KR20190135478A

KR20190135478A - 항 gpr20 항체

Info

Publication number: KR20190135478A
Application number: KR1020197027948A
Authority: KR
Inventors: 겐지 이이다; 도모코 시부타니; 겐스케 나카무라; 마사토 아마노
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2017-03-30
Filing date: 2018-03-29
Publication date: 2019-12-06
Also published as: CN110573618A; TWI782000B; JP7082112B2; JPWO2018181656A1; EP3604518A4; TW201840588A; CA3058357A1; US20200017583A1; WO2018181656A1; US11261249B2; EP3604518A1; AU2018244047A1

Abstract

본 발명의 과제는, GPR20 의 검출에 사용할 수 있는 항 GPR20 항체, 그 항체를 포함함으로써 이루어지는 GPR20 검출용 시약, GPR20 의 발현과 관련되는 질환의 진단용 시약 또는 검사용 조성물 등을 제공하는 것이다. 서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 48 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편, 당해 항체의 키메라화 항체, 토끼화 항체 등의 제공, 당해 항체를 포함함으로써 이루어지는 조성물 등의 제공.

Description

항 GPR20 항체

본 발명은, 신규한 항 GPR20 항체, 그 항체의 기능 단편, 그 항체의 수식체, 그 항체가 갖는 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열을 포함하는 뉴클레오티드, 그 뉴클레오티드가 삽입된 벡터, 그 뉴클레오티드 또는 벡터가 도입된 세포, 그 세포를 배양하는 공정을 포함하는 그 항체의 제조 방법, 의약 조성물, 진단용 또는 검사용 조성물 등에 관한 것이다.

GPR20 (G Protein-coupled receptor 20) 은, G 단백질 공액 수용체 (GPCR) 패밀리의 클래스 A 에 속하는 358 아미노산으로 이루어지는 7 회 막관통형의 단백질이고, N 말단측을 세포 외, C 말단측을 세포 내에 갖는다. GPR20 은, 뉴클레오티드 또는 지질을 인식하는 GPCR 과 유사한 아미노산 서열을 갖지만, 그 생리적 기능이나 생체 내에 있어서의 리간드는 동정되어 있지 않다. GPR20 을 HEK293 세포에 발현시킨 실험으로부터, GPR20 은, 리간드에 의한 자극이 없는 조건하에서 Gi 형의 3 량체 G 단백질을 항상적으로 활성화시키고 있는 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 1).

GPR20 은 심장, 뇌, 태반, 폐, 간장, 골격근, 신장, 췌장, 비장, 흉선, 전립선, 정소, 난소, 소장, 직장, 백혈구에서 메신저 RNA (mRNA) 의 발현이 확인되어 있고, 특히 소장에서의 고발현이 보고되고 있다 (비특허문헌 1). 뇌 내에 있어서는, 시상, 피각, 미상핵에서의 발현이 보고되고 있다 (비특허문헌 2). 또, GPR20 은 소화관 간질 종양 (GIST) (비특허문헌 3) 이나, 소화관 근층 내의 신경총 등에 존재하여 장관의 연동 운동에 관여하는 카할 개재 세포 (ICCs) 의 일부에 있어서 mRNA 발현이 보고되고 있었다. ICCs 는 GIST 의 기원 세포이고, 이들 세포에서는 GIST 의 주요한 전사 제어 인자인 ets variant 1 (ETV1) 에 의해 GPR20 의 발현이 조절되어 있는 것이 보고되고 있다 (비특허문헌 4).

GPR20 결손 마우스는, 오픈 필드 테스트에 있어서 총이동 거리의 증가를 특징으로 하는 다동성 장해의 표현형을 나타내므로, GPR20 이 중추 신경계에 있어서의 자발적 활동성에 관련하는 것이 시사되어 있다 (특허문헌 1).

이러한 점에서, GPR20 의 발현을 검출할 수 있는 방법의 제공은, GIST 등의 종양 세포나, 소화관에 존재하는 정상 카할 개재 세포, 뇌 내에 존재하는 세포 등을 GPR20 양성 세포로서 검출함으로써 이룰 수 있는 검사 또는 진단에 유용하다.

종래, 포르말린 고정된 조직 중의 인간 GPR20 을 검출할 수 있다고 여겨지는 폴리클로날 항체는 알려져 있지만, 검출 감도나 반응 특이성이 충분하지 않고, 균일한 품질의 항체를 제공하기 위해서는 문제가 있었다. 또, GPR20 의 면역 조직 화학 염색에 유용한 모노클로날 항체는 알려지지 않았다.

공개특허공보 US2003/0018989 A1

Hase M., et al. J Biol Chem. (2008) 283, 12747-12755 O' Dowd B. F., Gene 187 (1997) 75-81 Allander S. V., et al. CANCER RESEARCH (2001) 61, 8624-8628 Chi P., et al. Nature. (2010) 467 (7317) : 849-853

본 발명의 하나의 과제는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 과제는 항 GPR20 항체를 포함함으로써 이루어지는 GPR20 검출용 시약을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 하나의 과제는, 항 GPR20 항체를 포함함으로써 이루어지는 GPR20 의 발현과 관련되는 질환의 진단용 시약 또는 검사용 조성물 등을 제공하는 것이다.

