KR102486507B1 - 플렉틴-1 결합 항체 및 그의 용도 - Google Patents

플렉틴-1 결합 항체 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시내용의 측면들은 플렉틴-1의 표면 발현을 특징으로 하는 암을 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항-플렉틴-1 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항-플렉틴-1 항체는 표적화된 모이어티 (예를 들어, 치료 모이어티 또는 검출가능한 표지)에 접합된다.
[대표도]
도 3a

Description

플렉틴-1 결합 항체 및 그의 용도
관련 출원
본 출원은 2016년 4월 8일에 출원되고 발명의 영문 명칭이 "PLECTIN-1 BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF"인 미국 가출원 일련 번호 62/320,117의 35 U.S.C. § 119(e) 하의 출원일의 이익을 주장하고, 상기 가출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
췌장관 선암종 (PDAC)은 미국에서 암 사망의 4번째 선도 원인으로, 사망에 이르는 급속한 임상 과정을 나타낸다. 일단 진단되면, PDAC는 중앙값 생존이 6개월이고, 5년 생존율은 3 퍼센트에 불과하다 (Li et al., Lancet 363:1049-1057 (2004)).
화학요법 및 방사선요법은 이익이 미미할 뿐이고, 수술은 환자의 20％에서만 가능하기 때문에, 수술 절제를 허용하는 조기 검출이 더 긴 생존에 대한 최선의 희망을 제공한다 (Yeo et al., Ann Surg 222:580-588 (1995); discussion 588-592). 실제로, 고위험 환자군 (예를 들어, 유전적 암 증후군, 만성 췌장염, 및 신규 발병 당뇨병)에서의 PDAC 또는 고등급 전구체의 검출이 암 진단 포트폴리오에서 아직 충족되지 않은 중요한 요구를 나타낸다 (Brentnall et al., Ann. Intern. Med. 131:247-255 (1999); Canto et al., Clin. Gastroenterol. Hepatol. 2:606-621 (2004)).
혈청 CA-19-9는 임상적으로 사용되는 바이오마커이다; 그러나, 이는 초기 단계의 PDAC를 검출하는데 요구되는 감도가 결여된다 (Goggins, J. Clin. Oncol. 23:4524-4531 (2005)). 추가적으로, 단면 복부 영상화는 고위험 환자에서 초기 단계의 PDAC를 검출하는데 신뢰할 수 없는 것으로 증명되었다 (Pelaez-Luna et al., Am J Gastroenterol 102:2157-2163 (2007)).
따라서, 이러한 의학 분야에서의 최우선 순위는 진단술로서의 결합 리간드, 예컨대 신생물-전/초기 침습성 병변을 검출하기 위한 영상화 프로브의 개발 및 치료에서의 사용을 위한 바이오마커를 확인하는 것이다.
본 개시내용의 측면들은 임상적으로 유용한 항체-기반 작용제, 예컨대 항체 약물 접합체 (ADC)의 성공적인 개발이 자신의 표적에 대한 작용제의 특이성 및 선택성에 영향을 받는다는 인식에 관한 것이다. 플렉틴-1은 난소, 식도, 및 두경부 편평세포 암종, 뿐만 아니라 췌장관 선암종을 포함하는 다양한 암에 대한 유용한 바이오마커이다. 항체 표적, 예컨대 브렌툭시맙 베도틴이 표적으로 하는 CD30, 및 아도-트라스투주맙 엠탄신이 표적으로 하는 Her2와 대조적으로, 플렉틴-1은 특정 암 세포 (예를 들어, 췌장관 선암종 세포, 난소암 세포 등)에서만 세포 표면 상에 존재하여, 정교한 특이성 및 선택성을 제공하기 때문에 특히 유용한 표적이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암 세포 표면 상의 플렉틴-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 항원 결합 단편, 및 그의 사용 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항-플렉틴-1 항체가 플렉틴-1 발현 세포에 결합하는 것은 세포의 사멸을 유도한다 (예를 들어, 아팝토시스를 촉발한다).
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호(SEQ ID NO): 92에 대한 동일성이 적어도 85％인 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 92에 대한 동일성이 적어도 90％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％ 적어도 98％ 또는 적어도 99％인 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 92로 기재된 아미노산 서열에 특이적으로 결합한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 세포-표면 노출된 플렉틴-1 항원에 특이적으로 결합하고, 6개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이며, 여기서 CDRH1이 서열식별번호: 18에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2가 서열식별번호: 20에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3이 서열식별번호: 22에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1이 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2가 서열식별번호: 42에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3이 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하거나; 또는 CDRH1이 서열식별번호: 62에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2가 서열식별번호: 64에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3이 서열식별번호: 66에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1이 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2가 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3이 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 18에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2는 서열식별번호: 20에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3은 서열식별번호: 22에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1은 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2는 서열식별번호: 42에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3은 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 66으로 기재된 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDRH3)을 포함하는 가변 중쇄 영역을 포함하는, 세포-표면 노출된 플렉틴-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 44 또는 서열식별번호: 88로 기재된 서열을 갖는 상보성 결정 영역 3 (CDRL3)을 포함하는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 24의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 46의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 24의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열식별번호: 46의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편의 CDRH1은 서열식별번호: 62에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2는 서열식별번호: 64에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3은 서열식별번호: 66에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1은 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2는 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3은 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 68의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 90의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 68의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열식별번호: 90의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 24 또는 서열식별번호: 68로 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 세포-표면 노출된 플렉틴-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 46 또는 서열식별번호: 90으로 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 24에 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 46에 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열식별번호: 68에 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 90에 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 15와 적어도 85％의 동일성을 공유하는 서열 세트를 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 37과 적어도 85％의 동일성을 공유하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 15와 적어도 90％ (예를 들어, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％)의 동일성을 공유하는 서열 세트를 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 37과 적어도 90％ (예를 들어, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％)의 동일성을 공유하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 59와 적어도 85％의 동일성을 공유하는 서열 세트를 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 81과 적어도 85％의 동일성을 공유하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 59와 적어도 90％ (예를 들어, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％)의 동일성을 공유하는 서열 세트를 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 81과 적어도 90％ (예를 들어, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 또는 적어도 99％)의 동일성을 공유하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 59에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편은 IgG, IgG1, IgG2, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM, 및 IgE 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 항체 또는 항원 결합 단편은 모노클로날 항체, 인간화 항체, 디아바디, 키메라 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 어피바디, 또는 Fv 단편이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 플렉틴-1에 대해 표적화된 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 항체 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체)는 표적화된 작용제에 커플링된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 작용제는 검출가능한 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 검출가능한 모이어티는 방사성 동위원소, 자성 화합물, x선 흡수제, 화학적 화합물, 생물학적 태그, 및 형광 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 표적화된 작용제는 치료제이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 세포독성 모이어티 또는 면역조정 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 항체는 표적화된 작용제에 링커를 통해 연결된다. 일부 실시양태에서, 링커는 가요성 아미노산 서열이다. 일부 실시양태에서, 링커는 포토링커이다.
일부 실시양태에서, 표적화된 작용제는 생리학상 불활성인 나노입자를 포함한다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 자성, 형광성, 또는 방사성이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 작용제는 형광색소를 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 92로 기재된 아미노산 서열에 결합하는 것에 대해 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항체 또는 항원 결합 단편 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체)과 경쟁 또는 교차-경쟁하는 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 항체 또는 항원 결합 단편은 항체 또는 항원 결합 단편과 이의 항원 사이에서 10-6 M 미만의 평형 해리 상수 Kd로 경쟁 또는 교차-경쟁한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항체 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체)를 포함하고, 임의적으로 제약상 허용되는 부형제를 추가로 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDRH3이 서열식별번호: 22에 기재된 서열을 포함하는, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 18에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 20에 기재된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDRL3이 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 42에 기재된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDRH3이 서열식별번호: 66에 기재된 서열을 포함하는, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDRH1은 서열식별번호: 62에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRH2는 서열식별번호: 64에 기재된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 CDRL3이 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는, 3개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 단백질을 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, CDRL1은 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, CDRL2는 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 15, 24, 37, 46, 59, 68, 81, 또는 90으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열에 기재된 서열을 포함하는 단리된 핵산을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 핵산을 포함하는 단리된 세포 (예를 들어, 숙주 세포)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 단리된 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 또는 곤충 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 하이브리도마 세포이다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 표적화된 작용제에 커플링된, 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항체 또는 조성물 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체, 또는 항-플렉틴-1 항체를 포함하는 조성물)을 대상체에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 항체가 대상체 내의 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1에 결합하는 것인, 대상체 내의 암 세포에 작용제를 표적화하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 암에 걸린 대상체에게 유효량의 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항체 또는 조성물 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체, 또는 항-플렉틴-1 항체를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 암에 걸린 대상체에게 유효량의 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항체 또는 조성물 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체, 또는 항-플렉틴-1 항체를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 암 세포를 검출하는 방법을 제공한다.
본 개시내용에 의해 기술된 방법의 일부 실시양태에서, 항체 또는 조성물은 1 ng/kg 내지 100 mg/kg 범위의 용량으로 투여된다.
본 개시내용에 의해 기술된 방법의 일부 실시양태에서, 암 세포는 난소암 세포, 식도암 세포, 두경부 편평세포 암종 암 세포, 또는 췌장암 세포이다. 일부 실시양태에서, 암 세포는 췌장관 선암종 세포이다. 본 개시내용에 의해 기술된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 임의적으로는 인간이다.
도 1은 YapC- 또는 HPDE-코팅된 플레이트 상에서의 상이한 클론들의 시험관내 확인을 나타낸다.
도 2는 세포 사멸 검정법을 사용한 세포주의 추가적인 시험관내 확인을 나타낸다.
도 3a-3b는 플렉틴-1 단백질의 재조합 인간 C-말단 부분 (도 3a, Sec8-His) 및 플렉틴-1-양성 L3.6pl 암 세포 (도 3b) 상에서의 PAb1 결합 특이성을 나타낸다.
도 4a-4g는 L3.6pl 플렉틴-1-양성 암 세포에서의 PAb1의 내재화를 나타낸다. 도 4a-4b는 엔도솜 마커 Lamp-1과 병합된 PAb1 (도 4a) 및 IgG 대조군 (도 4b)의 염색 후의 L3.6pl의 대표적인 공초점 영상을 나타낸다. Lamp-1 (도 4c), PAb1 (도 4d)의 염색 및 LAMP-1 및 PAb1의 공동-국소화 (도 4e)가 제시된다. 도 4f는 PAb1의 유의한 부분이 Lamp-1과 병합되는 반면 IgG 대조군은 그렇지 않았음을 나타내는 데이터를 나타낸다. 도 4g는 L3.6pl 플렉틴-1-양성 세포 및 LNCap 플렉틴-1-음성 세포에서의 37℃에서, 4℃에서 또는 과량의 콜드 PAb1과 조합하여 인큐베이션한 후의 내재화된 125I-PAb1 방사능의 정량을 나타낸다; Comp.는 경쟁 검정법을 지칭한다.
도 5a-5d는 PAb1 처리 후의 아팝토시스에 의한 암 세포 사멸 유도를 나타낸다. 도 5a는 L3.6pl 세포의 형광 마이너스 원(fluorescent minus one) (FMO) 유동 세포측정법 데이터를 나타낸다. 도 5b는 72시간 대조군 IgG 처리 후의 L3.6pl 아넥신V 양성 세포를 나타낸다. 도 5c는 72시간 PAb1 처리 후의 L3.6pl 아넥신V 양성 세포를 나타낸다. 도 5d는 L3.6pl 암 세포가 대조군 IgG (D)에 비교하여 PAb1 처리 후 더 많은 아팝토시스를 겪었음을 나타낸다. *,p<0.05.
도 6a-6d는 YapC 암 세포의 튜불린 비등방성에 대한 PAb1 처리의 효과를 나타낸다. 도 6a는 처리 부재 하의 튜불린 염색 후의 YapC의 공초점 현미경검사 영상을 나타낸다. 도 6b는 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 처리 10분 후의 튜불린 염색 후의 YapC의 공초점 현미경검사 영상을 나타낸다. 도 6c는 PAb1 처리 24시간 후의 튜불린 염색 후의 YapC의 공초점 현미경검사 영상을 나타낸다. 도 6d는 처리되지 않은 대조군에 비교된 PAb1로 처리된 세포에서의 비등방성 감소를 나타낸다.
도 7a-7c는 YapC 암 세포에서의 PAb1과 튜불린의 공동-국소화를 나타낸다. 도 7a는 튜불린 염색 후의 YapC 세포의 공초점 현미경검사 영상을 나타낸다. 도 7b는 PAb1 염색 후의 YapC 세포의 공초점 현미경검사 영상을 나타낸다. 도 7c는 튜불린 염색 및 PAb1 염색의 공동-국소화 (화살표)를 나타낸다.
도 8a-8e는 피하 YapC 종양을 보유하는 면역손상 마우스의 생체-내 PAb1 용량-상승 치료를 나타낸다. 도 8a는 11일의 치료 후, 대조군 IgG 마우스에 비교하여 3 mg/kg PAb1이 투여된 마우스에서 종양 부피가 유의하게 더 낮다는 것을 나타낸다. 1 mg/kg PAb1 처리군은 제14일에 종양 부피의 유의한 감소를 도출하였다. 0.3 mg/kg 군과 비교하여 2개의 더 높은 용량의 PAb1가 유의하게 더 낮은 종양 부피를 나타냈다. *, p<0.05, IgG 대 3 mg/kg PAb1; #, p<0.05, IgG 대 1 mg/kg PAb1; °, p<0.05, 0.3 대 3 mg/kg PAb1;
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, p<0.05, 0.3 대 1 mg/kg PAb1. 도 8b는 각각의 군의 동물의 평균 체중을 나타낸다. 전체 치료 기간 동안 동물의 체중이 감소되지 않았음을 주지한다.
플렉틴 -1에 결합하는 항체
본 개시내용은 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편을 제공한다. 본 개시내용의 모노클로날 항체는 뮤린(murine), 인간화 또는 키메라 항체일 수 있거나 또는 다른 형태일 수 있다. 본 개시내용의 항체, 뿐만 아니라 본 개시내용의 항체의 생산 및 확인을 위한 방법의 상세한 설명이 본원에서 제공된다.
플렉틴-1은 중간체 필라멘트를 미세관 및 마이크로필라멘트에 연결하고, 추가적으로 세포골격을 형질막 및 핵막에 고정시키는 고분자량 단백질 (500 kDa)이다 (문헌 [Sonnenberg, et al., Exp Cell Res 313:2189-2203 (2007)]에서 리뷰됨).
일반적으로, 정상 췌장관 세포에서는 플렉틴-1 수준이 낮지만, 특정 암에 걸린 세포 (예를 들어, 전구 췌장 상피내 종양 (PanIN), 췌장관 선암종 세포 (PDAC), 난소암 세포 등)에서는 이의 발현이 상향조절된다. 정상 섬유모세포에서는 플렉틴-1이 독특한 세포질 및 핵 국소화를 나타내는 반면, 특정 암에 걸린 세포 (예를 들어, PDAC)에서는 세포막 상에서의 비정상적인 발현이 관찰된다. 플렉틴-1의 세포하 국소화 변경은 자가면역 병태인 신생물딸림 천포창, 및 연관된 림프구증식 신생물인 캐슬만병에서 또한 관찰되었다 (Aho et al., J Invest Dermatol 113:422-423 (1999)). 플렉틴-1은 신호 전달에서도 중요한 역할이 있다. 따라서, 특정 암에 걸린 세포 (예를 들어, 전구 췌장 상피내 종양 (PanIN), 췌장관 선암종 세포 (PDAC), 난소암 세포 등)에서의 플렉틴-1은 발암에 관련된 세포 이동, 극성 및 에너지 대사를 조절하는 신호전달 경로에 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1에 결합하는 항체 및 항원 결합 단편을 제공한다.
