KR20230132450A - 항trpv6 단일 클론 항체 및 그 응용 - Google Patents

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KR20230132450A
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웨이 탄
종보 왕
웨이 왕
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코히런트 바이오파마 (쑤저우), 리미티드
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Abstract

TRPV6 단백질의 특징적인 폴리펩티드 항원 면역화된 마우스를 선택하여, 스크리닝에 의해 하이브리도마 세포계 12CT 9.5.1, 16CT 18.1.1.2 및 16CT 4.1.1.2를 얻었으며, 상기 계열의 세포는 TRPV6에 대한 단일 클론 항체를 분비할 수 있고 TRPV6 단백질 및 종양 조직을 특이적으로 인식할 수 있다. 상기 계열의 항체는 인공 또는 자동화 방식을 통해 면역조직화학(IHC), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 면역형광(IF), 화학발광면역측정법(CLIA), 탁도 면역분석(TIA) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot) 방식으로 세포 내 TRPV6 수준을 검출하는 데 사용될 수 있어, 종양 조직에 대한 진단 방법에 사용되며, 생물학적 검출 분야에 속한다.

Description

항TRPV6 단일 클론 항체 및 그 응용
본 발명은 인간 TRPV6 단백질을 인식할 수 있는 일련의 항체 및 이 계열의 항체를 분비할 수 있는 하이브리도마 세포계에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 종양 세포막/혈장 내의 TRPV6 분자에 특이적으로 결합하는 일련의 단일 클론 항체를 제공한하고, 상기 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열 및 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 결정하였으며, 상기 항체 또는 이의 항원 단편은 인공 또는 자동화 방식을 통해 면역 조직 화학(IHC), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 면역 형광(IF), 화학발광면역측정법(CLIA), 탁도 면역분석(TIA) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot) 방식으로 세포 내 TRPV6 수준을 검출하는 데 사용될 수 있어, 종양에 대한 진단 방법에 사용되며, 생물학적 검출 분야에 속한다.
일시적 수용체 양이온 채널 서브패밀리 V 멤버 6(transient receptor potential cation channel subfamily V member 6), 즉 TRPV6은 세포 외에서 세포 내로의 칼슘 이온의 능동적 전달을 매개하는 고선택적 칼슘 이온 막 관통 전달 채널이다. TRPV6은 인간의 정상적인 신장, 위장관, 췌장, 유선 및 침샘 등에서 발현되지만 주로 장 상피 세포에서 발현되며, 칼슘 이온이 세포 내로 전달되는 데 관여하므로, TRPV6 채널의 수나 기능이 변경될 때, 칼슘 이온 조절에 변화를 일으키고 그와 관련된 조직 기관의 구조나 기능의 이상을 유발할 수 있다.
TRPV6은 정상적인 조직에 비해 유방암, 담관암, 난소암, 폐 편평암 및 전립선암 등 악성 종양에서 발현이 유의하게 높았으며, 그 비정상적인 발현은 종양의 형성과 진행에 관련이 있을 수 있다. Prevarskaya 팀은 TRPV6을 고발현하는 인간 전립선암 LNCap 세포의 칼슘 이온 섭취가 TRPV6에 의해 매개되며, siRNA 처리하여 TRPV6 단백질 수준을 하향 조절한 후, S 기 세포 수가 감소하고 세포 증식이 억제된다는 것을 발견하였다. TRPV6 mRNA 및 단백질 수준을 하향 조절되도록 또한 리도카인으로 인간 유방암 MDA-MB-231 세포, 전립선암 PC-3 세포 및 난소암 ES-2 세포를 처리한 후, 세포 증식이 억제되는 동시에, 칼슘 이온의 세포 내 진입 속도가 낮아지는데, 암세포의 억제가 칼슘 이온의 감소 및 TRPV6 수준과 관련이 있을 수 있음을 나타낸다. 이로부터, TRPV6은 인체의 다양한 종양과 밀접한 관련이 있으며 세포 내 및 세포 외의 칼슘 이온 농도 변화를 조절하는 것과 관련이 있을 수 있다는 것을 알 수 있다.
TRPV6은 종양 세포 마커로서 그에 대한 검출은 병리학적 진단과 상응한 표적 약물 사용에 모두 중요한 의미가 있다. 현재, 시중에는 진단 용도로 사용할 수 있는 항TRPV6 항체가 없으며 본 특허에 관련된 항체는 이 방면의 공백을 메울 수 있다.
본 출원의 일 양태는 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 3개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3; SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는HCDR3; 또는 SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄가변 영역; SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함된 3개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3; SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3; SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3 개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3; SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3; SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 3 개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역VH을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역VL을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 VH 및 경쇄 가변 영역 VL을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질을 특이적으로 인식하거나 이에 결합한다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질의 Kd 값은 10-7-10-10 M이다. 일부 실시형태에서, 상기 Kd 값은 10-7-10-10 M, 10-8-10-10 M, 또는 10-9-10-10 M이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질의 Kd 값은 약 10-7M 미만이다. 일부 실시형태에서, 상기 Kd 값은 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만 또는 약 10-10 M 미만이다. 일부 실시형태에서, Kd 값은 표면 플라즈몬 공명 방법에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 상기 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv, 또는 dAb에서 선택된다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 더 가진다. 일부 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1 또는 마우스의 IgG2a로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합 부분을 더 가진다. 일부 실시형태에서, 상기 접합 부분은 치료제, 방사성 동위원소, 검출 가능한 태그, 약물 동태학적으로 변형된 부분 또는 정제된 부분이다. 상기 접합 부분은 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 31로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 32로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 32와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 33으로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 34로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 35로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 35와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 더 제공한다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 제공한다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 다른 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이적 항체를 더 제공한다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 출원에 따른 다중 특이적 항체를 포함하는 항체 결합체를 더 제공한다.
일 양태에서, 본 출원은 항 TRPV6 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 더 제공하고, 상기 하이브리도마 세포주는 12CT9.5.1, 16CT4.1.1.2 및/또는 16CT18.1.1.2이며, 중국 전형적인 배양물 보존 센터에 보존되고, 여기서 12CT9.5.1의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202119이며, 16CT4.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202124이고, 16CT18.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202125이다.
일 양태에서, 본 출원은 또한 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 출원에 따른 단리된 핵산, 본 출원에 따른 벡터, 본 출원에 따른 숙주 세포, 본 출원에 따른 다중 특이적 항체 또는 본 출원에 따른 항체 결합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물을 제공한다.
일 양태에서, 본 출원은 피험자의 시료 중의 TRPV6을 분석 및 검출하기 위한 시약을 더 제공하고, 상기 시약은 본 출원에 따른 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시약은 피험자의 시료 중의 TRPV6을 분석 및 검출하는 데 사용된다.
일 양태에서, 본 출원은 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 (1) 상기 시료를 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; (2) 선택적으로 결합되지 않은 항체 또는 항체 단편을 제거하는 단계; 및 (3) 상기 시료 중의 TRPV6에 결합된 항체 또는 항체 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (1)에서, 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 기판 상에 고정된다. 일부 실시형태에서, 피험자에서 유래된 시료의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (1)에서, 상기 시료는 기판 상에 고정된다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (3)에서, 제2 항체를 사용하는 것을 더 포함하고, 선택적으로, 상기 제2 항체는 상기 시료 중의 TRPV6에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있고, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프와 상이하며, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프와 동일하고, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프와 TRPV6의 결합은 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 영향을 받지 않으며, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피터프와 TRPV6의 결합은 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 영향을 받는다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (3)에서, 제2 항체를 사용하는 것을 더 포함하고, 선택적으로, 상기 제2 항체는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있으며, 선택적으로, 상기 제2 항체는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 불변 영역 부분에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 제2 항체는 검출 분자에 결합되고, 선택적으로, 상기 검출 분자는 효소, 형광 마커 및 비오틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 효소이고, 선택적으로, 상기 효소는 겨자무과산화효소, 알칼리포스파타제 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 플루오레세인이고, 선택적으로, 상기 플루오레세인은 FITC, 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린 또는 Dylight를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 비오틴 또는 이의 유도체이다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법은, 상기 시료 중의 TRPV6에 결합하는 항체를 정량하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 면역조직화학(IHC), 면역형광(IF), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 화학발광면역측정법(CLIA, chemiluminescent immunoassay), 탁도 면역분석(TIA, Turbidimetric immunoassay) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot)이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 시료 중 세포 표면에서 TRPV6 를 발현하는 세포의 비율을 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법에서, 상기 피험자는 인간이다.
일 양태에서, 본 출원은 피험자 질병의 형성 또는 형성된 위험을 판단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 또는 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 반응을 예측 또는 모니터링하는 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 본 출원에서 따른 상기 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법으로 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 피험자 질병의 형성 또는 형성되는 위험을 판단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 또는 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 반응을 예측하거나 모니터링하는 방법은, 상기 시료 중 세포 표면에서 TRPV6을 발현하는 세포의 비율을 평가하는 단계를 더 포함하고, 상기 비율이 소정의 임계값을 초과하면, 상기 피험자는 상기 질병을 앓고 있거나 치료로부터 이득을 얻을 가능성이 더 높은 것으로 간주되며, 상기 임계값은 10%이다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 표적 약물 요법이다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 질병은 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 식도암, 폐암, 장암, 췌장암이다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 선택적으로 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 TRPV6의 결합 상황을 검출하기 위한는 시약을 더 포함하는 키트를 더 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 키트는 피험자 질병의 형성 또는 형성되는 위험을 진단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 반응을 예측하거나 모니터링하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 키트는 면역 조직 화학적 병리 진단에 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 키트는 종양 조직의 면역 조직 화학적 병리 진단에 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 질병은 암이고, 일부 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 식도암, 폐암, 장암, 췌장암이다.
일 양태에서, 본 출원은 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 (1) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 벡터 단백질에 결합시켜 TRPV6 항원 펩티드를 얻는 단계; (2) 단계(1)에 의해 얻은 상기 TRPV6 항원 펩티드를 면역원으로서 마우스를 면역시키는 단계; (3) 세포 융합 및 면역 펩티드 클론 스크리닝에 의해 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 높은 효율로 분비하는 양성 하이브리도마 세포계를 획득하는 단계; (4) TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 획득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 단백질이다.
일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 하나의 Cys를 추가하고 유리 설프히드릴기를 통해 상기 벡터 단백질에 결합된다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 하이브리도마 세포계는 마우스 하이브리도마 세포계 12CT 9.5.1, 16CT 18.1.1.2 및 16CT 4.1.1.2이다.
일 양태에서, TRPV6 수준과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단에 사용되는 약물에서 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 출원에 따른 단리된 핵산, 본 출원에 따른 벡터, 본 출원에 따른 숙주 세포, 본 출원에 따른 다중 특이적 항체, 본 출원에 따른 항체 결합체 및 본 출원에 따른 약물 조성물의 용도를 더 제공한다.
일 양태에서, 본 출원은 질병을 치료, 예방 또는 진단하는 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 필요한 피험자에게 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 출원에 따른 다중 특이적 항체, 본 출원에 따른 항체 결합체 및 본 출원에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
도면은 본 출원의 특정 양태를 더욱 상세히 설명하기 위해 본 명세서의 일부를 구성한다. 본 출원에 제시된 특정 실시형태에 대한 상세한 설명과 함께 이러한 도면 중 하나 이상을 참조함으로써 본 출원을 더 잘 이해할 수 있다.
도 1A는 CB-항-0001이 면역세포화학을 통해 TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포 중의 TRPV6 단백질을 특이적으로 검출할 수 있고(왼쪽 도면), 비-TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포에서 TRPV6 단백질이 검출되지 않은 것을 나타낸다(오른쪽 도면). 도 1B는 CB-항-0002가 면역세포화학을 통해 TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포 중의 TRPV6 단백질을 특이적으로 검출할 수 있고(왼쪽 도면), 비-TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포에서 TRPV6 단백질이 검출되지 않은 것을 나타낸다(오른쪽 도면). 도 1C는 CB-항-0003이 면역세포화학을 통해 TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포 중의 TRPV6 단백질을 특이적으로 검출할 수 있고(왼쪽 도면), 비-TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포에서 TRPV6 단백질(오른쪽 도면)이 검출되지 않은 것을 나타낸다.
도 2A는 CB-항-0001 항체의 면역 조직 화학적 검출 결과를 나타낸다. 도 2B는 CB-항-0002 항체의 면역 조직 화학적 검출 결과를 나타낸다. 도 2C는 CB-항-0003 항체의 면역 조직 화학적 검출 결과를 나타낸다.