또, 본 발명의 과제에는, 그 항체가 갖는 아미노산 서열을 코드하는 뉴클레오티드, 그 뉴클레오티드가 삽입된 벡터, 그 뉴클레오티드 또는 벡터가 도입된 세포, 그 세포를 배양하는 공정을 포함하는 그 항체의 제조 방법 등이 포함된다.

또한, 본 발명의 다른 하나의 과제는, 당해 항 GPR20 항체를 함유하는 의약 조성물, 및 그 의약 조성물을 사용한 GPR20 의 발현이 관여하는 질환의 치료 방법을 제공하는 것이다.

발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의, 검토를 실시하여, 신규한 항 GPR20 항체를 창출하고, 그 항체를 사용하여 GPR20 을 검출할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 48 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(2) GPR20 에 대한 결합에 대해, 서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 내지 466 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 11 의 아미노산 번호 20 내지 232 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 갖는 항체와 경합 저해 활성을 갖는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(3) LEVPLFHLFARLD (서열 번호 31) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편,

(4) 중사슬 서열이, 서열 번호 5 또는 8 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 6 또는 9 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 그리고 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고 ;

경사슬 서열이 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하는, (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(5) 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타내는 경사슬 가변 영역을 포함함으로써 이루어지는, (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(6) 서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 내지 466 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 중사슬, 및 서열 번호 11 의 아미노산 번호 20 내지 232 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 경사슬로 이루어지는 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(7) 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(8) 정상 영역이 토끼 항체 유래인 것을 특징으로 하는, (7) 에 기재된 키메라 항체,

(9) 서열 번호 19 의 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 21 의 아미노산 번호 21 내지 232 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 (1) 내지 (5), (7) 및 (8) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(10) 토끼화되어 있는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편,

(11) 인간화되어 있는 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (5) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편,

(12) 이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬, 및 (c) 에 기재된 경사슬을 포함하는, (1) 내지 (5) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편 :

(a) 서열 번호 23 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,

(b) 서열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,

(c) 서열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬,

(13) 서열 번호 23 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 중사슬, 및 서열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 경사슬로 이루어지는, (1) 내지 (5) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(14) 서열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 중사슬, 및 서열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 경사슬로 이루어지는, (1) 내지 (5) 및 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편,

(15) Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, (1) 내지 (14) 중 어느 한 항에 기재된 항체의 항원 결합성 단편,

(16) scFv 인 것을 특징으로 하는, (1) 내지 (14) 중 어느 한 항에 기재된 항체,

(17) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물,

(18) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편을 포함하고, 파라핀 포매 처리한 후 탈파라핀 처리한 조직 표본 (이하, 간단히 「표본」 이라고 한다) 중의 GPR20 의 검출 또는 측정 방법에 사용되는, (17) 에 기재된 조성물,

(19) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 피검 표본을 접촉시키는 공정을 포함하는, 표본 중의 GPR20 의 검출 또는 측정 방법에 사용되는, (17) 또는 (18) 에 기재된 조성물,

(20) GPR20 의 검출 또는 측정 방법이, 피검 표본에 있어서 GPR20 이 검출 혹은 측정되었거나, 또는 피검 표본에 있어서의 GPR20 의 발현 레벨 혹은 발현량이 사전에 결정된 기준과 동등하거나 또는 그것보다 높은 경우, 그 피검 표본을 양성으로 판정하고, 피검 표본에 있어서 GPR20 이 검출 혹은 측정되지 않았거나, 또는 피검 표본에 있어서의 GPR20 의 발현 레벨 혹은 발현량이 사전에 결정된 기준과 동등하거나 또는 그것보다 낮은 경우, 그 피검 표본을 음성으로 판정하는 공정을 포함하는, (18) 또는 (19) 에 기재된 조성물,

(21) GPR20 양성 질환의 검사 또는 진단 방법에 사용되는, (17) 내지 (20) 중 어느 한 항에 기재된 조성물,

(22) GPR20 양성 질환의 검사 또는 진단 방법이, GPR20 의 검출 또는 측정에 있어서, 양성으로 판정된 피검 표본이 유래하는 피험자는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정을 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 또는 예방 방법에 적합하다고 판정하고, 음성으로 판정된 피검 표본이 유래하는 피험자는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정을 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 또는 예방 방법에는 적합하지 않다고 판정하는 것을 포함하는, (17) 내지 (21) 중 어느 한 항에 기재된 조성물,

(23) GPR20 양성 질환이 GPR20 양성암인, (21) 또는 (22) 에 기재된 조성물,

(24) GPR20 양성 질환이 소화관 간질 종양 (GIST) 인, (21) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 조성물,

(25) 하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 피험자에게 투여되는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 의약 조성물 :

(a) (17) 내지 (19) 및 (21) 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 사용하여 GPR20 이 검출 또는 측정된 피검 표본이 유래하는 피험자 ;

(b) (20) 에 기재된 조성물을 사용한 GPR20 의 검출 또는 측정에 있어서 양성으로 판정된 피검 표본이 유래하는 피험자 ;