일부 실시양태에서, 항체, 일명 면역글로불린은 각각 약 25 kDa의 2개의 경쇄 (L) 및 각각 약 50 kDa의 2개의 중쇄 (H)로 구성된 사량체성 글리코실화 단백질이다. 람다 및 카파로 명명된 2가지 경쇄 유형이 항체에서 발견될 수 있다. 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라, 면역글로불린은 5가지 주요 클래스인 A, D, E, G, 및 M으로 할당될 수 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 각각의 경쇄는 전형적으로 N-말단 가변 (V) 도메인 (VL) 및 불변 (C) 도메인 (CL)을 포함한다. 각각의 중쇄는 전형적으로 N-말단 V 도메인 (VH), 3개 또는 4개의 C 도메인 (CH1-3), 및 힌지 영역을 포함한다. VH에 가장 가까운 CH 도메인이 CH1로 지정된다. VH 및 VL 도메인은 3개의 초가변 서열 영역 (상보성 결정 영역, CDR)에 대한 스캐폴드를 형성하는, 프레임워크 영역으로 칭해지는 비교적 보존된 서열의 4개의 영역 (FR1, FR2, FR3, 및 FR4)으로 이루어진다. CDR은 항체와 항원의 특이적인 상호작용을 담당하는 잔기의 대부분을 함유한다. CDR은 CDR1, CDR2, 및 CDR3으로 지칭된다. 따라서, 중쇄 상의 CDR 구성성분은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3으로 지칭되는 한편, 경쇄 상의 CDR 구성성분은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3으로 지칭된다. 전형적으로 CDR은 문헌 [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat et al.]에 기술된 바와 같은 카밧(Kabat) CDR을 지칭한다. 항원 결합 부위를 특성화하는 또 다른 표준은 코티아(Chothia)가 기술한 바와 같은 초가변 루프를 지칭하는 것이다. 예를 들어, 문헌 [Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:799-817]; 및 [Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14:4628-4638]을 참조한다. 또 다른 표준은 옥스포드 몰레큘라(Oxford Molecular)의 AbM 항체 모델링 소프트웨어가 사용하는 AbM 정의이다. 일반적으로, 예를 들어, 문헌 [Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains. In: Antibody Engineering Lab Manual (Ed.: Duebel, S, and Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg)]을 참조한다. 카밧 CDR과 관련하여 기술된 실시양태들은 대안적으로 코티아 초가변 루프 또는 AbM-정의 루프, 또는 이러한 방법들 중 임의의 것의 조합과 관련하여 기술된 유사한 관계를 사용하여 실행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-플렉틴-1 항체 및 항체를 코딩하는 본 개시내용의 핵산 분자는 하기 표 1에 제시된 CDR 아미노산 및 핵산 서열을 포함한다.
<표 1>
Figure 112018122144670-pct00002
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-플렉틴-1 결합제 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체)는 표 1에 제시된 항체 중 어느 하나에 대해 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3, 또는 이의 조합을 포함하는 임의의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-플렉틴-1 결합제는 표 1에 제시된 항체 중 어느 하나의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함한다. 본 개시내용은 표 1에 제시된 항체 중 어느 하나에 대해 제공된 바와 같은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 또는 CDRL3을 코딩하는 임의의 핵산 서열을 또한 포함한다. 항체 중쇄 및 경쇄 CDR3 도메인이 항원에 대한 항원의 결합 특이성/친화성에서 특히 중요한 역할을 할 수 있다. 따라서, 본 개시내용의 항-플렉틴-1 항체, 또는 그의 핵산 분자는 적어도 표 1에 제시된 바와 같은 또는 서열식별번호: 15, 22, 24, 37, 44, 46, 59, 66, 68, 81, 88 또는 90에 기재된 바와 같은 항체의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR3을 포함할 수 있다.
항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 완전한 아미노산 및 핵산 서열이 표 2에서 열거된다.
<표 2>
Figure 112018122144670-pct00003
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-플렉틴 항체는 표 1에 제시된 바와 같은 또는 본 개시내용의 서열 목록 (예를 들어, 서열식별번호: 15, 24, 37, 46, 59, 68, 81, 또는 90)에 기술된 바와 같은 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인 또는 양쪽 모두를 포함하는 임의의 항체를 포함한다. 본 개시내용은 표 1에 제시된 바와 같은 또는 본 개시내용의 서열 목록 (예를 들어, 서열식별번호: 4, 13, 26, 35, 48, 57, 70, 또는 79)에 기술된 바와 같은, 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 가변 도메인 핵산 서열 또는 양쪽 모두를 포함하는 항체를 코딩하는 임의의 핵산 분자를 또한 포함한다.
본 개시내용의 항-플렉틴-1 항체는 임의적으로 항체 불변 영역 또는 이의 일부분을 포함할 수 있다. 예를 들어, VL 도메인이 이의 C-말단 끝부분에서 Cκ 또는 Cλ와 같은 경쇄 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, VH 도메인 또는 이의 일부분이 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 및 임의의 아이소타입 서브클래스와 같은 중쇄 전체 또는 일부분에 부착될 수 있다. 항체는 적절한 불변 영역을 포함할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991)]을 참조한다). 따라서, 본 개시내용의 범주 내의 항체는 관련 분야에 공지된 불변 영역과 조합된, VH 및 VL 도메인, 또는 이의 항원 결합 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-플렉틴-1 항체는 서열식별번호: 4, 14, 26, 36, 48, 58, 70, 또는 80에 의해 표현되는 서열을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, VH 및/또는 VL 도메인이 생식계열 서열로 복귀될 수 있고, 예를 들어, 이러한 도메인의 FR이 생식계열 세포에 의해 생산된 것들에 매칭되도록 통상적인 분자 생물학 기술을 사용하여 돌연변이된다. 다른 실시양태에서, FR 서열은 컨센서스 생식계열 서열로부터 분기된 상태로 유지된다.
일부 실시양태에서, 예를 들어 서열식별번호: 6, 8, 10, 12, 17, 19, 21, 23, 28, 30, 32, 34, 39, 41, 43, 45, 50, 52, 54, 56, 61, 63, 65, 67, 72, 74, 76, 78, 83, 또는 85에 기재된 바와 같이, 항-플렉틴-1 항체 또는 항원 결합 단편은 항체의 프레임워크 영역을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-플렉틴-1 항체는 뮤린 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-플렉틴-1 항체는 키메라 또는 인간화 항체이다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 대한 아미노산 및 핵산 서열의 변이체 (예를 들어, 호모로그)를 구상한다는 것을 이해하여야 한다. "상동성"은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 모이어티 사이의 퍼센트 동일성을 지칭한다. 핵산 또는 이의 단편을 지칭할 때의 "실질적인 상동성"이라는 용어는 적합하게 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되면서 또 다른 핵산 (또는 이의 상보적 가닥)과 최적으로 정렬되었을 때, 정렬된 서열들의 약 90 내지 100％에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 실질적인 상동성을 공유하는 핵산 서열은 서열 동일성이 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％이다. 폴리펩티드 또는 이의 단편을 지칭할 때, "실질적인 상동성"이라는 용어는 적합한 갭, 삽입 또는 결실이 있으면서 또 다른 폴리펩티드와 최적으로 정렬되었을 때, 정렬된 서열의 약 90 내지 100％에서 뉴클레오티드 서열 동일성이 있다는 것을 나타낸다. "고도로 보존된"이라는 용어는 적어도 80％ 동일성, 바람직하게는 적어도 90％ 동일성, 더욱 바람직하게는 97％ 초과의 동일성을 의미한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 고도로 보존된 단백질은 적어도 85％, 적어도 90％, 적어도 91％, 적어도 92％, 적어도 93％, 적어도 94％, 적어도 95％, 적어도 96％, 적어도 97％, 적어도 98％, 적어도 99％의 동일성을 공유한다. 일부 경우에, 고도로 보존된은 100％ 동일성을 지칭할 수 있다. 동일성은 관련 분야의 기술자에 의해, 예를 들어, 관련 분야의 기술자에게 공지된 알고리즘 및 컴퓨터 프로그램의 사용에 의해, 쉽게 결정된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항-플렉틴-1 항체는 높은 친화력으로, 예를 들어, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 이보다 낮은 값의 Kd로 플렉틴-1에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-플렉틴-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 5 pM 내지 500 nM, 예를 들어, 50 pM 내지 100 nM, 예를 들어, 500 pM 내지 50 nM의 친화력으로 플렉틴-1에 결합할 수 있다. 본 개시내용은 플렉틴-1에 결합하는 것에 대해 본원에 기술된 항체 중 임의의 것과 경쟁하고, 친화력이 50 nM 이하 (예를 들어, 20 nM 이하, 10 nM 이하, 500 pM 이하, 50 pM 이하, 또는 5 pM 이하)인 항체 또는 항원 결합 단편을 또한 포함한다. 바이오센서 기술 (예를 들어, 옥텟(OCTET) 또는 비아코어(BIACORE))을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 관련 분야에 공지되어 있는 임의의 방법을 사용하여 항-플렉틴-1 항체의 친화력 및 결합 동역학을 테스트할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체"라는 용어는 일반적으로 면역글로불린을 지칭한다. 특이적 결합 능력을 유지 또는 소유하는 이의 모든 유도체가 본원에서 또한 제공된다. 항체 제제는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "항체 단편" 또는 "항원 결합 단편"이라는 용어는 전장보다 작은 항체의 임의의 유도체를 지칭한다. 일반적으로, 항원 결합 단편은 전장 항체의 특이적 결합 능력의 적어도 유의한 일부분을 유지한다. 항원 결합 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, dsFv 디아바디, 어피바디, 및 Fd 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 항원 결합 단편은 임의의 적합한 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 효소적으로 또는 화학적으로 무손상 항체의 단편화에 의해 생산될 수 있거나, 또는 부분적 항체 서열을 코딩하는 유전자로부터 재조합적으로 생산될 수 있다. 대안적으로, 항원 결합 단편은 전체적으로 또는 부분적으로 합성에 의해 생산될 수 있다. 항원 결합 단편은 임의적으로 단일쇄 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 단편은 예를 들어 디술피드 연결에 의해 함께 연결된 다수의 쇄를 포함할 수 있다. 항원 결합 단편은 임의적으로 다분자 복합체일 수도 있다. 기능성 항원 결합 단편은 전형적으로 적어도 약 50개의 아미노산을 포함할 것이고, 더욱 전형적으로는 적어도 약 200개의 아미노산을 포함할 것이다.
단일쇄 Fv (scFv)는 폴리펩티드 링커에 의해 서로 공유결합으로 연결된 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH)로만 이루어진 재조합 항원 결합 단편이다. VL 또는 VH가 NH2-말단 도메인일 수 있다. 2개의 가변 도메인이 심각한 입체적 간섭 없이 가교되는 한, 폴리펩티드 링커는 길이 및 조성이 가변적일 수 있다. 전형적으로, 링커는 주로 글리신 및 세린 잔기의 신장물로 구성되고, 약간의 글루탐산 또는 라이신 잔기가 용해성을 위해 산재된다.
디아바디는 이량체성 scFv이다. 전형적으로 디아바디의 성분들은 대부분의 scFv보다 더 짧은 펩티드 링커가 있고, 이들은 이량체로서 회합되는 것에 대한 선호도를 나타낸다.
Fv 단편은 비-공유결합 상호작용에 의해 함께 유지되는 1개의 VH 및 1개의 VL 도메인으로 이루어진 항원 결합 단편이다. dsFv라는 용어는 VH-VL 쌍을 안정화시키기 위한 조작된 분자간 디술피드 결합이 있는 Fv를 지칭하도록 본원에서 사용된다.
F(ab')2 단편은 pH 4.0-4.5에서 펩신 효소로 소화시킴으로써 면역글로불린 (전형적으로 IgG)으로부터 수득되는 것과 본질적으로 등가인 항원 결합 단편이다. 이러한 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다.
Fab 단편은 F(ab')2 단편 내의 2개의 중쇄 조각을 연결하는 디술피드 가교 또는 가교들의 환원에 의해 수득되는 것과 본질적으로 등가인 항원 결합 단편이다. Fab' 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다.
Fab 단편은 파파인 효소로 면역글로불린 (전형적으로 IgG)을 소화시킴으로써 수득되는 것과 본질적으로 등가인 항원 결합 단편이다. Fab 단편은 재조합적으로 생산될 수 있다. Fab 단편의 중쇄 절편은 Fd 조각이다.
어피바디는 항원 결합 분자 (예를 들어, 항체 모방체)로서의 기능을 하는 3-나선 다발을 포함하는 소형 단백질이다. 일반적으로, 어피바디는 아미노산 약 58개의 길이이고, 분자량이 약 6 kDa이다. 모체 단백질 도메인의 결합 활성에서 수반되는 2개의 알파-나선 내에 위치하는 13개의 아미노산의 무작위화에 의해 독특한 결합 성질이 있는 어피바디 분자가 획득된다. 파지 디스플레이와 같은 방법을 사용하여, 수십억개의 상이한 변이체를 함유하는 풀 (라이브러리)로부터 원하는 표적 단백질에 결합하는 특이적 어피바디 분자를 단리할 수 있다.
플렉틴 -1에 결합하는 항체의 생산
다수의 방법을 본 개시내용의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 수득하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 방법을 사용하여 항체를 생산할 수 있다. 모노클로날 항체는 공지된 방법에 따라 하이브리도마의 생성에 의해 생산될 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Kohler and Milstein (1975) Nature, 256: 495-499]을 참조한다). 그 후 이러한 방식으로 형성된 하이브리도마를 표준 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA) 및 표면 플라즈몬 공명 (예를 들어, 옥텟 또는 비아코어) 분석을 사용하여 스크리닝하여, 특정 항원과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 확인한다. 임의 형태의 특정 항원, 예를 들어, 재조합 항원, 천연 발생 형태, 이의 임의의 변이체 또는 단편, 뿐만 아니라 이의 항원성 펩티드 (예를 들어, 입체형상 에피토프로서 스캐폴드 내에 있거나 또는 선형 에피토프로서인 본원에 기술된 에피토프 중 임의의 것)가 면역원으로서 사용될 수 있다. 항체를 제조하는 한 예시적인 방법은 항체 또는 이의 단편 (예를 들어, scFv)을 발현하는 단백질 발현 라이브러리, 예를 들어, 파지 또는 리보솜 디스플레이 라이브러리를 스크리닝하는 것을 포함한다. 예를 들어, 파지 디스플레이가 문헌 라드너(Ladner) 등의 미국 특허 번호 5,223,409; 문헌 [Smith (1985) Science 228:1315-1317]; [Clackson et al. (1991) Nature, 352: 624-628]; [Marks et al. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; 및 WO 90/02809에 기술되어 있다.
디스플레이 라이브러리를 사용하는 것에 더하여, 특정 항원 (예를 들어, 플렉틴-1)을 사용하여 비-인간 동물, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스, 햄스터 또는 래트를 면역화시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 비-인간 동물은 마우스이다.
또 다른 실시양태에서, 비-인간 동물로부터 모노클로날 항체가 수득된 후, 관련 분야에 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 변형되고, 예를 들어, 키메라가 제조된다. 키메라 항체를 제조하기 위한 다양한 접근법이 기술되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:6851, 1985]; [Takeda et al., Nature 314:452, 1985], 캐빌리(Cabilly) 등의 미국 특허 번호 4,816,567; 보스(Boss) 등의 미국 특허 번호 4,816,397; 타나구치(Tanaguchi) 등의 유럽 특허 공보 EP171496; 유럽 특허 공보 0173494, 영국 특허 GB 2177096B를 참조한다.
항체는 관련 분야에 공지된 방법에 의해 인간화될 수도 있다. 예를 들어, 원하는 결합 특이성이 있는 모노클로날 항체가 상업적으로 인간화될 수 있다 (스캇진(Scotgene), 스코틀랜드; 및 옥스포드 몰레큘라, 캘리포니아주 팔로알토). 완전히 인간화된 항체, 예컨대 트랜스제닉 동물에서 발현된 것이 본 발명의 범주 내에 속한다 (예를 들어, 문헌 [Green et al. (1994) Nature Genetics 7, 13]; 및 미국 특허 번호 5,545,806 및 5,569,825를 참조한다).
추가적인 항체 생산 기술에 대해, 문헌 [Antibodies: A Laboratory Manual, Second Edition. ed. Edward A. Greenfield, Dana-Farber Cancer Institute, ⓒ2014]을 참조한다. 본 개시내용은 임의의 특정 공급원, 생산 방법, 또는 항체의 다른 특별한 특징들에 반드시 제한되지는 않는다.