도 3은 인간 방광 이행 세포 유두종 세포(RT4)에 대한 ACC-028 항체, MABN839 항체 및 CB-항-0001 항체의 IHC 비교 결과 실험을 나타낸다. 여기서, 도 3A는 ACC-028 항체의 IHC 결과이고, 도 3B는 MABN839 항체의 IHC 결과이며, 도 3C는 CB-항-0001 항체의 IHC 결과이다. 도 3C에서 세포막이 선명하고 뚜렷한 염색 효과가 있는 것을 볼 수 있다.
도 4는 상이한 조건에서 보관된 항체의 조직 염색 강도 및 염색 비율에 현저한 변화가 없음을 나타낸다. 여기서, 도 4A는 4°C에서 14일간 보관된 CB-항-0001 항체 원액의 IHC 결과이고, 도 4B는 37°C에서 14일간 보관된 CB-항-0001 항체 원액의 IHC 결과이며, 도 4C는 37°C에서 14일간 보관된 CB-항-0001 항체 작업 용액의 IHC 결과이다.
발명의 상세한 설명
이하의 설명은 본 출원의 다양한 실시형태를 설명하기 위한 것일 뿐이다. 따라서, 여기서의 구체적인 실시형태는 본 출원의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다. 당업자는 본 발명의 취지와 본 명세서의 설명에 기반하여 다양한 균등 방식 및 수정을 쉽게 얻을 수 있으며, 이러한 균등 실시형태가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 본 출원에 인용된 공개 출판물, 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 문헌은 본 출원에 전체적으로 참조되어 통합되어 있다.
문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 단수 형태 "일", "하나", "한 가지" 및 "이" 또는 "상기"는 복수 참조를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 "포괄", "포함", "함유" 및 "있음"과 같은 용어는 포괄적이거나 개방적이며 추가적이거나 서술되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 본 출원에서 사용된 용어 "......로 구성되다"는 폐쇄형이다.
출원인은 하이브리도마 세포주(계) 12CT9.5.1, 16CT4.1.1.2 및 16CT18.1.1.2는 중국 전형적인 배양물 보존 센터에 제출하여 기탁하였다. 12CT9.5.1의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202119이고, 16CT4.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202124이며, 16CT18.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202125이고, 세 개의 트리하이브리도마 세포주의 보존 주소는 중국 우한대학교이며, 보존 시간은 2021년 1월 13일이고, 기탁 기관는 중국 전형적인 배양물 보존 센터이다.
본 출원의 일 양태는 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 개시하고, 여기서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 3개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3; SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는HCDR3; 또는 SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 포함하는 본 출원의 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄가변 영역; SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함된 3개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 본출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3; SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3; SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3 개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역VH을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄 가변 영역; SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄가변 영역; 또는 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역VL을 더 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역을 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "항체"는 임의의 면역글로불린, 단일 클론 항체, 다가 항체, 다중 특이적 항체 또는 이중 특이성(2가) 항체를 포함한다. 천연적인 완전한 항체는 이황화 결합에 의해 서로 결합된 두 가닥의 중쇄와 두 가닥의 경쇄를 포함한다. 항체의 각 중쇄는 하나의 가변 영역(VH) 및 제1 불변 영역, 제2 불변 영역 및 제3 불변 영역(각각 CH1, CH2 및 CH3)으로 구성되며, 항체의 각 경쇄는 하나의 가변 영역(VL) 및 하나의 불변 영역(CL)로 구성된다. 경쇄와 중쇄의 가변 영역은 항원 결합을 담당한다. 각 사슬의 가변 영역은 크게 상보적 결정 영역(CDR)이라고 하는 3개의 초가변 영역으로 세분화된다(여기서, 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2, LCDR3을 포함하고, 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2, HCDR3을 포함한다).
본 출원에서 사용되는 항체의 "항원 결합 단편", 항체의 "항원 결합 부분" 등은 천연적으로 존재하는, 효소 촉진으로 얻을 수 있는, 합성되거나 유전자 조작된 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드는 항원과 특이적으로 결합하여 복합체를 형성한다. 항체의 항원 결합 단편은 예를 들어, 임의의 적합한 표준 기술을 사용하여 완전한 항체 분자에서 유도될 수 있으며, 상기 적합한 표준 기술은 예를 들어, 단백질 가수분해 소화 또는 코딩 항체 가변 구조 도메인과 선택적인 불변 도메인의 DNA를 조작하고 발현하는 재조합 유전자 공학 기술일 수 있다. DNA는 화학적 방법 또는 분자생물학 기술을 사용하여 시퀀싱 및 조작할 수 있으며, 예를 들어 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 구조로 배열하거나 코돈을 도입하여 시스테인 잔기를 생성하고, 아미노산을 변형, 추가 또는 삭제한다. 항원 결합 단편의 비제한적인 실예에는, (i) Fab 단편; (ii) F(ab')2 단편; (iii) Fd 단편; (iv) Fv 단편; (v) 단일 사슬 Fv(scFv) 분자; (vi) dAb 단편; 및 (vii) 항체의 초가변 영역을 모방하는 아미노산 잔기로 구성된 최소 인식 단위(예를 들어, CDR3 펩티드와 같은 단리된 상보적 결정 영역(CDR)) 또는 FR3-CDR3-FR4 펩티드를 포함한다. 도메인 특이적 항체, 단일 도메인 항체, 도메인 결핍 항체, 키메라 항체, CDR 이식 항체, 디아바디(diabody), 트리바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 미니바디(minibody), 나노바디(nanobody)(예를 들어, 1가 나노 항체, 2가 나노 항체 등), 소모듈화 면역약물(SMIP) 및 상어 변이체 IgNAR 구조 도메인과 같은 다른 조작 분자도 본 명세서에 사용되는 "항원 결합 단편" 표현에 포함된다.
본 출원에 개시된 항체 및 항원 결합 단편의 CDR 경계는 Kabat, Chothia 또는 Al-Lazikani 명명법에 의해 명명되거나 인식될 수 있다 (Al-Lazikani, B., Chothia, C., Lesk, A. M., J. Mol. Biol., 273(4), 927 (1997); Chothia, C 등, J Mol Biol. Dec 5; 186(3):651-63 (1985); Chothia, C. 및 Lesk, A.M., J.Mol.Biol., 196, 901 (1987); Chothia, C 등, Nature. Dec 21-28; 31(6252): 877-83 (1989); Kabat E.A. 등, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). 일부 실시형태에서, Kabat 데이터베이스에 따라 항체의 CDR 경계를 결정한다. 세 개의 CDR은 프레임워크 영역(FR, 여기서 중쇄 FR은 HFR1, HFR2, HFR3 및 HFR4를 포함하고 경쇄 FR은 LFR1, LFR2, LFR3 및 LFR4를 포함)으로 알려진 측면 연속 부분으로 이격되고, 프레임워크 영역은 CDR보다 더욱 보존적이며 초변성 고리를 지지하는 스캐폴드를 형성한다. 따라서 VH와 VL은 각각 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 배열된 3개의 CDR과 4개의 FR(인간 아미노산 잔기 N-말단에서 C-말단까지)을 포함한다. 중쇄와 경쇄의 불변 영역은 항원 결합에는 관여하지 않지만 다양한 효과 기능을 나타낸다. 포유 동물 중쇄는 α, δ, ε, γ 및 μ로 분류되고 포유 동물 경쇄는 λ 또는 κ로 분류된다. 항체는 이의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열과 각각 α, δ, ε, γ 및 μ의 존재 유무에 따라 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 다섯 가지 주요 클래스로 분류된다. 항체의 몇 가지 주요한 서브클래스는 IgG1(γ1 중쇄), IgG2(γ2 중쇄), IgG3(γ3 중쇄), IgG4(γ4 중쇄), IgA1(α1 중쇄) 또는 IgA2(α2 중쇄)와 같이 분류된다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질을 특이적으로 인식하거나 이에 결합한다.
SEQ ID NO: 2：MGPLQGDGGPALGGADVAPRLSPVRVWPRPQAPKEPALHPMGLSLPKEKGLILCLWSKFCRWFQRRESWAQSRDEQNLLQQKRIWESPLLLAAKDNDVQALNKLLKYEDCKVHQRGAMGETALHIAALYDNLEAAMVLMEAAPELVFEPMTSELYEGQTALHIAVVNQNMNLVRALLARRASVSARATGTAFRRSPCNLIYFGEHPLSFAACVNSEEIVRLLIEHGADIRAQDSLGNTVLHILILQPNKTFACQMYNLLLSYDRHGDHLQPLDLVPNHQGLTPFKLAGVEGNTVMFQHLMQKRKHTQWTYGPLTSTLYDLTEIDSSGDEQSLLELIITTKKREARQILDQTPVKELVSLKWKRYGRPYFCMLGAIYLLYIICFTMCCIYRPLKPRTNNRTSPRDNTLLQQKLLQEAYMTPKDDIRLVGELVTVIGAIIILLVEVPDIFRMGVTRFFGQTILGGPFHVLIITYAFMVLVTMVMRLISASGEVVPMSFALVLGWCNVMYFARGFQMLGPFTIMIQKMIFGDLMRFCWLMAVVILGFASAFYIIFQTEDPEELGHFYDYPMALFSTFELFLTIIDGPANYNVDLPFMYSITYAAFAIIATLLMLNLLIAMMGDTHWRVAHERDELWRAQIVATTVMLERKLPRCLWPRSGICGREYGLGDRWFLRVEDRQDLNRQRIQRYAQAFHTRGSEDLDKDSVEKLELGCPFSPHLSLPMPSVSRSTSRSSANWERLRQGTLRRDLRGIINRGLEDGESWEYQI
일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가지는 단백질의 Kd 값은 10-7-10-10 M이다. 일부 실시형태에서, 상기 Kd 값은 10-7-10-10 M, 10-8-10-10 M, 또는 10-9-10-10 M이다. 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질의 Kd 값은 약 10-7M 미만이다. 일부 실시형태에서, 상기 Kd 값은 약 10-7 M 미만, 약 10-8 M 미만, 약 10-9 M 미만 또는 약 10-10 M 미만이다. 일부 실시형태에서, Kd 값은 표면 플라즈몬 공명 방법에 의해 측정된다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv 또는 dAb로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역을 더 갖는다. 일부 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1 또는 마우스의 IgG2a로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 본 출원의 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한 접합 부분을 더 갖는다. 일부 실시형태에서, 상기 접합 부분은 치료제, 방사성 동위원소, 검출 가능한 태그, 약물 동태학적으로 변형된 부분 또는 정제된 부분이다. 상기 접합 부분은 직접 연결되거나 링커에 의해 연결된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "치료제"는 피험자의 질병을 치료 또는 예방하기 위한 임의의 약물 화합물일 수 있으며, 분자량이 500 미만의 소분자, 뉴클레오티드(예를 들어, DNA, 플라스미드 DNA, RNA, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 압타머 등), 짧은 펩티드, 단백질(효소 등)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 방사성 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 32P, 33P, 35S, 45Ti, 47Sc, 52Fe, 59Fe, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 67Ga, 68Ga, 75Sc, 77As, 86Y, 89Sr, 89Zr, 90Y, 90Nb, 94Tc, 99Tc, 99Mo, 105Pd, 105Rh, 111Ag, 111In, 123I, 124I, 125I, 131I, 133Xe, 142Pr, 143Pr, 149Pm, 153Sm, 154Gd, 155Gd, 156Gd, 157Gd, 158Gd, 161Tb, 166Dy, 169Er, 175Lu, 177Lu, 186Re, 188Re, 189Re, 194Ir, 198Au, 199Au, 211At, 211Pb, 212Bi, 212Pb, 213Bi, 223Ra 및 225Ac로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에 사용되는 용어 "검출 가능한 태그"는 본 발명의 항체에 직접 또는 간접적으로 결합되는 동시에, TRPV6 수준의 검출에 적합하거나 도움이 되는 임의의 검출 분자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 효소, 형광 마커 및 비오틴을 포함한다. 상기 효소는 과산화효소(예를 들어, 겨자무 과산화효소), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 당 산화효소, 우레아제, 헤테로사이클릭 산화효소(예를 들어, 크산틴 산화효소), 말산 탈수소효소 또는 이들의 유도체를 포함한다. 상기 형광 마커는 플루오레세인일 수 있으며, 선택적으로, 상기 플루오레세인은 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린, 녹색 형광 단백질(GFP), Dylight, Cy3 또는 Cy5를 포함한다.
다른 양태에서, 본 출원은 또한 본 출원에 따른 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산을 개시한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 31로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 32로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 32와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 33으로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 34로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 모두를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 핵산은 SEQ ID NO: 35로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 35와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 6으로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터를 더 개시한다.
다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포를 더 개시한다.