(c) (22) 또는 (24) 에 기재된 조성물을 사용하여, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정을 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 또는 예방에 적합하다고 판정된 피험자,

(26) 이하의 공정 (a) 및 (b) 를 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 방법 :

(a) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, (17) 내지 (19), (21) 에 기재된 조성물을 사용하여 검체의 GPR20 을 검출 또는 측정하는 공정 ;

(b) (a) 에 있어서 GPR20 의 발현이 검출 또는 측정된 검체가 유래하는 피험자에게 항 GPR20 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정,

(27) (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드,

(28) (27) 에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터,

(29) (27) 에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 (28) 에 기재된 벡터를 포함하는 세포,

(30) 하기 공정 (a) 및 (b) 를 포함하는, (1) 내지 (16) 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 제조 방법 :

(a) (29) 에 기재된 세포를 배양하는 공정 ;

(b) 공정 (a) 의 배양물로부터 모노클로날 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 회수하는 공정.

도 1 은, 래트 항 GPR20 항체 04-093 의 중사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 3) 및 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 2) 을 나타낸다.
도 2 는, 래트 항 GPR20 항체 04-093 의 경사슬의 아미노산 서열 (서열 번호 11) 및 뉴클레오티드 서열 (서열 번호 10) 을 나타낸다.
도 3 은, 래트 항 GPR20 항체 04-093 의 CDRH1 ∼ 3 (서열 번호 5 ∼ 9), CDRL1 ∼ 3 의 아미노산 서열 (서열 번호 13 ∼ 15) 을 나타낸다.
도 4 는, 토끼 키메라화 항체 중사슬 OcHch 의 아미노산 서열 (서열 번호 19) 을 나타낸다.
도 5 는, 토끼 키메라화 항체 경사슬 OcLch 의 아미노산 서열 (서열 번호 21) 을 나타낸다.
도 6 은, 토끼화 항체 중사슬 OcH01 의 아미노산 서열 (서열 번호 23) 을 나타낸다.
도 7 은, 토끼화 항체 중사슬 OcH02 의 아미노산 서열 (서열 번호 25) 을 나타낸다.
도 8 은, 토끼화 항체 경사슬 OcL01 의 아미노산 서열 (서열 번호 27) 을 나타낸다.
도 9 는, 인간 GPR20 일과성 발현 세포주와 항인간 GPR20 항체를 산생하는 하이브리도마의 배양 상청을 반응시켰을 때의 플로우 사이토메트리 해석 결과를 나타낸다. 세로축은 플로우 사이토메트리법에 의해 측정된 평균 형광 강도 (MFI) 의 상대값을 나타낸다.
도 10 은, 인간 GPR20 의 N 말단 48 아미노산으로 이루어지는 합성 펩티드에 대한 항인간 GPR20 항체의 결합성을 나타낸다.
도 11-1 은, 인간 GPR20 일과성 발현 세포에 대한 항 GPR20 항체의 면역 염색 이미지를 나타낸다. 도 11-1 은, 래트 항 GPR20 모노클로날 항체의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 11-2 는, 인간 GPR20 일과성 발현 세포에 대한 항 GPR20 항체의 면역 염색 이미지를 나타낸다. 도 11-2 는, 시판되는 토끼 항 GPR20 폴리클로날 항체의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 11-3 은, 인간 GPR20 일과성 발현 세포에 대한 항 GPR20 항체의 면역 염색 이미지를 나타낸다. 도 11-3 은, 시판되는 토끼 항 GPR20 폴리클로날 항체의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 12-1 은, 소화관 간질 종양 GIST 의 래트 항인간 GPR20 항체 및 시판되는 토끼 항 GPR20 항체에 의한 염색 이미지를 나타낸다. 도 12-1 은, 위 유래 GIST 의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 12-2 는, 소화관 간질 종양 GIST 의 래트 항인간 GPR20 항체 및 시판되는 토끼 항 GPR20 항체에 의한 염색 이미지를 나타낸다. 도 12-2 는, 소장 유래 GIST 의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 12-3 은, 소화관 간질 종양 GIST 의 래트 항인간 GPR20 항체 및 시판되는 토끼 항 GPR20 항체에 의한 염색 이미지를 나타낸다. 도 12-3 은, 대장 유래 GIST 의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 13 은, PC-3, GIST430, GIST430/654 피하 이식 마우스 모델 유래 종양 조직에 대한 래트 항 GPR20 항체 04-093, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체의 GPR20 염색 이미지를 나타낸다.
도 14-1 은, 소화관 간질 종양 GIST 의 래트 항 GPR20 항체 04-093, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체에 의한 염색 이미지를 나타낸다. 도 14-1 은, 위 유래 GIST 의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 14-2 는, 소화관 간질 종양 GIST 의 래트 항 GPR20 항체 04-093, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체에 의한 염색 이미지를 나타낸다. 도 14-2 는, 소장 유래 GIST 의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 14-3 은, 소화관 간질 종양 GIST 의 래트 항 GPR20 항체 04-093, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체에 의한 염색 이미지를 나타낸다. 도 14-3 은, 대장 유래 GIST 의 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 15 는, 인간 GPR20 의 N 말단 1 내지 48 아미노산으로 이루어지는 합성 펩티드 그리고 30 - 48 아미노산으로 이루어지는 합성 펩티드에 대한 래트 항 GPR20 모노클로날 항체의 결합 활성을 나타내고 있다. 가로축은 클론 번호, 세로축은 화학 발광량 (CPS) 에 의한 항체 결합량을 나타낸다.
도 16 은, 04-093 항체의 에피토프 (서열 번호 31 : 인간 GPR20 의 30 내지 42 번째의 아미노산 서열) 를 나타낸다.
도 17 은, OcH1L1, OcH2L1, OcChimera, 토끼IgG, 항-FLAG, 항-β 액틴을 사용한 웨스턴 블로트법에 의한 검출 결과를 나타내는 도면을 나타낸다.