본 발명의 일부 측면은 폴리뉴클레오티드 또는 벡터로 형질전환된 단리된 세포 (예를 들어, 숙주 세포)에 관한 것이다. 숙주 세포는 원핵생물 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 숙주 세포 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드 또는 벡터는 숙주 세포의 게놈 내로 통합될 수 있거나, 또는 염색체 외에서 유지될 수 있다. 숙주 세포는 임의의 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 예컨대 박테리아, 곤충, 진균, 식물, 동물 또는 인간 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 진균 세포는, 예를 들어, 사카로마이에스(Saccharomyces)) 속의 것, 특히 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae) 종의 것이다. "원핵생물"이라는 용어는 항체 또는 상응하는 면역글로불린 쇄의 발현을 위한 DNA 또는 RNA 분자로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 모든 박테리아를 포함한다. 원핵생물 숙주는 그람 음성, 뿐만 아니라 그람 양성 박테리아, 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 에스. 티피무리움(S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens) 및 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 포함할 수 있다. "진핵생물"이라는 용어는 효모, 고급 식물, 곤충 및 척추동물 세포, 예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대 NSO 및 CHO 세포를 포함한다. 재조합 생산 절차에서 사용된 숙주에 따라, 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 항체 또는 면역글로불린 쇄는 글리코실화될 수 있거나 또는 글리코실화되지 않을 수 있다. 항체 또는 상응하는 면역글로불린 쇄는 개시 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.
일부 실시양태에서, 벡터가 적합한 숙주 내로 혼입되었으면, 숙주를 뉴클레오티드 서열의 고수준 발현에 적절한 조건 하에 유지시킬 수 있고, 원한다면, 면역글로불린 경쇄, 중쇄, 경쇄/중쇄 이량체 또는 무손상 항체, 항원 결합 단편 또는 기타 면역글로불린 형태의 수집 및 정제가 이어질 수 있다; 문헌 [Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979)]을 참조한다. 따라서, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터가 세포 내로 도입되고, 차례로 세포가 항체 또는 항원 결합 단편을 생산한다. 추가로, 상기 언급된 숙주 세포를 포함하는 트랜스제닉 동물, 바람직하게는 포유동물을 항체 또는 항체 단편의 대규모 생산에 사용할 수 있다.
형질전환된 숙주 세포를 최적의 세포 성장을 달성하기 위한 관련 분야에 공지된 기술에 따라 발효기에서 성장시키고 배양할 수 있다. 일단 발현되면, 전체 항체, 이의 이량체, 개별적인 경쇄 및 중쇄, 기타 면역글로불린 형태, 또는 항원 결합 단편을 황산암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 관련 분야의 표준 절차에 따라 정제할 수 있다; 문헌 [Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982)]을 참조한다. 그 후, 항체 또는 항원 결합 단편을 성장 배지, 세포 용해물, 또는 세포막 분획으로부터 단리할 수 있다. 예를 들어, 미생물에 의해 발현된 항체 또는 항원 결합 단편을 임의의 통상적인 수단, 예를 들어, 분취용 크로마토그래피 분리 및 면역학적 분리 예컨대 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 (예를 들어, 항체의 불변 영역에 대해 지시됨)의 사용을 수반하는 것에 의해 단리 및 정제할 수 있다.
본 개시내용의 측면들은 모노클로날 항체의 무한 연장된 공급원을 제공하는 하이브리도마에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "하이브리도마 세포"는 B 림프모세포와 골수종 융합 파트너의 융합으로부터 유래된 불멸화된 세포를 지칭한다. 모노클로날 항체-생산 세포 (예를 들어, 하이브리도마 세포)를 제조하기 위해, 항체 역가가 확인되어 있는 개별적인 동물 (예를 들어, 마우스)를 선별하고, 최종 면역화 2일 내지 5일 후, 이의 비장 또는 림프절을 수확하고, 이에 함유된 항체-생산 세포를 골수종 세포와 융합하여, 원하는 모노클로날 항체 생산자 하이브리도마를 제조한다. 예를 들어, 이하에 기술된 바와 같은 표지된 단백질 및 항혈청을 반응시킨 후, 항체에 결합된 표지제의 활성을 측정함으로써, 항혈청 내의 항체 역가의 측정을 수행할 수 있다. 세포 융합은 공지된 방법, 예를 들어, 문헌 [Kochler and Milstein, Nature 256:495 (1975)]에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있다. 융합 프로모터로서, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 센다이(Sendai) 바이러스 (HVJ), 바람직하게는 PEG가 사용된다.
골수종 세포의 예는 NS-1, P3U1, SP2/0, AP-1 등을 포함한다. 항체 생산자 세포 (비장 세포)의 개수 및 사용될 골수종 세포의 개수의 비율은 바람직하게는 약 1:1 내지 약 20:1이다. PEG (바람직하게는 PEG 1000-PEG 6000)는 바람직하게는 약 10％ 내지 약 80％의 농도로 첨가된다. 양쪽 세포의 혼합물을 약 20℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 30℃ 내지 약 37℃에서 약 1분 내지 10분 동안 인큐베이션함으로써 세포 융합이 효율적으로 수행될 수 있다.
다양한 방법을 항체 (예를 들어, 본 발명의 자가항체 또는 종양 항원에 대한 것)를 생산하는 하이브리도마에 대해 스크리닝하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체가 직접적으로 또는 담체와 함께 흡착되는 고체상 (예를 들어, 마이크로플레이트)에 하이브리도마의 상청액이 첨가된 후, 방사성 물질 또는 효소로 표지된 단백질 A 또는 항-면역글로불린 항체 (마우스 세포가 세포 융합에서 사용되면, 항-마우스 면역글로불린 항체가 사용된다)가 첨가되어, 고체상에 결합된 단백질에 대한 모노클로날 항체를 검출한다. 대안적으로, 항-면역글로불린 항체 또는 단백질 A가 흡착되는 고체 상에 하이브리도마의 상청액이 첨가된 후, 방사성 물질 또는 효소로 표지된 단백질이 첨가되어, 고체상에 결합된 단백질에 대한 모노클로날 항체를 검출한다.
임의의 공지된 방법 또는 이의 변형에 따라 모노클로날 항체의 선별을 수행할 수 있다. 일반적으로, HAT (하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)이 첨가된 동물 세포용 배지가 사용된다. 하이브리도마가 성장할 수 있는 한 임의의 선별 및 성장 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 1％ 내지 20％, 바람직하게는 10％ 내지 20％ 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640 배지, 1％ 내지 10％ 소 태아 혈청을 함유하는 GIT 배지, 하이브리도마 배양용 무혈청 배지 (SFM-101, 닛스이 세이야쿠(Nissui Seiyaku)) 등을 사용할 수 있다. 일반적으로, 배양은 20℃ 내지 40℃, 바람직하게는 37℃에서 약 5일 내지 3주, 바람직하게는 1주 내지 2주 동안 약 5％ CO2 기체 하에 수행된다. 하이브리도마 배양물의 상청액의 항체 역가를 항혈청 내의 항-단백질의 항체 역가와 관련하여 상기 기술된 것과 동일한 방식에 따라 측정할 수 있다.
하이브리도마의 배양물로부터 직접적으로 면역글로불린을 수득하는 것에 대한 대안으로서, 불멸화된 하이브리도마 세포를 후속 발현 및/또는 유전자 조작을 위한 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 공급원으로서 사용할 수 있다. 재배열된 항체 유전자가 적합한 mRNA로부터 역전사되어 cDNA가 생산될 수 있다. 원한다면, 중쇄 불변 영역이 상이한 아이소타입의 것으로 교환될 수 있거나, 또는 전체적으로 제거될 수 있다. 단일쇄 Fv 영역을 코딩하도록 가변 영역들이 연결될 수 있다. 다중 Fv 영역들이 연결되어 하나를 초과하는 표적에 대한 결합 능력을 부여할 수 있거나, 또는 키메라 중쇄 및 경쇄 조합이 사용될 수 있다. 임의의 적합한 방법이 항체 가변 영역의 클로닝 및 재조합 항체의 생성에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 중쇄 및/또는 경쇄의 가변 영역을 코딩하는 적합한 핵산을 수득하고, 표준 재조합 숙주 세포 내로 형질감염될 수 있는 발현 벡터 내로 삽입한다. 다양한 이같은 숙주 세포를 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 포유동물 숙주 세포가 효율적인 프로세싱 및 생산에 유리할 수 있다. 이러한 목적에 유용한 전형적인 포유동물 세포주는 CHO 세포, 293 세포, 또는 NSO 세포를 포함한다. 변형된 재조합 숙주를 숙주 세포의 성장 및 코딩 서열의 발현에 적합한 배양 조건 하에 배양함으로써 항체 또는 항원 결합 단편의 생산이 착수될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편을 이들을 배양물로부터 단리함으로써 회수할 수 있다. 발현 시스템은 생성된 항체가 배지 내로 분비되도록 신호 펩티드를 포함하게 디자인될 수 있다; 그러나, 세포내 생산 또한 가능하다.
본 개시내용은 적어도 본원에 기술된 항체의 면역글로불린 쇄의 가변 영역을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 또한 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 가변 영역은 상기 기술된 하이브리도마 중 어느 하나에 의해 생산되는 항체의 가변 영역의 VH 및/또는 VL의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다.
항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 이러한 폴리뉴클레오티드 중 임의의 것을 단독으로 또는 조합하여 포함하는, DNA, cDNA, RNA, 또는 합성으로 생산된 DNA 또는 RNA, 또는 재조합으로 생산된 키메라 핵산 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 벡터의 일부분이다. 이같은 벡터는 추가 유전자 예컨대 적절한 숙주 세포에서 적절한 조건 하에 벡터의 선별을 허용하는 마커 유전자를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드는 진핵생물 또는 원핵생물에서의 발현을 허용하는 발현 제어 서열에 작동적으로 연결된다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 폴리뉴클레오티드가 번역가능한 mRNA로 전사되는 것을 포함한다. 진핵생물 세포, 바람직하게는 포유동물 세포에서의 발현을 확실하게 하는 조절 요소가 관련 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 이는 전사 개시를 용이하게 하는 조절 서열을 포함할 수 있고, 임의적으로, 전사 종결 및 전사체 안정화를 용이하게 하는 폴리-A 신호를 포함할 수 있다. 추가적인 조절 요소는 전사 인핸서, 뿐만 아니라 번역 인핸서, 및/또는 천연적으로 회합되거나 이종성인 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 원핵생물 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 요소는, 예를 들어, 이. 콜라이에서의 PL, Lac, Trp 또는 Tac 프로모터를 포함하고, 진핵생물 숙주 세포에서의 발현을 허용하는 가능한 조절 요소의 예는 효모에서의 AOX1 또는 GAL1 프로모터, 또는 포유동물 및 기타 동물 세포에서의 CMV-프로모터, SV40-프로모터, RSV-프로모터 (라우스 육종 바이러스), CMV-인핸서, SV40-인핸서 또는 글로빈 인트론이다.
전사 개시를 담당하는 요소 이외에, 이같은 조절 요소는 폴리뉴클레오티드의 하류에 전사 종결 신호, 예컨대 SV40-폴리-A 부위 또는 tk-폴리-A 부위를 또한 포함할 수 있다. 더욱이, 사용된 발현 시스템에 따라, 폴리펩티드를 세포 구획으로 지시하거나 또는 이를 배지 내로 분비시킬 수 있는 리더 서열이 폴리뉴클레오티드의 코딩 서열에 부가될 수 있고, 관련 분야에 널리 공지되어 있다. 리더 서열(들)은 적합한 단계에서 번역, 개시 및 종결 서열과 조립되고, 바람직하게는, 리더 서열은 번역된 단백질 또는 이의 일부분을 예를 들어 세포외 배지 내로 분비하는 것을 지시할 수 있다. 임의적으로, 원하는 특성, 예를 들어, 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 정제 단순화를 부여하는 C- 또는 N-말단 식별 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 이종성 폴리뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 적어도 경쇄 및/또는 중쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 양쪽 면역글로불린 쇄 또는 1개만의 가변 도메인을 코딩할 수 있다. 유사하게, 폴리뉴클레오티드는 동일한 프로모터의 제어 하에 놓일 수 있거나, 또는 별도로 발현을 위해 제어될 수 있다. 더욱이, 일부 측면은 항체의 다른 면역글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 임의적으로 조합된, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역글로불린 쇄의 가변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 유전자 조작에서 통상적으로 사용되는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지에 관련된다.