다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 다른 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이적 항체를 더 개시한다.
다른 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 본 출원에 따른 다중 특이적 항체를 포함하는 항체 결합체를 더 개시한다.
다른 양태에서, 본 출원은 항TRPV6 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주를 개시하고, 상기 하이브리도마 세포주는 12CT9.5.1, 16CT4.1.1.2 및/또는 16CT18.1.1.2로서 중국 전형적인 배양물 보존 센터에 보존되며, 여기서 12CT9.5.1의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202119이고, 16CT4.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202124이며, 16CT18.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202125이다.
다른 양태에서, 본 출원은 또한 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 출원에 따른 단리된 핵산, 본 출원에 따른 벡터, 본 출원에 따른 숙주 세포, 본 출원에 따른 다중 특이적 항체 또는 본 출원에 따른 항체 결합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물을 개시한다.
본 출원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 합리적인 의학적 판단 내에서 부적절한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 기타 동물 세포와의 접촉에 적합하고 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 것을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 본 명세서에 제공된 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체를 피험자에게 전달하기 위한 약학적으로 허용 가능한 용매, 현탁제 또는 임의의 다른 약학적으로 불활성인 매개를 의미하며, 이는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체의 구조, 형태 및 특성을 방해하지 않는다. 일부 이러한 담체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체를 피험자의 경구 섭취를 위한 정제, 알약, 캡슐제, 액체, 겔제, 시럽제, 페이스트, 현탁제 및 파스틸(pastilles) 등으로 조제할 수 있다. 일부 이러한 담체는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체를 주사, 주입 또는 국소 투여용 제제으로 조제할 수 있다.
본 출원에 제공된 약물 조성물에 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체는 예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 액체, 겔 또는 고체 담체, 수성 담체(예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 등장성 덱스트로스 주사액, 멸균수 주사액 또는 덱스트로스 및 젖산 링거 주사액), 비수성 담체(예를 들어, 식물성 고정유, 목화씨유, 옥수수유, 참기름 또는 땅콩유), 항미생물제, 등장제(예를 들어, 염화나트륨 또는 덱스트로스), 완충제(예를 들어, 인산 또는 구연산 완충제), 항산화제(예를 들어, 황산 수소 나트륨), 마취제(예를 들어, 염산프로카인), 현탁제/분산제(예를 들어, 카르복시메틸셀룰로오스 나트륨, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 또는 폴리비닐피롤리돈), 킬레이트제(예를 들어, EDTA(에틸렌디아미네테트라아세트산) 또는 EGTA(에틸렌글리콜테트라아세트산)), 유화제(예를 들어, 폴리소르베이트 80(Tween-80)), 희석제, 좌제, 부형제 또는 무독성 보조 물질, 본 분야에서 공지된 다른 성분 또는 이의 다양한 조합이 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 성분은 충진제, 접착제, 완충제, 방부제, 윤활제, 풍미제, 증점제, 착색제 또는 유화제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약물 조성물은 주사용 제제이다. 주사용 제제는 멸균 수용액 또는 분산제, 현탁제 또는 에멀젼을 포함한다. 모든 경우에, 주사용 제제는 멸균되어야 하며 주사하기 편리하도록 유체여야 한다. 주사용 제제는 생산과 보관 조건에서 안정적이어야 하며 박테리아 및 진균 등 미생물에 의한 오염을 방지해야 한다. 담체는 물, 에탄올, 폴리알코올(예를 들어, 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적절한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 주사용 제제는 적절한 유동성을 유지해야 한다. 예를 들어 레시틴과 같은 코팅제를 사용하거나 계면활성제 등을 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 미생물 억제는, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살과 같은 다양한 항세균제와 항진균제에 의해 구현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약물 조성물은 경구용 제제이다. 경구용 제제는 캡슐, 카시에(cachets), 알약, 정제, 타블렛(조미 기질을 사용하며, 일반적으로 자당 및 아라비아 고무 또는 트라가칸트 고무 사용), 분말, 과립제, 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액제 또는 현탁제, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르제 또는 시럽, 또는 파스틸(젤라틴 및 글리세린, 또는 자당 및 아라비아 고무와 같은 불활성 기질을 사용) 및/또는 가글제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
경구 투여용 고체 제형(예를 들어, 캡슐, 정제, 알약, 당의정, 산제, 과립제 등)에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체를 구연산나트륨 또는 인산수소디칼슘과 같은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 (1) 전분, 유당, 자당, 포도당, 만니톨 및/또는 규산과 같은 충전제 또는 증량제; (2) 카르복시메틸셀룰로오스, 알지네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 자당 및/또는 아라비아 고무와 같은 접합제; (3) 글리세린과 같은 보습제; (4) 한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 규산염 및 탄산나트륨과 같은 붕괴제; (5) 파라핀과 같은 용액 차단제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카올린 및 벤토나이트와 같은 흡수제; (9) 활석, 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 고체 폴리에틸렌글리콜, 소듐라우릴설페이트 및 이들의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제 중 어느 하나와 혼합한다.
경구 투여용 액체 제형에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체를 약학적으로 허용 가능한 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁제, 시럽 및 엘시르제 중 임의의 하나와 혼합한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 단리된 핵산, 벡터, 숙주 세포, 다중 특이적 항체 또는 항체 결합체 외에도, 액체 제형은 본 분야에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조 에이트, 이소프로판올, 1,3-부탄디올, 오일(특히는 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 올리브유, 피마자유, 참기름), 글리세린, 테트라히드로푸르푸릴알코올, 폴리에틸렌글리콜 및 탈수 소르비톨 지방산 에스테르 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 외에도, 경구용 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 풍미제, 착색제, 향미 증진제 및 방부제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 약물 조성물은 구강 스프레이 제제 또는 비강 스프레이 제제이다. 스프레이 제제는 수성 에어로졸, 비수성 현탁제, 리포좀 제제 또는 고체 과립 제제 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 수성 에어로졸은 약제의 수용액 또는 현탁제를 통상적으로 약학적으로 허용 가능한 담체 및 안정제와 혼합하여 제조한다. 담체와 안정제는 특정 약물 성분의 요구 사항에 따라 변경되지만 일반적으로 비이온성 계면활성제(트윈 또는 폴리에틸렌 글리콜), 올레인산, 레시틴, 아미노산(예를들어, 글리신), 완충액, 염, 당 또는 당알코올 등을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장액으로 제조되며 스프레이를 통해 전달될 수 있다.
일부 실시형태에서, 약물 조성물은 한 가지 이상의 다른 약물과 혼합하여 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 조성물은 적어도 한 가지의 다른 약물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 다른 약물은 항종양약, 심장 혈관용 약, 항염증약, 항바이러스약, 소화계 약, 신경계 약, 호흡계 약, 면역계 약, 피부병 약, 대사 약 등이다.
일부 실시형태에서, 경구, 주사(예를 들어, 정맥 내, 근육 내, 피하, 피내, 심장 내, 척수강 내, 흉막 내, 복막 내 주사 등), 점막(예를 들어, 비강 내, 구강 내 투여 등), 설하, 직장, 경피, 안구 내 및 폐 투여를 포함하되 이에 제한되지 않는 적절한 경로를 통해 필요한 피험자에게 약물 조성물을 투여할 수 있다. 일부 실시형태에서, 약물 조성물은 정맥 내, 피하, 경구, 근육 내 또는 심실 내로 투여될 수 있다.
다른 양태에서, 본 출원은 또한 피험자의 시료 중의 TRPV6을 분석하고 검출하기 위한 시약을 개시하고, 상기 시약은 본 출원에 따른 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 시약은 피험자의 시료 중의 TRPV6을 분석 및 검출하는 데 사용된다.
다른 양태에서, 본 출원은 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법을 더 개시하고, 상기 방법은 (1) 상기 시료을 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 접촉시키는 단계; (2) 선택적으로 결합되지 않은 항체 또는 항체 단편을 제거하는 단계; 및 (3) 상기 시료 중의 TRPV6에 결합된 항체 또는 항체 단편을 검출하는 단계를 포함한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "검출"은 분자(예를 들어, 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 분자)의 존재 유무를 결정하고 측정하거나, 단백질-단백질 상호작용(예를 들어, 항체와 항원 사이의 상호작용), 단백질-핵산 상호작용 또는 핵산-핵산 상호작용과 같은 분자 간의 상호작용(예를 들어, 결합, 작용(agonizing) 또는 길항 등 작용)을 결정하고 측정하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, "검출" 및 "측정"은 정량적 검출 및 측정을 포함한다. 일부 실시형태에서, 검출은 항체에 직접 또는 간접적으로 결합된 검출 분자의 신호를 결정하고 측정함으로써 수행된다. 검출은 당업자에게 익숙한 방법에 의해 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 검출은 면역조직화학(IHC), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 면역형광(IF), 화학발광면역측정법(CLIA), 탁도 면역분석(TIA) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot)을 사용하여 수행된다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (1)에서, 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편은 기판 상에 고정된다. 일부 실시형태에서, 피험자에서 유래된 시료의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (1)에서, 상기 시료는 기판 상에 고정된다. 일부 실시형태에서, 시료는 세포 또는 조직이다. 시료는 세포 원심분리 제조물, 세포학적 스미어, 코어 생검, 가는 바늘 천자 및/또는 조직 절편(예를 들어, 크라이오스탯 조직 절편, 파라핀 포매 조직 절편)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 일부 실시형태에서, 시료는 살아있는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시료는 종양 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 화학적 고정제를 사용하여 상기 고정을 수행한다. 조직학적 시료는 가교된 고정제(예를 들어, 포름알데히드, 파라포름알데히드 및 글루타르알데히드를 포함하는 알데히드)를 사용하여 제조될 수 있다. 조직 시료는 포름알데히드로 고정하고 파라핀에 포매할 수 있다. 또한 파라포름알데히드를 사용하여 고정하여 온도에 민감한 저온 재료에 포매하고 액체 질소로 급속 냉동할 수 있다. 다른 종류의 화학적 고정제는 산화제 및 알코올 고정제를 포함한다. 물리적 방법으로 고정할 수도 있다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (3)에서, 제2 항체를 사용하는 것을 더 포함하고, 선택적으로, 상기 제2 항체는 상기 시료 중의 TRPV6에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있고, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프와 상이하며, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프와 동일하고, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프와 TRPV6의 결합은 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 영향을 받지 않으며, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피터프와 TRPV6의 결합은 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 영향을 받는다.
본 출원에 사용되는 용어 "에피토프"는 항체 분자의 가변 영역 중의 특정 항원 결합 부위(상보적 부위라고 함)와 상호 작용하는 항원 결정자를 의미한다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 따라서, 상이한 항체는 하나의 항원의 상이한 영역에 결합할 수 있으며 상이한 생물학적 효과를 가질 수 있다. 에피토프는 입체 에피토프 또는 선형 에피토프일 수 있다. 입체 에피토프는 공간적으로 병렬된 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 세그먼트의 아미노산을 통해 생성된 것이다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬의 인접한 아미노산 잔기에 의해 생성되는 에피토프이다. 일부 실시형태에서, 에피토프는 항원의 당, 포스포릴 또는 설포닐 부분을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법의 단계 (3)에서, 제2 항체를 사용하는 것을 더 포함하고, 선택적으로, 상기 제2 항체는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있으며, 선택적으로, 상기 제2 항체는 본 출원에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 불변 영역 부분에 결합할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "제2 항체"는 항TRPV6 항체를 더 잘 검출하는데 목적을 두고, 제2 항체는 일반적으로 상업적으로 구매할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 제2 항체는 검출 분자에 결합되며, 선택적으로 상기 검출 분자는 효소, 형광 마커 및 비오틴을 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 효소이며, 선택적으로, 상기 효소는 과산화효소(예를 들어, 겨자나무과산화효소), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 당 산화효소, 우레아제, 헤테로사이클릭 산화효소(예를 들어, 크산틴산화효소), 말산 탈수소효소 또는 이의 유도체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 플루오레세인이고, 선택적으로, 상기 플루오레세인은 FITC, 로다민, 텍사스 레드, 피코에리트린, GFP, Cy3, Cy5 또는 Dylight를 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 검출 분자는 비오틴 또는 이의 유도체이다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법은, 상기 시료 중의 TRPV6에 결합하는 항체를 정량하는 단계를 더 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 면역 조직 화학(IHC), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 면역 형광(IF), 화학발광면역측정법면역측정법(CLIA), 탁도 연역 분석(TIA) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot)이다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 상기 시료 중 세포 표면에서 TRPV6 를 발현하는 세포의 비율을 평가할 수 있다.
일부 실시형태에서, 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법에서, 상기 피험자는 인간이다.