1. 정의

본 발명에 있어서, 「유전자」 란, 단백질의 아미노산을 코드하는 염기 서열이 포함되는 뉴클레오티드 또는 그 상보 사슬을 의미하고, 예를 들어, 단백질의 아미노산을 코드하는 염기 서열이 포함되는 뉴클레오티드 또는 그 상보 사슬인 폴리뉴클레오티드, 올리고 뉴클레오티드, DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등은 「유전자」 의 의미에 포함된다. 이러한 유전자는 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상의 뉴클레오티드이고, DNA 사슬과 RNA 사슬의 회합체, 1 본의 뉴클레오티드 사슬 상에 리보뉴클레오티드 (RNA) 와 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 가 혼재되는 것 및 그러한 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 2 본쇄 또는 3 본쇄 이상의 뉴클레오티드도 「유전자」 의 의미에 포함된다. 본 발명의 「GPR20 유전자」 로는, 예를 들어, GPR20 단백질의 아미노산 서열을 코드하는 염기 서열이 포함되는 DNA, mRNA, cDNA, cRNA 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「뉴클레오티드」 와 「핵산」 은 동일한 의미이고, 예를 들어, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 프라이머 등도 「뉴클레오티드」 의 의미에 포함된다. 이러한 뉴클레오티드는 1 본쇄, 2 본쇄 또는 3 본 이상의 사슬로 이루어지는 뉴클레오티드이고, DNA 사슬과 RNA 사슬의 회합체, 1 본의 뉴클레오티드 사슬 상에 리보뉴클레오티드 (RNA) 와 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA) 가 혼재되는 것 및 그러한 뉴클레오티드 사슬을 포함하는 2 본쇄 또는 3 본 이상의 사슬의 회합체도 「뉴클레오티드」 의 의미에 포함된다.

본 발명에 있어서, 「폴리펩티드」, 「펩티드」 및 「단백질」 은 동일한 의미이다.

본 발명에 있어서, 「항원」 을 「면역원」 의 의미에 사용하는 경우가 있다.

본 발명에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체에서 유래하는 각종 세포, 계대 배양 세포, 초대 배양 세포, 세포주, 재조합 세포 및 미생물 등도 포함된다.

본 발명에 있어서는, GPR20 을 인식하는 항체를, 각각 「항 GPR20 항체」 라고 표기하는 경우가 있다. 이러한 항체에는, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 키메라화 항체, 토끼화 항체, 인간화 항체, 인간 항체 등이 포함된다.

본 발명에 있어서의 「항체의 기능 단편」 이란, 원래의 항체가 발휘하는 기능의 적어도 일부를 발휘하는 항체 단편을 의미한다. 「항체의 기능 단편」 으로는, 예를 들어, Fab, F(ab')2, scFv, Fab', 1 본쇄 면역 글로블린 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다. 이러한 항체의 기능 단편은, 항체 단백질의 전체 길이 분자를 파파인, 펩신 등의 효소로 처리함으로써 얻어진 것에 더하여, 재조합 유전자를 사용하여 적당한 숙주 세포에 있어서 산생된 재조합 단백질이어도 된다.

본 발명에 있어서, 항체가 결합하는 「부위」, 즉 항체가 인식하는 「부위」 란, 항체가 결합 또는 인식하는 항원 상의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조를 의미한다. 본 발명에 있어서는, 이러한 부위를 에피토프, 항체의 결합 부위라고도 부른다. 본 발명의 항 GPR20 항체가 결합 또는 인식하는 GPR20 단백질 상의 부위로는, GPR20 단백질 상의 부분 펩티드 또는 부분 고차 구조 등을 예시할 수 있다.

항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 상보성 결정 영역 (CDR : Complementarity determining region) 이 있는 것이 알려져 있다. 상보성 결정 영역은, 초가변 영역 (hypervariable domain) 이라고도 불리고, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 1 차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조 상에 있어서, 통상, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 발명에 있어서는, 항체의 상보성 결정 영역에 대해, 중사슬의 상보성 결정 영역을 중사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 상보성 결정 영역을 경사슬 아미노산 서열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하고, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.