일부 실시양태에서, 진핵생물 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염시킬 수 있는 벡터 내의 진핵생물 프로모터 시스템으로서 발현 제어 서열이 제공되지만, 원핵생물 숙주용 제어 서열 또한 사용될 수 있다. 바이러스 예컨대 레트로바이러스, 우두 바이러스, 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 소 유두종 바이러스로부터 유래된 발현 벡터가 (예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 발현하도록 세포를 조작하기 위해) 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 표적화된 세포 집단 내로 전달하는데 사용될 수 있다. 다양한 적합한 방법이 재조합 바이러스 벡터를 구축하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적 세포로의 전달을 위해 폴리뉴클레오티드 및 벡터가 리포솜 내로 재구성될 수 있다. 세포 숙주의 유형에 따라 다를 수 있는 적절한 방법에 의해 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 면역글로불린 쇄의 중쇄 및/또는 경쇄 가변 도메인(들)을 코딩하는 서열 및 발현 제어 서열)를 함유하는 벡터가 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
변형
본 개시내용의 일부 측면은 플렉틴-1에 대해 표적화된 항체-약물 접합체에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "항체 약물 접합체"는 표적화된 분자 (예를 들어, 생물학적으로 활성인 분자, 예컨대 치료 분자, 및/또는 검출가능한 표지)에 연결된 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 분자를 지칭한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질, 생물발광 물질, 방사성 물질, 양전자 방출 금속, 비-방사성 상자성 금속 이온, 및 플렉틴-1의 검출 및 단리를 위한 친화성 표지를 포함하지만 이에 제한되지 않는 검출가능한 표지로 표지될 수 있다. 검출가능한 물질은 본 개시내용의 폴리펩티드에 직접적으로, 또는 관련 분야에 공지된 기술을 사용하여 중간체 (예를 들어, 관련 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링 또는 접합될 수 있다. 적절한 효소의 비제한적인 예는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코스 옥시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하고, 적절한 보결분자단 복합체의 비-제한적인 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함하고, 적절한 형광 물질의 예는 비오틴, 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드, 또는 피코에리트린을 포함하고, 발광 물질의 예는 루미놀을 포함하고, 생물발광 물질의 비-제한적인 예는 루시페라제, 루시페린, 및 이쿼린을 포함하며, 적절한 방사성 물질의 예는 방사성 금속 이온, 예를 들어, 알파-방출체 또는 기타 방사성동위원소, 예를 들어, 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 3중수소 (3H), 인듐 (115mIn, 113mIn, 112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc, 99mTc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 제논 (133Xe), 불소 (18F), 153Sm, Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 86R, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 및 주석 (113Sn, 117Sn)을 포함한다. 검출가능한 물질은 본 개시내용의 항-플렉틴-1 항체에 직접적으로, 또는 관련 분야에 공지된 기술을 사용하여 중간체 (예를 들어, 관련 분야에 공지된 링커)를 통해 간접적으로 커플링 또는 접합될 수 있다. 검출가능한 물질에 접합된 항-플렉틴-1 항체는 본원에 기술된 바와 같은 진단 검정법에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 항원 결합 단편은 치료 모이어티 (예를 들어, 치료제)로 변형될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "치료제"라는 용어는 세포 기능을 저해하거나, 세포 복제를 저해하거나 또는 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포를 사멸시킬 수 있는 화학물질 또는 약물 또는 단백질을 지칭한다. 치료제의 예는 세포독성 모이어티, 방사성동위원소, 식물, 진균 또는 박테리아 기원의 분자 (예를 들어, 식물-유래 독소 (예를 들어, 2차 대사산물), 글리코시드, 항미생물 화합물 (예를 들어, 스트렙토마이신, 페니실린 등), 생물학적 단백질 (예를 들어, 단백질 독소), 입자 (예를 들어, 재조합 바이러스 입자, 예를 들어, 바이러스 코트 단백질에 의한 것), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치료제는 세포내에서 활성인 약물 또는 기타 작용제, 예컨대 단범위 방사능 방출체 (단범위, 고에너지 알파-방출체 (예를 들어, 131I)를 예를 들어 포함함)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 치료제는 면역조정 모이어티 (예를 들어, 면역조정제)이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "면역조정제"는 작용제에 대한 대상체의 면역 반응을 증가 또는 감소시키는 화합물 또는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 면역조정제는 종양에 대한 대상체의 면역 반응을 강화할 수 있고, 예를 들어, 염증성 시토카인 예컨대 인터루킨-1 (IL-1), 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)의 수준을 증가시킬 수 있다. 대상체의 면역 반응을 증가시키는 면역조정제의 예는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 인터페론, 이미퀴모드, 박테리아로부터의 세포막 분획, 특정 인터루킨 및 시토카인 (예를 들어, IL-1β, IL-6, 및 TNF-α), 및 면역 체크포인트 저해제 (예를 들어, PD-1 저해제, PD1-L 저해제 등)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역조정제는 대상체의 면역 반응을 감소시킬 수 있다 (예를 들어, 면역억제를 매개하거나 또는 달성할 수 있다). 면역억제성 면역조정제의 예는 면역억제성 약물 (예를 들어, 글루코코르티코이드, 세포정지제, 항-염증성 모노클로날 항체 (예를 들어, 항-IL-2 수용체 항체), 및 이뮤노필린을 표적화하는 약물 (예를 들어, 시클로스포린, 시롤리무스 등)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 항체는 표적화된 작용제에 링커를 통해 커플링된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "링커"라는 용어는 가교에서와 같이 하나의 분자 또는 서열을 또 다른 분자 또는 서열에 부착시키는 분자 또는 서열, 예컨대 아미노산 서열을 지칭한다. "연결된", "접합된" 또는 "커플링된"은 공유결합, 또는 비-공유결합, 또는 기타 결합, 예컨대 반데르발스힘에 의해 부착 또는 결합되는 것을 의미한다. 본 개시내용이 기술하는 항체는 표적화된 작용제 (예를 들어, 치료 모이어티 또는 검출가능한 모이어티)에 직접적으로, 예를 들어, (임의적인 연결 서열, 예를 들어, 가요성 링커 서열의 존재 또는 부재 하에) 단백질 또는 펩티드 검출가능 모이어티와의 융합 단백질로서, 또는 화학적 커플링 모이어티를 통해 연결될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 출원 공보 번호 WO 2009/036092에 기술된 바와 같이, 다수의 이같은 커플링 모이어티, 예를 들어, 펩티드 링커 또는 화학적 링커가 관련 분야에 공지되어 있다. 일부 실시양태에서, 링커는 가요성 아미노산 서열이다. 가요성 아미노산 서열의 예는 2개 이상의 글리신 잔기의 신장물을 포함하는 글리신 및 세린 풍부 링커 (예를 들어, GGGS; 서열식별번호: 93)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 링커는 포토링커이다. 포토링커의 예는 케틸-반응성 벤조페논 (BP), 안트라퀴논 (AQ), 니트렌-반응성 니트로페닐 아지드 (NPA), 및 카르벤-반응성 페닐-(트리플루오로메틸)디아지린 (PTD)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 표적화된 작용제는 생리학상 불활성인 나노입자를 포함한다. 암 세포를 영상화하기 위해 개발되어 사용되는 나노입자의 예는 단리된 펩티드 리간드 및 파지 디스플레이 펩티드와 함께 사용하는 것에 대해 구상되는 자성 나노입자 및 이의 자성형광 유사체를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Weissleder et al., Nat. Biotechnol., 19:316-317 (2001)]; [McCarthy et al., Nanomedicine, 2:153-167 (2007)]; [Hogemann et al., Bioconjug. Chem., 11:941-946 (2000)], 및 [Josephson et al., Bioconjug. Chem., 10:186-191 (1999)]을 참조한다). 자성 및 형광성 분자 양쪽 모두를 동일한 분자 내에 혼입시키는 다중-모드 나노입자가 공지되어 있고, 형광 현미경검사 (이러한 초소형 입자의 형광 부분을 검출함) 및 MRI (이의 자성 부분을 검출함)를 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 나노입자는 자성, 형광성, 또는 방사성이다. 일부 실시양태에서, 표적화된 작용제는 형광색소를 포함한다.
제약 조성물
일부 측면에서, 본 개시내용은 항-플렉틴-1 항체를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 항-플렉틴-1 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"라는 용어는 제약 투여와 상용성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균 및 항진균 작용제, 등장성 및 흡수 지연 작용제 등을 포함하도록 의도된다. 제약상 활성인 물질을 위해 이같은 매질 및 작용제를 사용하는 것은 관련 분야에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비혼화성이지 않는 한, 조성물에서 이를 사용하는 것이 구상된다. 보충 활성 화합물이 조성물 내로 또한 혼입될 수 있다. 제약 조성물은 하기 기술된 바와 같이 제조될 수 있다. 활성 성분이 임의의 통상적인 제약상 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합 또는 배합될 수 있다. 조성물은 무균성일 수 있다.
전형적으로, 제약 조성물은 유효량의 작용제 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체, 또는 항-플렉틴-1 항체 및 표적화된 작용제를 포함하는 항체 약물 접합체)를 전달하기 위해 제형된다. 일반적으로, 활성 작용제의 "유효량"은 원하는 생물학적 반응 (예를 들어, 암성 세포를 사멸시키는 것 또는 종양 성장 억제)을 도출하는데 충분한 양을 지칭한다. 작용제의 유효량은 원하는 생물학적 종점, 화합물의 약역학, 치료되는 질환 (예를 들어, 플렉틴-1의 표면 발현을 특징으로 하는 특정 암), 투여 방식, 및 환자와 같은 요인에 따라 변할 수 있다.
수용자 환자가 이의 투여를 허용하면 조성물을 "제약상 허용되는 담체"라고 한다. 무균성 포스페이트-완충 염수가 제약상 허용되는 담체의 한 예이다. 기타 적절한 담체가 관련 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18th Ed. (1990)]을 참조한다.
관련 분야의 기술자는 통상적으로 사용되고 활성 작용제와 관련하여 불활성인 임의의 투여 방식, 비히클 또는 담체를 본 개시내용의 제약 조성물의 제조 및 투여에 활용할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이같은 방법, 비히클 및 담체의 실례는, 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 4th ed. (1970)]에 기술된 것들이고, 상기 문헌의 개시내용은 이에 의해 참조로 포함된다. 본 개시내용의 원리에 노출된 관련 분야의 기술자는 적절하고 적합한 비히클, 부형제 및 담체를 결정하거나 또는 활성 성분을 이들과 배합하여 본 개시내용의 제약 조성물을 형성시키는데 어려움을 겪지 않을 것이다.
화합물 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체, 또는 항-플렉틴-1 항체 및 표적화된 작용제를 포함하는 항체 약물 접합체)의 유효량, 일명 치료적 유효량은 암과 연관된 적어도 하나의 유해 효과 (예를 들어, 종양 성장, 전이)를 호전시키는데 충분한 양이다. 제약 조성물 내에 포함될 치료적 유효량은, 각각의 경우에, 여러 요인, 예를 들어, 치료될 환자의 유형, 체격 및 상태, 의도되는 투여 방식, 의도되는 투여 형태가 혼입될 환자의 능력 등에 좌우된다. 일반적으로, 활성 작용제의 양은 약 0.1 내지 약 250 mg/kg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 100 mg/kg을 제공하도록 각각의 투여 형태 내에 포함된다. 관련 분야의 통상의 기술자는 적합한 치료적 유효량을 경험적으로 결정할 수 있을 것이다.
본원에서 제공되는 교시내용과 조합하여, 다양한 활성 화합물 및 고려 요인 예컨대 효능, 상대적인 생체이용률, 환자 체중, 유해 부작용의 중증도, 및 선택된 투여 방식 중에서 선택함으로써, 효과적인 예방 또는 치료 처치 체계를 계획할 수 있고, 이는 실질적인 독성을 야기하지 않지만 특정 대상체를 처치하는데 전적으로 효과적이다. 임의의 특정 용도를 위한 유효량은 치료되는 질환 또는 병태, 투여되는 특정 치료제, 대상체의 체격, 또는 질환 또는 병태의 중증도와 같은 요인에 따라 변할 수 있다. 관련 분야의 통상의 기술자는 과도한 실험을 필요로 하지 않으면서 특정 핵산 및/또는 기타 치료제의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다.
일부 경우에, 본 개시내용의 화합물은 콜로이드성 분산 시스템에서 제조된다. 콜로이드성 분산 시스템은 수중유 에멀션, 마이셀, 혼합 마이셀, 및 리포솜을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 콜로이드성 시스템은 리포솜이다. 리포솜은 생체 내에서 또는 시험관내에서 전달 벡터로서 유용한 인공 막 용기이다. 크기가 0.2 - 4.0 ㎛ 범위인 대형 단층 소포 (LUV)가 대형 거대분자를 캡슐화할 수 있는 것으로 나타났다.
리포솜을 특이적 리간드 예컨대 모노클로날 항체, 당, 당지질, 또는 단백질에 커플링시킴으로써 리포솜을 특정 조직에 표적화할 수 있다. 리포솜을 예를 들어 평활근 세포에 표적화하는데 유용할 수 있는 리간드는 평활근 세포 특이적 수용체 및 분자와 상호작용하는 무손상 분자 또는 이의 단편, 예컨대 암 세포의 세포 표면 마커와 상호작용하는 항체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이같은 리간드는 관련 분야의 기술자에게 널리 공지되어 있는 결합 검정법에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 리포솜을 관련 분야에 공지된 항체에 커플링시킴으로써 리포솜을 조직에 표적화할 수 있다.
본 개시내용에 기술된 화합물은 단독으로 (예를 들어, 염수 또는 완충제 내에서), 또는 관련 분야에 공지된 임의의 전달 비히클을 사용하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 하기의 전달 비히클이 기술되어 있다: 코클리에이트(cochleate); 에멀솜(Emulsome); ISCOM; 리포솜; 생박테리아 벡터 (예를 들어, 살모넬라(Salmonella), 에쉐리키아 콜라이(Escherichia coli), 바실루스 칼메트-게린(Bacillus Calmette-Guerin), 시겔라(Shigella), 락토바실루스(Lactobacillus)); 생바이러스 벡터 (예를 들어, 우두, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스); 마이크로스피어; 핵산 백신; 중합체 (예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 키토산); 중합체 고리; 프로테오솜; 플루오린화나트륨; 트랜스제닉 식물; 바이로솜(virosome); 및 바이러스-유사 입자.
본 개시내용의 제형은 제약상 허용되는 용액에서 투여되고, 이는 일상적으로 제약상 허용되는 농도의 염, 완충제, 보존제, 상용성 담체, 아주반트, 및 임의적인 기타 치료 성분을 함유할 수 있다.
제약상 허용되는 담체라는 용어는 인간 또는 기타 척추동물에 투여하는데 적절한 하나 이상의 고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 담체라는 용어는 적용을 용이하게 하기 위해 활성 화합물이 이와 조합되는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 또한 제약 조성물의 성분들은 원하는 제약 효능을 실질적으로 손상시킬 상호작용이 없는 방식으로 본 개시내용의 화합물과, 그리고 서로 혼합될 수 있다.
당의정 코어에 적절한 코팅제가 제공된다. 이러한 목적을 위해, 농축된 당 용액을 사용할 수 있고, 이는 아라비아 검, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 및/또는 이산화티탄, 래커 용액, 및 적절한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 임의적으로 함유할 수 있다. 식별을 위해 또는 활성 화합물 용량의 상이한 조합들을 특성화하기 위해 염료 또는 색소가 정제 또는 당의정 코팅제에 첨가될 수 있다.
본원에 기술된 제형에 더하여, 화합물은 저장소 제제로서 제형될 수도 있다. 이같은 장기 작용 제형은 적절한 중합체성 또는 소수성 물질 (예를 들어, 적합한 오일 내의 에멀션으로서) 또는 이온 교환 수지와 함께, 또는 난용성 유도체로서, 예를 들어, 난용성 염으로서 제형될 수 있다.
제약 조성물은 적절한 고체 또는 겔 상 담체 또는 부형제를 또한 포함할 수 있다. 적절한 담체 또는 부형제의 예는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 및 중합체 예컨대 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
적절한 액체 또는 고체 제약 제제 형태는, 예를 들어, 흡입용 수성 또는 염수 용액이거나, 마이크로캡슐화되거나, 코클리에이트화되거나, 미세 금 입자 상에 코팅되거나, 리포솜에 함유되거나, 분무되거나, 에어로졸이거나, 피부 내로 이식하기 위한 펠릿이거나, 또는 피부 내로 긁을 날카로운 물체 상에 건조된다. 제약 조성물은 과립, 분말, 정제, 코팅 정제, (마이크로)캡슐, 좌약, 시럽, 에멀션, 현탁액, 크림, 점적제, 또는 활성 화합물이 지연 방출되는 제제를 또한 포함하고, 이의 제조에서 부형제 및 첨가제 및/또는 보조제 예컨대 붕해제, 결합제, 코팅제, 팽윤제, 윤활제, 풍미제, 감미제 또는 가용화제가 상기 기술된 바와 같이 관례적으로 사용된다. 이러한 제약 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에서 사용하기에 적절하다. 약물 전달 방법의 간략한 검토를 위해, 본원에 참조로 포함된 문헌 [Langer R (1990) Science 249:1527-1533]을 참조한다.
화합물은 그 자체로 (순수하게) 또는 제약상 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다. 의약에서 사용될 때, 염은 제약상 허용되어야 하지만, 제약상 허용되지 않는 염이 이의 제약상 허용되는 염을 제조하기 위해 편리하게 사용될 수 있다. 이같은 염은 하기 산으로부터 제조되는 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: 염산, 브로민화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p-톨루엔 술폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄 술폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-술폰산, 및 벤젠 술폰산. 또한, 이같은 염은 알칼리금속 또는 알칼리토금속 염, 예컨대 카르복실산 기의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘 염으로서 제조될 수 있다.
적절한 완충제는 아세트산 및 염 (1-2％ w/v); 시트르산 및 염 (1-3％ w/v); 붕산 및 염 (0.5-2.5％ w/v); 및 인산 및 염 (0.8-2％ w/v)을 포함한다. 적절한 보존제는 벤즈알코늄 클로라이드 (0.003-0.03％ w/v); 클로로부탄올 (0.3-0.9％ w/v); 파라벤 (0.01-0.25％ w/v) 및 티메로살 (0.004-0.02％ w/v)을 포함한다.
조성물은 편리하게 단위 투여량 형태로 제시될 수 있고, 약학 분야에 널리 공지되어 있는 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 모든 방법은 화합물을 하나 이상의 보조 성분을 구성하는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 화합물을 액체 담체, 미세 분할 고체 담체, 또는 양쪽 모두와 균일하게, 그리고 밀접하게 회합시킨 후, 필요하다면, 생성물을 성형함으로써 조성물이 제조된다. 액체 투약 단위는 바이알 또는 앰풀이다. 고체 투약 단위는 정제, 캡슐 및 좌약이다.
치료 방법
본 개시내용의 측면들은 특정 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1에 특이적으로 결합하는 항체의 발견에 관련된 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 바와 같은 항-플렉틴-1 항체가 특정 암 세포에 결합하는 것은 세포의 사멸을 유도한다 (예를 들어, 아팝토시스를 유도한다). 어떠한 특정 이론에 제한되는 것을 원치 않으면서, 일부 실시양태에서, 본 개시내용에 의해 기술된 항체는 플렉틴-1의 표면 발현을 특징으로 하는 암을 치료하는데 유용하다. 본원에서 사용된 바와 같이, "암을 치료함"은 환자 내의 암 세포의 개수를 감소시키는 것, 환자 내의 암 세포의 성장을 느리게 하는 것, 환자 내의 암 세포의 전이를 감소시키는 것을 지칭하고, 암 증상을 경감시키거나 환자의 수명을 증가시키기 위한 임의의 반응 유형을 포함한다.
