CN110573618A - 抗gpr20抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目标是提供：可以用于检测GPR20的抗GPR20抗体，包含所述抗体的用于检测GPR20的试剂，用于诊断与GPR20表达有关的疾病的诊断试剂或用于测试与GPR20表达有关的疾病的组合物等。本发明提供了：特异性结合包含在SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1至48所述的氨基酸序列的肽的抗体、或所述抗体的抗原结合片段、所述抗体的嵌合抗体、所述抗体的兔型抗体等。本发明还提供了包含所述抗体的组合物等。

Description

抗GPR20抗体
技术领域
本发明涉及新型抗GPR20抗体，抗体的功能片段，抗体的修饰，包含编码抗体氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸，具有核苷酸插入物的载体，用核苷酸或载体转染的细胞，包括培养细胞的步骤的用于产生抗体的方法，药物组合物，用于诊断或测试的组合物等。
背景技术
GPR20（G蛋白偶联受体20）是由358个氨基酸组成的七次跨膜蛋白，其属于G蛋白偶联受体（GPCR）家族的A类，并且该蛋白具有N末端细胞外结构域和C末端细胞内结构域。GPR20具有与识别核苷酸或脂质的GPCR的氨基酸序列相似的氨基酸序列。然而，尚未鉴定出GPR20的生理功能和体内配体。根据促使HEK293细胞表达GPR20的实验，已报道GPR20在没有配体刺激的条件下组成型激活Gi三聚体G蛋白（非专利文献1）。
GPR20已被确认具有在心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰腺、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、直肠和白细胞中的信使RNA（mRNA）表达，并且特别地，它在小肠中的高表达已得到报道（非专利文献1）。在脑中，在丘脑、壳核和尾状核中的表达已得到报道（非专利文献2）。另外，GPR20的mRNA表达已在胃肠道间质瘤（GIST）（非专利文献3）或一些Cajal间质细胞（ICC）中得到报道，其存在于胃肠肌层中的丛等中并且涉及肠蠕动。ICC是GIST的起源细胞，并且已报道GPR20的表达受ets变体1（ETV1）调节，所述ETV1是GIST的主要转录因子（非专利文献4）。
GPR20缺陷型小鼠已显示出多动症的表型，其特征在于旷场测试中的总行进距离中的增加，提示GPR20与中枢神经系统中的自发性活动相关（专利文献1）。
因此，可以检测GPR20表达的方法的提供可用于通过检测肿瘤（例如GIST）细胞、存在于胃肠道中的正常Cajal间质细胞、存在于脑中的细胞等等如GPR20阳性细胞得到的测试或诊断。
据报道能够在福尔马林固定的组织中检测人GPR20的多克隆抗体迄今已知，但显示出不足的检测灵敏度或反应特异性。存在关于证明质量均匀的抗体的问题。此外，尚不知道可用于GPR20的免疫组织化学染色中的任何单克隆抗体。
引用列表
专利文献
专利文献1：US 2003/0018989 A1
非专利文献
非专利文献1：Hase M.等人，J Biol Chem.（2008）283，12747-12755
非专利文献2：O'Dowd B. F.，Gene 187（1997）75-81
非专利文献3：Allander S. V.等人，CANCER RESEARCH（2001）61，8624-8628
非专利文献4：Chi P.等人，Nature.（2010）467（7317）：849-853。
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供特异性结合GPR20的抗体。
本发明的另一个目的是提供用于GPR20检测的试剂，其包含抗GPR20抗体。本发明的进一步替代目的是提供用于诊断与GPR20表达有关的疾病的试剂或用于测试与GPR20表达有关的疾病的组合物等，其包含抗GPR20抗体。
本发明的目的还包括编码抗体的氨基酸序列的核苷酸，具有核苷酸插入物的载体，用核苷酸或载体转染的细胞，包括培养细胞的步骤的用于产生抗体的方法等。
本发明的进一步替代目的是提供含有抗GPR20抗体的药物组合物，以及使用该药物组合物用于治疗涉及GPR20表达的疾病的方法。
问题的解决方案
本发明人已进行了针对实现上述目的的深入研究，并且通过开发新型抗GPR20抗体并发现可以使用该抗体检测GPR20来完成本发明。具体地，本发明包括本发明的下述方面：
（1）一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体特异性结合包含在SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1至48处的氨基酸序列的肽；
（2）一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体对于结合GPR20，具有针对具有以下重链和轻链的抗体的竞争性抑制活性，所述重链由在SEQ ID NO：3中的氨基酸位置20至466处的氨基酸序列组成，并且所述轻链由在SEQ ID NO：11中的氨基酸位置20至232处的氨基酸序列组成；
（3）根据（1）或（2）的抗体或抗体的抗原结合片段，其结合由氨基酸序列LEVPLFHLFARLD（SEQ ID NO：31）组成的表位；
（4）根据（1）至（3）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
重链序列包含可变区，其具有由SEQ ID NO：5或8中所示的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO：6或9中所示的氨基酸序列组成的CDRH2、以及由SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列组成的CDRH3；和
轻链序列包含可变区，其具有由SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列组成的CDRL2、以及由SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列组成的CDRL3；
（5）根据（1）至（4）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列组成的重链可变区、以及由SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区；
（6）根据（1）至（5）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其由以下重链和轻链组成，所述重链包含在SEQ ID NO：3中的氨基酸位置20至466处的氨基酸序列，所述轻链包含在SEQ ID NO：11中的氨基酸位置20至232处的氨基酸序列；
（7）根据（1）至（5）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其为嵌合抗体；
（8）根据（7）的嵌合抗体，其中所述恒定区衍生自兔抗体；
（9）根据（1）至（5）、（7）和（8）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由在SEQID NO：19中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成的重链以及由在SEQ ID NO：21中的氨基酸位置21至232处的氨基酸序列组成的轻链；
（10）根据（1）至（5）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其具有兔型；
（11）根据（1）至（5）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其为人源化的；
（12）根据（1）至（5）和（10）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含下述重链（a）或（b）和轻链（c）：
（a）由在SEQ ID NO：23中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成的重链，
（b）由在SEQ ID NO：25中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成的重链，和
（c）由在SEQ ID NO：27中的氨基酸位置20至230处的氨基酸序列组成的轻链；
（13）根据（1）至（5）和（10）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其由以下重链和轻链组成，所述重链包含在SEQ ID NO：23中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列，所述轻链包含在SEQ ID NO：27中的氨基酸位置21至230处的氨基酸序列；
（14）根据（1）至（5）和（10）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，其由以下重链和轻链组成，所述重链包含在SEQ ID NO：25中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列，所述轻链包含在SEQ ID NO：27中的氨基酸位置21至230处的氨基酸序列；
（15）根据（1）至（14）中任一个的抗体的抗原结合片段，其选自Fab、F（ab'）2、Fab'和Fv；
（16）根据（1）至（14）中任一个的抗体，其为scFv；
（17）一种组合物，其包含根据（1）至（16）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段；
（18）根据（17）的组合物，其包含根据（1）至（16）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段，并且用于检测或测量组织制剂中的GPR20的方法中，所述组织制剂通过石蜡包埋然后脱石蜡进行处理（下文简称为“制剂”）；
（19）根据（17）或（18）的组合物，其用于检测或测量制剂中的GPR20的方法中，所述方法包括使根据（1）至（16）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段与测试制剂接触的步骤；
（20）根据（18）或（19）的组合物，其中用于检测或测量GPR20的方法包括以下步骤：当在测试制剂中已检测到或测量到GPR20，或者测试制剂中GPR20的表达水平等价于或高于预定参考时，确定测试制剂为阳性的，并且当在测试制剂中未检测到或测量到GPR20，或者测试制剂中GPR20的表达水平等价于或低于预定参考时，确定测试制剂为阴性的；
（21）根据（17）至（20）中任一个的组合物，其用于测试或诊断GPR20阳性疾病的方法中；
（22）根据（17）至（21）中任一个的组合物，其中用于测试或诊断GPR20阳性疾病的方法包括：确定产生在GPR20的检测或测量中已确定为阳性的测试制剂的测试受试者适合于用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法，所述用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法包括施用特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段的步骤；和确定产生已确定为阴性的测试制剂起源的测试受试者不适合于用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法，所述用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法包括施用特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段的步骤；
（23）根据（21）或（22）的组合物，其中所述GPR20阳性疾病是GPR20阳性癌症；
（24）根据（21）至（23）中任一个的组合物，其中所述GPR20阳性疾病是胃肠道间质瘤（GIST）；
（25）一种药物组合物，其包含特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段，所述药物组合物待施用于下述测试受试者（a）至（c）中的任一个：
（a）产生测试制剂的测试受试者，在所述测试制剂中，已使用根据（17）至（19）和（21）中任一个的组合物检测或测量GPR20；
（b）产生测试制剂的测试受试者，所述测试制剂已使用根据（20）的组合物在GPR20的检测或测量中确定为阳性的；和
（c）已确定为适合于用于治疗或预防GPR20阳性疾病的测试受试者，其包括使用根据（22）或（24）的组合物，施用特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段的步骤；
（26）一种用于治疗GPR20阳性疾病的方法，其包括下述步骤（a）和（b）：
（a）使用根据（1）至（16）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段、或者根据（17）至（19）和（21）中任一个的组合物，检测或测量样本中的GPR20的步骤；和
（b）将抗GPR20抗体或抗体的抗原结合片段施用于产生样本的测试受试者的步骤，其中所述样本在步骤（a）中已检测或测量GPR20的表达；
（27）一种多核苷酸，其编码根据（1）至（16）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段；
（28）一种载体，其包含根据（27）的多核苷酸；
（29）一种细胞，其包含根据（27）的多核苷酸或根据（28）的载体；和
（30）一种用于产生根据（1）至（16）中任一个的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其包括下述步骤（a）和（b）：
（a）培养根据（29）的细胞的步骤；和
（b）从步骤（a）的培养物中收集单克隆抗体或抗体的抗原结合片段的步骤。
附图简述
[图1]图1显示了大鼠抗GPR20抗体04-093的重链的氨基酸序列（SEQ ID NO：3）和核苷酸序列（SEQ ID NO：2）。
[图2]图2显示了大鼠抗GPR20抗体04-093的轻链的氨基酸序列（SEQ ID NO：11）和核苷酸序列（SEQ ID NO：10）。
[图3]图3显示了大鼠抗GPR20抗体04-093的CDRH1至CDRH3（SEQ ID NO：5至9）和CDRL1至CDRL3（SEQ ID NO：13至15）的氨基酸序列。
[图4]图4显示了兔嵌合抗体重链OcHch的氨基酸序列（SEQ ID NO：19）。
[图5]图5显示了兔嵌合抗体轻链OcLch的氨基酸序列（SEQ ID NO：21）。
[图6]图6显示了兔型抗体重链OcH01的氨基酸序列（SEQ ID NO：23）。
[图7]图7显示了兔型抗体重链OcH02的氨基酸序列（SEQ ID NO：25）。
[图8]图8显示了兔型抗体轻链OcL01的氨基酸序列（SEQ ID NO：27）。