본 발명에 있어서, 「항체 변이체」 란, 원래의 항체가 갖는 아미노산 서열에 있어서 아미노산이 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 (이하, 「변이」 라고 총칭한다) 하여 이루어지는 아미노산 서열을 갖고, 또한 본 발명의 GPR20 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 항체 변이체에 있어서의 변이 아미노산의 수는, 1 내지 2 개, 1 내지 3 개, 1 내지 4 개, 1 내지 5 개, 1 내지 6 개, 1 내지 7 개, 1 내지 8 개, 1 내지 9 개, 1 내지 10 개, 1 내지 12 개, 1 내지 15 개, 1 내지 20 개, 1 내지 25 개, 1 내지 30 개, 1 내지 40 개 또는 1 내지 50 개이다. 이러한 항체 변이체도 본 발명의 「항체」 에 포함된다.

본 발명에 있어서, 「1 내지 수 개」 에 있어서의 「수 개」 란, 3 내지 10 개를 가리킨다.

본 발명의 항체가 발휘하는 활성·성질로는, 예를 들어, 생물적 활성, 이화학적 성질 등을 들 수 있고, 구체적으로는, 각종 생물 활성, 항원이나 에피토프에 대한 결합 활성, 제조나 보존시에 있어서의 안정성, 열안정성 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 5 × SSC 를 포함하는 용액 중에서 65 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시하고, 이어서 2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 0.5 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 그리고 0.2 × SSC - 0.1 ％ SDS 를 포함하는 수용액 중에서 65 ℃ 에서 20 분간, 각각 세정하는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 의미한다. SSC 란 150 mM NaCl - 15 mM 시트르산나트륨의 수용액이고, n × SSC 는 n 배 농도의 SSC 를 의미한다.

본 발명에 있어서 「세포 상해」 란, 어떠한 형태로, 세포에 병리적인 변화를 가져오는 것을 가리키고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 의미한다.

본 발명에 있어서 「세포 상해 활성」 이란 상기 세포 상해를 일으키는 것을 의미한다. 본 발명에 있어서 「항체 의존성 세포 상해 활성」 이란, 「antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) 활성」 을 가리키고, NK 세포가 항체를 통해서 종양 세포 등의 표적 세포를 상해하는 작용 활성을 의미한다.

본 발명에 있어서 「암」 과「종양」 은 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서 「면역 조직 화학 (immunohistochemistry : IHC)」 이란 조직 표본 중의 항원을 검출하는 조직학적 (조직 화학적) 수법을 의미하고, 「면역 항체법」 과 동일한 의미이고, 「면역 염색 (immunostaining)」 도 동일한 의미로 사용된다.

본 발명에 있어서 「변성형 GPR20」 란, 포르말린으로 고정시킨 표본 중의 GPR20 분자를 의미한다. 포르말린으로 고정시킨 후에 파라핀 처리 및 탈파라핀 처리한 표본 중의 GPR20 분자도 「변성형 GPR20」 이라고 한다.

본 발명에 있어서 「비변성형 GPR20」 이란, 포르말린으로 고정시키지 않은 샘플 중의 GPR20 을 의미한다. 포르말린으로 고정시키지 않은 표본 중의 GPR20 분자도 「비변성형 GPR20」 이라고 한다.

2. GPR20

본 발명에서 사용하는 GPR20 은, 인간, 인간 이외의 포유 동물 (예를 들어, 모르모트, 래트, 마우스, 토끼, 돼지, 양, 소, 원숭이 등) 혹은 닭의 T 세포 혹은 비만 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 상기의 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또, GPR20 을 in vitro 에서 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, GPR20 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 GPR20 을 발현시킴으로써, 그 단백질을 얻을 수 있다.

인간 GPR20 의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열은, GenBank 에 액세션 번호 : NM_005293 으로 등록되어 있다. 또, 인간 GPR20 의 아미노산 서열은, GenBank 에 액세션 번호 : NP_005284 로 등록되어 있다.

GPR20 의 cDNA 는 예를 들어, GPR20 의 mRNA 를 발현하고 있는 장기의 cDNA 라이브러리 또는 인간 세포로부터 추출한 게놈 DNA 를 주형으로 하여, GPR20 의 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리메라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, 487-49) 을 실시하는, 이른바 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

또한, 인간 GPR20 을 코드하는 뉴클레오티드 서열과 상보적인 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드와 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GPR20 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 GPR20 의 cDNA 에 포함된다. 또한 인간 GPR20 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 베리언트 또는 이것에 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드로서, 또한 GPR20 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드도 GPR20 의 cDNA 에 포함된다.

또, 인간 GPR20 의 아미노산 서열에 있어서, 1 개, 2 혹은 3 개 또는 4 혹은 5 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, GPR20 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 GPR20 에 포함된다. 또한 인간 GPR20 유전자좌로부터 전사되는 스플라이싱 베리언트에 코드되는 아미노산 서열 또는 그 아미노산 서열에 있어서, 1 개, 2 혹은 3 개 또는 4 혹은 5 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GPR20 과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 GPR20 에 포함된다.

본 명세서에서 사용된 인간 GPR20 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 1 에 기재되어 있다.