일 양태에서, 본 출원은 피험자 질병의 형성 또는 형성된 위험을 판단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 또는 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 반응을 예측 또는 모니터링하는 방법을 더 개시하고, 상기 방법은 본 출원에서 따른 상기 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법으로 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 피험자 질병의 형성 또는 형성되는 위험을 판단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 또는 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 반응을 예측하거나 모니터링하는 방법은, 상기 시료 중 세포 표면에서 TRPV6을 발현하는 세포의 비율을 평가하는 단계를 더 포함하고, 상기 비율이 소정의 임계값을 초과하면, 상기 피험자는 상기 질병을 앓고 있거나 치료로부터 이득을 얻을 가능성이 더 높은 것으로 간주되며, 상기 임계값은 10%이다. 일부 실시형태에서, 상기 치료는 표적 약물 요법이다.
본 명세서에서 사용되는 문구 "이득을 얻는", "이익되는" 또는 "유익한"은 는 (1) 질병의 진행을 어느 정도 억제(예를 들어, 감소, 느리게 하거나 완전히 멈추게 하는 것)하고(속도를 늦추고 완전히 정체하는 것을 포함); (2) 질병의 발작 및/또는 증상 횟수를 감소시키며; (3) 병변의 크기를 축소하고; (4) 질병 세포가 인접한 주변 장기 및/또는 조직으로 침윤되는 것을 억제하며; (5) 질병이 전파하는 것을 억제하고; (6) 이 질병과 관련된 한 가지 이상의 증상을 어느 정도 완화하며; (7) 치료 후 질병이 나타나지 않는 시간이 길어지고; (8) 질병의 무진전 생존기와 같은 병변이 가라앉거나 풀리 수 있지만 반드시 그런 것은 아닌 자가면역 반응이 줄며; (9) 전체 생존율 증가하고; (10) 반응율이 더 높으며; 및/또는 (11) 치료 후 특정 시점에서 사망률이 감소되는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 임의의 원하는효과를 의미한다.
일부 실시형태에서, 치료에 대한 상기 피험자의 반응을 예측하거나 모니터링하는 것은 피험자의 종양이 경감 또는 가중 여부를 평가하는 것과 관련된다. 일부 실시형태에서, 상기 피험자의 치료에 대한 반응을 예측하거나 모니터링하는 것은, 피험자가 치료(예를 들어, 특정 약물을 이용한 치료)를 받은 후 호전 여부 및/또는 호전될 가능성 여부를 평가하는 것과 관련될 수 있다. 본 출원의 예측 또는 모니터링 방법은 임상적으로 치료 결정을 내리는 데 사용될 수 있다. 치료 방안(예를 들어, 특정 치료 약물 또는 조합의 투여, 수술 개입 등을 포함하는 특정 치료 방안)을 투여한 후, 본 출원의 예측 또는 모니터링 방법은 특정 피험자의 장기 생존 가능성을 평가하는 데 있어 가치 있는 도구이다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 질병은 암이다. 일부 실시형태에서, 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 식도암, 폐암, 장암, 췌장암이다. 일부 실시형태에서, 암은 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암 또는 결장 직장암이다.
일 양태에서, 본 출원은 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고, 선택적으로 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 TRPV6의 결합 상황을 검출하기 위한는 시약을 더 포함하는 키트를 더 개시한다.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 키트는 피험자 질병의 형성 또는 형성되는 위험을 진단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 반응을 예측하거나 모니터링하기 위해 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 키트는 면역 조직 화학적 병리 진단에 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 키트는 종양 조직의 면역 조직 화학적 병리 진단에 사용된다. 일부 실시형태에서, 상기 질병은 암이고, 일부 실시형태에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 식도암, 폐암, 장암, 췌장암이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 암은 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암 또는 결장 직장암이다.
일 양태에서, 본 출원은 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법을 더 제공하고, 상기 방법은 (1) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 벡터 단백질에 결합시켜 TRPV6 항원 펩티드를 얻는 단계; (2) 단계(1)에 의해 얻은 상기 TRPV6 항원 펩티드를 면역원으로서 마우스를 면역시키는 단계; (3) 세포 융합 및 면역 펩티드 클론 스크리닝에 의해 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 높은 효율로 분비하는 양성 하이브리도마 세포계를 획득하는 단계; (4) TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 획득하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터 단백질은 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH) 단백질이다.
일부 실시형태에서, SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N-말단에 하나의 Cys를 추가하고 유리 설프히드릴기를 통해 상기 벡터 단백질에 결합된다.
SEQ ID NO: 3: PLKPRTNNRTSPRDNTLLQQKLLQEAYMTPK.
일부 실시형태에서, 본 출원에 따른 하이브리도마 세포계는 마우스 하이브리도마 세포계 12CT 9.5.1, 16CT 18.1.1 또는 16CT 4.1.1.2이다. 여기서, 세포계 12CT 9.5.1에서 생성된 항체는 CB-항-0001 항체를 포함하고, 세포계 16CT 4.1.1.2에서 생성된 항체는 CB-항-0002 항체를 포함하며, 세포계 16CT 18.1.1에서 생성된 항체는 CB-항-0003 항체를 포함한다.
다른 양태에서, 본 출원은 TRPV6와 관련된 질병의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단을 위한 약물에서 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 출원에 따른 다중 특이적 항체, 본 출원에 따른 항체 결합체 및 본 출원에 따른 약물 조성물의 용도를 더 개시한다.
일 양태에서, 본 출원은 질병을 치료, 예방 또는 진단하는 방법을 더 개시하고, 상기 방법은 필요한 피험자에게 본 출원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 본 출원에 따른 다중 특이적 항체, 본 출원에 따른 항체 결합체 및 본 출원에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
실시예
아래의 실시예는 본 발명을 보다 잘 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해해서는 아니 된다. 아래에 설명된 모든 특정 조성물, 재료 및 방법은 그 전체 또는 일부가 모두 본 발명의 범위 내에 있다. 이러한 특정 조성물, 재료 및 방법은 본 발명을 한정하기 위한 것이 아니라 특정 실시형태가 본 발명의 범위 내에 있음을 설명하기 위한 것이다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 진보성을 추가하지 않고 동등한 조성물, 재료 및 방법을 개발할 수 있다. 본 발명의 방법에 대한 다양한 수정이 본 발명의 범위 내에 여전히 포함될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명자는 이러한 수정을 본 발명의 범위 내에 포함시킬 계획이다.
실시예 1 항원 폴리펩티드의 합성 및 재조합 항원의 제조
1. 항원성 폴리펩티드 선택
Uniprot 및 Genbank에서 등록 번호가 Q9H1D0 및 GI: 1918017293인 단백질 서열(예를 들어, SEQ ID NO : 2에 표시됨)에 대해 서열 및 2단계 구조 분석을 수행한다. 상기 TRPV6 단백질의 전체 길이는 765 개의 아미노산이며 분자량은 약 87 kDa 정도이다. 온라인 서버 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/를 통해 상기 단백질의 2단계 구조와 표면 접근성(Surface Accessibility) 매개변수를 예측하고, 이의 항원성 지수에 대한 분석 결과를 통해 아미노산 서열 IFQTEDPEELGHF(SEQ ID NO: 4), DGPANYNVDLPF(SEQ ID NO: 5) 또는 PLKPRTNNRTSPRDNTLLQQKLLQEAYMTPK(SEQ ID NO: 3)을 항원으로 선택하여 화학적으로 합성한다. 결합을 용이하게 하기 위해 상기 폴리펩티드의 아미노 말단에 시스테인을 첨가하여 설프히드릴기를 제공하는 데 사용하였다.
2. 폴리펩티드의 결합 및 정제
Thermo Scientific의 말레아미드로 활성화된 키홀-림펫 헤모사이아닌 단백질 키트를 선택하고 키트에 제공된 절차에 따라 조작한다.
결합할 폴리펩티드의 경우, 먼저 폴리펩티드의 유리 설프히드릴기를 Ellman 시약으로 검출한다: Ellman 시약 스톡액 100 μL를 96웰 플레이트에 첨가한 다음 폴리펩티드 용액 10 μL를 첨가하고, Nano Drop 분광광도계를 사용하여 λ = 412 nm에서 이의 자외선 흡수값을 측정하되, OD값>0.15이면 다음 단계를 수행하고; OD 값<0.15 및 >0.05이면, 요구 사항에 도달할 때까지 폴리펩티드를 보충하며; OD값<0.05이면, 폴리펩티드 합성 단계로 돌아가서 다시 품질을 제어한다.
결합을 시작할 때, 각 mcKLH 패키지에 200 μL의 탈이온수를 첨가하여 10 mg/mL의 KLH 용액을 배합하고, 2 mg의 반항원을 500 μL의 Imject EDC 결합 완충액에 용해시키며, 500 μL의 폴리펩티드 용액을 200 μL의 벡터 단백질 용액에 첨가하였다. l mL 탈이온수를 포장된 EDC(10 mg)에 첨가하고 완전히 용해될 때까지 천천히 흔든 후 50 μL를 취하여 mcKLH 폴리펩티드 용액에 첨가하며, 2시간 동안 반응시킨 다음 탈염 컬럼을 통해 처리하여 결합되지 않은 가교제와 염류를 제거하였다.
실시예 2 하이브리도마 세포계의 구축
1. 면역
실시예 1에서 가교된 폴리펩티드를 프로인드 완전 보조제(freund's complete adjuvant)로 유화하여 4 내지 6주령의 암컷 Balb/c 마우스(베이징 워이퉁 레화 실험 동물 기술 유한회사에서 구입)에 60μg/마리의 조제량으로 마우스당 6개 점으로 복부 피하 주사하여 면역하였다. 14일마다 한 번씩 면역을 강화하고 항원은 30μg/마리의 조제량으로 프로인드 불완전 보조제로 유화하였다. 3차 면역강화 후 7 일간, 간접 ELISA (파장 450 nm)로 마우스의 혈청에서 항면역원의 다항역가를 검출하고, 역가가 가장 높은 마우스는 꼬리 정맥 주사로 충격면역시키며, 항원은 생리 식염수로 균일하게 혼합하고, 조제량은 50 μg/마리이다.
2. 세포 융합
면역 기준에 도달한 마우스의 비장 세포 현탁액을 제조하고 5:1 비율로 마우스 골수 종양 세포 F0에 혼합한 후 5분간 1500 rpm으로 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 원심분리 튜브를 37°C 워터배스에 넣고 PEG 1500(Roche사) 1mL를 1분 동안 천천히 첨가하면서 세포를 교반하였다. 온수에 1분간 정치한 후 무혈청의 IMDM(Sigma사) 10mL를 첨가하고, 균일하게 혼합한 후 1000 rpm으로 5분간 원심분리하였다. 상등액을 버린 후 혈청(PAA사) 10mL를 첨가하고 세포를 조심스럽게 불면서 10XHAT(Sigma사)를 혼합한 흉선세포 5 mL를 첨가하여 균일하게 혼합하였다. 2.1% 니트로셀룰로오스(Sigma사)를 함유한 반고체 배지 25 mL를 첨가하고 충분히 균일하게 혼합한 다음 20개의 세포 배양 접시에 균일하게 부어준다. 세포 배양 접시를 습식 박스에 넣고 37°C, 5%의 CO2 인큐베이터에서 배양한다.
3. 양성 하이브리도마 세포의 클론 및 ELISA 스크리닝
융합한 후 7일 동안, 클론 세포 덩어리의 크기와 밀도가 적당하고, 해부 현미경으로 둥글고 단단하며 큰 클론 덩어리 흡수하여 미리 준비된 배지가 있는 96 웰 배양 플레이트에 펀칭하고 37°C, 5%의 CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
3일 후, 세포의 양이 바닥 면적의 약 2/3를 차지하고 100 μL의 상등액을 취하여, 각각 면역원 및 합성 폴리펩티드를 사용하여 ELISA 스크리닝하였다. 양성 클론은 액체를 완전히 바꾸고, 배양 세포와 1%의 HT(Sigma사)가 포함된 완전한 배지를 200μL 첨가하였다. 2일 후 2차 ELISA 스크리닝을 수행하고, 양성 클론을 미리 준비된 배지(배양 세포 및 HT 포함)가 있는 24웰 플레이트에 옮겼다. 5일 후, 100μL의 상등액을 취하여 3차 ELISA 스크리닝을 수행하여 12CT 9.5.1, 16CT 18.1.1.2 및 16CT 4.1.1.2의 3주의 고역가의 양성 클론을 얻으며, 6웰 플레이트와 세포 배양 플라스크에 차례로 옮겨 확대 배양하여 동결 기탁하였다.