[图9]图9显示了当产生抗人GPR20抗体的杂交瘤的培养上清液与瞬时表达人GPR20的细胞系反应时的流式细胞术分析结果。纵坐标表示通过流式细胞术测量的平均荧光强度（MFI）的相对值。
[图10]图10显示了抗人GPR20抗体针对由人GPR20的N末端48个氨基酸组成的合成肽的结合活性。
[图11-1]图11-1显示了用抗GPR20抗体免疫染色的瞬时表达GPR20的人细胞的图像。图11-1显示了用大鼠抗GPR20单克隆抗体染色的图像。
[图11-2]图11-2显示了用抗GPR20抗体免疫染色的瞬时表达GPR20的人细胞的图像。图11-2显示了用商购可得的兔抗GPR20多克隆抗体染色的图像。
[图11-3]图11-3显示了用抗GPR20抗体免疫染色的瞬时表达GPR20的人细胞的图像。图11-3显示了用商购可得的兔抗GPR20多克隆抗体染色的图像。
[图12-1]图12-1显示了用大鼠抗人GPR20抗体和商购可得的兔抗GPR20抗体免疫染色的胃肠道间质瘤GIST的图像。图12-1显示了染色的胃衍生的GIST的图像。
[图12-2]图12-2显示了用大鼠抗人GPR20抗体和商购可得的兔抗GPR20抗体免疫染色的胃肠道间质瘤GIST的图像。图12-2显示了染色的小肠衍生的GIST的图像。
[图12-3]图12-3显示了用大鼠抗人GPR20抗体和商购可得的兔抗GPR20抗体免疫染色的胃肠道间质瘤GIST的图像。图12-3显示了大肠胃衍生的GIST的图像。
[图13]图13显示了在衍生自皮下PC-3-、GIST430或GIST430/654移植的小鼠的肿瘤组织中，用大鼠抗GPR20抗体04-093、兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体染色的GPR20的图像。
[图14-1]图14-1显示了用大鼠抗GPR20抗体04-093、兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体免疫染色的胃肠道间质瘤GIST的图像。图14-1显示了染色的胃衍生的GIST的图像。
[图14-2]图14-2显示了用大鼠抗GPR20抗体04-093、兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体免疫染色的胃肠道间质瘤GIST的图像。图14-2显示了染色的小肠衍生的GIST的图像。
[图14-3]图14-3显示了用大鼠抗GPR20抗体04-093、兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体免疫染色的胃肠道间质瘤GIST的图像。图14-3显示了大肠胃衍生的GIST的图像。
[图15]图15显示了大鼠抗GPR20单克隆抗体针对由来自人GPR20的N末端的氨基酸位置1至48组成的合成肽、以及由其中的氨基酸位置30至48组成的合成肽的结合活性。横坐标表示克隆编号，且纵坐标表示基于化学发光强度（CPS）结合的抗体量。
[图16]图16显示了04-093抗体的表位（SEQ ID NO：31：在人GPR20的位置30至42处的氨基酸序列）。
[图17]图17是显示了通过使用OcH1L1、OcH2L1、OcChimera、兔IgG、抗FLAG和抗β肌动蛋白的蛋白质印迹的检测结果的图解。
实施方案的描述
1. 定义
在本发明中，术语“基因”用于意指包含编码蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸、或其互补链。术语“基因”意欲包括例如多核苷酸、寡核苷酸、DNA、mRNA、cDNA和cRNA，作为包含编码蛋白质的氨基酸序列的核苷酸序列的核苷酸、或其互补链。此类基因是单链、双链、三链或其它多链核苷酸。术语“基因”还意欲包括DNA和RNA链的聚集体，在一条核苷酸链上的核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）的混合物，以及包含此类核苷酸链的双链、三链或其它多链核苷酸。本发明的“GPR20基因”的实例可以包括DNA、mRNA、cDNA和cRNA，其包含编码GPR20蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
在本发明中，术语“核苷酸”用于具有与术语“核酸”的那种相同的含义，并且还意欲包括例如DNA、RNA、探针、寡核苷酸、多核苷酸和引物。此类核苷酸是单链、双链、三链或其它多链核苷酸。术语“核苷酸”还意欲包括DNA和RNA链的聚集体，在一条多核苷酸链上的核糖核苷酸（RNA）和脱氧核糖核苷酸（DNA）的混合物，以及包含此类核苷酸链的两条链或者三条或更多条链的聚集体。
在本发明中，术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”的使用具有相同的含义。
在本发明中，术语“抗原”有时用于意指“免疫原”。
在本发明中，术语“细胞”还用于包括例如衍生自各个动物的各种细胞、传代培养细胞、原代培养细胞、细胞系、重组细胞和微生物细胞。
在本发明中，识别GPR20的每种抗体也称为“抗GPR20抗体”。此类抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、兔型抗体、人源化抗体、人抗体等等。
在本发明中，术语“抗体的功能片段”用于意指发挥原始抗体的至少一部分功能的抗体片段。“抗体的功能片段”的实例可以包括但不限于抗原结合片段，例如Fab、F（ab'）2、scFv、Fab'和单链免疫球蛋白。此类抗体的功能片段可以通过用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体蛋白的全长分子来获得，或者可以是使用重组基因在适当的宿主细胞中产生的重组蛋白。
在本发明中，抗体与之结合的“位点”，即由抗体识别的“位点”，用于意指由抗体结合或识别的抗原上的部分肽或部分构象。在本发明中，此类位点也称为抗体的表位或结合位点。GPR20蛋白上由本发明的抗GPR20抗体结合或识别的位点的实例可以包括GPR20蛋白上的部分肽或部分构象。
已知抗体分子的重链和轻链各自具有三个互补决定区（CDR）。此类互补决定区也称为高变区，并且位于抗体的重链和轻链的可变区中。这些区域具有特别高度可变的一级结构，并且通常在重链和轻链各自中的多肽链的一级结构上分成三个位点。在本发明中，关于抗体的互补决定区，从重链的氨基酸序列的氨基末端侧起，重链的互补决定区分别称为CDRH1、CDRH2和CDRH3，而从轻链的氨基酸序列的氨基末端侧起，轻链的互补决定区分别称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。这些位点在三维结构上彼此定位接近，并且确定抗体对抗体与之结合的抗原的特异性。
在本发明中，术语“抗体突变体”用于意指这样的多肽，其通过氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入（下文统称为“突变”），具有的氨基酸序列衍生自原始抗体的氨基酸序列，并且与本发明的GPR20蛋白结合。此类抗体突变体中突变氨基酸的数目是1或2、1至3、1至4、1至5、1至6、1至7、1至8、1至9、1至10、1至12、1至15、1至20、1至25、1至30、1至40或1至50。此类抗体突变体也包括在本发明的“抗体”中。
在本发明中，短语“一个至几个”中的术语“几个”用于意指3至10。
由本发明的抗体施加的活性或特性的实例可以包括生物活性和物理化学特性，并且可以具体包括各种生物活性、针对抗原或表位的结合活性、在生产或保存时的稳定性和热稳定性。
在本发明中，短语“在严格条件下杂交”用于意指杂交在涉及在65℃下在含有5 ×SSC的溶液中杂交的条件下进行，随后为在65℃下在含有2 × SSC-0.1% SDS的水溶液中的20分钟洗涤，在65℃下在含有0.5 × SSC-0.1% SDS的水溶液中的20分钟洗涤，以及在65℃下在含0.2 × SSC-0.1% SDS的水溶液中或在与其等价的条件下的20分钟洗涤。SSC是150mM NaCl-15 mM柠檬酸钠的水溶液，并且n × SSC意指浓度为n倍的SSC。
在本发明中，术语“细胞毒性”用于意指以任何给定方式对细胞造成病理变化。该术语不仅意指直接创伤，还意指对细胞造成的所有类型的结构或功能损伤，例如DNA切割、碱基二聚体的形成、染色体切割、对细胞有丝分裂器的损伤、以及各种类型的酶活性中的减少。
在本发明中，术语“细胞毒活性”用于意指引起细胞毒性。在本发明中，术语“抗体依赖性细胞毒性（ADCC）活性”用于意指通过NK细胞经由抗体损伤靶细胞如肿瘤细胞的效应或活性。
在本发明中，术语“癌症”用于具有与术语“肿瘤”的那种相同的含义。
在本发明中，术语“免疫组织化学（IHC）”用于意指检测组织制剂中的抗原的组织学（组织化学）方法。术语“免疫组织化学”具有与“免疫抗体方法”以及“免疫染色”的那种相同的含义。
在本发明中，术语“变性的GPR20”用于意指在福尔马林中固定的制剂中的GPR20分子。在福尔马林固定，用石蜡处理并通过脱石蜡处理的制剂中的GPR20分子也被称为“变性的GPR20”。
在本发明中，术语“非变性的GPR20”用于意指未在福尔马林中固定的样品中的GPR20。未在福尔马林中固定的制剂中的GPR20分子也称为“非变性的GPR20”。
2. GPR20
本发明中使用的GPR20可以直接从人或非人哺乳动物（例如，豚鼠、大鼠、小鼠、兔、猪、绵羊、牛或猴）或鸡的T细胞或肥大细胞中纯化，然后可以使用，或者可以制备上述细胞的细胞膜级分，并且可以用作GPR20。可替代地，GPR20也可以通过在体外合成或通过允许宿主细胞经由遗传操作产生GPR20而获得。根据此类遗传操作，GPR20蛋白可以通过以下具体地获得：将GPR20 cDNA掺入能够表达GPR20 cDNA的载体内，然后在含有酶、底物以及转录和翻译所需的含能材料的溶液中合成GPR20，或者转化其它原核生物或真核生物的宿主细胞，以便允许其表达GPR20。
人GPR20 cDNA的核苷酸序列在GenBank中在登录号NM_005293下登记。人GPR20的氨基酸序列也在GenBank中在登录号NP_005284下登记。
GPR20 cDNA可以通过例如所谓的PCR方法来获得，在所述PCR方法中，使用来自GPR20 mRNA表达器官的cDNA文库或从人细胞提取的基因组DNA作为模板，并使用能够特异性扩增GPR20 cDNA的引物来执行聚合酶链反应（下文称为“PCR”）（Saiki，R.K.等人，Science（1988）239，487-491）。
在严格条件下与由编码人GPR20的核苷酸序列互补的核苷酸序列组成的多核苷酸杂交，并且编码具有与GPR20的那种等价的生物活性的蛋白质的多核苷酸，也包括在GPR20cDNA中。另外，由人GPR20基因基因座转录的剪接变体、或在严格条件下与其杂交的多核苷酸、编码具有与GPR20的那种等价的生物活性的蛋白质的剪接变体或多核苷酸，也包括在GPR20 cDNA中。
由氨基酸序列（所述氨基酸序列通过1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自人GPR20的氨基酸序列）组成，并且具有与GPR20等价的生物活性的蛋白质也包括在GPR20中。另外，由氨基酸序列组成，并且具有与GPR20的那种等价的生物活性的蛋白质也包括在GPR20中，所述氨基酸序列由从人GPR20基因基因座转录的剪接变体编码，或者通过1、2、3、4或5个氨基酸的取代、缺失或添加而衍生自氨基酸序列。
本说明书中使用的人GPR20的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：1中。
3. 抗GPR20抗体的产生
本发明的针对GPR20的抗体可以通过以下来获得：通过常规方法用GPR20或选自GPR20的氨基酸序列的任何给定多肽免疫动物，然后收集且纯化在其活体中产生的抗体。抗原GPR20的生物种类并不限于人，并且因此，动物也可以用衍生自非人动物如猴、小鼠或大鼠的GPR20免疫。在这种情况下，可以通过检查所获得的结合异源GPR20的抗体与人GPR20的交叉反应性来选择适用于人疾病的抗体。应注意，抗原GPR20可以通过允许宿主细胞根据遗传操作产生GPR20基因而获得。具体地，产生能够表达GPR20基因的载体，然后将载体引入宿主细胞内，使得基因在其中表达，并且其后，可以纯化所表达的GPR20。
本发明的针对GPR20的抗体也可以通过使用DNA免疫方法来获得。DNA免疫方法是涉及以下的方法：用抗原表达质粒转染动物（例如小鼠或大鼠）个体，然后在个体中表达抗原以诱导针对抗原的免疫。转染方法包括将质粒直接注射到肌肉中的方法，将转染试剂如脂质体或聚乙烯亚胺注射到静脉中的方法，使用病毒载体的方法，使用基因枪注射附着有质粒的金颗粒的方法，将大量质粒溶液快速注射到静脉中的流体动力学方法等等。关于将表达质粒注射到肌肉中的转染方法，称为体内电穿孔的技术，其涉及将电穿孔应用于质粒的肌内注射部位，作为用于改善表达水平的方法已知（Aihara H，Miyazaki J. NatBiotechnol. 1998 Sep；16（9）: 867-70或Mir LM，Bureau MF，Gehl J，Rangara R，Rouy D，Caillaud JM，Delaere P，Branellec D，Schwartz B，Scherman D. Proc Natl Acad Sci US A. 1999 Apr 13；96（8）: 4262-7）。该方法通过在质粒的肌内注射之前用透明质酸酶处理肌肉进一步改善表达水平（McMahon JM1，Signori E，Wells KE，Fazio VM，Wells DJ.，Gene Ther. 2001 Aug；8（16）: 1264-70）。
产生针对GPR20的抗体的抗体产生细胞可以根据已知方法（例如，Kohler和Milstein，Nature（1975）256，第495-497页；以及Kennet，R.编辑，Monoclonal Antibodies，第365-367页，Plenum Press，N.Y.（1980）），与骨髓瘤细胞融合，以建立从其中可以获得单克隆抗体的杂交瘤。此类方法的具体实例描述于国际公开号WO09/48072（于2009年4月16日公开）和WO10/117011（于2010年10月14日公开）中。
因此建立的大鼠抗人GPR20抗体的具体实例可以包括04-093抗体。04-093抗体的重链的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：3中，并且编码重链的核苷酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：2中。04-093抗体的轻链的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ IDNO：11中，并且编码轻链的核苷酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：10中。04-093抗体特异性结合包含在SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1至48处的氨基酸序列的肽。另外，04-093抗体结合由肽中的氨基酸序列LEVPLFHLFARLD（SEQ ID NO：31）组成的表位，所述肽包含在SEQID NO：1中的氨基酸位置1至48处的氨基酸序列。