3. 항 GPR20 항체의 제조

본 발명의 GPR20 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여, GPR20 또는 GPR20 의 아미노산 서열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역하고, 생체 내에 산생되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 GPR20 의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 원숭이, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 GPR20 을 동물에 면역할 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 GPR20 에 결합하는 항체와 인간 GPR20 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다. 또한, 항원이 되는 GPR20 은 GPR20 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 산생시킴으로써 얻을 수 있다. 구체적으로는, GPR20 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현한 GPR20 을 정제하면 된다.

본 발명의 GPR20 에 대한 항체는, DNA 면역법을 사용하여 얻을 수도 있다. DNA 면역법이란, 항원 발현 플라스미드를 마우스나 래트 등의 동물 개체에 유전자 도입하고, 항원을 개체 내에서 발현시킴으로써, 항원에 대한 면역을 유도하는 수법이다. 유전자 도입의 수법에는, 직접 플라스미드를 근육에 주사하는 방법이나, 리포솜이나 폴리에틸렌이민 등의 도입 시약을 정맥 주사하는 방법, 바이러스 벡터를 사용하는 수법, 플라스미드를 부착시킨 금 입자를 Gene Gun 에 의해 쏘아넣는 수법, 급속히 대량의 플라스미드 용액을 정맥 주사하는 Hydrodynamic 법 등이 존재한다. 발현 플라스미드의 근주 (筋注) 에 의한 유전자 도입법에 관해, 발현량을 향상시키는 수법으로서, 플라스미드를 근주 후, 동일한 부위에 일렉트로포레이션을 가하는 in vivo electroporation 이라는 기술이 알려져 있다 (Aihara H, Miyazaki J. Nat Biotechnol. 1998 Sep ; 16(9) : 867-70 또는 Mir LM, Bureau MF, Gehl J, Rangara R, Rouy D, Caillaud JM, Delaere P, Branellec D, Schwartz B, Scherman D. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Apr 13 ; 96(8) : 4262-7.). 본 수법은 플라스미드의 근주 전에 히알루로니다아제로 근육을 처리함으로써, 더욱 발현량이 향상된다 (McMahon JM1, Signori E, Wells KE, Fazio VM, Wells DJ. Gene Ther. 2001 Aug ; 8(16) : 1264-70).

또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N. Y. (1980)) 에 따라, GPR20 에 대한 항체를 산생하는 항체 산생 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다. 이와 같은 방법의 구체적인 예는, 국제 공개 제WO09/48072호 팜플렛 (2009년 4월 16일 공개) 및 제WO10/117011호 (2010년 10월 14일 공개) 팜플렛에 기재되어 있다.

이와 같이 하여 수립된 래트 항인간 GPR20 항체의 실례로는, 04-093 항체를 들 수 있다. 04-093 항체 중사슬의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 3 에, 이것을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열표의 서열 번호 2 에, 각각 나타내고 있다. 04-093 항체 경사슬의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 11 에, 이것을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 서열표의 서열 번호 10 에, 각각 나타내고 있다. 04-093 항체는, 서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 48 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합한다. 또, 04-093 항체는 서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 48 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 펩티드 중의 LEVPLFHLFARLD (서열 번호 31) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프에 결합한다.

본 발명의 항체는, 04-093 항체에서 유래하는 6 종 모든 CDR 서열을 유지하고, GPR20 에 결합하는 활성을 가지고 있는 항체이면 된다. 즉, 본 발명의 항체의 중사슬 가변 영역은, 서열 번호 5 또는 8 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1 (GFTFNNYWMT (Abm 의 정의에 의한다) 또는 NYWMT (Kabat 의 정의에 의한다)), 서열 번호 6 또는 9 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 (SITNIDGSSY (Abm 의 정의에 의한다) 또는 SITNIDGSSYYPDSVKG (Kabat 의 정의에 의한다)), 및 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 (GSFDY) 을 보유하고 있다. 또, 상기의 항체의 경사슬 가변 영역은, 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1 (KASQNVNKYLN), 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 (NTNNLQT), 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 (FQHVSWLT) 을 보유하고 있다. 이들 CDR 의 아미노산 서열은, 도 3 에도 기재되어 있다.

본 발명의 항체는 GPR20 단백질을 특이적으로 인식한다. 바꿔 말하면, 본 발명의 바람직한 항체는 GPR20 단백질에 특이적으로 결합한다.

어느 양태에 있어서, 바람직한 항체는, 비변성형의 인간 GPR20, 및 포르말린으로 고정시킨 표본 중의 변성형 인간 GPR20 의 양방에 특이적으로 결합한다. 또, 보다 바람직한 항체는, 비변성형의 인간 GPR20, 및 포르말린으로 고정시킨 표본 중의 변성형 인간 GPR20 의 양방에 특이적으로 결합하고, 또한 다른 GPR 패밀리에 특이적으로 결합하지 않는 항체 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체에는, 상기의 GPR20 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 또는 토끼화 (Rabbit type) 항체, 마우스화 항체 등도 포함된다. 이들 항체는, 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조). 또, 다른 예로는 마우스 또는 래트 유래의 항체의 가변 영역을 토끼 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다.