실시예 3 복수 유도법에 의한 단일 클론 항체 제조
1. 복수액 제조
대수 생장기 세포를 무혈청 배지로 세척하고 현탁시키며, 약 5x105/mL로 계수하고, 미리 파라핀 오일로 감작된 마우스에 l mL의 현탁된 세포를 복강 주사하였다. 7일 후에 복수액을 수집하기 시작하였다. 추출한 복수액을 4°C에서 10분간 4000 rpm으로 원심분리하였다. 중간 복수액을 조심스럽게 흡입하여 원심분리 튜브에 수집하고 4°C 또는 -20°C에서 보관하였다.
2. 단일 클론 항체의 정제
따라 Protein G(GE사) 친화층 크로마토그래피를 사용하여 지침에 복수액 중 항체를 정제하였다. 순도는 SDS-PAGE 겔로 감정하고 농도는 브래드 포드(Bradford) 방법으로 측정하였다. 정제된 항체는 -20°C에서 보관하였다.
실시예 4 단일 클론 항체 특성 감정
1. 서브타입 감정
코팅된 양-항-마우스 IgG를 100 mL의 MPBS(pH 7.4)를 사용하여 0.5 μg/mL로 희석하고 웰당 100 μL를 첨하가여 4°C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 액체를 비우고 0.05%의 Tween을 함유한 PBS로 3회 세척한 후, 웰당 200 μL의 차단 용액(2%의 BSA 및 3%의 자당을 함유한 PBS)을 첨가하여 37°C에서 1시간 동안 배양한 후 액체를 비우고 PBST로 3번 세척하였다. 각 웰에 하이브리도마 상등액 0.l mL를 첨가하고 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션한 후 액체를 비우고 PBST로 3번 세척하였다. HRP 표지된 양-항-마우스(κ, λ) 항체를 차단 용액에 1:1000으로 희석하거나 HRP 표지된 양-항-마우스(IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA) 항체를 1:2000으로 희석하여 웰당 0.l mL씩 적당한 웰에 첨가하여 37°C에서 l시간 동안 배양하고 액체를 비우며 PBST로 3번 세척하였다. 각 웰에 0.15%의 ABTS와 0.03%의 H2O2를 함유한 구연산 완충액(pH 4.0)을 50μL 첨가하여 발색 반응을 진행하고, 10분 내지 20분 내에 405 nm 파장에서의 OD를 측정하였다. 그 결과, 얻은 CB-항-0001 및 CB-항-0002 항체는 IgG1형 마우스 유래 단일 클론 항체이고, CB-항-0003 항체는 IgG2a형 마우스 유래 단일 클론 항체인 것으로 나타났다.
2. 친화성 상수 측정
먼저, 얻은 항-TRPV6 항체를 SPR 칩에 고정시킨 후, 1 x PBST를 희석액으로 면역 펩티드를 11.52 nM로 희석한 다음, 1.3배로 희석하여 마지막 하나의 농도는 4.04 nM이며, 총 5개의 농도 구배이다. 친화력 검출은 SPR 기기를 사용하여 수행되었으며, 기기의 자동 분석에 의해 CB-항-0001의 친화성 상수는 5.19x10-10으로 계산되었다.
3. 단일 항체의 반응 특이성 및 적용 효과
TRPV6 단백질로 형질감염시킨 293T 세포를 선택하여 본 발명의 단일 클론 항체의 인식 특이성을 면역세포화학적 방법으로 검출하였으며, 면역 세포 화학적 실험 과정은 다음과 같이 수행하였다: 293T 세포에 TRPV6 플라스미드를 형질감염시키고, 형질감염된 세포를 슬라이드(Slides)가 함유된 24 웰 플레이트에 분주한 후, IMDM+10%의 FBS 배지에서 세포를 72시간 동안 배양하고, 상등액을 제거하며, PBS로 1회 세척하고, 메탄올을 첨가하여 30초 동안 고정시킨 후, PBS로 2회 세척하였다. 항체 희석액으로 적당한 희석 비율에 따라 항-TRPV6 항체 작업액을 배합하고, 24 웰 플레이트 중의 PBS를 제거하며, 항체 작업 용액을 첨가하고, 4섭씨도에서 밤새 배양하며, PBS로 3 회 세척하고, 2차 항체(ElivisionTM plus Polyer HRP (마우스/토끼) IHC 키트, 푸저우 마이신 바이오 테크놀로지 개발 유한회사(Fuzhou Maixin Biotechnology Co., Ltd.,)에서 구입하고, 제품 번호 KIT-9903)를 적가하고, 실온에서 15분 내지 20분 인큐베이션한 후, PBS로 3X3분 헹구고(즉, 매번 3분간 지속되게 3번 헹굼), PBS를 털어내고 새로 배합한 DAB 발색액으로 3분 동안 발색시킨다. 25초 동안 헤마톡실린으로 재염색하고, 30초 동안 PBS로 블루로 리턴한다. 75%, 95%, 100% 및 100%의 알코올 구배에 따라 순차적으로 탈수하고, 마지막으로 자일렌으로 3분 동안 투명하게 하며 중성 생고무로 밀봉하였다.
도 1A 내지 1C에 도시된 바와 같이, CB-항-0001 항체, CB-항-0002 항체 및 CB-항-0003 항체는 각각 TRPV6 플라스미드로 형질감염된 293T 세포에서 면역세포화학으로 TRPV6 단백질을 특이적으로 검출할 수 있었으며, TRPV6 플라스미드가 이식되지 않은 293T 세포에서는 TRPV6 단백질이 검출되지 않았다. 이 결과는 얻은 항TRPV6 항체가 TRPV6 단백질을 특이적으로 인식할 수 있고, 즉 인식 특성을 가지고 있는 것을 나타낸다.
실시예 5 항체의 가변 영역의 서열 측정
배양된 하이브리도마 세포계를 1x106 취하여 원심분리하고, 상등액을 제거하며, 세포 침전물은 쑤저우 진웨이지 바이오테크놀로지 유한회사(GENEWIZ)에 위탁하여 아래에 나타낸 예시적인 항체 중쇄 가변 영역 서열 및 항체 경쇄 가변 영역 서열과 같은 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 측정하였다.
표 1 항체의 CDR 아미노산 서열

표 2 항체의 가변 영역 아미노산 서열


표 3 항체의 가변 영역을 코딩하는 핵산 서열



실시예 6 조직 절편의 염색 및 감정
1. 절편 제조 과정
조직 왁스 블록은 다듬은 후 두께를 5 μm로 설정하여 연속적으로 절편하고, 연속 절편을 45°C의 온수에서 전개하며, 양전자 탈락 방지 슬라이드에 절편을 에 붙이고, 실온에서 하룻 밤 동안 바람으로 건조시킨 후 -20℃에 넣어 장기 보관하였다.
2. IHC 염색 및 분석
일반적인 자일렌으로 매번 15분씩 두 번 탈랍하고 100%, 100%, 95% 및 75% 구배의 에탄올에서 각각 3분간 수화시킨 후 마지막으로 수돗물로 헹구었다. 항원 복구를 수행한 다음 절편을 습식 박스에 넣고 3X3분 동안 PBS로 헹구었다. 3%의 H2O2를 적가하여 10분간 배양하고 PBS로 3X3분간 헹구었다. PBS를 털어내고 차단 용액(동물 비면역 혈청)을 적가하여 실온에서 60분간 배양하였다. 절편을 건조시키고, 적당한 비율로 희석된 1차 항체를 적가하여 4°C에서 하룻밤 인큐베이션며, PBS로 3X3분간 헹구고, 2차 항체를 적가하고(ElivisionTM plus Polyer HRP(마우스/토끼) IHC 키트, 푸저우 마이신 바이오테크놀로지 개발 유한회사, 제품 번호 KIT-9903,), 실온에서 15분 내지 20분간 인큐베이션하며, PBS로 3X3분 동안 헹구고, PBS를 털어낸 후 새로 배합한 DAB 발색 용액으로 3분 동안 발색하였다. 25초 동안 헤마톡실린으로 재염색하고, 30초 동안 PBS로 블루로 리턴한다. 75%, 95%, 100% 및 100%의 알코올 구배에 따라 순차적으로 탈수하고, 마지막으로 자일렌으로 3분 동안 투명하게 하며 중성 생고무로 밀봉하였다.
3. 데이터 통계
도 2A 내지 2C에 도시된 바와 같이, CB-항-0001 항체, CB-항-0002 항체 및 CB-항-0003 항체는 각각 면역조직화학을 통해 조직 절편의 TRPV6 단백질을 검출할 수 있다.
또한, 발명자는 H-점수 채점법을 사용하여 종양 세포의 세포막 염색 상황을 기록하고, H-점수가 60 이상이면 강한 염색으로 기록하며, H-점수가 1점 내지 60이면 약한 염색으로 기록하고, 강한 염색과 약한 염색을 모두 양성으로 하고, H-점수가 0이면 음성으로 기록하였다. IHC에 의해 검출된 각 종양 조직에서 TRPV6의 수준을 각각 통계하고 TCGA 데이터베이스에서 TRPV6 mRNA 수준과 비교하여 검증하여 항체 특이성을 평가하였으며, 기록된 정보는 표 4에 나열되어 있다. 그 결과, 본 발명의 항체를 사용하여 TRPV6 단백질 수준을 검출한 결과, 양성률이 높은 (특히 강한 염색의 비율이 높은) 암 유형은 종양 게놈 지도 데이터베이스(the Cancer Genome Atlas Program, 즉TCGA 데이터베이스)에 대응하게 통계된 TRPV6 mRNA 수준(예를 들어 TPM > 1) 수준도 높은 것으로 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 항체를 사용하면 세포 표면에서 TRPV6의 발현 상황을 정확하게 평가할 수 있고, 따라서 검출되는 시료가 TRPV6을 발현하는 암세포인지 여부를 판단할 수 있는 것을 알 수 있다.
표 4 IHC에 의해 검출된 종양 조직 내 TRPV6 수준

실시예 7 IHC 비교 실험
시판 항체 "항-인간 TRPV6 (세포 외) 항체"(카탈로그 번호 ACC-028, Alomone Labs에서 구입, RRID: AB_2756545, 본 명세서에서 "ACC-028 항체"로 약칭됨), 항체 "항-TrpV6 항체, 클론 4A5.1"(카탈로그 번호 MABN839, Sigma-Aldrich사에서 구입, 본 명세서에서 "MABN839 항체"로 약칭됨) 및 CB-항-0001 항체를 비교 실험한다.
실시예 6의 제2 부분과 동일한 단계로 CDX 종양 모델 RT4(인간 방광 이행 세포 유두종 세포)의 절편을 얻는다. ACC-028 항체(희석 비율 1:50), MABN839 항체(희석 비율 1:50) 및 CB-항-0001 항체(희석 비율 1:2000)를 적가하여 4°C에서 하룻밤 배양하고, PBS로 3X3분간 헹구고 2차 항체(ElivisionTM plus Polyer HRP (마우스/토끼) IHC 키트, 푸저우 마이신 바이오테크놀로지 개발 유한공사에서 구입, 제품번호 KIT-9903)를 적가하며, 실온에서 15분 내지 20분간 인큐베이션하고 PBS로 3X3분을 헹구며 PBS를 버리고 새로 배합한 DAB발색액으로 3분간 발색하였다. 25초 동안 헤마톡실린으로 재염색하고, 30초 동안 PBS로 블루로 리턴한다. 75%, 95%, 100% 및 100%의 알코올 구배에 따라 순차적으로 탈수하고, 마지막으로 자일렌으로 3분 동안 투명하게 하며 중성 생고무로 밀봉하고, 염색 결과를 판독하였다. 그 결과 ACC-028 항체는 검출 감도가 낮고 소량의 RT4 세포막에서만 특이성 신호가 검출되며(도 3A 참조); MABN839 항체는 특이성이 낮고 모든 조직세포와 간질 세포에서 모두 신호를 감지하고(도 3B 참조); 반면, CB-항-0001 항체는 검출 신호의 위치 결정이 정확하고 명확하며, 특이성이 우수하고 감도가 높아(도 3C 참조), IHC 응용에 이상적인 항체인 것으로 나타났다.
실시예 8 안정성 실험
가속파괴 방법을 사용하여 CB-항-0001 항체에 대해 안정성 검증을 수행하고, 즉 각각 (1) 항체 원액을 각각 4°C에서 14일간 보관하며; (2) 항체 원액을 37°C의 항온 인큐베이터에 넣어 14일간 인큐베이션하고; 및 (3) 항체 작업액(ZSbio ZLI-9028 항체 희석액을 사용하여 항체 원액을1:2000의 비율로 희석한 후 상기 항체 작업액을 획득)을 37°C 인큐베이터에 넣어 14일 동안 인큐베이션하였다. 동일한 실험 조건에서 앞에서 설명한 세 가지 유형의 항체 용액으로 IHC 검출을 수행하여 세 가지 처리 방식 하의 항체의 안정성을 평가하였다.
