Asn Gln Tyr Arg His Phe
65 70 75 80
Asn Tyr Ala Ala Tyr Ala Pro Thr Val Glu Glu Glu Thr Asn Glu Asp
85 90 95
Ile Leu Lys Val Leu Ile Arg Cys Tyr Leu Cys His Lys Pro Leu Cys
100 105 110
Glu Ile Glu Lys Leu Lys His Ile Leu Gly Lys Ala Arg Phe Ile Lys
115 120 125
Leu Asn Asn Gln Trp Lys Gly Arg Cys Leu His Cys Trp Thr Thr Cys
130 135 140
Met Glu Asp Leu Leu Pro
145 150
<210> 32
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Met Ala Arg Phe His Asn Pro Ala Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Thr Thr Leu Asp Thr Thr Leu Gln Asp Ile Thr Ile Ala Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Arg Arg Pro Leu Gln Gln Thr Glu Val Tyr Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Ser Asp Leu Tyr Val Val Tyr Arg Asp Gly Glu Pro Leu Ala Ala
50 55 60
Cys Gln Ser Cys Ile Lys Phe Tyr Ala Lys Ile Arg Glu Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Tyr Ser Asp Ser Val Tyr Ala Thr Thr Leu Glu Asn Ile Thr Asn Thr
85 90 95
Lys Leu Tyr Asn Leu Leu Ile Arg Cys Met Cys Cys Leu Lys Pro Leu
100 105 110
Cys Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Ser Lys Arg Arg Phe His
115 120 125
Lys Ile Ala Gly Ser Tyr Thr Gly Gln Cys Arg Arg Cys Trp Thr Thr
130 135 140
Lys Arg Glu Asp Arg Arg Leu Thr Arg Arg Glu Thr Gln Val
145 150 155
<210> 33
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Met Phe Glu Asp Lys Arg Glu Arg Pro Arg Thr Leu His Glu Leu Cys
1 5 10 15
Glu Ala Leu Asn Val Ser Met His Asn Ile Gln Val Val Cys Val Tyr
20 25 30
Cys Lys Lys Glu Leu Cys Arg Ala Asp Val Tyr Asn Val Ala Phe Thr
35 40 45
Glu Ile Lys Ile Val Tyr Arg Asp Asn Asn Pro Tyr Ala Val Cys Lys
50 55 60
Gln Cys Leu Leu Phe Tyr Ser Lys Ile Arg Glu Tyr Arg Arg Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Ser Val Tyr Gly Thr Thr Leu Glu Ala Ile Thr Lys Lys Ser Leu
85 90 95
Tyr Asp Leu Ser Ile Arg Cys His Arg Cys Gln Arg Pro Leu Gly Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Gln Lys Leu Val Asp Glu Lys Lys Arg Phe His Glu Ile
115 120 125
Ala Gly Arg Trp Thr Gly Gln Cys Ala Asn Cys Trp Gln Arg Thr Arg
130 135 140
Gln Arg Asn Glu Thr Gln Val
145 150
<210> 34
<211> 148
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
Met Phe Glu Asp Pro Ala Thr Arg Pro Arg Thr Leu His Glu Leu Cys
1 5 10 15
Glu Val Leu Glu Glu Ser Val His Glu Ile Arg Leu Gln Cys Val Gln
20 25 30
Cys Lys Lys Glu Leu Gln Arg Arg Glu Val Tyr Lys Phe Leu Phe Thr
35 40 45
Asp Leu Arg Ile Val Tyr Arg Asp Asn Asn Pro Tyr Gly Val Cys Ile
50 55 60
Met Cys Leu Arg Phe Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Gln
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Lys Thr Leu Glu Glu Arg Val Arg Lys Pro Leu
85 90 95
Ser Glu Ile Thr Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Thr Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Glu Glu Lys Glu Arg His Val Asn Ala Asn Lys Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Met Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ser Glu Cys Trp Arg Pro Arg Pro
130 135 140
Val Thr Gln Val
145
<210> 35
<211> 149
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Met Phe Gln Asp Ala Glu Glu Lys Pro Arg Thr Leu His Asp Leu Cys
1 5 10 15
Gln Ala Leu Glu Thr Ser Val His Glu Ile Glu Leu Lys Cys Val Glu
20 25 30
Cys Lys Lys Thr Leu Gln Arg Ser Glu Val Tyr Asp Phe Val Phe Ala
35 40 45
Asp Leu Arg Ile Val Tyr Arg Asp Gly Asn Pro Phe Ala Val Cys Lys
50 55 60
Val Cys Leu Arg Leu Leu Ser Lys Ile Ser Glu Tyr Arg His Tyr Asn