本发明的抗体可以是保留04-093抗体的所有6个CDR序列，并且具有结合GPR20的活性的任何抗体。具体地，本发明的抗体的重链可变区具有由SEQ ID NO：5或8（GFTFNNYWMT（基于Abm的定义）或NYWMT（基于Kabat的定义））中所示的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQID NO：6或9（SITNIDGSSY（基于Abm的定义）或SITNIDGSSYYPDSVKG（基于Kabat的定义））中所示的氨基酸序列组成的CDRH2、以及由SEQ ID NO：7（GSFDY）中所示的氨基酸序列组成的CDRH3。上述抗体的轻链可变区具有由SEQ ID NO：13（KASQNVNKYLN）中所示的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO：14（NTNNLQT）中所示的氨基酸序列组成的CDRL2、以及由SEQ IDNO：15（FQHVSWLT）中所示的氨基酸序列组成的CDRL3。这些CDR的氨基酸序列也显示于图3中。
本发明的抗体特异性识别GPR20蛋白。换言之，本发明的优选抗体特异性结合GPR20蛋白。
某种形式的优选抗体在福尔马林中固定的制剂中特异性结合非变性的人GPR20和变性的人GPR20两者。抗体的更优选实例可以包括但不限于在福尔马林固定的制剂中特异性结合非变性的人GPR20和变性的人GPR20两者的抗体，并且不与GPR家族的其它成员特异性结合。
本发明的抗体还包括已对于减少异源抗原性的目的而进行人工修饰的遗传重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、兔型抗体和小鼠型抗体、以及针对GPR20的上述单克隆抗体。这些抗体可以通过已知方法产生。
嵌合抗体的实例可以包括其中可变区和恒定区彼此异源的抗体，例如通过将小鼠或大鼠衍生的抗体的可变区与人衍生的恒定区缀合而形成的嵌合抗体（参见Proc. Natl.Acad. Sci. U.S.A.，81，6851-6855，（1984））。它的其它实例可以包括通过将小鼠或大鼠衍生的抗体的可变区与兔衍生的恒定区缀合而形成的嵌合抗体。
兔嵌合抗体的其它具体实例可以包括包含重链（OcHch）和轻链（OcLch）的抗体，所述重链包含衍生自04-093抗体的重链可变区和兔重链恒定区，所述轻链包含衍生自04-093抗体的轻链可变区和兔轻链恒定区。OcHch的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：19的氨基酸位置20至456处。OcLch的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：21的氨基酸位置21至232处。
本发明的抗体包括上述人源化抗体和通过修饰兔型抗体的CDR形成的抗体。这些抗体可以通过使用已知方法产生。
人源化抗体的实例可以包括通过仅将互补决定区（CDR）掺入人衍生的抗体内形成的抗体（参见Nature（1986）321，第522-525页），以及通过将一些构架中的氨基酸残基以及CDR序列移植到人抗体内形成的抗体（国际公开号WO90/07861）。兔型抗体的实例可以包括通过仅将互补决定区（CDR）掺入兔衍生的抗体内形成的抗体，以及通过将一些构架中的氨基酸残基以及CDR序列移植到兔抗体内形成的抗体。CDR的氨基酸序列可以通过已知方法，例如Kabat的定义、Chothia的定义或Abm的定义进行测定。根据本发明的CDR可以通过任何方法定义。
兔型抗体的进一步具体实例可以包括04-093抗体的兔型抗体。它的更具体的实例可以包括包含重链（OcH01）或（OcH02）和轻链（OcL01）的兔型抗体，所述重链（OcH01）由在序列表中的SEQ ID NO：23的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成、或所述重链（OcH02）由在SEQ ID NO：25的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成，所述轻链（OcL01）由在SEQ IDNO：27的氨基酸位置21至230处的氨基酸序列组成。
已知在培养的哺乳动物细胞中产生的抗体重链的羧基末端处的赖氨酸残基被缺失（Journal of Chromatography A，705：129-134（1995）），并且还已知在重链羧基末端处的两个氨基酸残基，甘氨酸和赖氨酸被缺失，并且位于羧基末端处的脯氨酸残基是新近酰胺化的（Analytical Biochemistry，360：75-83（2007））。然而，这些重链序列的此类缺失和修饰对抗体的抗原结合活性和效应子功能（补体的激活、抗体依赖性细胞毒性等）没有影响。相应地，本发明还包括已经历上述修饰的抗体，并且此类抗体的具体实例可以包括包含在重链羧基末端处的1或2个氨基酸缺失的缺失突变体，以及通过使上述缺失突变体酰胺化形成的缺失突变体（例如，其中在羧基末端位点处的脯氨酸残基被酰胺化的重链）。然而，涉及在根据本发明的抗体重链的羧基末端处的缺失的缺失突变体并不限于上述缺失突变体，只要它们保留抗原结合活性和效应子功能。构成根据本发明的抗体的两条重链可以是选自全长抗体和上述缺失突变体的任何一种类型的重链，或者可以是选自上述组的任何两种类型的组合。各个缺失突变体的比率可以受产生根据本发明的抗体的培养的哺乳动物细胞的类型和培养条件影响。根据本发明的抗体的主要成分的实例可以包括其中在两条重链的每个羧基末端各自处缺失一个氨基酸残基的抗体。
通过上述方法获得的抗体就其针对抗原的结合活性进行评估，使得可以选择优选的抗体。用于比较抗体特性的另一种指示剂的一个实例可以包括抗体的稳定性。差示扫描量热法（DSC）是能够迅速准确地测量热变性中点（Tm）的方法，所述Tm充当关于蛋白质的相对结构稳定性的良好指示剂。通过使用DSC测量Tm值并对获得的值进行比较，可以比较热稳定性中的差异。已知抗体的保存稳定性与抗体的热稳定性具有一定的关联性（Lori Burton等人，Pharmaceutical Development and Technology（2007）12，第265-273页），并且因此，可以使用热稳定性作为指示剂来选择优选抗体。用于选择抗体的指示剂的其它实例可以包括在合适的宿主细胞中的高产率和在水溶液中的低凝集。例如，由于具有最高产率的抗体并不总是表现出最高的热稳定性，因此有必要通过基于上述指示剂综合确定其来选择最适合的抗体。
通过经由适当的接头连接抗体的全长重链和轻链序列用于获得单链免疫球蛋白的方法也是已知的（Lee，H-S等人，Molecular Immunology（1999）36，61-71；以及Shirrmann，T.等人，mAbs（2010），2（1），1-4）。此类单链免疫球蛋白可以二聚化，以保留与抗体的那些相似的结构和活性，所述抗体最初是四聚体。此外，本发明的抗体可以是具有单个重链可变区且不具有轻链序列的抗体。在骆驼或美洲驼中观察到称为单结构域抗体（sdAb）或纳米抗体的此类抗体，并且已报道保留抗原结合能力（Muyldemans S.等人，ProteinEng.（1994）7（9），1129-35；Hamers-Casterman C.等人，Nature（1993）363（6428）446-8）。这些抗体可以解释为根据本发明的抗体的一种抗原结合片段。
一旦分离出抗体基因，就可以使用宿主和表达载体的适当组合，将基因引入适当的宿主内以产生抗体。抗体基因的具体实例可以是编码本说明书中描述的抗体的重链序列的基因和编码其中描述的抗体的轻链序列的基因的组合。在宿主细胞的转化后，可以将此类重链序列基因和轻链序列基因插入单个表达载体内，或者相反，可以将这些基因各自插入不同的表达载体内。当真核细胞用作宿主时，可以使用动物细胞、植物细胞或真核微生物。动物细胞的实例可以包括（1）哺乳动物细胞，例如其为猴细胞的COS细胞（Gluzman，Y.，Cell（1981）23，第175-182页，ATCC CRL-1650）、小鼠成纤维细胞NIH3T3（ATCC编号CRL-1658）、以及中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞，ATCC CCL-61）的二氢叶酸还原酶缺陷细胞系（Urlaub，G.和Chasin，L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.（1980）77，第4126-4220页）。当原核细胞用作宿主时，例如可以使用大肠杆菌（Escherichia coli）或枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。将目标抗体基因引入这些细胞内用于转化，然后在体外培养转化细胞以获得抗体。在上述培养方法中，存在其中产率根据抗体的序列而不同的情况，并且因此，能够使用产率作为指示剂，从具有等价结合活性的抗体中选择容易地作为药剂产生的抗体。
本发明抗体的同种型的实例可以包括但不限于IgG（IgG1、IgG2、IgG3和IgG4）、IgM、IgA（IgA1和IgA2）、IgD和IgE，优选IgG或IgM，更优选IgG1或IgG2。
本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合部分的抗体的抗原结合片段，或其修饰。抗体的片段可以通过用蛋白水解酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体，或通过经由基因工程方法修饰抗体基因并允许适当的培养细胞表达基因来获得。在此类抗体片段中，保留全长抗体分子的全部或一部分功能的片段可以称为抗体的抗原结合片段。抗体功能的实例一般可以包括抗原结合活性、中和抗原活性的活性、增强抗原活性的活性、抗体依赖性细胞细胞毒性活性、补体依赖性细胞毒性活性和补体依赖性细胞细胞毒性活性。由根据本发明的抗体的抗原结合片段保留的功能是针对GPR20的结合活性。
抗体片段的实例可以包括Fab、F（ab'）2、Fv、包含经由适当的接头连接的重链和轻链Fv片段的单链Fv（scFv）、双抗体（多种双抗体）、线性抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。另外，通过在还原条件下处理F（ab'）2而获得的抗体可变区的单价片段的Fab'包括在抗体片段中。
本发明的抗体可以是对于至少两种不同抗原具有特异性的多特异性抗体。此类分子通常与两种类型的抗原结合（即双特异性抗体）。根据本发明的“多特异性抗体”包括对于多种（例如，三种类型的）抗原具有特异性的抗体。
本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或由此类抗体的片段组成的抗体（例如，F（ab'）2双特异性抗体）。双特异性抗体可以通过连接两种类型抗体的重链和轻链（HL对）产生，或者可以通过融合产生不同单克隆抗体的杂交瘤来产生，以产生双特异性抗体产生的融合细胞（Millstein等人，Nature（1983）305，第537-539页）。
本发明的抗体可以是单链抗体（也称为scFv）。通过经由多肽接头连接抗体重链可变区和轻链可变区来获得单链抗体（Pluckthun，The Pharmacology of MonoclonalAntibodies，113（Rosenberg和Moore编辑，Springer Verlag，New York，第269-315页（1994）；以及Nature Biotechnology（2005），23，第1126-1136页）。可替代地，通过经由多肽接头连接两个scFv产生的biscFv片段可以用作双特异性抗体。
用于产生单链抗体的方法是本领域众所周知的（参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513和5,455,030）。在该scFv中，重链可变区和轻链可变区经由接头连接，所述接头不形成缀合物，优选多肽接头（Huston，J.S.等人，Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A.（1988），85，5879-5883）。scFv中的重链可变区和轻链可变区可以衍生自相同的抗体或可以衍生自不同的抗体。例如，由12至19个残基组成的任何给定的单链肽用作连接这些可变区的多肽接头。
为了获得编码抗体的重链或重链可变区的DNA序列和编码其轻链或轻链可变区的DNA的scFv编码DNA，编码完整或所需氨基酸序列的每个DNA部分用作模板，并且使用侧接模板的两个末端的引物对通过PCR扩增。随后，编码多肽接头部分的DNA与侧接DNA的两个末端的引物对组合进一步扩增，使得所得到的片段可以在其末端处与重链和轻链DNA连接。
一旦产生scFv编码DNA，就可以根据常规方法获得含有DNA的表达载体和用表达载体转化的宿主，并且可以使用宿主根据常规方法获得scFv。这些抗体片段可以通过以与上述相同的方式获得且表达其基因而在宿主中产生。
可以将本发明的抗体多聚化以增强其对于抗原的亲和力。在这种情况下，可以使相同类型的抗体多聚化，或者可以将分别识别相同抗原的多个表位的多种抗体多聚化。用于使这些抗体多聚化的方法的实例可以包括两种scFv与IgG CH3结构域的结合，这些与链霉抗生物素蛋白的结合，以及螺旋-转角-螺旋基序的引入。
本发明的抗体可以是多克隆抗体，其为在氨基酸序列中不同的多种抗GPR20抗体的混合物。多克隆抗体的一个实例可以包括在CDR中不同的多种抗体的混合物。此类多克隆抗体可以是通过培养产生不同抗体的细胞混合物获得的培养物中纯化的抗体（参见WO2004/061104）。
与各种分子如聚乙二醇（PEG）缀合的抗体也可以用作抗体的修饰。
本发明的抗体可以是由抗体和另外的药物形成的缀合物（免疫缀合物）。此类抗体的实例可以包括抗体与放射性物质或具有药理效应的化合物的缀合物（NatureBiotechnology（2005）23，第1137-1146页）。
可以将获得的抗体纯化至同质状态。对于抗体的分离和纯化，可以使用用于普通蛋白质的分离和纯化方法。例如，适当选择柱层析、过滤、超滤、盐析、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦，并且彼此组合，使得可以分离且纯化抗体（Strategies forProtein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual，DanielR. Marshak等人编辑，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1996）；以及Antibodies:A Laboratory Manual.编辑Harlow和David Lane，Cold Spring Harbor Laboratory（1988）），尽管分离和纯化方法的实例并不限于此。
层析的实例可以包括亲和层析、离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤层析、反相层析和吸附层析。这些层析技术可以使用液相层析法如HPLC或FPLC进行。亲和层析中使用的柱的实例可以包括蛋白A柱和蛋白G柱。涉及使用蛋白A的柱的实例可以包括Hyper D、POROS和Sepharose F. F.（Pharmacia）。此外，使用抗原固定的载体，可以通过利用抗体与抗原的结合活性来纯化抗体。
4. 药物组合物