플렉틴-1의 표면 발현을 특징으로 하는 암의 예는 난소암 세포, 식도암 세포, 두경부 편평세포 암종 암 세포, 또는 췌장암 세포 (예를 들어, 췌장관 선암종 (PDAC))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 그러나, 다른 암 (예컨대 폐암, 방광암, 유방암, 식도암, 구강암, 설암, 치은암, 피부암 (예를 들어, 흑색종, 기저세포 암종, 카포시 육종 등), 근육암, 심장암, 간암, 기관지암, 연골암, 골암, 위암, 전립선암, 고환암, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁암, 결장암, 결장직장암, 위암, 신장암, 방광암, 림프종 암, 비장암, 흉선암, 갑상선암, 뇌암, 신경세포암, 중피종, 담낭암, 안암 (예를 들어, 각막의 암, 포도막의 암, 맥락막의 암, 황반부의 암, 유리체액암 등), 관절암 (예컨대 활막암), 교모세포종, 백혈구암 (예를 들어, 림프종, 백혈병 등), 유전성 비-폴립증 암 (HNPC), 결장염-연관 암 등이 본 개시내용에 기술된 항-플렉틴-1 항체를 사용하여 치료될 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 암은 육종 (예컨대 골육종 및 카포시 육종)에 의해 추가로 예시된다.
일부 측면에서, 본 개시내용은 암에 걸린 대상체에게 유효량의 본 개시내용에 의해 기술된 항체 또는 조성물 (예를 들어, 항-플렉틴-1 항체, 또는 항-플렉틴-1 항체를 포함하는 조성물)을 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일반적으로, 바람직하게는 본 개시내용의 항체 및 제약 조성물은 화합물 또는 혼합물을 정제, 캡슐 또는 알약으로서 경구로, 또는 비경구적으로, 정맥내로, 피내로, 근육내로 또는 피하로, 또는 경피로 투여될 수 있게 하는데 적절한 제약상 허용되는 담체 또는 부형제를 함유한다.
항-플렉틴-1 항체 및/또는 기타 화합물을 함유하는 제약 조성물은 의약을 투여하기 위한 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다. 다양한 투여 경로가 이용가능하다. 물론, 선택된 특정 방식은 선택된 특정 작용제 또는 작용제들, 치료 중인 특정 병태, 및 치료 효능에 요구되는 투여량에 좌우될 것이다. 일반적으로, 본 개시내용의 방법은 의학적으로 허용되는 임의의 투여 방식을 사용하여 실행될 수 있고, 이는 임상적으로 허용되지 않는 유해 효과를 야기하지 않으면서 치료 효과를 일으키는 임의의 방식을 의미한다. 다양한 투여 방식이 본원에서 논의된다. 치료법에서 사용하기 위해, 유효량의 항-플렉틴-1 항체 및/또는 기타 치료제가 작용제를 원하는 표면, 예를 들어, 점막, 전신으로 전달하는 임의의 방식에 의해 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용의 제약 조성물을 투여하는 것은 숙련된 기술자에게 공지된 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다. 투여 경로는 경구, 비경구, 정맥내, 근육내, 복막내, 비강내, 설하, 기관내, 흡입, 피하, 안구, 질, 및 직장을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 전신 경로는 경구 및 비경구를 포함한다. 여러 유형의 장치가 정기적으로 흡입에 의한 투여에 사용된다. 이러한 유형의 장치는 계량 용량 흡입기 (MDI), 호흡-작동식 MDI, 건조 분말 흡입기 (DPI), MDI와 조합된 스페이서/홀딩 챔버, 및 네뷸라이저를 포함한다.
경구 투여를 위해, 활성 화합물(들)을 관련 분야에 널리 공지되어 있는 제약상 허용되는 담체와 조합함으로써 화합물이 쉽게 제형될 수 있다. 이같은 담체는 본 개시내용의 화합물이 치료될 대상체에 의한 경구 섭취를 위해 정제, 알약, 당의정, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형될 수 있게 한다. 경구 사용을 위한 제약 제제를 고체 부형제로서 수득할 수 있고, 임의적으로, 생성된 혼합물을 분쇄하고, 원한다면 적절한 보조제를 첨가한 후, 과립 혼합물을 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득한다. 적절한 부형제는, 특히, 충전제 예컨대 락토스, 수크로스, 만니톨 또는 소르비톨을 포함하는 당; 셀룰로스 제제, 예를 들어, 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트래거캔스 고무, 메틸 셀룰로스, 히드록시프로필메틸-셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 및/또는 폴리비닐피롤리돈 (PVP)이다. 원한다면, 붕해제, 예컨대 가교 폴리비닐 피롤리돈, 한천, 또는 알긴산 또는 이의 염 예컨대 알긴산나트륨을 첨가할 수 있다. 임의적으로, 경구 제형은 내부의 산 조건을 중화하기 위한 완충제 또는 염수에서 또한 제형될 수 있거나, 또는 어떠한 담체도 없이 투여될 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 제약 제제는 젤라틴으로 제조된 푸시-핏(push-fit) 캡슐, 뿐만 아니라 젤라틴 및 가소화제, 예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질의 밀봉 캡슐을 포함한다. 푸시-핏 캡슐은 충전제 예컨대 락토스, 결합제 예컨대 전분, 및/또는 윤활제 예컨대 탈크 또는 스테아르산마그네슘, 및 임의적인 안정화제와 혼합된 활성 성분을 함유할 수 있다. 연질 캡슐에서, 활성 화합물은 적절한 액체, 예컨대 지방 오일, 액체 파라핀, 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해 또는 현탁될 수 있다. 추가적으로, 안정화제가 첨가될 수 있다. 경구 투여용으로 제형된 마이크포스피어가 또한 사용될 수 있다. 이같은 마이크로스피어는 관련 분야에 잘 정의되어 있다. 모든 경구 투여용 제형은 이같은 투여에 적절한 투여량이어야 한다. 협측 투여를 위해, 조성물은 통상적인 방식으로 제형된 정제 또는 로젠지의 형태를 취할 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 본 개시내용에 따라 사용하기 위한 화합물은 적절한 추진제, 예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적절한 기체를 사용하여, 네뷸라이저 또는 가압 팩으로부터의 에어로졸 분무 제시의 형태로 편리하게 전달될 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 밸브를 제공하여 계량된 양을 전달함으로써 투여량 단위가 결정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에서 사용하기 위한 예를 들어 젤라틴의 캡슐 및 카트리지는 화합물 및 적절한 분말 기제 예컨대 락토스 또는 전분의 분말 혼합물을 함유하도록 제형될 수 있다.
화합물은, 이를 전신적으로 전달하기를 원하는 경우, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여용으로 제형될 수 있다. 주사용 제형은 보존제가 첨가된 단위 투여량 형태로, 예를 들어, 앰풀 또는 다중-용량 용기 내에 제시될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 내의 현탁액, 용액 또는 에멀션과 같은 형태를 취할 수 있고, 제형제 예컨대 현탁, 안정화 및/또는 분산 작용제를 함유할 수 있다.
비경구 투여용 제약 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수성 용액을 포함한다. 추가적으로, 활성 화합물의 현탁액은 적합한 유성 주사 현탁액으로서 제조될 수 있다. 적절한 친지성 용매 또는 비히클은 지방 오일 예컨대 참기름, 또는 합성 지방산 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨, 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 임의적으로, 현탁액은 적절한 안정화제 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 고도로 농축된 용액의 제조를 허용하는 작용제를 또한 함유할 수 있다.
대안적으로, 활성 화합물은 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어, 발열원이 없는 멸균수와 함께 구성시키기 위한 분말 형태일 수 있다.
화합물은 통상적인 좌약 기제 예컨대 코코아 버터 또는 기타 글리세리드를 예를 들어 함유하는, 직장 또는 질 조성물 예컨대 좌약 또는 정체 관장제 내에 제형될 수도 있다.
기타 전달 시스템은 시간-방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이같은 시스템은 화합물의 반복 투여를 피할 수 있어서, 대상체 및 의사의 편의를 증가시킨다. 다수의 유형의 방출 전달 시스템이 이용가능하고, 관련 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 이는 중합체 기반 시스템 예컨대 폴리(락티드-글리콜리드), 코폴리옥살레이트, 폴리카프로락톤, 폴리에스테르아미드, 폴리오르토에스테르, 폴리히드록시부티르산, 및 폴리안히드리드를 포함한다. 약물을 함유하는 상기 중합체의 마이크로캡슐이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,075,109에 기술되어 있다. 전달 시스템은 스테롤 예컨대 콜레스테롤, 콜레스테롤 에스테르 및 지방산 또는 천연 지방 예컨대 모노-, 디- 및 트리-글리세리드를 포함하는 지질; 히드로겔 방출 시스템; 실라스틱(silastic) 시스템; 펩티드-기반 시스템; 왁스 코팅제; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용한 압착 정제; 부분적으로 융합된 이식물 등인 비-중합체 시스템을 또한 포함한다. 구체적인 예는 (a) 본 개시내용의 작용제가 매트릭스 내의 형태로 함유되는 부식성 시스템 예컨대 미국 특허 번호 4,452,775, 4,675,189, 및 5,736,152에 기술된 것들, 및 (b) 활성 성분이 중합체로부터 제어된 속도로 투과하는 확산성 시스템 예컨대 미국 특허 번호 3,854,480, 5,133,974 및 5,407,686에 기술된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 추가적으로, 펌프-기반 하드웨어 전달 시스템을 사용할 수 있고, 이들 중 일부는 이식용으로 개조된다.
본 개시내용에 의해 기술된 항-플렉틴-1 항체 및 조성물은 대상체 (예를 들어, 암에 걸린 대상체)에게 여러번 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물이 대상체에게 전달되는 횟수는 2 내지 10회 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회)의 범위 내이다. 일부 실시양태에서, 이종성 핵산은 대상체에게 10회를 초과하여 전달된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 역일 (예를 들어, 24시간 기간) 당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일의 역일 당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 역주 (7일의 역일) 당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 격주 당 1회 (예를 들어, 2주의 역주 기간에 1회) 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 역월 당 1회 (예를 들어, 30일의 역일 당 1회) 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 6개월의 역월 당 1회 이하로 투여된다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 또는 조성물의 용량은 대상체에게 역년 (예를 들어, 365일 또는 윤년의 경우 366일) 당 1회 이하로 투여된다.
면역검정법
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 세포, 예를 들어, 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1을 원위치에서 또는 시험관내에서 검출하는 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체로부터 수득된 샘플 내의 세포의 표면 상의 플렉틴-1을 검출하는 방법에 관한 것이다. 샘플은, 예를 들어, 대상체로부터 종양 또는 이의 일부분을 추출함으로써, 대상체로부터 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 종양으로부터 단리될 수 있다. 그러나, 일부 실시양태에서, 세포는 단리된 종양의 환경에서 조사될 수 있다.
일부 실시양태에서, 윈위치에서 플렉틴-1을 검출하는 방법은 대상체에게 표지 (예를 들어, 방사성 표지)에 접합된 플렉틴-1 항체 또는 항원 결합 단편을 이러한 항체 또는 항원 결합 단편이 대상체 내의 세포, 예를 들어, 암 세포 상의 플렉틴-1의 접근가능한 에피토프와 결합 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에 전달하는 단계; 및 대상체 내의 표지를 (예를 들어, 자가방사선촬영술, 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술 (SPECT), 양전자 방출 단층촬영술 (PET) 및 섬광조영술을 포함을 포함하는 기타 핵의학 검출 기술을 사용하여) 검출하는 단계를 수반한다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터 수득된 종양 샘플 내의 플렉틴-1을 검출하는 방법은 (a) 항원이 샘플 내에 존재한다면, 항체 또는 항원 결합 단편이 항원에 결합하는데 적절한 조건 하에, 샘플을 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키고, 이에 의해 결합 복합체를 형성시키는 단계; 및 (b) 예를 들어, 종양 세포의 표면 상에서, 항원에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 수준을 결정하는 단계 (예를 들어, 결합 복합체의 수준을 결정하는 단계)를 수반한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 결합 복합체는 항원 (예를 들어, 플렉틴-1 단백질)에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편의 생체분자 복합체를 지칭한다. 결합 복합체는 단일 특이성의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 상이한 특이성의 2개 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 복합체는 동일한 항원 상의 상이한 항원성 부위들을 인식하는 2개 이상의 항체를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 항원 결합 단편은 다른 생체분자 예컨대 RNA, DNA, 다당류 또는 단백질이 이에 결합되어 있으면서 항원에 결합될 수 있다. 한 실시양태에서, 결합 복합체는 상이한 항원들을 인식하는 2개 이상의 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 복합체 내의 항체 또는 항원 결합 단편 (예를 들어, 항원에 결합된 고정된 항체 또는 항원 결합 단편)은 그 자체가 항원으로서 항체 또는 항원 결합 단편 (예를 들어, 검출가능하게 표지된 항체 또는 항원 결합 단편)에 결합될 수 있다. 따라서, 일부 경우에, 결합 복합체는 다중 항원 및 다중 항체 또는 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 결합 복합체 내에 존재하는 항원은 이의 천연 원위치 입체형상일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 정제된 단백질 항원, 또는 항원을 포함하는 단리된 단백질 (여기서 항원은 이의 천연 원위치 입체형상이 아니다)과 항체 또는 항원 결합 단편 사이에 결합 복합체가 형성된다. 일부 실시양태에서, 정제된 단백질 항원과 항체 또는 항원 결합 단편 사이에 결합 복합체가 형성되고, 여기서 항원은 이의 천연 원위치 입체형상이 아니고, 고체 지지체 (예를 들어, PVDF 막) 상에 고정된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편, 및, 예를 들어, 원위치에서 천연 입체형상으로 (예를 들어, 세포의 표면 상에) 존재하는 세포 표면 단백질로 결합 복합체가 형성된다. 결합 복합체 내의 항체 또는 항원 결합 단편은 검출가능하게 표지될 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 결합 복합체는 검출가능하게 표지된 항체 또는 항원 결합 단편 및 표지되지 않은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 복합체는 검출가능하게 표지된 항원을 포함한다. 일부 실시양태에서, 결합 복합체 내의 항체 또는 항원 결합 단편은 하나 이상의 고체 지지체에 고정된다. 일부 실시양태에서, 결합 복합체 내의 항원은 하나 이상의 고체 지지체에 고정된다. 예시적인 고체 지지체가 본원에 개시되고, 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 결합 복합체의 상기 예들은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 결합 복합체의 다른 예가 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
임의의 검출, 진단, 및 모니터링 방법에서, 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 항원이 직접적으로 또는 간접적으로 고체 지지체 표면에 접합될 수 있다. 고체 지지체에 접합시키는 방법은 표준이고, 공유결합 및 비-공유결합 상호작용을 통해 달성될 수 있다. 접합 방법의 비제한적인 예는 흡착, 가교, 단백질 A/G - 항체 상호작용, 및 스트렙타비딘-비오틴 상호작용을 포함한다. 기타 접합 방법이 관련 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
일부 측면에서, 상기 검출, 진단, 및 모니터링 방법은 항원에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편 (예를 들어, 결합 복합체)의 수준을 하나 이상의 기준 표준물에 비교하는 단계를 포함한다. 기준 표준물은, 예를 들어, 전자간증에 걸린 또는 걸리지 않은 대상체에서의 상응하는 플렉틴-1의 수준일 수 있다. 한 실시양태에서, 기준 표준물은 플렉틴-1을 함유하지 않는 샘플에서 검출된 플렉틴-1의 수준 (예를 들어, 배경 수준)이다. 대안적으로, 샘플을 비-특이적 항체 (예를 들어, 비-면역 혈청으로부터 수득된 항체)와 접촉시킴으로써, 특정 플렉틴-1을 함유하는 샘플로부터 배경 수준이 결정될 수 있다. 한편, 기준 표준물은 플렉틴-1을 함유하는 샘플 (예를 들어, 양성 대조군)에서 검출된 플렉틴-1의 수준일 수 있다. 일부 경우에, 기준 표준물은 샘플 내의 플렉틴-1의 다양한 농도와 연관되고 테스트 샘플 내의 플렉틴-1의 농도를 정량하는데 유용한 일련의 수준일 수 있다. 기준 표준물의 상기 예들은 제한적이지 않고, 다른 적절한 기준 표준물이 관련 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다.