검출을 거쳐, 상이한 조건에서 보관된 항체의 조직 염색 강도와 염색 비율은 모두 뚜렷한 변화가 나타나지 않았다(도 4를 참조하면, 여기서 도 4A는 4°C에서 14일간 보관된 CB-항-0001 항체 원액에 대한 IHC 결과이고, 도 4B는 37°C에서 14일간 보관한 CB-항-0001 항체 원액에 대한 IHC 결과이며, 도 4C는 37°C에서 14일간 보관한 CB-항-0001 항체 작동 용액에 대한 IHC 결과임). 이를 통해, CB-항-0001 항체 작업액은 37°C에서 14일간 보ㅍ한 후에도 항체가 여전히 안정적이였으며 우수한 검출 능력을 유지함을 알 수 있다.
CCTCC C202119 20210113 CCTCC C202124 20210113 CCTCC C202125 20210113
SEQUENCE LISTING <110> COHERENT BIOPHARMA (SUZHOU) , LIMITED <120> ANTI-TRPV6 MONOCLONAL ANTIBODY AND APPLICATION THEREOF <130> 066138-8006WO02 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 14538 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> DNA encoding TRPV6 <222> (1)..(14538) <400> 1 agagtcctgg ctggctctgc caagtgtaac aaactcacag ccctctccaa actggctggg 60 gctgctggga gactcccaag gaactcgtca ggaaggcagg agacaggaga cgggacctct 120 acagggagac ggtgggccgg cccttggggg ggctgatgtg gccccaaggc tgagtcccgt 180 cagggtctgg cctcggcctc aggcccccaa ggagccggcc ctacacccca tgggtttgtc 240 actgcccaag gagaaagggc taattctctg cctatggagc aagttctgca gatggttcca 300 gagacgggag tcctgggccc agagccgaga tgagcagaac ctgctgcagc agaagaggta 360 aggccccctt ggtctgctcc cttccccacc tccccaggcc tgcacctcta cccctcaccc 420 ctccctcacc tcccgtcttt gtttggcacc tttggctgga cagatggtgc tcccaggccc 480 ggactggctc cttgggagca ttctgtctta agagcctcag cctgtagggc tggtgaaaga 540 ggatggggtt gagatgggca caggtgttca ctatcttaag atctaattcg attctgcaag 600 cctcttgtga gtacttctct aagggccagg cgtcttgctg gggcttgtaa ggatagagca 660 tcacagcccc tccacccaag aggggacggc aggtgaggac aatgccttct gtatctccac 720 tgcttgcctc tagaacagtc tctctggcag gaacacatag tatacatatg ttcgcatgga 780 ggaatgagtg aacgattgaa tgaatgaagc agagagaacc gcggacacca ggaaccagaa 840 aataagacaa aatgtgaaaa aagtgaccat tcctatgtat ctgtctcatc agacactgac 900 caaggcctta ctatttgccc agcactgggg ggatatgaag acctacaacg ctcaaaccca 960 accttgaggt gtatttctct ctcagtgcgg gtggggactg aggggaagcg ggtcaaaata 1020 acagatgttc cgaggacctg tgctcttccg cattcaggtg gtggaaatcg agactctagc 1080 gtttaagccc taaggacatt cactggtggc ttccagcccc tgaaaacttc ctaaacccgt 1140 gtcctgcttt cttcaccatg acagcttgga gtacagagca ggagaggagc agggaatcgg 1200 aactcagggc tatccctgca tgtggtctct tcttcaaggt ctctaataga gttctctacc 1260 cagttggtgg catgctagaa ggaagtcctg cctgttgggg ctttccctgg gtcacgaagg 1320 aggcagatgt ctggtcatag aggaaagcct gaagtctttg tgccttaggg tttttctctg 1380 accccaagag taggagcctg ctttagcctg accggggagg ctgcctggag gcccctgtgt 1440 tttcttttgc tgaaggattc 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aacatgagct ggagggaggt ggcccacaag tgcccaatgt 3180 atgcctccgc cccacacatt accgctcttt ccttcatctg tggtcactgc tcaggcttgc 3240 cccccaacct ccaagaaaaa tcaggaggag ccataaaact agaagaacca cataatttag 3300 tggtcagagc ctggggctgg attcttggcc aagcatcctg cctttaactc cgtgtgatct 3360 tctggcaatg atttggttat gccgcttcag tttccttttc tgaagcatgg gagaactatt 3420 cagctggtgt tagaaggttg taaagagcaa aagtgataat gagtgagatg ctgcgggaat 3480 gagaggggcc atgaacttcc cctgcacagc actgtatcca cccaggaatg caagaagcca 3540 cgcactccga gcaaccctgt tatgtaccag ccccagccct gcccagaggg tacactcact 3600 ggtgggaaag gtatttgtgg agagaccagt gggacccatg cctgtcttct ctaactcctc 3660 ttccagccct gattaaaact gagaatcgtg accaagaaat gaccagtggg gcatgcgtcg 3720 tggctctgtc tctgacttgc ttcctccatc tgtttcatga gcagatttga ctcagtttct 3780 gaggggcttt ctagctctaa aaatcttatt tgaacttttc tcaagagtct tgtgatcctg 3840 ccttgtttct cagcacctaa aaaccaaatt ggacccatgc acacagtgca cacatctaca 3900 aggatggagg agcagatgag ggtgtggggc ggaggagacg gagagaggaa gtcaggaatc 3960 cttccctggt ggcccagagg cagccctgag aaggaggtca ttgatctgtt tgctcaagaa 4020 ataatgtgct agattttgtg ccaggaaccc cttagttggg ttttcaccag gctaatgttg 4080 aactagaccg ttcaatttta ttataattaa ttgcctagta aaagaaaaca ttctagaacc 4140 tgaaaatacc tttcatattg ttacagtttc agatttgctc tataatctct tttgactact 4200 tcatcagtgg gagcttaaaa ggcttcatct gacttttttt tgtttctccc ttagttgagt 4260 atttagtgat ccataagaaa acatttttat gtataggata tttctgattc cttttcgagt 4320 gaagaatcct cattctaaaa cggattatga atcattgtac ctctgaatca ggggttctcc 4380 accttggact attgacattt tggacaggat aattctttgc agtgagggct gtcatgtgca 4440 gggtgcttag ccgtgtccct gcctttgacc cccgtgttgt gatctaaact cctgtgataa 4500 gttgctattg aaaaatctat ttgtccccca agcacaggaa tctttgagta ggtcagctct 4560 gtgcacctcc ttcagggacc caaggagagt caggtgtttt ggggtcagcc ttactcccaa 4620 gcaggtgagc tagggctttc tgtgctgtcc ccttgtgggc atatgaggtt attgcaagta 4680 atggctgggc cggatacctt caaaacccgt ccacaggctg ggcccccctt tttgctggag 4740 tctggagttc acagtcggag gaggctagtt ctctacaaac cttgctgggt tgggtcataa 4800 gctggctctt cacgcagggt 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atccatgaat cccaaattgg gtaaatccag gaagggtccg 6540 aagacagaat gggaacattc agatgcacat gaaattcgat gaatgaatcc tctagattgg 6600 attctctttt ttctctgcat ctgtcattgt tggccatagt ttgtgtctta ggggccaata 6660 gccgaaacaa agtagtatct aaagccctct agacagctgg tctgaaaatg atggagaaca 6720 ctgtttcgca aactttaatg tgagctgttt ggaaactgag acccctgagc ttgtctctga 6780 tttatcgcca ccggtttttg catgcaagga ccacttaagc aatgcttctc caactttcat 6840 atgcccagga atcagctgga aatcttctta aactgcagat ttggattcac taggtggaag 6900 ggtccgccag agcatttcca tttcttataa gggctcatgt gctgctgctg atccaggggt 6960 ccactttaag aaggaaggct gttgagatga tgtgagaaga aagacgagag gcagaaagga 7020 agagacagag ataatgaatg aatgaatgaa tgaatgaatg aatgaacacc tatgaggaag 7080 gaaggcctgg agccaggctt gttcttatgg tccactgttc ttttgtgtta agccctgaag 7140 atgctattgt tgggagggaa gcgccaggat caaagggttc tgctgagaag gttgagtagg 7200 cagaggatgg tgcaacagga gaaatcctgc tagcctgtgc atatgactcc ctccacaaat 7260 atgagacagg aattccttgc acccctcggt ccatgcaaaa caaggcttat cctggagggc 7320 aatctcaggg cacctggtga 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gacacagggg atctgagcct cctactcttt ttttctcttc 8220 tctgtctccc ttccgtgtca gtcctgactg cccatcacta gaacgcctgc cccctgaaat 8280 gccaggggcc tagagaagag gaagagatgg gcagcagctg gatcccctgg gaatcctgaa 8340 cacccgagag ctccctgttc tccatcccag gctacccctg agggaaagag actggggtgc 8400 atatgggagg gaccccctgc aggatcctgg ggacagaccc gtgactgaca gctgtctctg 8460 ggccaggtca gactgcactg cacatcgctg ttgtgaacca gaacatgaac ctggtgcgag 8520 ccctgcttgc ccgcagggcc agtgtctctg ccagagccac aggcactgcc ttccgccgta 8580 gtccctgcaa cctcatctac tttggtgaga gcagggctgg gcttggagga cgggcagttg 8640 gaaaggtggg caaggcaggg cagggccagg cagaggagga tcctgtcttc agccgtatct 8700 gttgggcagc tgggaggagc aatccttcta gggcttaatt agactagagg ccaatttacc 8760 ccacgaccct tcctctggtt ctgcaggaaa agtgtcctca agccctgagc tgagatgtgg 8820 gggaagataa ggctgtcact tgggggagac tgtccacccc atcctgccat cctgcactct 8880 cctaccatag atctctctgt gtccacaggg gagcaccctt tgtcctttgc tgcctgtgtg 8940 aacagtgagg agatcgtgcg gctgctcatt gagcatggag ctgacatccg ggcccaggac 9000 tccctgggta agagctgaga tggggagggg agctgggatg ctgcagggag tgagggacag 9060 ggtgaggaga ggggctggga ccttcaggaa gacctcaggg tggggatggg gacatcaggg 9120 actttaggcc agtggccaca tgataccctg tgtcctcccc aggaaacaca gtgttacaca 9180 tcctcatcct ccagcccaac aaaacctttg cctgccagat gtacaacctg ttgctgtcct 9240 acgacagaca tggggaccac ctgcagcccc tggacctcgt gcccaatcac cagggtctca 9300 cccctttcaa gctggctgga gtggagggta acactgtggt gagagacggt ccccatccct 9360 gaggtgtctt tctaatgacc ctcaacctat cccgctggcc ctgggagaaa cagaggtgaa 9420 cgcgatccct gatgcttaga tcccattctc aactcagaaa tttttcaacc cctcccactg 9480 tggttacctg ttccctttct tgcccactcc ttttcccctg aggcattggg ggttacagag 9540 tctagatccc atgctaggat tgtctgtaat gccccagccc accttccctt tcagccccca 9600 gagcagggcc ctccagcctc tcgtctctcc tttccaaact ctggagggag tcatgggaga 9660 ggatgaggaa cctatgaatg tcactgtgaa tgtgggttct tctgccctct aaaggctgtc 9720 atcaaaatga aagggcagcc accttctcca ggggtgccgt cctcctgcac atgcatccta 9780 tccacactct gtgaccgtcc cctttgctta ctgctcctga gtcatcttca ctttccctta 9840 gatgtttcag cacctgatgc agaagcggaa gcacacccag tggacgtatg gaccactgac 9900 ctcgactctc tatgacctca cagagatcga ctcctcaggg gatgagcagt ccctgctgga 9960 acttatcatc accaccaaga agcgggaggt atggctcatg acagcaggct gtggctgggg 10020 aggggtgtca gggtctctga gccacctgtt ctctttctgt tgcaggctcg ccagatcctg 10080 gaccagacgc cggtgaagga gctggtgagc ctcaagtgga agcggtacgg gcggccgtac 10140 ttctgcatgc tgggtgccat atatctgctg tacatcatct gcttcaccat gtgctgcatc 10200 taccgccccc tcaagcccag gaccaataac cgcacgagcc cccgggacaa caccctctta 10260 cagcagaagc tacttcaggt gacacccttg taggagcaga tcagcagggc aggacttggc 10320 tctctgtcct cagagactgg tgtccctttc ctccctcaca ccatttctcc ccttgctcta 10380 atctcaaata tatgggtaca aactccaaat gcacgcccac aaaaacacac atacgctctt 10440 actctgagag cagagtttga gaagacccaa acctaacaga ttaaaaagaa tctgctaaga 10500 ctggtgaccc tgggcaccat ggaaatgcag ggcagaggcc tgaaagccct gagcattttg 10560 actgttcttc tcccccatta ggaagcctac atgaccccta aggacgatat ccggctggtc 10620 ggggagctgg tgactgtcat tggggctatc atcatcctgc tggtagaggt gaggtgtgga 10680 tggactctgg 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tcggggtgag acctgttaga ggctggatgg ggcaattgct tggggaatgt gtgcagatgt 11580 tctctgcctc ctgctccttc tagatgattt ttggcgacct gatgcgattc tgctggctga 11640 tggctgtggt catcctgggc tttgcttcag gtaatcatct gtccaggacc aggggccatg 11700 gcagggaaga gatgaggaag tctagggggc actggctctg gctaaacttg gggaggagga 11760 gtaatgcaga gatcagagga gacctatggt atcagaggat gggacgtcct ccagaggtga 11820 gaaaaatcgg gagtgttagg gagaggtggc tcttaggatc aagatgaggc tcatacaaaa 11880 ctagggaccg taaaaaccca aagtttggag cactgcagag ctggtgatat tgagatgaag 11940 ggaccaggat ggacatgcac gcagagcccg gggtgggctg gtcgtctgca tggttgccat 12000 ggtaaccctc acccccttgg gtggagcagc cttctatatc atcttccaga cagaggaccc 12060 cgaggagcta ggccacttct acgactaccc catggccctg ttcagcacct tcgagctgtt 12120 ccttaccatc atcgatggcc cagccaacta caacgtggac ctgcccttca tgtacagcat 12180 cacctatgct gcctttgcca tcatcgccac actgctcatg ctcaacctcc tcattgccat 12240 gatgggcgac actcactggc gagtggccca tgagcgggat gagctgtgga gggcccaggt 12300 gagccccctg gtggcaggga gggttagggc aagtcatccc cttcctacca 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tgaagaaggt caacaaaggc 13200 tgccctaccc ctacctctgt ctgcgcccag cctcatctct gacttctcct tttgttccca 13260 tacgcagatt gtggccacca cagtgatgct ggagcggaag ctgcctcgct gcctgtggcc 13320 tcgctccggg atctgcggac gggagtatgg cctgggagac cgctggttcc tgcggtgagt 13380 gatatgcggg ggtaggtgtc ccctgagaag cctcatcggc agggtatccc cctgctcaga 13440 cagcttccgg ctcctgggtt ccctgtggag gcctgtgtgc tccctaggct ctatgcttgt 13500 tgattgagct ggtgaggaag gggtcccgtt tggagctcag acttcccaaa gcatccaggg 13560 agtctgtggc agagcctgct gctttctgag gcctagctgc caaggggcca gtgacccagg 13620 catccaccat ggctgcagaa aagggaaaag gccagcaatg gcggggatgg gaggaccagg 13680 ggataacaga caagcatcct tcttggatct gttcttcaag tcctggctgt gtctcaagtc 13740 ctcccgcatt ccacagggtg gaagacaggc aagatctcaa ccggcagcgg atccaacgct 13800 acgcacaggc cttccacacc cggggctctg aggatttgga caaagactca gtggaaaaac 13860 tagagctggg ctgtcccttc agcccccacc tgtcccttcc tatgccctca gtgtctcgaa 13920 gtacctcccg cagcagtgcc aattgggaaa ggcttcggca agggaccctg aggagagacc 13980 tgcgtgggat aatcaacagg ggtctggagg acggggagag ctgggaatat cagatctgac 14040 tgcgtgttct cacttcgctt cctggaactt gctctcattt tcctgggtgc atcaaacaaa 14100 acaaaaacca aacacccaga ggtctcatct cccaggcccc aggggagaaa gaggagtagc 14160 atgaacgcca aggaatgtac gttgagaatc actgctccag gcctgcatta ctccttcagc 14220 tctggggcag aggaagccca gcccaagcac ggggctggca gggcgtgagg aactctcctg 14280 tggcctgctc atcacccttc cgacaggagc actgcatgtc agagcacttt aaaaacaggc 14340 cagcctgctt gggcgctcgg tctccacccc agggtcataa gtggggagag agcccttccc 14400 agggcaccca ggcaggtgca gggaagtgca gagcttgtgg aaagcgtgtg agtgagggag 14460 acaggaacgg ctctgggggt gggaagtggg gctaggtctt gccaactcca tcttcaataa 14520 agtcgttttc ggatccct 14538 <210> 2 <211> 765 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> TRPV6 <222> (1)..