本发明提供了药物组合物，其包含抗GPR20抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰。
本发明的药物组合物可用于治疗或预防各种疾病，所述疾病由于GPR20或其配体的过表达、或者GPR20突变或基因扩增的异常或增加的GPR20信号而起始或恶化（下文称为“GPR20相关疾病”），特别是各种癌症。
待治疗或预防的此类癌症的起始或恶化的原因的实例可以包括GPR20基因中的单核苷酸多态性（SNP）、GPR20的高表达、组成型激活GPR20的错义突变、GPR20基因的扩增或过表达、以及GPR20同种型的转换。
此类癌症类型的实例可以包括胃肠道间质瘤（GIST），并且可以优选包括表达GPR20蛋白的胃肠道间质瘤（GIST）。
在本发明中，疾病的治疗或预防包括但不限于疾病优选表达GPR20蛋白的个体中的疾病发作的预防、其恶化或进展的压制或抑制、由患有该疾病的个体显示出的一种或两种或更多种症状的减轻、其恶化或进展的压制或缓解、继发性疾病的治疗或预防等。
本发明的药物组合物可以含有治疗或预防有效量的抗GPR20抗体或抗体的功能片段，以及药学上可接受的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或添加剂。
“治疗或预防有效量”意指借助于特定剂型和给药途径对特定疾病具有治疗或预防作用的量，并且具有与“药理学有效量”的那种相同的含义。
本发明的药物组合物可以含有用于改变、维持或保持组合物或其中含有的抗体的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、张力、无菌或稳定性、溶解性、持续释放、吸收性、渗透性、剂型、强度、特性、形状等的材料（下文称为“药物材料”）。药物材料并无特别限制，只要该材料是药理学上可接受的。例如，无毒或低毒性是优选由这些药物材料具有的特性。
药物材料的实例可以包括氨基酸、抗微生物剂、抗氧化剂、缓冲剂、填料、螯合剂、络合剂、填充剂、单糖、二糖、烃、着色剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物、防腐剂、溶剂、糖醇、悬浮剂、表面活性剂、稳定性增强剂、弹性增强剂、转运试剂、稀释剂、赋形剂和/或药物添加剂。加入的这些材料的量是抗GPR20抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰的重量的0.001至1000倍，优选0.01至100倍，且更优选0.1至10倍。
包含封装在脂质体中的抗GPR20抗体或其功能片段、或抗体或功能片段的修饰的免疫脂质体，或者含有包含与脂质体缀合的抗体的抗体修饰的药物组合物（美国专利号6214388）等，也包括在本发明的药物组合物中。
赋形剂或载体并无特别限制，只要它们是通常用于注射用水、盐水、人造脑脊髓液、以及用于经口或肠胃外施用的其它制剂的液体或固体材料。盐水的实例可以包括中性盐水和含血清白蛋白的盐水。
缓冲剂的实例可以包括经调节以使药物组合物的最终pH达到7.0至8.5的Tris缓冲液，经调节以使最终pH达到4.0至5.5的乙酸盐缓冲液，经调节以使最终pH达到5.0至8.0的柠檬酸盐缓冲液，以及经调节以使最终pH达到5.0至8.0的组氨酸缓冲液。
本发明的药物组合物是固体、液体、悬浮液等等。本发明的药物组合物的另一个实例可以包括冷冻干燥的制剂。可以使用赋形剂如蔗糖形成冻干制剂。
本发明的药物组合物的施用途径可以是肠内施用、局部施用和肠胃外施用中的任一种。其实例可以包括静脉内施用、动脉内施用、肌内施用、皮内施用、皮下施用、腹膜内施用、透皮施用、骨内施用和关节内施用。
药物组合物的组成可以根据施用方法、抗体对于GPR20蛋白的结合亲和力等进行确定。随着本发明的抗GPR20抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰的亲和力增加（即，Kd值很低），即使其应用的剂量降低，药物组合物也可以发挥药效。
本发明的抗GPR20抗体的剂量不受限制，只要剂量是药理学有效量。剂量可以基于个体的物种、疾病的类型、症状、性别、年龄、预先存在的状况、抗体对于GPR20蛋白的结合亲和力或其生物活性、以及其它因素来适当地确定。通常0.01至1000 mg/kg，优选0.1至100mg/kg的剂量可以每1至180天施用一次、或者每天施用两次或三次或更多次。
药物组合物的形式的实例可以包括注射剂（包括冷冻干燥制剂和滴剂）、栓剂、经鼻吸收制剂、经皮吸收制剂、舌下制剂、胶囊、片剂、软膏、颗粒、气溶胶、丸剂、粉末、悬浮液、乳液、滴眼剂和生物植入物制剂。
包含抗GPR20抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰作为活性成分的药物组合物可以与另外的药剂同时或分开施用。例如，包含抗GPR20抗体或抗体的功能片段作为活性成分的药物组合物可以在施用另外的药剂后施用，或者另外的药剂可以在施用药物组合物后施用。可替代地，药物组合物和另外的药剂可以同时施用。另外的药剂的实例可以包括各种抗癌剂，例如化学治疗剂和放射疗法。这些情况统称为本发明的抗体“与另外的药剂的组合使用”。包含本发明的抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰以及另外的药物的药物组合物也包括在本发明中。
本发明还提供了用于治疗或预防GPR20相关疾病如癌症的方法，本发明的抗体用于制备用于治疗或预防疾病的药物组合物的用途，以及本发明的抗体用于治疗或预防疾病的用途。包含本发明的抗体的用于治疗或预防的试剂盒也包括在本发明中。
5. 用于诊断的组合物
本发明提供了用于测试或诊断的组合物（下文称为“用于诊断的组合物”），其包含抗GPR20抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰。
本发明的用于诊断的组合物可用于测试或诊断GPR20相关疾病，例如癌症和胃肠道间质瘤（GIST），或者GPR20表达。在本发明中，测试或诊断包括例如确定或测量发展疾病的风险、确定疾病的存在或不存在、测量疾病的进展或恶化程度、使用包含抗GPR20抗体等等的药物组合物测量或确定药物疗法的效应、测量或确定除药物疗法外的疗法的效应、测量疾病复发的风险、以及确定疾病复发的存在或不存在，尽管根据本发明的测试或诊断并不限于此。
本发明的用于诊断的组合物可用于鉴定关于本发明的抗GPR20抗体或其功能片段、或抗体或功能片段的修饰、包含其的组合物、或包含其的药物组合物的受体个体。
用于诊断的组合物可以含有pH缓冲剂、渗透压调节剂、盐、稳定剂、防腐剂、显色剂、敏化剂、聚集抑制剂等等。
本发明提供了用于测试或诊断GPR20相关疾病如癌症的方法，本发明的抗体用于制备用于诊断疾病的组合物的用途，以及本发明的抗体用于测试或诊断疾病的用途。包含本发明的抗体的用于测试或诊断的试剂盒也包括在本发明中。
使用本发明的用于诊断的组合物的测试或诊断方法期望地是夹心ELISA。可以使用任何通常的使用抗体的检测方法，例如ELISA、RIA、ELISPOT（酶联免疫斑点）、斑点印迹、Ouchterlony测试、CIE（对流免疫电泳）、CLIA（化学发光免疫测定）或FCM（流式细胞术）。抗体可以通过使用生物素的方法或者通过生化分析中可行的标记方法，使用发光团或荧光团如HRP、碱性磷酸酶、FITC或ALEXA、标记如放射性同位素等等进行标记。显色底物，如TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）、BCIP（5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯）、ρ-NPP（对硝基苯基磷酸酯）、OPD（邻苯二胺）、ABTS（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）和SuperSignal ELISA PicoChemiluminescent Substrate（Thermo Fisher Scientific Inc.）、荧光底物QuantaBlu（R）Fluorogenic Peroxidase Substrate（Thermo Fisher Scientific Inc.）、以及化学发光底物可以用于使用酶促标记的检测中。衍生自人或非人动物的样品以及人工处理的样品如重组蛋白可以经受该测定。衍生自各个生物的测试样品的实例可以包括但不限于血液、滑液、腹水、淋巴、脑脊髓液、组织匀浆上清液和组织切片。
包含本发明的抗体的用于测试或诊断的夹心ELISA试剂盒可以包含对照（GPR20衍生肽的标准溶液）、着色试剂、用于稀释的缓冲溶液、用于固相的抗体、用于检测的抗体和洗涤液等等。例如，吸光度、荧光、发光或RI（放射性同位素）方法优选应用于测量与抗原结合的抗体量的方法。在测量中优选使用吸光度板阅读器、荧光板阅读器、发光板阅读器、RI液体闪烁计数器等等。
本发明的抗体可以用于上述免疫组织学测试以及蛋白质印迹或斑点印迹中，其涉及根据常规方法从样品中的细胞、组织或器官或其一部分制备溶解的蛋白质，并且使标记的抗体与溶解的蛋白质反应，以确认溶解的蛋白质中GPR20的存在或不存在。待测试的样品包括但不限于由各种细胞分泌的外来体等等制备的溶解的蛋白质，所述细胞包括体液如血液中含有的细胞、血液循环肿瘤细胞和癌细胞。
本发明提供了可用于免疫组织化学（IHC）分析的抗体或其功能片段，以及抗体或功能片段的修饰，以及包含其的组合物。此类组合物也包括在本发明的“用于诊断的组合物”中。
免疫组织化学没有并无限制，只要这种方法涉及使组织切片与抗原结合抗体（第一抗体）反应，并且检测与抗原结合的第一抗体。优选在福尔马林固定后通过石蜡包埋处理组织切片。将因此包埋在石蜡中的组织切片切片，然后脱石蜡，随后为抗原修复处理和非特异性反应抑制处理。用于抗原修复处理的方法的实例可以包括热处理和使用蛋白酶等等的酶促处理。热处理是优选的。热处理通常在优选条件下执行，所述优选条件涉及90至110℃的温度、pH 8至10以及在20至60分钟范围内的处理时间。可以在pH调节中使用Tris-EDTA缓冲溶液（例如，含有1 mM EDTA的10 mM Tris缓冲溶液）等等。用于使其催化活性与用于显色中的酶的那种相同或相似的内源酶失活的方法通常用作非特异性反应抑制处理。对于通过过氧化物酶反应的显色，优选使用H2O2等等预先抑制组织中存在的内源性过氧化物酶。溶剂如水或甲醇的可以用于H2O2。H2O2的浓度为0.1至3%，优选0.3至3%。H2O2溶液可以补充有叠氮化钠。另外，使用血清或酪蛋白的阻断方法也可以用作非特异性反应抑制处理。在第一抗体反应之前，可以用血清或酪蛋白处理组织。可替代地，血清或酪蛋白可以包含在用于稀释第一抗体的溶剂中。
关于第一抗体的反应条件并无特别限制，并且涉及4至50℃，优选20至37℃，且更优选24℃的温度。反应时间为5分钟至一天一夜，优选10分钟至4小时，且更优选30分钟至1小时。
优选地，能够显现并结合第一抗体的抗体（第二抗体）可以用于第一抗体的检测中。可以使用与第二抗体本身结合的抗体（第三抗体）执行三个或更多个反应。第二抗体或第三抗体可以优选通过使用涉及以下的方法来显现：使酶如过氧化物酶或碱性磷酸酶与这些抗体缀合，或将生物素等等加入这些抗体中，并且与缀合有酶的链霉抗生物素蛋白等等结合，随后为与适合酶的显色底物反应。用于使酶与第二抗体或第三抗体缀合的方法的实例可以包括使用包含糊精聚合物或氨基酸聚合物的试剂的方法，酶和第二抗体的许多分子附着于所述聚合物（聚合物方法）。显色底物如DAB可以用于使生物素化的第二抗体与过氧化物酶标记的链霉抗生物素蛋白反应的方法（LSAB方法）中。可替代地，可以使用由荧光染料等等标记的第二抗体。当用荧光标记的第二抗体处理样品时，在处理后在荧光显微镜下检测阳性细胞。
涂片方法涉及通过应用于玻璃或在离心机中离心将切除的细胞分离成细胞组分和流体组分，并且使细胞组分免疫染色。具体地，可以将细胞组分应用到载玻片上，在乙醇溶液、10%福尔马林溶液等等中固定，然后以与组织切片中相同的方式进行免疫染色。
冷冻包埋方法涉及将切除的组织包埋在OCT化合物等等中，然后使包埋的组织在液氮等等中快速冷冻，并且使用低温恒温器使冷冻的组织切片，以制备载玻片制剂。该制剂可以在10%福尔马林溶液、乙醇溶液等等中固定，然后以与组织切片中相同的方式进行免疫染色。
免疫组织化学程序可以使用由反应溶液、反应条件、洗涤运行次数等编程的免疫仪器自动执行。
对于诊断成像，抗体用药学上可接受的放射性核素或发光材料进行标记，并且施用于测试受试者，并且可以使用诊断成像技术如PET/CT拍摄图像，以确定或测试GPR20的存在。
本发明的用于诊断的组合物中包含的抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰，优选为与GPR20结合的抗体，即具有GPR20选择性的抗体或其功能片段、或者抗体或功能片段的修饰。
具有人GPR20选择性的抗体的实例可以包括包含重链和轻链的抗体，所述重链包含大鼠04-093抗体的重链CDRH1、CDRH2和CDRH3，所述轻链包含其轻链CDRL1、CDRL2和CDRL3，包含大鼠04-093抗体的重链可变区和轻链可变区的抗体，以及包含大鼠04-093抗体的重链和轻链的抗体。此类抗体的实例可以包括但不限于大鼠04-093抗体、衍生自04-093抗体的嵌合抗体、衍生自04-093抗体的兔型抗体、以及衍生自04-093抗体的人源化抗体。
在本发明的一个优选实施方案中，用于诊断的组合物用于GPR20检测或测量。
本发明提供了用于检测或测量测试样品中的人GPR20的方法。
上述检测或测量方法可以采用用于本发明的诊断的组合物。在本发明中，还包括用于诊断的此类测量方法和组合物，用于诊断或测试人GPR20阳性癌症，优选胃肠道间质瘤。
本发明还包括用于鉴定可以向其施用靶向GPR20的药物组合物的个体（患者）的方法。在该鉴定方法中，在衍生自个体的样品中测量人GPR20。当在样品中已检测到人GPR20，或者已检测到人GPR20的量大于衍生自健康个体的样品中检测到的人GPR20的量时，确定个体是阳性的。因此，可以将个体鉴定为可以向其施用靶向GPR20的药物组合物的个体。
为了鉴定靶向GPR20的药物组合物施用于其的个体，可以确认衍生自测试受试者的样品中GPR20的表达，并且另外，GPR20的表达水平或者免疫染色的染色比率或染色强度可以进一步用作指数。此类方法的一个实例可以包括涉及以下的方法：根据用抗GPR20抗体的免疫染色中的染色程度确定表1中所示的0至3的得分，并且鉴定得分为1或更高、2或更高或者3或更高的受试者作为靶向GPR20的药物组合物施用于其的患者。
上述方法可以采用本发明的用于诊断的组合物。
在此类鉴定方法的优选形式中，个体可以被用于确定个体患有癌症，优选胃肠道间质瘤，或具有发展其的风险。
在一个实施方案中，本发明的药物组合物可以施用于已在此类鉴定方法中确定为阳性的个体。
6. 试剂
本发明的抗体或其抗原结合片段、或者抗体或抗原结合片段的修饰也可用作试剂。此类试剂可用于上述测试或诊断、用于研究及其它目的。
实施例
在下文中，将在下述实施例中具体描述本发明。此外，这些实施例不应以任何方式以有限的方式加以解释。应注意，在下述实施例中，除非另有说明，否则根据“MolecularCloning”（ Sambrook，J.，Fritsch，E. F.和Maniatis，T.，由Cold Spring HarborLaboratory Press于1989年出版）中描述的方法进行关于遗传操作的各个操作，或者当已使用商购可得的试剂或试剂盒时，实施例已按照商购可得的产品中包括的说明书进行。在本说明书中，除非另有说明，否则试剂、溶剂和原材料可容易地从商购可得的来源获得。