또 다른 실시양태는 상기 기술된 항체, 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 세포 중 어느 하나, 및 임의적인, 적절한 검출 수단을 포함하는 진단 조성물에 관한 것이다. 항체 또는 항원 결합 단편은, 예를 들어, 면역검정법에서 사용하기에 적절하고, 여기서 이는 액체 상으로 이용될 수 있거나 또는 고체 상 담체에 결합될 수 있다. 항체 또는 항원 결합 단편을 이용할 수 있는 면역검정법의 예는 직접적 또는 간접적 양식의 경쟁적 및 비-경쟁적 면역검정법이다. 이같은 면역검정법의 예는 효소 결합 면역검정법 (ELISA), 방사성 면역검정법 (RIA), 샌드위치 (면역계량 검정법), 유동 세포측정법, 웨스턴 블롯 검정법, 면역침전 검정법, 면역조직화학, 면역-현미경검사, 측방 유동 면역-크로마토그래피 검정법, 및 프로테오믹스(proteomics) 어레이이다. 항원 및 항체 또는 항원 결합 단편은 다수의 상이한 고체 지지체 (예를 들어, 담체, 막, 칼럼, 프로테오믹스 어레이 등)에 결합될 수 있다. 고체 지지체 물질의 예는 유리, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드, 폴리비닐리덴 디플루오라이드, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리카르보네이트, 덱스트란, 나일론, 아밀로스, 천연 및 변형 셀룰로스, 예컨대 니트로셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 아가로스, 및 자철광을 포함한다. 지지체의 성질은 고정적일 수 있거나 또는 용액 내에 현탁될 수 있다 (예를 들어, 비드).
추가 실시양태에 의해, 본원에서 제공되는 항체 및 항원 결합 단편은 혈액 샘플, 임의의 다른 적합한 체액 샘플 (예를 들어, 림프액), 또는 조직 샘플 (예를 들어, 췌장 조직, 난소 조직, 대상체의 두경부로부터의 조직, 유방 조직, 폐 조직 등)일 수 있는 생물학적 샘플을 대상체로부터 수득함으로써 대상체에서의 플렉틴-1 발현을 평가하는 방법에서 또한 사용될 수 있다. 이러한 절차는 항체 또는 항원 결합 단편과 항원 사이에 결합 복합체가 형성될 수 있게 하는 조건 하에 샘플 (예를 들어, 췌장 조직), 또는 이로부터 단리된 단백질 샘플을 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 그 후, 이같은 결합 복합체의 수준을 관련 분야에 공지된 방법에 의해 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 항원이 샘플 내에 존재한다면, 항체 또는 항원 결합 단편이 플렉틴-1 단백질에 결합하고, 항원에 결합된 항체 또는 항원 결합 단편으로 이루어진 결합 복합체가 형성되는데 적절한 조건 하에, 생물학적 샘플이 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉된다. 이러한 접촉 단계는 전형적으로 반응 챔버, 예컨대 튜브, 플레이트 웰, 멤브레인 배스(membrane bath), 세포 배양 접시, 현미경 슬라이드 등에서 수행된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체 상에 고정된다. 일부 실시양태에서, 항원은 고체 지지체 상에 고정된다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 반응 챔버의 표면이다. 일부 실시양태에서, 고체 지지체는 중합체 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 스트립, 폴리비닐리덴 디플루로라이드 (PVDF) 막 등)의 것이다. 기타 적합한 고체 지지체가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 및 항원 결합 단편은 항원과의 접촉 전에 고체 지지체 상에 고정된다. 다른 실시양태에서, 항체 및 항원 결합 단편의 고정은 결합 복합체의 형성 후에 수행된다. 또 다른 실시양태에서는, 결합 복합체의 형성 전에 항원이 고체 지지체 상에 고정된다. 일부 실시양태에서, 고정된 결합 복합체를 검출하도록 반응 챔버에 검출 시약이 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 항원에 대해 지시된 검출가능하게 표지된 2차 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1차 항체 또는 항원 결합 단편 자체가 검출가능하게 표지되고, 이에 의해 검출 시약이다.
한 측면에서, 검출 방법은 항체 또는 항원 결합 단편을 고체 지지체에 고정하는 단계, 샘플 내에 존재한다면 항원이 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에, 샘플 (예를 들어, 생물학적 샘플 또는 단리된 단백질 샘플)을 고체 지지체에 적용하는 단계, 과량의 샘플을 고체 지지체로부터 제거하는 단계, 검출가능하게 표지된 항체 또는 항원 결합 단편이 항원이 결합된 고정된 항체 또는 항원 결합 단편에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에, 검출가능하게 표지된 항체 또는 항원 결합 단편을 적용하는 단계, 고체 지지체를 세정하는 단계, 및 고체 지지체 상의 표지의 존재에 대해 검정하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 반응 챔버 (예를 들어, 멤브레인 배스)에서 항체 및 항원 결합 단편과 접촉되기 전에 항원이 고체 지지체, 예컨대 PVDF 막 상에 고정된다. 고정된 결합 복합체를 검출하도록 검출 시약이 반응 챔버에 첨가된다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 항원에 대해 지시된 검출가능하게 표지된 2차 항체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 검출 시약은 1차 항체 또는 항원 결합 단편에 대해 지시된 검출가능하게 표지된 2차 항체를 포함한다. 본원에 개시된 바와 같이, 검출가능한 표지는, 예를 들어, 방사성동위원소, 형광단, 발광 분자, 효소, 비오틴-모이어티, 에피토프 태그 또는 염료 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 1차 항체 또는 항원 결합 단편 자체가 검출가능하게 표지되고, 이에 의해 검출 시약이다. 적절한 검출가능한 표지가 본원에서 기술되고, 관련 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다.
따라서, (a) 항원 결합 시약 (예를 들어, 플렉틴-1 결합 시약)으로서의 검출가능하게 표지되고/되거나 표지되지 않은 항체 또는 항원 결합 단편; (b) 검출 시약; 및, 임의적인 (c) 샘플 내의 항원을 검출하는데 시약을 사용하기 위한 완전한 설명서를 포함하는, 가정용 또는 임상 용도 (현장 관리 서비스)에 적절한 진단 키트가 제공된다. 일부 실시양태에서, 진단 키트는 고체 지지체 상에 고정된 항체 또는 항원 결합 단편, 및/또는 플렉틴-1을 포함한다. 본원에 기술된 고체 지지체 중 임의의 것이 진단 키트에 혼입시키기에 적절하다. 바람직한 실시양태에서, 고체 지지체는 반응 챔버 또는 플레이트 웰의 표면이다. 전형적으로, 플레이트 웰은 6, 12, 24, 96, 384, 및 1536개로부터 선택된 개수의 웰이 있는 멀티웰 플레이트 내에 있지만, 이는 이렇게 제한되지 않는다. 다른 실시양태에서, 진단 키트는 검출가능하게 표지된 항체 또는 항원 결합 단편을 제공한다. 진단 키트는 이러한 실시양태에 제한되지 않고, 키트 조성에서의 기타 변동이 관련 분야의 통상의 기술자에게 쉽게 명백할 것이다.
본 개시내용이 하기의 실시예에 의해 추가로 설명되고, 이는 어떠한 방식으로도 추가로 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 본 출원의 전반에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 (문헌, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 공동-계류 중인 특허 출원을 포함함)의 전체 내용은 이에 의해 명확하게 참고로 포함된다.
실시예
이. 콜라이에서의 인간 플렉틴-1의 발현 및 정제
His-태그 벡터 (15 mg/L, 서열식별번호: 2) 및 GST-태그 벡터 (30 mg/L, 서열식별번호: 3) 양쪽 모두의 익스프레션-레디(Expression-ready) 구축물을 모노클로날 항체를 생성시키는데 사용하였다. 발현을 평가하기 위해, 플라스미드를 B 계통의 이. 콜라이에 형질전환시켰다. 4 mL 시험관에서 시험을 수행하였고, 하기의 변수들을 조사하였다: 온도, 발현 시간, 및 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)의 농도.
원심분리로 세포를 수확하였다. 초음파처리로 세포 펠릿을 용해시키고, 니켈 칼럼을 사용하여 1-단계 정제로 표적 단백질을 수득하였다. 분획들을 풀링하고, 저장 완충제에 대해 투석하였다. 상이한 저장 완충제들을 사용하여, 어떤 것이 0.4 mg/mL를 초과하는 농도로 가장 안정적인 단백질을 산출하였는지를 결정하였다. 분자량 및 순도 측정을 수득하기 위해 표준 프로토콜을 사용하여 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 단백질을 분석하였다. 소 혈청 알부민 (BSA)을 표준물로 사용하여, 브래드포드(Bradford) 단백질 검정법으로 단백질 농도를 결정하였다.
모노클로날 항-인간 플렉틴 -1 단백질의 개발
표적 단백질 (서열식별번호: 1에서 밑줄이 그어지고, 서열식별번호: 92에 기재됨)을 인식하는 항-인간 플렉틴-1 단백질 모노클로날 항체의 특정 패널을 개발하였다.
먼저, 5마리의 BALB/c 마우스를 진스크립트(GenScript)의 모노익스프레스(MonoExpress) 면역화 프로토콜로 면역화시키고, 2주 동안 관찰하였다.
전기융합을 사용하여 2가지 융합을 수행하였다. 이러한 프로세스를 사용한 평균 융합 효율은 약 1개의 하이브리도마/5000개의 B 세포였다. 하이브리도마 클론의 예상 수율은 2×104개였고, 융합된 세포를 96-웰 플레이트 내로 플레이팅하였다. ELISA를 수행하여, 양성 클론에 대해 융합 단백질을 스크리닝하였다. 그 후, 양성 클론으로부터의 상청액을 표적 단백질에 대한 ELISA로 추가로 스크리닝하였다. 10*His-태그 단백질을 카운터 스크린으로서 사용하였다. 선별된 클론은 표적 단백질에 대해 양성이고, 10*His-태그 단백질에 대해 음성이었다. 양성 클론을 인간 재조합 Sec 8 (플렉틴-1 섹션 8)로 코팅된 24-웰 플레이트 내로 확장시키고, 각각의 클론에 대한 2 mL의 상청액을 수집한 후 세포를 보관용으로 냉동하였다. 표 3은 인간 재조합 플렉틴-1 섹션 8로 코팅된 플레이트 상에서 성장된 세포주에 대한 OD450nm를 나타낸다.
<표 3>
실험 세포주에 대한 OD450 결과
Figure 112018122144670-pct00004
2가지 융합으로부터의 양성 1차 클론을 제한 희석에 의해 서브클로닝하여, 서브클론들이 단일 모세포로부터 유래되었음을 확실하게 하였다. 클론을 3세대 동안 성장시켰다. 서브클론을 ELISA에 의해 추가로 스크리닝하였다. ELISA 결과를 기초로, 각각의 1차 클론의 안정적인 서브클론 세포주 2개를 냉동보존하였다.
클론 PAb1 및 PAb2가 가장 높은 특이적 플렉틴 결합 잠재력을 나타냈다 (도 1). 클론 PAb3, PAb4, 및 PAb5 또한 암 세포를 사멸시키는 능력이 실연되었다 (도 2).
롤러 병을 사용하여 약 15 mg/L 농도의 항체를 생산하였다. 단백질 A/G 친화성 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 항체 단백질을 추가로 정제하고, 저장을 위해 PBS 완충제 내로 투석하였다. 품질 제어를 위해, 항체에 SDS-PAGE에 의한 품질 테스트, OD280nm에서의 흡광에 의한 농도 결정, 및 ELISA에 의한 항원 반응성을 진행하였다.
선별된 항체를 표준 전장 항체 시퀀싱에 적용하였다. 항체에 전체 RNA 추출, RT-PCR, 및 5' RACE 및 3' RACE PCR을 진행하였다. 가변 및 불변 영역의 표적 PCR 단편을 겔-정제하고, 시퀀싱 벡터 내로 클로닝하였다. 컨센서스 서열을 추론하기 위해, 각각의 쇄의 적어도 5개의 독립적인 양성 클론을 시퀀싱하였다.
PAb1 및 PAb2의 모노클로날 항체 시퀀싱
PAb1 및 PAb2를 하기 절차를 사용하여 시퀀싱하였다. TRIzol® 시약 (앰비온(Ambion), 카탈로그 번호: 15596-026) 및 TRIzol® 시약의 기술 안내서로부터의 절차를 사용하여 진스크립트에 의해 회수된 하이브리도마 세포로부터 전체 RNA를 단리하였다. 그 후, 전체 RNA를 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 아이소타입-특이적 안티센스 프라이머 또는 범용 프라이머를 프라임스크립트(PrimeScript)™ 제1 가닥 cDNA 합성 키트로 제조사의 프로토콜을 사용하여 전체 RNA를 cDNA로 역전사시키는데 사용하였다. VH, VL, CH, 및 CL의 항체 단편을 증폭시켰다. 그 후, 증폭된 항체 단편을 표준 분자 클로닝 절차를 사용하여 별개로 표준 클로닝 벡터 내로 클로닝하였다. 콜로니 PCR을 수행하여, 올바른 크기의 삽입물이 있는 클론을 확인하였다. 올바른 크기의 삽입물이 있는 5개를 초과하는 단일 콜로니를 각각의 항체 단편에 대해 시퀀싱하였다.
궁극적으로, 올바른 VH, VL, CH, 및 CL 삽입물 크기의 단일 콜로니 5개를 시퀀싱용으로 보냈다. 5개의 상이한 클론의 VH, VL, CH, 및 CL 유전자가 거의 동일한 것으로 밝혀졌다. 하기의 서열 목록에 열거된 PAb1 및 PAb2 컨센서스 서열은 PAb1 및 PAb2 항체의 서열을 나타낸다.
PAb1을 사용한 시험관내 검정법
시험관내 결합 검정법을 수행하였다. 도 3a는 PAb1이 플렉틴-1 단백질의 재조합 인간 C-말단 부분에 특이적으로 결합한다는 것을 나타낸다. 데이터는 PAb1이 재조합 인간 Sec8-His 단백질에 높은 친화력 (예를 들어, Kd < 1 nM)으로 선택적으로 결합한다는 것을 나타낸다. 도 3b는 플렉틴-1 양성 L3.6pl 암 세포 상에서의 PAb1 결합 특이성을 나타낸다; PAb1은 플렉틴-1 음성 LNCaP 세포에 결합하지 않았다.
도 4a-4g는 L3.6pl 플렉틴-1 양성 암 세포에서의 PAb1의 내재화를 나타낸다. 엔도솜 마커 LAMP-1과 병합된, PAb1 (도 4a) 또는 IgG 대조군 (도 4b)으로의 L3.6pl 세포의 염색을 실연하는 대표적인 공초점 현미경검사 영상이 제시된다. PAb1 및 LAMP-1의 공동-국소화가 관찰되었다 (도 4c-4e). 정량 검정법은 PAb1의 유의한 부분이 LAMP-1과 병합된 반면 IgG 대조군은 그렇지 않았음을 나타냈다. 도 4g에 나타난 바와 같이, L3.6pl 세포에서의 37℃에서, 4℃에서, 또는 콜드 PAb1과 조합하여 인큐베이션한 후의 내재화된 125I- PAb1 방사능의 측정은 4℃ 대 37 4℃에서의 양쪽 모두의 세포주에서의 방사능 감소를 나타낸 반면, 콜드 PAb1와의 경쟁 (Comp.) 동안에는 L3.6pl 세포에서만 내재화 활성이 감소하였다.
도 5a-5d는 PAb1 처리 후의 아팝토시스에 의한 암 세포 사멸 유도에 관한 데이터를 나타낸다. 도 5a는 유동 세포측정법에 의한 L3.6pl 세포의 형광 마이너스 원 대조군 실험을 나타낸다. 도 5b는 대조군 IgG 처리 72시간 후의 L3.6pl 아넥신 V-양성 세포를 나타낸다. 도 5c는 PAb1 처리 72시간 후의 L3.6pl 아넥신 V-양성 세포를 나타낸다. 데이터는 PAb1-처리 L3.6pl 세포가 대조군 IgG-처리 세포에 비교하여 유의하게 더 많은 아팝토시스 (아넥신 V에 의해 평가된 바와 같음)를 겪었음을 나타낸다 (도 5d).