토끼 키메라화 항체의 더욱 구체적인 예로는 04-093 항체 유래의 중사슬 가변 영역과 토끼 중사슬의 정상 영역을 포함함으로써 이루어지는 중사슬 (OcHch), 그리고 04-093 항체 유래의 경사슬 가변 영역과 토끼 경사슬의 정상 영역을 포함함으로써 이루어지는 경사슬 (OcLch) 을 포함함으로써 이루어지는 항체를 들 수 있다. OcHch 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 19 의 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타나 있다. OcLch 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 21 의 아미노산 번호 21 내지 232 에 나타나 있다.

본 발명의 항체에는, 상기 인간화 항체나 토끼화 항체의 CDR 을 개변한 항체가 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 제WO90/07861호 팜플렛) 를 들 수 있다. 토끼화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 토끼 유래의 항체에 삽입한 항체, CDR 의 서열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 토끼 항체에 이식한 항체를 들 수 있다. CDR 의 아미노산 서열은, 카밧 (Kabat) 의 정의, 코시아 (Chothia) 의 정의, Abm 의 정의 등 공지된 방법에 의해 정할 수 있지만, 본 발명에 있어서의 CDR 은 어느 방법에 의해 정의된 것이어도 된다.

토끼화 항체의 더욱 구체적인 예로는, 04-093 항체의 토끼화 항체를 들 수 있고, 보다 구체적인 예로는, 서열표의 서열 번호 23 의 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 (OcH01) 또는 서열 번호 25 의 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 (OcH02), 및 서열 번호 27 의 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬 (OcL01) 을 포함함으로써 이루어지는 토끼화 항체를 들 수 있다.

또한, 포유류 배양 세포에서 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 서열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 상해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에는 당해 수식을 받은 항체도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등을 들 수 있다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되어 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 산생하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.

이상의 방법에 의해 얻어진 항체는, 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체의 성질을 비교할 때의 다른 지표의 일례로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는, 단백의 상대적 구조 안정성이 양호한 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 재빠르게, 또 정확하게 측정할 수 있는 방법이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.

또, 항체의 중사슬 및 경사슬의 전체 길이 서열을 적절한 링커를 사용하여 연결하고, 1 본쇄 이뮤노글로블린 (single chain immunoglobulin) 을 취득하는 방법도 알려져 있다 (Lee, H-S, et. al., Molecular Immunology (1999) 36, p.61-71 ; Shirrmann, T. et. al., mAbs (2010), 2, (1) p.1-4). 이와 같은 1 본쇄 이뮤노글로블린은 2 량체화함으로써, 본래는 4 량체인 항체와 유사한 구조와 활성을 유지하는 것이 가능하다. 또, 본 발명의 항체는, 단일한 중사슬 가변 영역을 갖고, 경사슬 서열을 갖지 않는 항체이어도 된다. 이와 같은 항체는, 단일 도메인 항체 (single domain antibody : sdAb) 또는 나노보디 (nanobody) 라고 불리고 있고, 실제로 낙타 또는 라마에서 관찰되고, 항원 결합능이 유지되어 있는 것이 보고되고 있다 (Muyldemans S. et. al., Protein Eng. (1994) 7(9), 1129-35, Hamers-Casterman C. et. al., Nature (1993) 363 (6428) 446-8). 상기의 항체는, 본 발명에 있어서의 항체의 항원 결합성 단편의 일종이라고 해석할 수도 있다.

항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주과 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 서열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 서열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 서열 유전자와 경사슬 서열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 다른 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다. 진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 동물 세포로는, (1) 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220) 를 들 수 있다. 또, 원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다. 이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 이상의 배양법에 있어서는 항체의 서열에 의해 수량이 상이한 경우가 있고, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다.

본 발명의 항체의 아이소 타입으로서의 제한은 없고, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA (IgA1, IgA2), IgD 혹은 IgE 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG 또는 IgM, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.

또 본 발명의 항체는, 항체의 항원 결합부를 갖는 항체의 항원 결합성 단편 또는 그 수식물이어도 된다. 항체를 파파인, 펩신 등의 단백질 분해 효소로 처리하거나, 혹은 항체 유전자를 유전자 공학적 수법에 의해 개변하여 적당한 배양 세포에 있어서 발현시킴으로써, 그 항체의 단편을 얻을 수 있다. 이와 같은 항체 단편 중에서, 항체 전체 길이 분자가 갖는 기능의 전부 또는 일부를 유지하고 있는 단편을 항체의 항원 결합성 단편이라고 부를 수 있다. 항체의 기능으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, 항체 의존성 세포 상해 활성, 보체 의존성 세포 상해 활성 및 보체 의존성 세포성 세포 상해 활성을 들 수 있다. 본 발명에 있어서의 항체의 항원 결합성 단편이 유지하는 기능은, GPR20 에 대한 결합 활성이다.

예를 들어, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab')2, Fv, 또는 중사슬 및 경사슬의 Fv 를 적당한 링커로 연결시킨 싱글 체인 Fv (scFv), 디아보디 (diabody/diabodies), 선상 항체, 및 항체 단편으로 형성된 다특이성 항체 등을 들 수 있다. 또, F(ab')2 를 환원 조건하에서 처리한 항체의 가변 영역의 1 가의 단편인 Fab' 도 항체의 단편에 포함된다.