实施例1：大鼠抗人GPR20抗体的产生
1）-1人GPR20表达载体的构建
使用人脑衍生的cDNA作为模板，根据本领域技术人员已知的方法，通过PCR扩增编码人GPR20蛋白（NP_005284）的cDNA，并且将扩增产物掺入用于哺乳动物表达的载体内，以产生人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20。人GPR20的氨基酸序列显示于序列表中的SEQ ID NO：1中。EndoFree Plasmid Giga Kit（Qiagen N.V.）用于pcDNA3.1-hGPR20质粒DNA的大量生产。
1）-2大鼠的免疫
对于免疫，使用6周龄的WKY/Izm雌性大鼠（Japan SLC，Inc.）。首先，用透明质酸酶（Sigma-Aldrich Co. LLC）预处理每只大鼠的下肢，并且其后，将人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20肌内注射到相同部位内。随后，采用ECM830（BTX），使用双针电极在相同位点上进行体内电穿孔。每两周一次，重复相同的体内电穿孔。在第79天时，从大鼠中收集淋巴结，然后用于杂交瘤的产生中。
1）-3杂交瘤的产生
使用Hybrimune Hybridoma Production System（Cyto Pulse Sciences，Inc.），通过电细胞融合，将淋巴结细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14细胞融合，然后将细胞悬浮且用ClonaCell-HY Selection Medium D（StemCell Technologies Inc.）稀释，然后在37℃和5% CO2的条件下培养。收集培养物中出现的各个杂交瘤集落作为单克隆杂交瘤，然后悬浮于ClonaCell-HY Selection Medium E（StemCell Technologies Inc.）中，然后在37℃和5% CO2的条件下培养。在细胞的适度增殖后，产生各个杂交瘤细胞的冷冻原种，同时从每个杂交瘤中收集培养上清液，并且用于筛选产生抗GPR20抗体的杂交瘤。
1）-4根据Cell-ELISA方法的抗体产生杂交瘤筛选
1）-4-1用于细胞ELISA中的抗原基因表达细胞的制备
在补充有10% FBS的DMEM培养基中，以5 x 106个细胞/10 mL制备293α细胞（衍生自表达整联蛋白αv和整联蛋白β3的HEK293细胞的稳定表达细胞系）。按照关于使用Lipofectamine 2000（Invitrogen Corp.）的转导程序，将pcDNA3.1-hGPR20的DNA或作为阴性对照的pcDNA3.1引入293α细胞内，并且将细胞以100 μL/孔的量分配到96孔板（CorningInc.）内。其后，将细胞在37℃和5% CO2的条件下在补充有10% FBS的DMEM培养基中培养24至27小时。将获得的转染细胞以粘附状态用于Cell-ELISA中。
1）-4-2 Cell-ELISA
去除用实施例1）-4-1中制备的表达载体转染的293α细胞的培养上清液，然后将来自每个杂交瘤的培养上清液加入用pcDNA3.1-hGPR20或pcDNA3.1转染的293α细胞中。使细胞在4℃下静置1小时。用补充有5% FBS的PBS（+）洗涤孔中的细胞一次，并且其后，将兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich Co.LLC）加入孔中，所述抗体已用补充有5%FBS的PBS（+）稀释500倍。使细胞在4℃下静置1小时。孔中的细胞用补充有5% FBS的PBS（+）洗涤三次，并且其后，将OPD着色溶液（其已通过将邻苯二胺二盐酸盐（Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.）和H2O2溶解于OPD溶液（0.05M柠檬酸三钠，0.1M磷酸氢二钠12-水；pH4.5）中进行制备，使得物质分别变为0.4 mg/ml和0.6%（v/v））以100 μL/孔的量加入孔中。伴随偶尔的搅拌进行显色反应。其后，向板中加入（100 μL/孔）1 M HCl以终止显色反应，随后使用板阅读器（ENVISION：PerkinElmer，Inc.）在490 nm处测量吸光度。为了选择产生与细胞膜的表面上表达的人GPR20特异性结合的抗体的杂交瘤，选择杂交瘤作为抗人GPR20抗体产生阳性杂交瘤，所述杂交瘤产生的培养上清液在用pcDNA3.1-hGPR20表达载体转染的293α细胞中显示出比用对照pcDNA3.1转染的293α细胞中的那种更高的吸光度。
1）-5根据流式细胞术的人GPR20结合抗体筛选
1）-5-1用于流式细胞术分析中的抗原基因表达细胞的制备
293T细胞以5 × 104个细胞/cm2接种于225-cm2烧瓶（由Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.制造）中，然后将细胞在37℃和5% CO2的条件下在补充有10% FBS的DMEM培养基中培养过夜。在第二天时，使用Lipofectamine 2000，将pcDNA3.1-hGPR20或作为阴性对照的pcDNA3.1引入293T细胞内，并且细胞在37℃和5% CO2的条件下进一步培养过夜。在第二天时，用TrypLE Express（由Life Technologies Corp.制造）处理由每种表达载体转染的293T细胞，并且将细胞用补充有10% FBS的DMEM洗涤，然后悬浮于补充有5% FBS的PBS中。获得的细胞悬浮液用于流式细胞术分析中。
1）-5-2流式细胞术分析
通过流式细胞术进一步确认由杂交瘤产生的抗体对人GPR20的结合特异性，其已通过实施例1）-4-2中的Cell-ELISA确定为阳性的。将实施例1）-5-1中制备的瞬时表达的293T细胞的悬浮液离心，然后去除上清液。其后，通过加入来自每个杂交瘤的培养上清液使细胞悬浮。使细胞在4℃下静置1小时。细胞用补充有5% FBS的PBS洗涤两次，并且其后，通过加入抗大鼠IgG FITC缀合物（由Sigma-Aldrich Co.LLC制造）悬浮细胞，所述缀合物已用补充有5%FBS的PBS稀释500倍。使细胞在4℃下静置1小时。细胞用补充有5% FBS的PBS洗涤两次，然后重悬浮于补充有5% FBS和2 μg/ml 7-氨基放线菌素D（由Molecular Probes，Inc.制造）的PBS中，随后为使用流式细胞仪（FC500；由Beckman Coulter，Inc.制造）的检测。使用Flowjo（由Tree Star，Inc.制造）分析数据。通过门控出7-氨基放线菌素D阳性细胞，从分析中去除死细胞后，生成活细胞的FITC荧光强度的直方图。基于以下结果选择产生人GPR20结合抗体的杂交瘤（178个克隆），其中与用对照pcDNA3.1转染的293T细胞相比，用pcDNA3.1-hGPR20转染的293T细胞中，关于抗体的直方图移位至强荧光强度侧。图9显示了关于克隆编号04-093、13-001、13-006、13-010、13-040和13-046的结果，以及没有添加第一抗体（w/o 1stAb）的阴性对照作为特异性结合人GPR20的抗体的实例。图9的横坐标表示克隆编号，并且其纵坐标表示基于MFI（平均荧光强度）结合的抗体的量。
1）-6通过肽-ELISA的筛选
通过肽-ELISA评估针对人GPR20的N末端48个氨基酸的结合活性。用PBS稀释至1 μg/mL的NeutrAvidin（Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc.）以100 μL/孔加入96孔Maxisorp板（Nunc）中，并且使板在4℃下静置过夜。去除溶液，并且用300 μL/孔含有0.05%Tween 20的PBS（下文称为PBST）洗涤板三次。然后，将来自人GPR20的N末端的位置1至48处的氨基酸组成的C末端生物素化的合成肽1（SEQ ID NO：29）以10 nM溶解于PBS中，并且该溶液以100 μL/孔加入。使板在室温下静置1小时。同样地，制备补充有具有与GPR20的氨基酸序列不同的序列的C末端生物素化的合成肽的板作为阴性对照，然后以与上述板相同的方式处理。从板中去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μL/孔加入含有1% BSA的PBS，并且使板在室温下静置过夜。去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μL/孔加入来自用含有1% BSA的PBS稀释2倍的每种产生抗人GPR20抗体的杂交瘤的培养上清液，并且使板在室温下静置1小时。去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μL/孔加入用PBS稀释500倍的在兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体（Sigma-Aldrich Co.LLC），并且使板在室温下静置1小时。去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μl/孔加入SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate，并且使板在室温下静置10分钟，随后为使用板阅读器（ARVO，PerkinElmer，Inc.）测量化学发光。图10显示了6种抗体的典型反应实例，其显示出与在来自人GPR20的N末端位置1至48处的氨基酸的特异性结合。图10的横坐标表示克隆编号，并且其纵坐标表示基于化学发光强度（CPS）结合的抗体的量。
1）-7大鼠单克隆抗体的亚类和类型的测定
使用RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT（DS Pharma Biomedical Co.，Ltd.），测定大鼠抗人GPR20单克隆抗体的重链亚类和轻链类型。结果确认04-093、13-001、13-006、13-010、13-040全部都具有IgG2b和κ链。由于以与实施例4中描述的方法相同的方式分析其核苷酸序列，13-001、13-006、13-010和13-040抗体的分别氨基酸序列具有高度同源的序列，并且是因此推测识别相同的表位。
1）-8大鼠抗人GPR20抗体的制备
从杂交瘤培养上清液中纯化大鼠抗人GPR20单克隆抗体04-093、13-001和13-046。
首先，用ClonaCell-HY Selection Medium E充分增加每种产生抗GPR20抗体的杂交瘤的体积，并且其后，将培养基更换为20% Ultra Low IgG FBS（Life TechnologiesCorp.）已加入其中的Hybridoma SFM（Life Technologies Corp.）。其后，将杂交瘤培养4至5天。收获所得到的培养上清液，并且通过经过0.8-μm过滤器和0.2-μm过滤器从其中去除不溶物质。
根据蛋白G亲和层析从上述杂交瘤的培养上清液中纯化抗体。将抗体吸附到Protein G柱（GE Healthcare Biosciences Corp.）。将柱用PBS洗涤，随后为用0.1 M甘氨酸/HCl水溶液（pH 2.7）的洗脱。通过加入1 M Tris-HCl（pH 9.0），将洗脱物的pH调节至7.0至7.5。其后，使用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20（分子量截止：UF30K，Sartorius Inc.），用HBSor（25 mM组氨酸/5%山梨糖醇，pH 6.0）替换缓冲液，同时浓缩抗体，使得抗体的浓度调节至0.7 mg/mL或更高。最后，通过Minisart-Plus过滤器（SartoriusInc.）过滤抗体，以获得纯化的样品。
实施例2：大鼠抗人GPR20抗体的IHC能力评估
2）-1使用瞬时表达GPR20的293T细胞评估GPR20染色特性
2）-1-1细胞块的产生
使用Lipofectamine 2000（Life Technologies Corp.），用pcDNA3.1-hGPR20或pcDNA3.1（空载体）转染293T细胞。将表达GPR20的293T细胞的团块在福尔马林中固定，然后制备成石蜡包埋块。同样地，转染pcDNA3.1（空载体）（对照293T细胞）的293T细胞也在福尔马林中固定，然后制备成石蜡包埋的块。
2）-1-2瞬时表达GPR20的293T细胞的免疫染色
比较1）-8中制备的大鼠单克隆抗人GPR20抗体04-093、13-001和13-046，以及商购可得的兔多克隆抗人GPR20抗体的GPR20染色特性。所有商购可得的抗体都用人GPR20衍生的合成肽作为抗原产生，并且使用由Lifespan Biosciences，Inc.制造的LS-A101（C末端）、LS-A102（N末端）、LS-A103（细胞质结构域）、LS-A104（C末端）和LS-B7724（在位置291至340处的氨基酸），由Abcam PLC制造的ab75559，由Novus Biologicals制造的NLS101（C末端），以及由Santa Cruz Biotechnology，Inc.制造的sc-87141（N末端）。用于产生每种兔多克隆抗体的免疫中使用的、用于合成肽的GPR20内的位点在括号内指示。
使用Autostainer Link的预处理系统（PT Link；由Dako/Agilent TechnologiesInc.制造），脱石蜡和抗原修复用抗原修复溶液（Target Retrieval Solution High pH；由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）在97℃下进行20分钟。使用自动染色仪器（DakoAutostainer Link 48；由Dako/Agilent Technologies Inc.制造），在室温下进行随后的染色程序。在用EnVision FLEX WASH BUFFER（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）洗涤一次后，将Peroxidase Block 3% H2O2（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育5分钟，并且用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤一次。将无血清蛋白质块（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育15分钟。通过送风去除溶液。用Signal-stain Antibody Diluent （由Cell SignalingTechnology，Inc.制造），将每种抗GPR20抗体稀释成表2-1和2-2中所述的浓度，并且与细胞反应30分钟。在用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤三次后，根据第一抗体的物种，将大鼠抗体的Histofine简单染色小鼠MAX PO（大鼠）#414311（由Nichirei Corp.制造）、以及兔抗体的EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit #K4003（由Dako/AgilentTechnologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育30分钟，然后用EnVision FLEXWASH BUFFER洗涤两次。