65 70 75 80
Tyr Ser Leu Tyr Gly Asp Thr Leu Glu Gln Thr Leu Lys Lys Cys Leu
85 90 95
Asn Glu Ile Leu Ile Arg Cys Ile Ile Cys Gln Arg Pro Leu Cys Pro
100 105 110
Gln Glu Lys Lys Arg His Val Asp Leu Asn Lys Arg Phe His Asn Ile
115 120 125
Ser Gly Arg Trp Thr Gly Arg Cys Ala Val Cys Trp Arg Pro Arg Arg
130 135 140
Arg Gln Thr Gln Val
145
<210> 36
<211> 160
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
Met Ala Arg Phe Glu Asp Pro Thr Gln Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Ser Thr Thr Leu Asn Ile Pro Leu His Asp Ile Arg Ile Asn Cys
20 25 30
Val Phe Cys Lys Gly Glu Leu Gln Glu Arg Glu Val Phe Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Asn Asp Leu Phe Ile Val Tyr Arg Asp Cys Thr Pro Tyr Ala Ala
50 55 60
Cys Leu Lys Cys Ile Ser Phe Tyr Ala Arg Val Arg Glu Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Tyr Arg Asp Ser Val Tyr Gly Glu Thr Leu Glu Ala Glu Thr Lys Thr
85 90 95
Pro Leu His Glu Leu Leu Ile Arg Cys Tyr Arg Cys Leu Lys Pro Leu
100 105 110
Cys Pro Thr Asp Lys Leu Lys His Ile Thr Glu Lys Arg Arg Phe His
115 120 125
Asn Ile Ala Gly Ile Tyr Thr Gly Gln Cys Arg Gly Cys Arg Thr Arg
130 135 140
Ala Arg His Leu Arg Gln Gln Arg Gln Ala Arg Ser Glu Thr Leu Val
145 150 155 160
<210> 37
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Met Ala Leu Phe His Asn Pro Glu Glu Arg Pro Tyr Lys Leu Pro Asp
1 5 10 15
Leu Cys Arg Thr Leu Asp Thr Thr Leu His Asp Val Thr Ile Asp Cys
20 25 30
Val Tyr Cys Arg Arg Gln Leu Gln Arg Thr Glu Val Tyr Glu Phe Ala
35 40 45
Phe Gly Asp Leu Asn Val Val Tyr Arg Asp Gly Val Pro Leu Ala Ala
50 55 60
Cys Gln Ser Cys Ile Lys Phe Tyr Ala Lys Ile Arg Glu Leu Arg Tyr
65 70 75 80
Tyr Ser Glu Ser Val Tyr Ala Thr Thr Leu Glu Thr Ile Thr Asn Thr
85 90 95
Lys Leu Tyr Asp Leu Ser Ile Arg Cys Met Cys Cys Leu Lys Pro Leu
100 105 110
Ser Pro Ala Glu Lys Leu Arg His Leu Asn Ser Lys Arg Arg Phe His
115 120 125
Lys Ile Ala Gly Asn Phe Thr Gly Gln Cys Arg His Cys Trp Thr Ser
130 135 140
Lys Arg Glu Asp Arg Arg Arg Thr Arg Gln Glu Thr Gln Val
145 150 155

Claims (10)

1.一种抗体的重链可变区，其特征在于，所述的重链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
HCDR1：SSYWIC SEQ ID NO:5；
HCDR2：CIYSGDGDAYYASWAKG SEQ ID NO:6；和
HCDR3：DRVYDSSSGHGL SEQ ID NO:7；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。
2.一种抗体的重链，其特征在于，所述的重链具有如权利要求1所述的重链可变区和重链恒定区。
3.一种抗体的轻链可变区，其特征在于，所述轻链可变区包括以下三个互补决定区CDR：
LCDR1：QASENIYSNLA SEQ ID NO:8；
LCDR2：GTSDLPS SEQ ID NO:9；和
LCDR3：QSYYYRSSSAYGWD SEQ ID NO:10；
其中，上述氨基酸序列中任意一种氨基酸序列还包括任选地经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸的，并能够保留HPV16 E6蛋白结合亲和力的衍生序列。
4.一种抗体的轻链，其特征在于，所述的轻链具有如权利要求3所述的轻链可变区和轻链恒定区。
5.一种抗体，其特征在于，所述抗体具有：
(1)如权利要求1所述的重链可变区；和/或
(2)如权利要求3所述的轻链可变区；
或者，所述抗体具有：
如权利要求2所述的重链；和/或如权利要求4所述的轻链。
6.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：
(i)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；以及
(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。
7.一种多核苷酸，其特征在于，其编码选自下组的多肽：
(1)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；或
(2)如权利要求6所述的重组蛋白。
8.一种载体，其特征在于，它含有本发明权利要求7所述的多核苷酸。
9.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求8所述的载体或基因组中整合有权利要求7所述的多核苷酸。
10.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有：
(a)如权利要求1所述的重链可变区、如权利要求2所述的重链、如权利要求3所述的轻链可变区、如权利要求4所述的轻链、或如权利要求5所述的抗体；和
(b)选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、或酶。
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