(765) <400> 2 Met Gly Pro Leu Gln Gly Asp Gly Gly Pro Ala Leu Gly Gly Ala Asp 1 5 10 15 Val Ala Pro Arg Leu Ser Pro Val Arg Val Trp Pro Arg Pro Gln Ala 20 25 30 Pro Lys Glu Pro Ala Leu His Pro Met Gly Leu Ser Leu Pro Lys Glu 35 40 45 Lys Gly Leu Ile Leu Cys Leu Trp Ser Lys Phe Cys Arg Trp Phe Gln 50 55 60 Arg Arg Glu Ser Trp Ala Gln Ser Arg Asp Glu Gln Asn Leu Leu Gln 65 70 75 80 Gln Lys Arg Ile Trp Glu Ser Pro Leu Leu Leu Ala Ala Lys Asp Asn 85 90 95 Asp Val Gln Ala Leu Asn Lys Leu Leu Lys Tyr Glu Asp Cys Lys Val 100 105 110 His Gln Arg Gly Ala Met Gly Glu Thr Ala Leu His Ile Ala Ala Leu 115 120 125 Tyr Asp Asn Leu Glu Ala Ala Met Val Leu Met Glu Ala Ala Pro Glu 130 135 140 Leu Val Phe Glu Pro Met Thr Ser Glu Leu Tyr Glu Gly Gln Thr Ala 145 150 155 160 Leu His Ile Ala Val Val Asn Gln Asn Met Asn Leu Val Arg Ala Leu 165 170 175 Leu Ala Arg Arg Ala Ser Val Ser Ala Arg Ala Thr Gly Thr Ala Phe 180 185 190 Arg Arg Ser Pro Cys Asn Leu Ile Tyr Phe Gly Glu His Pro Leu Ser 195 200 205 Phe Ala Ala Cys Val Asn Ser Glu Glu Ile Val Arg Leu Leu Ile Glu 210 215 220 His Gly Ala Asp Ile Arg Ala Gln Asp Ser Leu Gly Asn Thr Val Leu 225 230 235 240 His Ile Leu Ile Leu Gln Pro Asn Lys Thr Phe Ala Cys Gln Met Tyr 245 250 255 Asn Leu Leu Leu Ser Tyr Asp Arg His Gly Asp His Leu Gln Pro Leu 260 265 270 Asp Leu Val Pro Asn His Gln Gly Leu Thr Pro Phe Lys Leu Ala Gly 275 280 285 Val Glu Gly Asn Thr Val Met Phe Gln His Leu Met Gln Lys Arg Lys 290 295 300 His Thr Gln Trp Thr Tyr Gly Pro Leu Thr Ser Thr Leu Tyr Asp Leu 305 310 315 320 Thr Glu Ile Asp Ser Ser Gly Asp Glu Gln Ser Leu Leu Glu Leu Ile 325 330 335 Ile Thr Thr Lys Lys Arg Glu Ala Arg Gln Ile Leu Asp Gln Thr Pro 340 345 350 Val Lys Glu Leu Val Ser Leu Lys Trp Lys Arg Tyr Gly Arg Pro Tyr 355 360 365 Phe Cys Met Leu Gly Ala Ile Tyr Leu Leu Tyr Ile Ile Cys Phe Thr 370 375 380 Met Cys Cys Ile Tyr Arg Pro Leu Lys Pro Arg Thr Asn Asn Arg Thr 385 390 395 400 Ser Pro Arg Asp Asn Thr Leu Leu Gln Gln Lys Leu Leu Gln Glu Ala 405 410 415 Tyr Met Thr Pro Lys Asp Asp Ile Arg Leu Val Gly Glu Leu Val Thr 420 425 430 Val Ile Gly Ala Ile Ile Ile Leu Leu Val Glu Val Pro Asp Ile Phe 435 440 445 Arg Met Gly Val Thr Arg Phe Phe Gly Gln Thr Ile Leu Gly Gly Pro 450 455 460 Phe His Val Leu Ile Ile Thr Tyr Ala Phe Met Val Leu Val Thr Met 465 470 475 480 Val Met Arg Leu Ile Ser Ala Ser Gly Glu Val Val Pro Met Ser Phe 485 490 495 Ala Leu Val Leu Gly Trp Cys Asn Val Met Tyr Phe Ala Arg Gly Phe 500 505 510 Gln Met Leu Gly Pro Phe Thr Ile Met Ile Gln Lys Met Ile Phe Gly 515 520 525 Asp Leu Met Arg Phe Cys Trp Leu Met Ala Val Val Ile Leu Gly Phe 530 535 540 Ala Ser Ala Phe Tyr Ile Ile Phe Gln Thr Glu Asp Pro Glu Glu Leu 545 550 555 560 Gly His Phe Tyr Asp Tyr Pro Met Ala Leu Phe Ser Thr Phe Glu Leu 565 570 575 Phe Leu Thr Ile Ile Asp Gly Pro Ala Asn Tyr Asn Val Asp Leu Pro 580 585 590 Phe Met Tyr Ser Ile Thr Tyr Ala Ala Phe Ala Ile Ile Ala Thr Leu 595 600 605 Leu Met Leu Asn Leu Leu Ile Ala Met Met Gly Asp Thr His Trp Arg 610 615 620 Val Ala His Glu Arg Asp Glu Leu Trp Arg Ala Gln Ile Val Ala Thr 625 630 635 640 Thr Val Met Leu Glu Arg Lys Leu Pro Arg Cys Leu Trp Pro Arg Ser 645 650 655 Gly Ile Cys Gly Arg Glu Tyr Gly Leu Gly Asp Arg Trp Phe Leu Arg 660 665 670 Val Glu Asp Arg Gln Asp Leu Asn Arg Gln Arg Ile Gln Arg Tyr Ala 675 680 685 Gln Ala Phe His Thr Arg Gly Ser Glu Asp Leu Asp Lys Asp Ser Val 690 695 700 Glu Lys Leu Glu Leu Gly Cys Pro Phe Ser Pro His Leu Ser Leu Pro 705 710 715 720 Met Pro Ser Val Ser Arg Ser Thr Ser Arg Ser Ser Ala Asn Trp Glu 725 730 735 Arg Leu Arg Gln Gly Thr Leu Arg Arg Asp Leu Arg Gly Ile Ile Asn 740 745 750 Arg Gly Leu Glu Asp Gly Glu Ser Trp Glu Tyr Gln Ile 755 760 765 <210> 3 <211> 31 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Pro Leu Lys Pro Arg Thr Asn Asn Arg Thr Ser Pro Arg Asp Asn Thr 1 5 10 15 Leu Leu Gln Gln Lys Leu Leu Gln Glu Ala Tyr Met Thr Pro Lys 20 25 30 <210> 4 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ile Phe Gln Thr Glu Asp Pro Glu Glu Leu Gly His Phe 1 5 10 <210> 5 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Asp Gly Pro Ala Asn Tyr Asn Val Asp Leu Pro Phe 1 5 10 <210> 6 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtacca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtcccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaa 339 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Thr 1 5 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Gly Trp Ala Gly Asp Phe 1 5 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is absent. <400> 11 Leu Val Ser Xaa 1 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 12 Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Gln Thr 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 13 Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr Trp 1 5 <210> 14 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 14 Ile Arg Leu Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 15 Ala Arg Leu Ala Tyr Asp Gly Glu Arg Tyr Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 16 Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Asn Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is absent. <400> 17 Trp Ala Ser Xaa 1 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 18 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 19 Ala Phe Thr Phe Ser His Tyr Trp 1 5 <210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Ile Arg Leu Lys Ser Tyr Asn Tyr Ala Thr 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 21 Thr Arg Leu Gly Tyr Phe Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 22 <211> 12 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 22 Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Thr Asn Gln Lys Asn Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is absent. <400> 23 Trp Ala Ser Xaa 1 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 24 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr 1 5 <210> 25 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Gln Val Gln Val Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Gly Trp Ala Gly Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Leu Thr Leu Ser Val Thr Ile Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Ala Ala Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ala Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Gly 85 90 95 Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 27 <211> 125 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser His Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ser Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Leu Ala Tyr Asp Gly Glu Arg Tyr Tyr Tyr Ala Leu 100 105 110 Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 28 <211> 113 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 28 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Phe Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Asn Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 29 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 29 Glu Val Met Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Ala Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Tyr Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Leu Gly Tyr Phe Gly Ser Leu Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 30 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Thr Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Ser Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Glu Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr 85 90 95 Tyr Ser Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 31 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 caggtccaag tgcagcagcc tggggctgag cttgtgaagc ctgggacttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggcta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120 cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatggtta tactaactac 180 aatcaaaagt tcaggggcaa ggccacattg tctgtagaca aatcctccac cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct attactgtgg gtgggcgggg 300 gacttctggg gccaaggcac cactctcaca gtctcctca 339 <210> 32 <211> 336 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 gatgttgtgc tgacccagag tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 60 atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 120 ttgttacaga ggccaggcca gtctccaaag cgcctaatct atctggtgtc taagctggac 180 tctgcagccc ctgacaggtt cgctggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgaaga tttgggaatt tactattgct ggcaaggtac acattttcct 300 cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336 <210> 33 <211> 375 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60 tcctgtgttg cctctggatt cactttcagt tactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctcataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacaa cttaagatct gaagacactg gcatttatta ctgtgccagg 300 cttgcttacg acggggagcg gtattactat gctctggact actggggtca aggaacctca 360 gtcaccgtct cctca 375 <210> 34 <211> 339 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaagtttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtaaca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatatg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaataaaa 339 <210> 35 <211> 372 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 35 gaagtgatgc ttgaggagtc tggaggaggc ttagtgcaac ctggaggatc catgaagctc 60 tcctgtgttg cctctgcatt cactttcagt cactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120 ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatcttataa ttatgcaaca 180 cattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcca gagatgattc caagagtagt 240 gtctacctgc aaatgaacag cctaaggcct gaagacactg gcatttatta ctgtaccagg 300 cttggttact tcggtagcct ctactatgct atggactact ggggtcaagg aacctcagtc 360 accgtctcct ca 372