将DAKO Liquid DAB + Substrate Chromogen System加至细胞，然后使所述细胞温育总共10分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤一次。将EnVision FLEXHematoxylin加至细胞，使所述细胞温育5分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER和离子交换水洗涤总共三次。
各个抗体的典型染色结果显示于图11-1、11-2和11-3中。对图11-1、11-2和11-3中每种抗体的染色强度进行评分，并且结果显示于表2-1和2-2中。在表中，+++表示强阳性，++表示阳性，+表示弱阳性，并且-表示阴性。与兔多克隆抗GPR20抗体相比，大鼠单克隆抗GPR20抗体04-093、13-001和13-046显示出对于表达GPR20的293T细胞（293-GPR20）的强染色特性。另一方面，大鼠单克隆抗GPR20抗体显示出对于阴性对照293T细胞（293-EV）的染色特性，并且因此确认为具有GPR20特异性染色特性。
2）-2临床GIST组织切片的免疫染色
2）-2-1 GIST组织阵列的染色
使用GIST481，胃肠道间质瘤组织阵列，24个病例/48个核（由US Biomax，Inc.制造），研究临床标本中抗GPR20抗体的染色特性。
使用Autostainer Link的预处理系统（PT Link；由Dako/Agilent TechnologiesInc.制造），脱石蜡和抗原修复用抗原修复溶液（Target Retrieval Solution High pH；由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）在97℃下进行20分钟。使用自动染色仪器（DakoAutostainer Link 48；由Dako/Agilent Technologies Inc.制造），在室温下进行随后的染色程序。在用EnVision FLEX WASH BUFFER（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）洗涤一次后，将Peroxidase Block 3% H2O2（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育5分钟，并且用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤一次。将无血清蛋白质块（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育15分钟。通过送风去除溶液。用Signal-stain Antibody Diluent （由Cell SignalingTechnology，Inc.制造），将每种大鼠单克隆抗GPR20抗体或兔多克隆抗GPR20抗体稀释至10μg/mL或5 μg/mL，并且与细胞反应30分钟。在用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤三次后，将Histofine简单染色小鼠MAX PO（大鼠）#414311（由Nichirei Corp.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育30分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤两次。
将DAKO Liquid DAB + Substrate Chromogen System加至细胞，然后使所述细胞温育总共10分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤一次。将EnVision FLEXHematoxylin加至细胞，使所述细胞温育5分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER和离子交换水洗涤总共三次。
在图12中，由于比较抗体对于（图12-1）胃GIST、（图12-2）小肠GIST和（图12-3）大肠GIST的GPR20-染色特性，大鼠抗GPR20抗体04-093是最高度敏感的。
实施例3：大鼠抗人GPR20抗体04-093的序列分析
3）-1从产生04-093的杂交瘤制备总RNA
为了扩增编码04-093的重链和轻链信号序列以及可变区的cDNA，使用TRIzol Reagent（Ambion，Inc.）从产生04-093的杂交瘤制备总RNA。
3）-2通过5'-RACE PCR扩增编码04-093的重链信号序列和可变区的cDNA，并测定核苷酸序列
使用大约1 μg实施例3）-1中制备的总RNA和SMARTer RACE cDNA Amplification Kit（Clontech Laboratories，Inc.），进行编码04-093的重链信号序列和可变区的cDNA的扩增。UPM（Universal Primer A Mix；附着于SMARTer RACE cDNA Amplification Kit）以及由已知大鼠重链的恒定区序列设计的引物，用作用于通过PCR扩增编码04-093的轻链信号序列和可变区的cDNA的引物。
将因此通过5'-RACE PCR扩增的编码重链信号序列和可变区的cDNA克隆到质粒内。然后，对重链信号序列和可变区的cDNA的核苷酸序列进行序列分析。
3）-3通过5'-RACE PCR扩增编码04-093的轻链信号序列和可变区的cDNA，并测定核苷酸序列
以与实施例3）-2相同的方式进行cDNA的扩增，除了UPM（Universal Primer A Mix；附着于SMARTer RACE cDNA Amplification Kit）以及由已知大鼠轻链的恒定区序列设计的引物，用作用于通过PCR扩增编码04-093的轻链信号序列和可变区的cDNA的引物之外。
通过将它们与已知的恒定区序列连接，来确定04-093抗体的重链和轻链的全长序列。参考IMGT（国际ImMunoGeneTics信息系统（注册商标））中公开的AABR03048905（IGHG2B*01）的核苷酸序列和氨基酸序列，使用大鼠重链IgG2b的恒定区的核苷酸序列和氨基酸序列。参考也在该系统中公开的V01241（IGKC*01）的核苷酸序列和氨基酸序列，使用大鼠轻链IgK的恒定区的核苷酸序列和氨基酸序列。
04-093抗体的重链具有序列表中的SEQ ID NO：3中所示的氨基酸序列。在序列表中的SEQ ID NO：3中所示的重链氨基酸序列中，由在位置1至19处的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由在位置20至133处的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由在位置134至466处的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。上述可变区具有在序列表中的SEQ ID NO：3中，由在位置45至54处的氨基酸序列（GFTFNNYWMT）或在位置50至54处的氨基酸序列（NYWMT）组成的CDRH1、由在位置69至78处的氨基酸序列（SITNIDGSSY）或在位置69至85处的氨基酸序列（SITNIDGSSYYPDSVKG）组成的CDRH2、以及由在位置118至122处的氨基酸序列（GSFDY）组成的CDRH3。04-093抗体的重链可变区具有序列表中的SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列。04-093抗体的CDRH1具有序列表中的SEQ ID NO：5或8中所示的氨基酸序列，CDRH2的氨基酸序列具有序列表中的SEQ ID NO：6或9中所示的氨基酸序列，并且CDRH3的氨基酸序列具有序列表中的SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。此外，04-046抗体重链的氨基酸序列显示于图1中。
04-093抗体的轻链具有序列表中的SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。在序列表中的SEQ ID NO：11中所示的轻链氨基酸序列中，由在位置1至19处的氨基酸残基组成的氨基酸序列是信号序列，由在位置20至126处的氨基酸残基组成的氨基酸序列是可变区，并且由在位置127至232处的氨基酸残基组成的氨基酸序列是恒定区。上述可变区具有在序列表中的SEQ ID NO：11中，由在位置43至53处的氨基酸序列组成的CDRL1、由在位置69至75处的氨基酸序列组成的CDRL2、以及由在位置108至115处的氨基酸序列组成的CDRL3。04-093抗体的轻链可变区具有序列表中的SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列。04-093抗体的CDRL1具有序列表中的SEQ ID NO：13（KASQNVNKYLN）中所示的氨基酸序列，CDRL2的氨基酸序列具有序列表中的SEQ ID NO：14（NTNNLQT）中所示的氨基酸序列，并且CDRL3的氨基酸序列具有序列表中的SEQ ID NO：15（FQHVSWLT）中所示的氨基酸序列。此外，04-093抗体轻链的氨基酸序列显示于图2中。
04-093抗体的重链氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列编码。在序列表中的SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列中，由在位置1至57处的核苷酸组成的核苷酸序列是信号序列。在序列表中的SEQ ID NO：2中所示的核苷酸序列中，由在位置58至399处的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-093抗体的重链可变区，并且由在位置400至1398处的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-093抗体的重链恒定区。编码上述可变区的核苷酸序列具有在SEQ ID NO：2中由编码CDRH1的在核苷酸位置133至162处或在核苷酸位置118至162处的核苷酸序列组成的多核苷酸、由编码CDRH2的在核苷酸位置205至234处或在核苷酸位置205至183处的核苷酸序列组成的多核苷酸、以及由编码CDRH3的在核苷酸位置352至366处的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-093抗体的重链信号序列和可变区的核苷酸序列也显示于序列表中的SEQ ID NO：16中。在序列表中的SEQ ID NO：16中所示的核苷酸序列中，由在位置1至57处的核苷酸组成的核苷酸序列代表信号序列，并且由在位置58至399处的核苷酸组成的核苷酸序列编码重链可变区。SEQ ID NO：2的序列也显示于图1中。
04-093抗体的轻链氨基酸序列由序列表中的SEQ ID NO：10中所示的核苷酸序列编码。在序列表中的SEQ ID NO：10中所示的核苷酸序列中，由在位置1至57处的核苷酸组成的核苷酸序列是信号序列。在序列表中的SEQ ID NO：10中所示的核苷酸序列中，由在位置58至378处的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-093抗体的轻链可变区，并且由在位置379至696处的核苷酸组成的核苷酸序列编码04-093抗体的轻链恒定区。编码上述可变区的核苷酸序列具有在SEQ ID NO：10中由编码CDRL1的在核苷酸位置127至159处的核苷酸序列组成的多核苷酸、由编码CDRL2的在核苷酸位置205至225处的核苷酸序列组成的多核苷酸、以及由编码CDRL3的在核苷酸位置322至354处的核苷酸序列组成的多核苷酸。04-093抗体的轻链信号序列和可变区的核苷酸序列也显示于序列表中的SEQ ID NO：17中。在序列表中的SEQ ID NO：17中所示的核苷酸序列中，由在位置1至57处的核苷酸组成的核苷酸序列代表信号序列，并且由在位置58至378处的核苷酸组成的核苷酸序列编码轻链可变区。SEQ IDNO：10的序列也显示于图2中。
实施例4：兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体的产生
4）-1兔嵌合形式的抗GPR20抗体04-093的设计
参考IMGT（R），国际ImMunoGeneTics信息系统（R），通过将兔重链恒定区IGHG*02和兔轻链恒定区IGKC2*01分别连接到克隆04-093的重链和轻链可变区，来设计兔嵌合序列。
兔嵌合抗体重链命名为OcHch。其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：19中。在SEQ IDNO：19中，在氨基酸位置1至19处的氨基酸序列代表信号序列的氨基酸序列，在位置20至133处的氨基酸序列代表重链可变区的氨基酸序列，并且在位置134至456处的氨基酸序列代表重链恒定区的氨基酸序列。
兔嵌合抗体轻链命名为OcLch。其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：21中。在SEQ IDNO：21中，在氨基酸位置1至20处的氨基酸序列代表信号序列的氨基酸序列，在位置21至127处的氨基酸序列代表轻链可变区的氨基酸序列，并且在位置128至232处的氨基酸序列代表轻链恒定区的氨基酸序列。
4）-2兔型形式的抗GPR20抗体04-093的设计
通过CDR移植（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029-10033（1989））设计兔型抗体的可变区的氨基酸序列。基于可变区的氨基酸序列同一性和对于兔种系序列的调节，选择重链受体序列IGHV1S7*01和IGHJ3*01、以及轻链受体序列IGKV1S39*01和IGKJ1-2*01。使用蛋白质三维结构分析程序BioLuminate（由Schrodinger，LLC制造），分析克隆04-093的构建同源性模型，并且基于由Queen等人（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，10029-10033（1989））给出的标准，选择待移植到受体上的供体残基。选择兔IGHG*02作为重链恒定区，并且选择兔IGKC1*01作为轻链恒定区。
设计了两种类型的兔型抗体重链OcH01和OcH02。其氨基酸序列分别显示于SEQ IDNO：23和25。在SEQ ID NO：23和25中，在位置1至19处的氨基酸序列代表信号序列，在位置20至133处的氨基酸序列代表可变区，并且在位置134至456处的氨基酸序列代表恒定区。