암 세포 유형 및 건강한 세포 유형의 생존을 PAb1 또는 IgG 대조군 처리 72시간 후에 측정하였다. 로지스틱 비선형 회귀에 의해 EC50을 계산하였고, 이는 세포 생육성을 50％만큼 감소시킨 mAb의 농도 (nM)로서 보고되었다. 데이터가 표 4 (하기)에서 제시된다.
<표 4>
Figure 112018122144670-pct00005
YapC 암 세포의 튜불린 비등방성에 대한 PAb1 처리의 효과를 공초점 현미경검사에 의해 조사하였다. 도 6a는 PAb1로 처리되지 않은 YapC 세포에서의 튜불린 염색을 나타낸다. 도 6b는 모노메틸 오리스타틴 E (MMAE) 처리 10분 후의 튜불린 염색을 나타낸다; MMAE는 튜불린 중합을 차단한다. 도 6c는 PAb1 처리 24시간 후의 튜불린 염색을 나타낸다. 데이터는 미처리 대조군 세포에 비교하여 PAb1로 처리된 세포에서의 비등방성 감소를 나타낸다 (도 6d).
YapC 암 세포에서의 PAb1과 튜불린의 공동-국소화를 또한 연구하였다. 튜불린 염색 (도 7a) 및 PAb1 염색 (도 7b) 후의 YapC의 대표적인 공초점 현미경검사 영상이 제시된다. 데이터는 죽어가는 세포의 표면 상에서 튜불린 및 PAb1이 공동-국소화된다는 것을 나타낸다 (도 7c; 화살표). 커플 세포 상에서 PAb1 염색 증가가 또한 관찰되었다.
PAb1을 사용한 시험관내 검정법
피하 YapC 종양을 보유하는 면역손상 마우스에게 PAb1 또는 IgG 대조군을 투여하였다. 데이터는 11일 후, 3 mg/kg PAb1로 처리된 마우스가 IgG 대조군으로 처리된 마우스와 비교하여 종양 부피가 유의하게 더 작았다는 것을 나타낸다 (도 8a). 데이터는 1 mg/kg PAb1의 마우스가 제14일에 종양 부피의 유의한 감소를 도출하였음을 또한 나타냈다. 0.3 mg/kg PAb1로 처리된 마우스에 비교하여 2개의 더 높은 용량 (1 mg/kg 및 3 mg/kg)의 PAb1가 유의하게 더 낮은 종양 부피를 초래하였고 (도 8a), 이는 용량-의존적 효과를 나타낸다. 데이터는 PAb1로 처리된 동물이 전체 치료 기간 동안 체중이 감소되지 않았음을 또한 나타냈다 (도 8b). 제0일, 제14일 및 제25일의 3 mg/kg PAb1로 처리된 마우스의 사진이 또한 제시된다 (도 8c-8e).
서열
>서열식별번호: 1 - 플렉틴 (헤미데스모솜 단백질 1), 호모 사피엔스(Homo sapiens); 표적 단백질에 밑줄이 그어짐
Figure 112018122144670-pct00006
Figure 112018122144670-pct00007
Figure 112018122144670-pct00008
>서열식별번호: 2 - pET-10NC-Plec C 말단: His 태그 -EK 절단 부위-인간 플렉틴 1 (섹션 8)-정지 코돈 (344개의 아미노산; MW=36959.2; 예상 pI=8.80)
Figure 112018122144670-pct00009
>서열식별번호: 3 - pGEX2t-섹션 8: GST 태그 -트롬빈 절단 부위-인간 플렉틴 1 (섹션 8)-정지 코돈 (540개의 아미노산; MW=59809.3; 예상 pI=8.15)
Figure 112018122144670-pct00010
Pab2 서열
Figure 112018122144670-pct00011
Figure 112018122144670-pct00012
Figure 112018122144670-pct00013
Figure 112018122144670-pct00014
Figure 112018122144670-pct00015
Pab1 서열
Figure 112018122144670-pct00016
Figure 112018122144670-pct00017
Figure 112018122144670-pct00018
Figure 112018122144670-pct00019
>서열식별번호: 92 - 플렉틴 (헤미데스모솜 단백질 1), 호모 사피엔스; 표적 단백질에 밑줄이 그어짐
Figure 112018122144670-pct00020
SEQUENCE LISTING <110> iTi Health, Inc. <120> PLECTIN-1 BINDING ANTIBODIES AND USES THEREOF <130> I0447.70002WO00 <140> Not Yet Assigned <141> 2017-04-07 <150> US 62/320,117 <151> 2016-04-08 <160> 93 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4684 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Ala Gly Met Leu Met Pro Arg Asp Gln Leu Arg Ala Ile Tyr 1 5 10 15 Glu Val Leu Phe Arg Glu Gly Val Met Val Ala Lys Lys Asp Arg Arg 20 25 30 Pro Arg Ser Leu His Pro His Val Pro Gly Val Thr Asn Leu Gln Val 35 40 45 Met Arg Ala Met Ala Ser Leu Arg Ala Arg Gly Leu Val Arg Glu Thr 50 55 60 Phe Ala Trp Cys His Phe Tyr Trp Tyr Leu Thr Asn Glu Gly Ile Ala 65 70 75 80 His Leu Arg Gln Tyr Leu His Leu Pro Pro Glu Ile Val Pro Ala Ser 85 90 95 Leu Gln Arg Val Arg Arg Pro Val Ala Met Val Met Pro Ala Arg Arg 100 105 110 Thr Pro His Val Gln Ala Val Gln Gly Pro Leu Gly Ser Pro Pro Lys 115 120 125 Arg Gly Pro Leu Pro Thr Glu Glu Gln Arg Val Tyr Arg Arg Lys Glu 130 135 140 Leu Glu Glu Val Ser Pro Glu Thr Pro Val Val Pro 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Arg Asp Leu Gly 355 360 365 Val Thr Arg Leu Leu Asp Pro Glu Asp Val Asp Val Pro Gln Pro Asp 370 375 380 Glu Lys Ser Ile Ile Thr Tyr Val Ser Ser Leu Tyr Asp Ala Met Pro 385 390 395 400 Arg Val Pro Asp Val Gln Asp Gly Val Arg Ala Asn Glu Leu Gln Leu 405 410 415 Arg Trp Gln Glu Tyr Arg Glu Leu Val Leu Leu Leu Leu Gln Trp Met 420 425 430 Arg His His Thr Ala Ala Phe Glu Glu Arg Arg Phe Pro Ser Ser Phe 435 440 445 Glu Glu Ile Glu Ile Leu Trp Ser Gln Phe Leu Lys Phe Lys Glu Met 450 455 460 Glu Leu Pro Ala Lys Glu Ala Asp Lys Asn Arg Ser Lys Gly Ile Tyr 465 470 475 480 Gln Ser Leu Glu Gly Ala Val Gln Ala Gly Gln Leu Lys Val Pro Pro 485 490 495 Gly Tyr His Pro Leu Asp Val Glu Lys Glu Trp Gly Lys Leu His Val 500 505 510 Ala Ile Leu Glu Arg Glu Lys Gln Leu Arg Ser Glu Phe Glu Arg Leu 515 520 525 Glu Cys Leu Gln Arg Ile Val Thr Lys Leu Gln Met Glu Ala Gly Leu 530 535 540 Cys Glu Glu Gln Leu Asn Gln Ala Asp Ala Leu Leu Gln Ser Asp Val 545 550 555 560 Arg Leu Leu Ala Ala Gly Lys Val Pro Gln Arg Ala Gly Glu Val Glu 565 570 575 Arg Asp Leu Asp Lys Ala Asp Ser Met Ile Arg Leu Leu Phe Asn Asp 580 585 590 Val Gln Thr Leu Lys Asp Gly Arg His Pro Gln Gly Glu Gln Met Tyr 595 600 605 Arg Arg Val Tyr Arg Leu His Glu Arg Leu Val Ala Ile Arg Thr Glu 610 615 620 Tyr Asn Leu Arg Leu Lys Ala Gly Val Ala Ala Pro Ala Thr Gln Val 625 630 635 640 Ala Gln Val Thr Leu Gln Ser Val Gln Arg Arg Pro Glu Leu Glu Asp 645 650 655 Ser Thr Leu Arg Tyr Leu Gln Asp Leu Leu Ala Trp Val Glu Glu Asn 660 665 670 Gln His Arg Val Asp Gly Ala Glu Trp Gly Val Asp Leu Pro Ser Val 675 680 685 Glu Ala Gln Leu Gly Ser His Arg Gly Leu His Gln Ser Ile Glu Glu 690 695 700 Phe Arg Ala Lys Ile Glu Arg Ala Arg Ser Asp Glu Gly Gln Leu Ser 705 710 715 720 Pro Ala Thr Arg Gly Ala Tyr Arg Asp Cys Leu Gly Arg Leu Asp Leu 725 730 735 Gln Tyr Ala Lys Leu Leu Asn Ser Ser Lys Ala Arg Leu Arg Ser Leu 740 745 750 Glu Ser Leu His Ser Phe Val Ala Ala Ala Thr Lys Glu Leu Met Trp 755 760 765 Leu Asn Glu Lys Glu Glu Glu Glu Val Gly Phe Asp Trp Ser Asp Arg 770 775 780 Asn Thr Asn Met Thr Ala Lys Lys Glu Ser Tyr Ser Ala Leu Met Arg 785 790 795 800 Glu Leu Glu Leu Lys Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Gln Asn Ala Gly 805 810 815 Asp Arg Leu Leu Arg Glu Asp His Pro Ala Arg Pro Thr Val Glu Ser 820 825 830 Phe Gln Ala Ala Leu Gln Thr Gln Trp Ser Trp Met Leu Gln Leu Cys 835 840 845 Cys Cys Ile Glu Ala His Leu Lys Glu Asn Ala Ala Tyr Phe Gln Phe 850 855 860 Phe Ser Asp Val Arg Glu Ala Glu Gly Gln Leu Gln Lys Leu Gln Glu 865 870 875 880 Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ser Cys Asp Arg Ser Ala Thr Val Thr Arg 885 890 895 Leu Glu Asp Leu Leu Gln Asp Ala Gln Asp Glu Lys Glu Gln Leu Asn 900 905 910 Glu Tyr Lys Gly His Leu Ser Gly Leu Ala Lys Arg Ala Lys Ala Val 915 920 925 Val Gln Leu Lys Pro Arg His Pro Ala His Pro Met Arg Gly Arg Leu 930 935 940 Pro Leu Leu Ala Val Cys Asp Tyr Lys Gln Val Glu Val Thr Val His 945 950 955 960 Lys Gly Asp Glu Cys Gln Leu Val Gly Pro Ala Gln Pro Ser His Trp 965 970 975 Lys Val Leu Ser Ser Ser Gly Ser Glu Ala Ala Val Pro Ser Val Cys 980 985 990 Phe Leu Val Pro Pro Pro Asn Gln Glu Ala Gln Glu Ala Val Thr Arg 995 1000 1005 Leu Glu Ala Gln His Gln Ala Leu Val Thr Leu Trp His Gln Leu 1010 1015 1020 His Val Asp Met Lys Ser Leu Leu Ala Trp Gln Ser Leu Arg Arg 1025 1030 1035 Asp Val Gln Leu Ile Arg Ser Trp Ser Leu Ala Thr Phe Arg Thr 1040 1045 1050 Leu Lys Pro Glu Glu Gln Arg Gln Ala Leu His Ser Leu Glu Leu 1055 1060 1065 His Tyr Gln Ala Phe Leu Arg Asp Ser Gln Asp Ala Gly Gly Phe 1070 1075 1080 Gly Pro Glu Asp Arg Leu Met Ala Glu Arg Glu Tyr Gly Ser Cys 1085 1090 1095 Ser His His Tyr Gln Gln Leu Leu Gln Ser Leu Glu Gln Gly Ala 1100 1105 1110 Gln Glu Glu Ser Arg Cys Gln Arg Cys Ile Ser Glu Leu Lys Asp 1115 1120 1125 Ile Arg Leu Gln Leu Glu Ala Cys Glu Thr Arg Thr Val His Arg 1130 1135 1140 Leu Arg Leu Pro Leu Asp Lys Glu Pro Ala Arg Glu Cys Ala Gln 1145 1150 1155 Arg Ile Ala Glu Gln Gln Lys Ala Gln Ala Glu Val Glu Gly Leu 1160 1165 1170 Gly Lys Gly Val Ala Arg Leu Ser Ala Glu Ala Glu Lys Val Leu 1175 1180 1185 Ala Leu Pro Glu Pro Ser Pro Ala Ala Pro Thr Leu Arg Ser Glu 1190 1195 1200 Leu Glu Leu Thr Leu Gly Lys Leu Glu Gln Val Arg Ser Leu Ser 1205 1210 1215 Ala Ile Tyr Leu Glu Lys Leu Lys Thr Ile Ser Leu Val Ile Arg 1220 1225 1230 Gly Thr Gln Gly Ala Glu Glu Val Leu Arg Ala His Glu Glu Gln 1235 1240 1245 Leu Lys Glu Ala Gln Ala Val Pro Ala Thr Leu Pro Glu Leu Glu 1250 1255 1260 Ala Thr Lys Ala Ser Leu Lys Lys Leu Arg Ala Gln Ala Glu Ala 1265 1270 1275 Gln Gln Pro Thr Phe Asp Ala Leu Arg Asp Glu Leu Arg Gly Ala 1280 1285 1290 Gln Glu Val Gly Glu Arg Leu Gln Gln Arg His Gly Glu Arg Asp 1295 1300 1305 Val Glu Val Glu Arg Trp Arg Glu Arg Val Ala Gln Leu Leu Glu 1310 1315 1320 Arg Trp Gln Ala Val Leu Ala Gln Thr Asp Val Arg Gln Arg Glu 1325 1330 1335 Leu Glu Gln Leu Gly Arg Gln Leu Arg Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala 1340 1345 1350 Asp Pro Leu Gly Ala Trp Leu Gln Asp Ala Arg Arg Arg Gln Glu 1355 1360 1365 Gln Ile Gln Ala Met Pro Leu Ala Asp Ser Gln Ala Val Arg Glu 1370 1375 1380 Gln Leu Arg Gln Glu Gln Ala Leu Leu Glu Glu Ile Glu Arg His 1385 1390 1395 Gly Glu Lys Val Glu Glu Cys Gln Arg Phe Ala Lys Gln Tyr Ile 1400 1405 1410 Asn Ala Ile Lys Asp Tyr Glu Leu Gln Leu Val Thr Tyr Lys Ala 1415 1420 1425 Gln Leu Glu Pro Val Ala Ser Pro Ala Lys Lys Pro Lys Val Gln 1430 1435 1440 Ser Gly Ser Glu Ser Val Ile Gln Glu Tyr Val Asp Leu Arg Thr 1445 1450 1455 His Tyr Ser Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ser Gln Tyr Ile Lys Phe 1460 1465 1470 Ile Ser Glu Thr Leu Arg Arg Met Glu Glu Glu Glu Arg Leu Ala 1475 1480 1485 Glu Gln Gln Arg Ala Glu Glu Arg Glu Arg Leu Ala Glu Val Glu 1490 1495 1500 Ala Ala Leu Glu Lys Gln Arg Gln Leu Ala Glu Ala His Ala Gln 1505 1510 1515 Ala Lys Ala Gln Ala Glu Arg Glu Ala Lys Glu Leu Gln Gln Arg 1520 1525 1530 Met Gln Glu Glu Val Val Arg Arg Glu Glu Ala Ala Val Asp Ala 1535 1540 1545 Gln Gln Gln Lys Arg Ser Ile Gln Glu Glu Leu Gln Gln Leu Arg 1550 1555 1560 Gln Ser Ser Glu Ala Glu Ile Gln Ala Lys Ala Arg Gln Ala Glu 1565 1570 1575 Ala Ala Glu Arg Ser Arg Leu Arg Ile Glu Glu Glu Ile Arg Val 1580 1585 1590 Val Arg Leu Gln Leu Glu Ala Thr Glu Arg Gln Arg Gly Gly Ala 1595 1600 1605 Glu Gly Glu Leu Gln Ala Leu Arg Ala Arg Ala Glu Glu Ala Glu 1610 1615 1620 Ala Gln Lys Arg Gln Ala Gln Glu Glu Ala Glu Arg Leu Arg Arg 1625 1630 1635 Gln Val Gln Asp Glu Ser Gln Arg Lys Arg Gln Ala Glu Val Glu 1640 1645 1650 Leu Ala Ser Arg Val Lys Ala Glu Ala Glu Ala Ala Arg Glu Lys 1655 1660 1665 Gln Arg Ala Leu Gln Ala Leu Glu Glu Leu Arg Leu Gln Ala Glu 1670 1675 1680 Glu Ala Glu Arg Arg Leu Arg Gln Ala Glu Val Glu Arg Ala Arg 1685 1690 1695 Gln Val Gln Val Ala Leu Glu Thr Ala Gln Arg Ser Ala Glu Ala 1700 1705 1710 Glu Leu Gln Ser Lys Arg Ala Ser Phe Ala Glu Lys Thr Ala Gln 1715 1720 1725 Leu Glu Arg Ser Leu Gln Glu Glu His Val Ala Val Ala Gln Leu 1730 1735 1740 Arg Glu Glu Ala Glu Arg Arg Ala Gln Gln Gln Ala Glu Ala Glu 1745 1750 1755 Arg Ala Arg Glu Glu Ala Glu Arg Glu Leu Glu Arg Trp Gln Leu 1760 1765 1770 Lys Ala Asn Glu Ala Leu Arg Leu Arg Leu Gln Ala Glu Glu Val 1775 1780 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Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 53 tggataaaca ctgagactgg tgagccaaca tatgcagatg acttcaaggg a 51 <210> 54 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 54 cggtttgcct tctctttgga aacctctgcc agcactgcct atttgcagat caacaacctc 60 aaaaatgagg acacggctac atatttctgt gccccc 96 <210> 55 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 55 ggagggtttg cttac 15 <210> 56 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 56 tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 33 <210> 57 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polynucleotide <400> 57 cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaagatc 60 tcctgcaagg cttctggtta taccttcaca gactattcaa tgcactgggt gaagcaggct 120 ccaggaaagg gtttaaagtg gatgggctgg ataaacactg agactggtga gccaacatat 180 gcagatgact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcctat 240 ttgcagatca acaacctcaa 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<220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 88 Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 89 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 89 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 1 5 10 <210> 90 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 90 Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His 85 90 95 Leu Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg <210> 91 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 91 Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln 1 5 10 15 Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30 Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln 35 40 45 Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60 Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg 65 70 75 80 His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro 85 90 95 Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 100 105 <210> 92 <211> 364 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 92 Ser Ser Ser Asp Gly Val Val Lys Ser Met Ile Ile Asp Arg Arg Ser 1 5 10 15 Gly Arg Gln Tyr Asp Ile Asp Asp Ala Ile Ala Lys Asn Leu Ile Asp 20 25 30 Arg Ser Ala Leu Asp Gln Tyr Arg Ala Gly Thr Leu Ser Ile Thr Glu 35 40 45 Phe Ala Asp Met Leu Ser Gly Asn Ala Gly Gly Phe Arg Ser Arg Ser 50 55 60 Ser Ser Val Gly Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Ile Ser Pro Ala Val Ser 65 70 75 80 Arg Thr Gln Leu Ala Ser Trp Ser Asp Pro Thr Glu Glu Thr Gly Pro 85 90 95 Val Ala Gly Ile Leu Asp Thr Glu Thr Leu Glu Lys Val Ser Ile Thr 100 105 110 Glu Ala Met His Arg Asn Leu Val Asp Asn Ile Thr Gly Gln Arg Leu 115 120 125 Leu Glu Ala Gln Ala Cys Thr Gly Gly Ile Ile Asp Pro Ser Thr Gly 130 135 140 Glu Arg Phe Pro Val Thr Asp Ala Val Asn Lys Gly Leu Val Asp Lys 145 150 155 160 Ile Met Val Asp Arg Ile Asn Leu Ala Gln Lys Ala Phe Cys Gly Phe 165 170 175 Glu Asp Pro Arg Thr Lys Thr Lys Met Ser Ala Ala Gln Ala Leu Lys 180 185 190 Lys Gly Trp Leu Tyr Tyr Glu Ala Gly Gln Arg Phe Leu Glu Val Gln 195 200 205 Tyr Leu Thr Gly Gly Leu Ile Glu Pro Asp Thr Pro Gly Arg Val Pro 210 215 220 Leu Asp Glu Ala Leu Gln Arg Gly Thr Val Asp Ala Arg Thr Ala Gln 225 230 235 240 Lys Leu Arg Asp Val Gly Ala Tyr Ser Lys Tyr Leu Thr Cys Pro Lys 245 250 255 Thr Lys Leu Lys Ile Ser Tyr Lys Asp Ala Leu Asp Arg Ser Met Val 260 265 270 Glu Glu Gly Thr Gly Leu Arg Leu Leu Glu Ala Ala Ala Gln Ser Thr 275 280 285 Lys Gly Tyr Tyr Ser Pro Tyr Ser Val Ser Gly Ser Gly Ser Thr Ala 290 295 300 Gly Ser Arg Thr Gly Ser Arg Thr Gly Ser Arg Ala Gly Ser Arg Arg 305 310 315 320 Gly Ser Phe Asp Ala Thr Gly Ser Gly Phe Ser Met Thr Phe Ser Ser 325 330 335 Ser Ser Tyr Ser Ser Ser Gly Tyr Gly Arg Arg Tyr Ala Ser Gly Ser 340 345 350 Ser Ala Ser Leu Gly Gly Pro Glu Ser Ala Val Ala 355 360 <210> 93 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 93 Gly Gly Gly Ser 1

Claims (112)

  1. 서열식별번호: 24로 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 46으로 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하거나 또는 서열식별번호: 68로 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 및 서열식별번호: 90으로 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 플렉틴-1 (plectin-1)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열식별번호: 92에 대하여 적어도 85% 동일성을 갖는 아미노산 서열에 특이적으로 결합하거나 또는 서열식별번호: 92로 기재된 아미노산 서열에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  3. 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 플렉틴-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  4. 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 서열식별번호: 81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는, 플렉틴-1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화된 작용제에 커플링되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 표적화된 작용제가 검출가능한 모이어티 또는 치료제인 항체 또는 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서, 검출가능한 모이어티가 방사성 동위원소, 자성 화합물, x선 흡수제, 화학적 화합물, 생물학적 태그, 및 형광 분자로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 치료제가 세포독성 모이어티 또는 면역조정 모이어티인 항체 또는 항원 결합 단편.
  8. 제6항에 있어서, 표적화된 작용제에 링커를 통해 커플링되는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  9. 제8항에 있어서, 링커가 가요성 아미노산 서열 또는 포토링커인 항체 또는 항원 결합 단편.
  10. 제5항에 있어서, 표적화된 작용제가 생리학상 불활성인 나노입자 또는 형광색소를 포함하는, 항체 또는 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서, 나노입자가 자성, 형광성, 또는 방사성인 항체 또는 항원 결합 단편.
  12. 플렉틴-1에 특이적으로 결합하고, 6개의 상보성 결정 영역 (CDR): CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편이며, 여기서
    CDRH1이 서열식별번호: 18에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2가 서열식별번호: 20에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3이 서열식별번호: 22에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1이 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2가 서열식별번호: 42에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3이 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하거나; 또는
    CDRH1이 서열식별번호: 62에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2가 서열식별번호: 64에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3이 서열식별번호: 66에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1이 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2가 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3이 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 것인
    항체 또는 항원 결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, CDRH1이 서열식별번호: 18에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2가 서열식별번호: 20에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3이 서열식별번호: 22에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1이 서열식별번호: 40에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2가 서열식별번호: 42에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3이 서열식별번호: 44에 기재된 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, 서열식별번호: 24의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열식별번호: 46의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  15. 제12항에 있어서, CDRH1이 서열식별번호: 62에 기재된 서열을 포함하고, CDRH2가 서열식별번호: 64에 기재된 서열을 포함하고, CDRH3이 서열식별번호: 66에 기재된 서열을 포함하고, CDRL1이 서열식별번호: 84에 기재된 서열을 포함하고, CDRL2가 서열식별번호: 86에 기재된 서열을 포함하며, CDRL3이 서열식별번호: 88에 기재된 서열을 포함하는 것인 항체 또는 항원 결합 단편.
  16. 제15항에 있어서, 서열식별번호: 68의 중쇄 가변 도메인 서열 및 서열식별번호: 90의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  17. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체, 인간화 항체, 디아바디, 키메라 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, 어피바디, 또는 Fv 단편인 항체 또는 항원 결합 단편.
  18. 제1항, 제2항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 서열식별번호: 15 또는 서열식별번호: 59에 기재된 서열을 갖는 중쇄 불변 도메인을 포함하거나 또는 IgG, IgG1, IgG2, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM, 및 IgE 불변 도메인으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체 또는 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 형광 작용제, 발광 작용제, 효소성 작용제 및 방사성 작용제로 이루어진 군으로부터 선택된 작용제에 접합된 항체 또는 항원 결합 단편.
  20. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 암을 치료하기 위한 조성물.
  21. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는, 암을 검출하기 위한 조성물.
  22. 제1항 내지 제4항 및 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 항체 또는 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  23. 제22항의 단리된 핵산을 포함하는 단리된 세포이며, 여기서 세포는 박테리아 세포, 효모 세포, 포유동물 세포, 곤충 세포, 또는 하이브리도마 세포인 단리된 세포.
  24. 유효량의 제1항의 항체 또는 항원 결합 단편 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 유효량의 조성물을 포함하는, 암을 치료하기 위한 제약 조성물이며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 표적화된 작용제에 커플링되고, 항체 또는 항원 결합 단편은 암을 갖는 대상체 내의 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1에 결합하는 것인 제약 조성물.
  25. 유효량의 제1항의 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 상기 항체 또는 항원 결합 단편 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 유효량의 조성물을 포함하는, 암 세포를 검출하기 위한 제약 조성물이며, 여기서 항체 또는 항원 결합 단편은 표적화된 작용제에 커플링되고, 항체 또는 항원 결합 단편은 암을 갖는 대상체 내의 암 세포의 표면 상의 플렉틴-1에 결합하는 것인 제약 조성물.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 표적화된 작용제가 검출가능한 모이어티 또는 치료제인 제약 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 검출가능한 모이어티가 방사성 동위원소, 자성 화합물, x선 흡수제, 화학적 화합물, 생물학적 태그, 및 형광 분자로 이루어진 군으로부터 선택되거나 또는 치료제가 세포독성 모이어티 또는 면역조정 모이어티인 제약 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편이 표적화된 작용제에 링커를 통해 커플링되는, 제약 조성물.
  29. 제28항에 있어서, 링커가 가요성 아미노산 서열 또는 포토링커인 제약 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 표적화된 작용제가 생리학상 불활성인 나노입자 또는 형광색소를 포함하는, 제약 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 나노입자가 자성, 형광성, 또는 방사성인 제약 조성물.
  32. 제24항 또는 제25항에 있어서, 항체 또는 항원 결합 단편, 또는 조성물이 1 ng/kg 내지 100 mg/kg 범위의 용량으로 투여되는 것인 제약 조성물.
  33. 제24항 또는 제25항에 있어서, 암 세포가 난소암 세포, 식도암 세포, 두경부 편평세포 암종 암 세포, 또는 췌장암 세포인 제약 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 췌장암 세포가 췌장관 선암종 세포인 제약 조성물.
  35. 제24항 또는 제25항에 있어서, 대상체가 포유동물인 제약 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 대상체가 인간인 제약 조성물.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11168145B2 (en) 2016-04-08 2021-11-09 Zielbio, Inc. Plectin-1 binding antibodies and uses thereof
US11890352B2 (en) 2018-02-27 2024-02-06 University Of Virginia Patent Foundation Plectin-targeted liposomes/PARP inhibitor in the treatment of cancer
WO2023077099A1 (en) * 2021-10-29 2023-05-04 Zielbio, Inc. Cancer specific plectin-1 specific antibodies and methods of use thereof
CN115947855B (zh) * 2022-05-20 2023-10-27 杭州邦顺制药有限公司 抗cd24抗体的制备及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011521897A (ja) 2008-04-14 2011-07-28 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 膵管腺癌の検出および治療のためのプレクチン−１標的化剤

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3854480A (en) 1969-04-01 1974-12-17 Alza Corp Drug-delivery system
US4675189A (en) 1980-11-18 1987-06-23 Syntex (U.S.A.) Inc. Microencapsulation of water soluble active polypeptides
US4452775A (en) 1982-12-03 1984-06-05 Syntex (U.S.A.) Inc. Cholesterol matrix delivery system for sustained release of macromolecules
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
ATE151110T1 (de) 1988-09-02 1997-04-15 Protein Eng Corp Herstellung und auswahl von rekombinantproteinen mit verschiedenen bindestellen
US5133974A (en) 1989-05-05 1992-07-28 Kv Pharmaceutical Company Extended release pharmaceutical formulations
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
ATE164395T1 (de) 1990-12-03 1998-04-15 Genentech Inc Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
EP0575485A1 (en) 1991-03-01 1993-12-29 Dyax Corp. Process for the development of binding mini-proteins
IE921169A1 (en) 1991-04-10 1992-10-21 Scripps Research Inst Heterodimeric receptor libraries using phagemids
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
US5407686A (en) 1991-11-27 1995-04-18 Sidmak Laboratories, Inc. Sustained release composition for oral administration of active ingredient
US5736152A (en) 1995-10-27 1998-04-07 Atrix Laboratories, Inc. Non-polymeric sustained release delivery system
CN1297902A (zh) * 1999-11-24 2001-06-06 上海博容基因开发有限公司 一种新的多肽——人网蛋白80和编码这种多肽的多核苷酸
US7754208B2 (en) * 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
AU2003223520A1 (en) 2002-04-12 2003-10-27 Mitokor Targets for therapeutic intervention identified in the mitochondrial proteome
WO2004108948A2 (en) * 2003-06-04 2004-12-16 President And Fellows Of Harvard College Systems, methods and kits for characterizing phosphoproteomes
US7842466B1 (en) * 2005-09-16 2010-11-30 Celera Corporation Colon disease targets and uses thereof
WO2009036092A2 (en) 2007-09-10 2009-03-19 University Of Massachusetts Mitochondria-targeted anti-tumor agents
EP2231186A4 (en) 2007-12-17 2012-08-08 Dyax Corp COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING OSTEOLYTIC DISORDERS COMPRISING MMP-14 BINDING PROTEINS
KR20120101054A (ko) * 2009-11-05 2012-09-12 유니버시티 오브 버지니아 페이턴트 파운데이션 암에 대한 바이오마커로서 플렉틴-1을 검출하기 위한 조성물 및 방법
AU2013302620B2 (en) * 2012-08-14 2018-08-02 Minerva Biotechnologies Corporation Stem cell enhancing therapeutics
US9856315B2 (en) * 2014-10-15 2018-01-02 Cell Signaling Technology, Inc. Methylation and acetylation sites
US10611796B2 (en) 2016-03-16 2020-04-07 Council Of Scientific & Industrial Research Method for regressing pancreatic tumor by a liposomal formulation along with DNA vaccines
US11168145B2 (en) 2016-04-08 2021-11-09 Zielbio, Inc. Plectin-1 binding antibodies and uses thereof
CN112105380A (zh) 2017-10-11 2020-12-18 埃缇健康公司D/B/A泽尔拜尔 网蛋白-1结合抗体和其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011521897A (ja) 2008-04-14 2011-07-28 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 膵管腺癌の検出および治療のためのプレクチン−１標的化剤
US20150151010A1 (en) 2008-04-14 2015-06-04 The General Hospital Corporation Plectin-1 Targeted Agents for Detection and Treatment of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma

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