Claims (57)

  1. TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역;
    (b) SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역; 또는
    (c) SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역에 포함된 3개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3;
    (b) SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는HCDR3; 또는
    (c) SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄가변 영역;
    (b) SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄가변 영역; 또는
    (c) SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역에 포함된 3개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3;
    (b) SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3; 또는
    (c) SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택된 3 개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 7로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 8로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 9로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 10으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 11로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 12로 표시되는 LCDR3;
    (b) SEQ ID NO: 13으로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 14로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 15로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 16으로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 17로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 18로 표시되는 LCDR3; 또는
    (c) SEQ ID NO: 19로 표시되는 HCDR1, SEQ ID NO: 20으로 표시되는 HCDR2, SEQ ID NO: 21로 표시되는 HCDR3, SEQ ID NO: 22로 표시되는 LCDR1, SEQ ID NO: 23으로 표시되는 LCDR2 및 SEQ ID NO: 24로 표시되는 LCDR3으로 이루어진 군으로부터 선택되는 3 개의 중쇄 상보적 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3 및 3 개의 경쇄 상보적 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역;
    (b) SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역; 또는
    (c) SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역VH을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄가변 영역;
    (b) SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄가변 영역; 또는
    (c) SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 가변 영역VL을 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 ,
    (a) SEQ ID NO: 25로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 26으로 표시되는 경쇄 가변 영역;
    (b) SEQ ID NO: 27로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 28로 표시되는 경쇄 가변 영역; 또는
    (c) 또는 SEQ ID NO: 29로 표시되는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 30으로 표시되는 경쇄가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 VH및 경쇄 가변 영역 VL을 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질을 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 SEQ ID NO: 2로 표시되는 아미노산 서열을 가진 단백질의 Kd 값은 10-7 M 미만인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 Kd 값은 표면 플라즈몬 공명법을 통해 검출되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원 결합 단편은 F(ab')2, Fab', Fab, Fv, scFv, dsFv 또는 dAb 중에서 선택되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 불변 영역 및/또는 경쇄 불변 영역를 더 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄 불변 영역은 마우스의 IgG1 또는 마우스의 IgG2a로부터 유래되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 중쇄 불변 영역은 인간의 IgG1로부터 유래되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 접합 부분을 더 갖는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 접합 부분은 치료제, 방사성 동위원소, 검출 가능한 태그, 약물 동태학적으로 변형된 부분 또는 정제된 부분인 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제15항 또는 제16항에 있어서,
    상기 접합 부분은 직접적으로 연결되거나 링커를 통해 연결되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  20. 제19항에 있어서, 상기 핵산은,
    (a) SEQ ID NO: 31로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 31과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 32로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 32와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두;
    (b) SEQ ID NO: 33으로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 33과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, 및 SEQ ID NO: 34로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 34와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두; 또는
    (c) SEQ ID NO: 35로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 35와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열, SEQ ID NO: 6으로 표시되는 핵산 서열 또는 SEQ ID NO: 6과 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 핵산.
  21. 제19항 또는 제20에 따른 핵산 서열을 포함하는 벡터.
  22. 제21항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  23. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편,
    및 다른 항원에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하는 다중 특이적 항체.
  24. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 제23항에 따른 다중 특이적 항체를 포함하는 항체 결합체.
  25. 항-TRPV6 단일 클론 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주로서, 상기 하이브리도마 세포주는 12CT9.5.1, 16CT4.1.1.2 또는 16CT18.1.1.2이고, 중국 전형적인 배양물 보존 센터에 기탁되며, 상기 12CT9.5.1의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202119이고, 상기 16CT4.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202124이며, 상기 16CT18.1.1.2의 기탁 번호는 CCTCC NO: C202125인 하이브리도마 세포주.
  26. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산, 제21항에 따른 벡터, 제22항에 따른 숙주 세포, 제23항에 따른 다중 특이적 항체 또는 제24항에 따른 항체 결합체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약물 조성물.
  27. 하나 이상의 제1항 내지 제18항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 피험자의 시료 중의 TRPV6을 분석하고 검출을 위한 시약.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 시약은 피험자의 시료 중의 TRPV6을 분석하고 검출하는 데 사용되는 시약.
  29. 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
    (1) 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편과 상기 시료를 접촉시키는 단계;
    (2) 선택적으로, 결합되지 않은 항체 또는 항체 단편을 제거하는 단계;
    (3) 상기 시료 중의 TRPV6에 결합된 항체 또는 항체 단편을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  30. 제29항에 있어서,
    상기 단계(1)에서의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 기판 상에 고정되는 방법.
  31. 제29항에 있어서,
    상기 단계(1)에서의 상기 시료는 기판 상에 고정되는 방법.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계(3)는 제2 항체를 사용하는 것을 포함하고, 선택적으로, 상기 제2 항체는 상기 시료 중의 TRPV6에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있고, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프와 상이하며, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 에피토프와 동일하고, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프가 TRPV6에 결합하는 것은 상기 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 영향을 받지 않으며, 선택적으로, 상기 제2 항체의 에피토프가 TRPV6에 결합하는 것은 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 영향을 받는 방법.
  33. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계(3)는 제2 항체를 사용하는 것을 포함하고, 선택적으로, 상기 제2 항체는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있으며, 선택적으로, 상기 제2 항체는 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항원 결합 단편의 불변 영역 부분에 결합할 수 있는 방법.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서,
    상기 제2 항체는 검출 분자에 결합되며, 선택적으로 상기 검출 분자는 효소, 형광 마커 및 비오틴을 포함하는 방법.
  35. 제34항에 있어서,
    상기 검출 분자는 효소이며, 선택적으로 상기 효소는 겨자무과산화효소, 알칼리성 포스파타제 또는 이의 유도체를 포함하는 방법.
  36. 제34항에 있어서,
    상기 검출 분자는 플루오레세인이고, 선택적으로, 상기 플루오레세인은 FITC, 로다민, 텍사스 레드, 피코에리스린 또는 Dylight를 포함하는 방법.
  37. 제34항에 있어서,
    상기 검출 분자는 비오틴 또는 그 유도체인 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료 중의 TRPV6에 결합된 항체를 정량하는 단계를 더 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 방법은 면역조직화학(IHC), 효소결합면역흡착측정법(ELISA), 면역형광(IF), 화학발광면역측정법(CLIA), 탁도 면역분석(TIA) 또는 웨스턴 블롯(Western Blot)인 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 피험자는 인간인 방법.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 시료 중 세포 표면에서 TRPV6을 발현하는 세포의 비율을 평가하는 데 사용되는 방법.
  42. 피험자 질병의 형성 또는 형성된 위험을 판단하고, 피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 상기 피험자의 반응을 예측하거나 모니터링하는 방법으로서, 상기 방법은, 제29항 내지 제41항 중 어느한 항에 따른 방법을 사용하여 상기 피험자의 시료 중의 TRPV6을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  43. 제41항에 있어서,
    상기 방법은 상기 시료 중 세포 표면에서 TRPV6을 발현하는 세포의 비율을 평가하는 단계를 더 포함하고, 상기 비율이 예정된 임계값을 초과하면 상기 피험자가 상기 질병을 앓고 있거나 치료에서 이득을 얻을 가능성이 있는 것으로 간주하며, 상기 임계값은 10%이고, 바람직하게는 상기 치료는 표적 약물 치료인 방법.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서,
    상기 질병은 암인 방법.
  45. 제44항에 있어서,
    상기 암은 유방암,
    난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 식도암, 폐암, 장암, 췌장암이고; 바람직하게는 상기 암은 HER2+ 유방암, 삼중 음성 유방암 또는 결장 직장암인 방법.
  46. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하며,
    선택적으로 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 TRPV6에 결합된 상황을 검출하기 위한 시약을 더 포함하는 키트.
  47. 제46항에 있어서,
    피험자 질병의 형성 또는 형성된 위험을 진단하고,
    피험자 질병의 진행 또는 예후를 평가하거나, 질병 치료를 받는 피험자에서 치료에 대한 상기 피험자의 반응을 예측하거나 모니터링하는 데 사용되는 키트.
  48. 제46항에 있어서,
    면역 조직 화학적 병리 진단에 사용되는 키트.
  49. 제48항에 있어서,
    종양 조직의 면역 조직 화학적 병리 진단에 사용되는 키트.
  50. 제47항에 있어서,
    상기 질병은 암인 키트.
  51. 제48항에 있어서,
    상기 질병은 유방암, 난소암, 자궁내막암, 담관암, 위암, 식도암, 폐암, 장암, 췌장암이고; 바람직하게는 상기 질병은 HER2+유방암, 삼중 음성 유방암 또는 결장 직장암인 키트.
  52. (1) SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열을 벡터 단백질에 결합시켜 TRPV6 항원성 펩티드를 얻는 단계;
    (2) 단계(1)에서 얻은 상기 TRPV6 항원성 펩티드를 면역원으로서 마우스를 면역시키는 단계;
    (3) 세포 융합 및 면역 펩티드 클론 스크리닝에 의해 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 높은 효율로 분비하는 양성 하이브리도마 세포계를 획득하는 단계; 및
    (4) TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 획득하는 단계를 포함하는 TRPV6에 특이적으로 결합하는 항체를 제조하는 방법.
  53. 제52항에 있어서,
    상기 벡터 단백질은 키홀-림펫 헤모사이아닌(KLH) 단백질인 방법.
  54. 제52항 또는 제53항에 있어서,
    SEQ ID NO: 3으로 표시되는 아미노산 서열의 N말단에 하나의 Cys를 추가하고 유리 설프히드릴기를 통해 상기 벡터 단백질에 결합되는 방법.
  55. 제52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하이브리도마 세포계는 마우스 하이브리도마 세포계 12CT 9.5.1, 16CT 18.1.1.2 또는 16CT 4.1.1.2인 방법.
  56. TRPV6와 관련된 질병의 치료 및/또는 예방 및/또는 진단을 위해 사용되는 약물에서 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산, 제21항에 따른 벡터, 제22항에 따른 숙주 세포, 제23항에 따른 다중 특이적 항체, 제24항에 따른 항체 결합체 및 제25항에 따른 약물 조성물의 용도.
  57. 도움이 필요한 피험자에게 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제19항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 단리된 핵산, 제21항에 따른 벡터, 제22항에 따른 숙주 세포, 제23항에 따른 다중 특이적 항체, 제24항에 따른 항체 결합체 또는 제25항에 따른 약물 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 질병을 치료, 예방 또는 진단하는 방법.
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