设计了一种类型的兔型抗体轻链OcL01。其氨基酸序列显示于SEQ ID NO：27中。在SEQ ID NO：27中，在位置1至20处的氨基酸序列代表信号序列，在位置21至127处的氨基酸序列代表可变区，并且在位置128至230处的氨基酸序列代表恒定区。
4）-2重组抗体的产生
4）-2-1兔嵌合抗GPR20抗体重链表达载体的构建
4）-2-1-1抗体表达载体pCMA-LK的构建
使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.），已通过用限制酶XbaI和PmeI消化质粒pcDNA3.3-TOPO/LacZ（Invitrogen Corp.）获得的大约5.4-kb片段，与包含编码人轻链信号序列和人κ链恒定区的氨基酸序列的DNA序列（SEQ ID NO：28）的DNA片段结合，以产生pcDNA3.3/LK。
从pcDNA3.3/LK中去除新霉素表达单位，以构建pCMA-LK。
4）-2-1-2兔嵌合抗体重链OcHch表达载体的构建
合成了包含编码兔嵌合抗体重链OcHch的氨基酸序列的DNA序列（SEQ ID NO：18）的DNA片段（GENEART）。在序列表中的SEQ ID NO：18中所示的核苷酸序列中，由在位置26至82处的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由在位置83至424处的核苷酸组成的核苷酸序列编码重链可变区，并且由在位置425至1393处的核苷酸组成的核苷酸序列编码恒定区。
使用In-Fusion HD PCR克隆试剂盒（Clontech Laboratories，Inc.），将合成的DNA片段与DNA片段结合，该片段已通过用XbaI和PmeI消化pCMA-LK，以从其中去除编码轻链信号序列和人κ链恒定区的DNA序列而获得，以便构建兔嵌合抗体重链OcHch表达载体。
4）-2-2兔嵌合抗GPR20抗体轻链表达载体的构建
4）-2-2-1兔嵌合抗体轻链OcLch表达载体的构建
合成了包含编码兔嵌合抗体轻链OcLch的氨基酸序列的DNA序列（SEQ ID NO：20）的DNA片段（GENEART）。在序列表中的SEQ ID NO：20中所示的核苷酸序列中，由在位置26至85处的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由在位置86至406处的核苷酸组成的核苷酸序列编码轻链可变区，并且由在位置407至721处的核苷酸组成的核苷酸序列编码恒定区。以与实施例4）-2-1-2相同的方式构建兔嵌合抗体轻链OcLch表达载体。
4）-2-3兔型抗GPR20抗体重链表达载体的构建
4）-2-3-1兔型抗体重链OcH01表达载体的构建
合成了包含编码兔型抗体重链OcH01的氨基酸序列的DNA序列（SEQ ID NO：22）的DNA片段（GENEART）。在序列表中的SEQ ID NO：22中所示的核苷酸序列中，由在位置26至82处的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由在位置83至424处的核苷酸组成的核苷酸序列编码重链可变区，并且由在位置425至1393处的核苷酸组成的核苷酸序列编码恒定区。以与实施例4）-2-1-2相同的方式构建兔型抗体重链OcH01表达载体。
4）-2-3-2兔型抗体重链OcH02表达载体的构建
合成了包含编码兔型抗体重链OcH02的氨基酸序列的DNA序列（SEQ ID NO：24）的DNA片段（GENEART）。在序列表中的SEQ ID NO：24中所示的核苷酸序列中，由在位置26至82处的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由在位置83至424处的核苷酸组成的核苷酸序列编码重链可变区，并且由在位置425至1393处的核苷酸组成的核苷酸序列编码恒定区。以与实施例4）-2-1-2相同的方式构建兔型抗体重链OcH02表达载体。
4）-2-4兔型抗GPR20抗体轻链表达载体的构建
4）-2-4-1兔型抗体轻链OcL01表达载体的构建
合成了包含编码兔型抗体轻链OcL01的氨基酸序列的DNA序列（SEQ ID NO：26）的DNA片段（GENEART）。在序列表中的SEQ ID NO：26中所示的核苷酸序列中，由在位置26至85处的核苷酸组成的核苷酸序列编码信号序列，由在位置86至406处的核苷酸组成的核苷酸序列编码轻链可变区，并且由在位置407至721处的核苷酸组成的核苷酸序列编码恒定区。以与实施例5）-2-1-2相同的方式构建兔型抗体轻链OcL01表达载体。
4）-2-5重组抗体的制备
4）-2-5-1重组抗体的产生
根据该手册，培养并传代FreeStyle 293F细胞（Invitrogen Corp.）。将1.2 × 109个处于对数生长期的FreeStyle 293F细胞（Invitrogen Corp.）接种在3-L FernbachErlenmeyer Flask（Corning Inc.）上，然后用FreeStyle 293表达培养基（InvitrogenCorp.）以2.0 × 106个细胞/mL稀释。将0.24 mg重链表达载体、0.36 mg轻链表达载体和1.8 mg聚乙烯亚胺（Polyscience #24765）加入40 mL Opti-Pro SFM培养基（InvitrogenCorp.）中，并且将得到的混合物轻轻搅拌。在温育5分钟后，将混合物加入FreeStyle 293F细胞中。将细胞以90 rpm在8% CO2培养箱中在37℃下振荡培养4小时，并且其后，向培养物中加入600 mL EX-CELL VPRO培养基（SAFC Biosciences Inc.）、18 mL GlutaMAX I（GIBCO）和30 mL Yeastolate Ultrafiltrate（GIBCO）。将细胞以90 rpm在8% CO2培养箱中在37℃下进一步振荡培养7天。获得的培养上清液通过Disposable Capsule Filter（Advantec #CCS-045-E1H）进行过滤。
OcChimera通过在重组抗体的表达中OcHch和OcLch表达载体的组合产生。OcH1L1通过OcH01和OcL01表达载体的组合产生。OcH2L1抗体通过OcH02和OcL01表达载体的组合产生。
4）-2-5-2重组抗体的纯化
通过rProtein A亲和层析的一步法从实施例4）-2-5-1中获得的培养上清液中纯化抗体。将培养上清液应用于已填充有用PBS平衡的MabSelectSuRe（由GE HealthcareBiosciences Corp.制造）的柱。用其量为柱体积的两倍或更多倍的PBS洗涤柱。随后，使用2M精氨酸盐酸盐溶液（pH 4.0）进行洗脱，使得收集含有抗体的级分。将该级分透析（ThermoFisher Scientific Inc.，Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette），使得用PBS替换缓冲液。用Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20（分子量截止：UF10K，Sartorius Inc.）浓缩抗体，从而将IgG浓度调节至2 mg/mL。最后，通过Minisart-Plus过滤器（SartoriusInc.）过滤抗体，以获得纯化的样品。
实施例5：使用兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体的免疫染色
5）-1 GIST细胞系的免疫染色
使用GIST细胞系（GIST430和GIST430/654）和作为阴性对照的前列腺癌细胞系（PC-3）的石蜡包埋制剂，研究实施例4）-2-5中产生的兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体的染色特性。使用Autostainer Link的预处理系统（PT Link；由Dako/Agilent TechnologiesInc.制造），脱石蜡和抗原修复用抗原修复溶液（Target Retrieval Solution High pH；由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）在97℃下进行40分钟。使用自动染色仪器（DakoAutostainer Link 48；由Dako/Agilent Technologies Inc.制造），在室温下进行随后的染色程序。在用EnVision FLEX WASH BUFFER（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）洗涤一次后，将Peroxidase Block 3% H2O2（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育5分钟，并且用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤一次。将无血清蛋白质块（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育30分钟。通过送风去除溶液。用REAL Antibody Diluent（由Dako/Agilent TechnologiesInc.制造），将大鼠单克隆抗GPR20抗体、兔嵌合抗GPR20抗体或兔型抗GPR20抗体稀释至1.0μg/mL至10 μg/mL，并且与细胞反应30分钟。在用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤三次后，将大鼠抗体的Histofine简单染色小鼠MAX PO（大鼠）#414311（由Nichirei Corp.制造）、以及兔抗体的EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit #K4003（由Dako/Agilent Technologies Inc.制造）加至细胞，然后使所述细胞温育30分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤两次。
将DAKO Liquid DAB + Substrate Chromogen System加至细胞，然后使所述细胞温育总共10分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER洗涤一次。将EnVision FLEXHematoxylin加至细胞，使所述细胞温育5分钟，然后用EnVision FLEX WASH BUFFER和离子交换水洗涤总共三次。
图13显示了典型的染色图像。与大鼠抗体04-093相比，兔嵌合抗体OcChimera以及兔型抗体OcH1L1和OcH2L1显示出对于GIST细胞系高度敏感的染色特性。这些抗体没有显示出对于不表达GPR20的前列腺癌细胞系的染色特性。
5）-2临床GIST的免疫染色
使用GIST801，胃肠道间质瘤组织阵列，80个病例/80个核（由US Biomax，Inc.制造），研究临床标本中兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体的染色特性。以与实施例5）-1相同的方式进行染色。
在图14中，作为比较抗体对于（图14-1）胃GIST、（图14-2）小肠GIST和（图14-3）大肠GIST的GPR20-染色特性的结果，发现所有兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体与大鼠抗GPR20抗体04-093相比更加高度敏感。
实施例6：表位的鉴定
6）-1通过肽-ELISA评估结合能力
通过肽-ELISA评估大鼠抗人GPR20抗体04-093与下文给出的合成肽的结合。用PBS稀释至1 μg/mL的NeutrAvidin（Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc.）以100 μL/孔加入96孔Maxisorp板（Nunc），并且使板在4℃下静置过夜。去除溶液，并且用300 μL/孔含有0.05%Tween 20的PBS（下文称为PBST）洗涤板三次。然后，由人GPR20的氨基酸位置1至48（SEQ IDNO：29）组成的C末端生物素化的合成肽1、由人GPR20的氨基酸位置30至48（SEQ ID NO：30）组成的合成肽2、以及具有与GPR20的氨基酸序列不同的序列的阴性对照合成肽，各自以10nM溶解于PBS中，并且这种溶液以100 μL/孔加入。使板在室温下静置1小时。从板中去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μL/孔加入在PBS中的阻断剂酪蛋白（ThermoFisher Scientific Inc.），并且使板在室温下静置1小时。去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μL/孔加入用在PBS中的阻断剂酪蛋白稀释成1 μg/mL的04-093抗体，并且使板在室温下静置1小时。去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μL/孔加入用PBS稀释500倍的在兔中产生的抗大鼠IgG-过氧化物酶抗体（JacksonImmunoResearch Laboratories，Inc.），并且使板在室温下静置1小时。去除溶液，并且用PBST洗涤每个孔三次。然后，以100 μl/孔加入SuperSignal ELISA PicoChemiluminescent Substrate，并且使板在室温下静置10分钟，随后为使用板阅读器（SpectraMax M3，Molecular Devices，LLC）测量化学发光。图15显示了各种抗体的反应实例。图15的横坐标表示克隆编号，并且其纵坐标表示基于化学发光强度（CPS）结合的抗体的量。04-093抗体显示出针对合成肽1和合成肽2等价的结合活性。另一方面，其它抗GPR20抗体并未显示出针对合成肽2的结合活性。这些结果指示04-093抗体结合由GPR20的氨基酸位置30至48（SEQ ID NO：30：LEVPLFHLFARLDEELHGT）组成的氨基酸序列。
6）-2评估使用GPR20片段肽的结合能力
对于表位的详细分析，合成了由GPR20的氨基酸位置29至48组成的肽，以及其中从该肽一个接一个地连续截短末端氨基酸残基的肽，然后进行N末端生物素化和C末端酰胺化，以产生GPR20片段肽文库（Sigma-Aldrich Japan G.K.）。通过使用Octet RED384系统（由PallForteBio Corp.制造），捕获GPR20片段肽作为传感器芯片的配体，并且使用04-093抗体作为分析物，测量04-093抗体对于产生的GPR20片段肽的解离常数。PBS-T用作缓冲溶液，并且使用的传感器芯片是链霉抗生物素蛋白传感器芯片（由Pall ForteBio Corp.制造）。关于每个GPR20片段肽，将传感器芯片浸入1 μg/mL肽溶液中300秒，然后浸入04-093抗体的连续稀释溶液（从0.247到20 nM的3倍稀释系列，5个浓度）中90秒，并且监测结合相。随后，将传感器芯片浸入缓冲溶液中，并且监测解离相270秒。在用每个浓度测量04-093抗体后，将传感器芯片浸入柠檬酸盐缓冲溶液（pH 2.2）中20秒用于重建，并且进一步浸入缓冲溶液中20秒用于平衡。使用1：1结合模型分析数据以计算结合速率常数ka、解离速率常数kd和解离常数KD（KD = kd/ka）。结果显示于表3中。
GPR20片段肽（GLEVPLFHLFARLD：SEQ ID NO：29的氨基酸位置29至42）显示出与04-093抗体的强结合，而结合在GPR20片段肽（GLEVPLFHLFARL：SEQ ID NO：29的氨基酸位置29至41）中减少。此外，GPR20片段肽（LEVPLFHLFARLDEEL：SEQ ID NO：29的氨基酸位置30至45）显示出与04-093抗体的强结合，而结合在GPR20片段肽（EVPLFHLFARLDEEL：SEQ ID NO：29的氨基酸位置31至45）中减少。根据这些结果，SEQ ID NO：29的氨基酸位置30至42（LEVPLFHLFARLD：SEQ ID NO：31）被鉴定为04-093抗体的表位。
实施例7：通过蛋白质印迹检测GPR20蛋白
通过蛋白质印迹检测在293T细胞中瞬时表达的GPR20蛋白。使用Lipofectamine 2000（Life Technologies Corp.），用人GPR20表达载体pcDNA3.1-hGPR20、N末端加上FLAG标签的人GPR20表达载体pFLAG-GPR2、或pcDNA3.1（空载体）转染293T细胞。使用Mem-PER PlusMembrane Protein Extraction Kit（Thermo Fisher Scientific Inc.），从细胞制备膜级分的蛋白质溶液，并且使用BCA蛋白质测定（Thermo Fisher Scientific Inc.）测量蛋白质浓度。向浓度调节的蛋白质溶液中加入NuPAGE（TM）LDS Sample Buffer（4X）和NuPAGE（TM）Sample Reducing Agent（10X）（Thermo Fisher Scientific Inc.），以达到1X浓度。在70℃下加热10分钟后，根据标准方法，使用Tris/甘氨酸/SDS缓冲液，通过SDS-PAGE电泳20 μg/泳道的蛋白质。在电泳后，将蛋白质从凝胶转移到Immobilon-FL膜（Merck Millipore）。这种Immobilon-FL膜用Odyssey Blocking Buffer（LI-COR，Inc.）封闭1小时，然后在4℃下在用0.1% Tween 20/Odyssey Blocking Buffer稀释的兔嵌合抗GPR20抗体或兔型抗GPR20抗体的第一抗体反应溶液中振荡过夜。同样地，兔IgG、小鼠抗FLAG抗体和小鼠抗β-肌动蛋白抗体用作第一抗体反应溶液中的对照。使用SNAP i.d.系统（Merck Millipore），用TBS-0.1% Tween 20缓冲液洗涤膜三次。然后在用0.1% Tween 20/Odyssey Blocking Buffer稀释的第二抗体溶液（当第一抗体是兔抗体时，使用IRDye 680CW山羊抗兔IgG，并且当第一抗体是小鼠抗体时，使用IRDye 800CW山羊抗小鼠IgG）中反应，然后用TBS-0.1% Tween 20缓冲液洗涤两次且用TBS洗涤一次。使用Odyssey Infrared Imaging System（LI-COR，Inc.）检测荧光。在图17中，兔型抗GPR20抗体OcH1L1和OcH2L1以及兔嵌合抗GPR20抗体OcChimera显示出与表达人GPR20的293T-pcDNA3.1-GPR20细胞、或表达N末端加上FLAG标签的人GPR20的293T-pFLAG-GPR20细胞的反应性，并且检测到多个条带。另一方面，在阴性对照293T-pcDNA3.1细胞中未检测到条带。此外，小鼠抗FLAG抗体仅显示出与293T-pFLAG-GPR20的反应性，并且检测到多个条带。这些结果指示兔嵌合抗GPR20抗体和兔型抗GPR20抗体可用于通过蛋白质印迹的GPR20检测。
工业适用性
由本发明提供的抗GPR20抗体的使用使表达GPR20的各种癌症的测试或诊断成为可能。因此，本发明可以提供包含本发明的抗GPR20抗体的试剂盒等等，用于表达GPR20的各种癌症的测试或诊断。本发明还可以提供包含本发明的抗GPR20抗体作为活性成分的药物组合物等等。
序列表自由文本
SEQ ID NO：18：包含编码兔嵌合抗体重链OcHch的氨基酸序列的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：19：兔嵌合抗体重链OcHch的氨基酸序列
SEQ ID NO：20：包含编码兔嵌合抗体轻链OcLch的氨基酸序列的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：21：兔嵌合抗体轻链OcLch的氨基酸序列
SEQ ID NO：22：包含编码兔型抗体重链OcH01的氨基酸序列的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：23：兔型抗体重链OcH01的氨基酸序列
SEQ ID NO：24：包含编码兔型抗体重链OcH02的氨基酸序列的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：25：兔型抗体重链OcH02的氨基酸序列
SEQ ID NO：26：包含编码兔型抗体轻链OcL01的氨基酸序列的序列的DNA片段的核苷酸序列
SEQ ID NO：27：兔型抗体轻链OcL01的氨基酸序列
SEQ ID NO：28：包含编码人轻链信号序列和人κ链恒定区的氨基酸序列的DNA序列的DNA片段
SEQ ID NO：29：合成肽1（在人GPR20的位置1至48处的氨基酸序列）。

Claims (30)

1.一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体特异性结合包含在SEQ ID NO：1中的氨基酸位置1至48处的氨基酸序列的肽。
2.一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体对于结合GPR20，具有针对具有以下重链和轻链的抗体的竞争性抑制活性，所述重链由在SEQ ID NO：3中的氨基酸位置20至466处的氨基酸序列组成，并且所述轻链由在SEQ ID NO：11中的氨基酸位置20至232处的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1或2的抗体或抗体的抗原结合片段，其结合由氨基酸序列LEVPLFHLFARLD（SEQ ID NO：31）组成的表位。
4.根据权利要求1至3中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其中
所述重链序列包含可变区，其具有由SEQ ID NO：5或8中所示的氨基酸序列组成的CDRH1、由SEQ ID NO：6或9中所示的氨基酸序列组成的CDRH2、以及由SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列组成的CDRH3；和
所述轻链序列包含可变区，其具有由SEQ ID NO：13中所示的氨基酸序列组成的CDRL1、由SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列组成的CDRL2、以及由SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列组成的CDRL3。
5.根据权利要求1至4中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由SEQ ID NO：4中所示的氨基酸序列组成的重链可变区、以及由SEQ ID NO：12中所示的氨基酸序列组成的轻链可变区。
6.根据权利要求1至5中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其由以下重链和轻链组成，所述重链包含在SEQ ID NO：3中的氨基酸位置20至466处的氨基酸序列，所述轻链包含在SEQ ID NO：11中的氨基酸位置20至232处的氨基酸序列。
7.根据权利要求1至5中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其为嵌合抗体。
8.根据权利要求7的嵌合抗体，其中所述恒定区衍生自兔抗体。
9.根据权利要求1至5、7和8中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含由在SEQID NO：19中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成的重链以及由在SEQ ID NO：21中的氨基酸位置21至232处的氨基酸序列组成的轻链。
10.根据权利要求1至5中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其具有兔型。
11.根据权利要求1至5中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其为人源化的。
12.根据权利要求1至5和10中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含下述重链（a）或（b）和轻链（c）：
（a）由在SEQ ID NO：23中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成的重链，
（b）由在SEQ ID NO：25中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列组成的重链，和
（c）由在SEQ ID NO：27中的氨基酸位置20至230处的氨基酸序列组成的轻链。
13.根据权利要求1至5和10中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其由以下重链和轻链组成，所述重链包含在SEQ ID NO：23中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列，所述轻链包含在SEQ ID NO：27中的氨基酸位置21至230处的氨基酸序列。
14.根据权利要求1至5和10中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，其由以下重链和轻链组成，所述重链包含在SEQ ID NO：25中的氨基酸位置20至456处的氨基酸序列，所述轻链包含在SEQ ID NO：27中的氨基酸位置21至230处的氨基酸序列。
15.根据权利要求1至14中任一项的抗体的抗原结合片段，其选自Fab、F（ab'）2、Fab'和Fv。
16.根据权利要求1至14中任一项的抗体，其为scFv。
17.一种组合物，其包含根据权利要求1至16中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
18.根据权利要求17的组合物，其包含权利要求1至16中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段，并且用于检测或测量组织制剂中的GPR20的方法中，所述组织制剂通过石蜡包埋然后脱石蜡进行处理（下文简称为“制剂”）。
19.根据权利要求17或18的组合物，其用于检测或测量制剂中的GPR20的方法中，所述方法包括使根据权利要求1至16中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段与测试制剂接触的步骤。
20.根据权利要求18或19的组合物，其中用于检测或测量GPR20的所述方法包括以下步骤：当在所述测试制剂中已检测到或测量到GPR20，或者所述测试制剂中GPR20的表达水平等价于或高于预定参考时，确定所述测试制剂为阳性的，并且当在所述测试制剂中未检测到或测量到GPR20，或者所述测试制剂中GPR20的表达水平等价于或低于预定参考时，确定所述测试制剂为阴性的。
21.根据权利要求17至20中任一项的组合物，其用于检测或诊断GPR20阳性疾病的方法中。
22.根据权利要求17至21中任一项的组合物，其中用于测试或诊断GPR20阳性疾病的方法包括：确定产生在GPR20的检测或测量中已确定为阳性的测试制剂的测试受试者适合于用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法，所述用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法包括施用特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段的步骤；和确定产生已确定为阴性的测试制剂的测试受试者不适合于用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法，所述用于治疗或预防GPR20阳性疾病的方法包括施用特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段的步骤。
23.根据权利要求21或22的组合物，其中所述GPR20阳性疾病是GPR20阳性癌症。
24.根据权利要求21至23中任一项的组合物，其中所述GPR20阳性疾病是胃肠道间质瘤（GIST）。
25.一种药物组合物，其包含特异性结合GPR20的抗体或所述抗体的抗原结合片段，所述药物组合物待施用于下述测试受试者（a）至（c）中的任一个：
（a）产生测试制剂的测试受试者，在所述测试制剂中，已使用根据权利要求17至19和21中任一项的组合物检测或测量GPR20；
（b）产生测试制剂的测试受试者，所述测试制剂已使用根据权利要求20的组合物在GPR20的检测或测量中确定为阳性的；和
（c）已确定为适合于用于治疗或预防GPR20阳性疾病的测试受试者，其包括使用根据权利要求22或24的组合物，施用特异性结合GPR20的抗体或抗体的抗原结合片段的步骤。
26.一种用于治疗GPR20阳性疾病的方法，其包括下述步骤（a）和（b）：
（a）使用根据权利要求1至16中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段、或者根据权利要求17至19和21中任一项的组合物，检测或测量样本中的GPR20的步骤；和
（b）将抗GPR20抗体或抗体的抗原结合片段施用于产生样本的测试受试者的步骤，所述样本在步骤（a）中已检测或测量GPR20的表达。
27.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1至16中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段。
28.一种载体，其包含根据权利要求27的多核苷酸。
29.一种细胞，其包含根据权利要求27的多核苷酸或根据权利要求28的载体。
30.一种用于产生根据权利要求1至16中任一项的抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其包括下述步骤（a）和（b）：
（a）培养根据权利要求29的细胞的步骤；和
（b）从步骤（a）的培养物中收集单克隆抗体或所述抗体的抗原结合片段的步骤。
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