또한 본 발명의 항체는 적어도 2 종류의 상이한 항원에 대해 특이성을 갖는 다특이성 항체이어도 된다. 통상 이와 같은 분자는 2 종류의 항원에 결합하는 것이지만 (즉, 이중 특이성 항체 (bispecific antibody)), 본 발명에 있어서의 「다특이성 항체」 는, 그 이상 (예를 들어, 3 종류) 의 항원에 대해 특이성을 갖는 항체를 포함하는 것이다.

본 발명의 다특이성 항체는, 전체 길이로 이루어지는 항체, 또는 그러한 항체의 단편 (예를 들어, F(ab')2 이중 특이성 항체) 이어도 된다. 이중 특이성 항체는 2 종류의 항체의 중사슬과 경사슬 (HL 쌍) 을 결합시켜 제조할 수도 있고, 상이한 모노클로날 항체를 산생하는 하이브리도마를 융합시켜, 이중 특이성 항체 산생 융합 세포를 제조함으로써도 제조할 수 있다 (Millstein et al., Nature (1983) 305, p.537-539).

본 발명의 항체는 1 본쇄 항체 (scFv 라고도 기재한다) 이어도 된다. 1 본쇄 항체는, 항체의 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역을 폴리펩티드의 링커로 연결함으로써 얻어진다 (Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, 113 (Rosenberg 및 Moore 편, Springer Verlag, New York, p.269-315 (1994), Nature Biotechnology (2005), 23, p.1126-1136). 또, 2 개의 scFv 를 폴리펩티드 링커로 결합시켜 제조되는 BiscFv 단편을 이중 특이성 항체로서 사용할 수도 있다.

1 본쇄 항체를 제조하는 방법은 당기술 분야에 있어서 주지되어 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호, 미국 특허 제5,260,203호, 미국 특허 제5,091,513호, 미국 특허 제5,455,030호 등을 참조). 이 scFv 에 있어서, 중사슬 가변 영역과 경사슬 가변 영역은, 콘주게이트를 만들지 않는 링커, 바람직하게는 폴리펩티드 링커를 개재하여 연결된다 (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988), 85, p.5879-5883). scFv 에 있어서의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역은, 동일한 항체에서 유래해도 되고, 다른 항체에서 유래해도 된다. 가변 영역을 연결하는 폴리펩티드 링커로는, 예를 들어 12 ∼ 19 잔기로 이루어지는 임의의 1 본쇄 펩티드가 사용된다.

scFv 를 코드하는 DNA 는, 상기 항체의 중사슬 또는 중사슬 가변 영역을 코드하는 DNA, 및 경사슬 또는 경사슬 가변 영역을 코드하는 DNA 중, 그들 서열 중 전부 또는 원하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR 법에 의해 증폭시키고, 이어서, 추가로 폴리펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA, 및 그 양단이 각각 중사슬, 경사슬과 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭시킴으로써 얻어진다.

또, 일단 scFv 를 코드하는 DNA 가 제조되면, 그것들을 함유하는 발현 벡터, 및 그 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또, 그 숙주를 사용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv 를 얻을 수 있다. 이들 항체 단편은, 상기와 동일하게 하여 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해 산생시킬 수 있다.

본 발명의 항체는, 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화되는 항체로는, 1 종류의 항체이어도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv 의 결합, 스트렙토아비딘과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체는, 아미노산 서열이 상이한 복수 종류의 항 GPR20 항체의 혼합물인 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로는, 상이한 항체를 산생하는 세포의 혼합물을 배양하고, 그 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).

항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체는, 추가로 이들 항체와 다른 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합하고 있는 것을 들 수 있다 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146).

얻어진 항체는 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다. 어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파마시아) 등을 들 수 있다. 또, 항원을 고정화시킨 담체를 사용하여, 항원에 대한 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.

4. 의약 조성물

본 발명은 항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체를 포함하는 의약 조성물을 제공한다.

본 발명의 의약 조성물은 GPR20 혹은 그 리간드의 과잉 발현 또는 GPR20 의 변이 혹은 유전자 증폭에 의한 GPR20 시그널 이상 또는 항진, 또는 GPR20 의 아이소폼의 스위칭에 의해 야기되거나 또는 증악화되는 각종 질환 (이하, 「GPR20 에 관련되는 질환」 이라고 한다), 특히 각종 암의 치료 또는 예방에 유용하다.

이러한 치료 또는 예방의 대상이 되는 암의 야기 또는 증악화의 원인으로는, GPR20 유전자 내의 1 염기 치환 (SNP), GPR20 의 고발현, GPR20 을 항상적으로 활성화하는 미스센스 변이, GPR20 유전자의 증폭 또는 과잉 발현, GPR20 아이소폼의 스위칭 등을 예시할 수 있다.

이러한 암종으로는, 예를 들어, 소화관 간질 종양 (GIST) 을 들 수 있고, 바람직하게는 GPR20 단백질을 발현하고 있는 소화관 간질 종양 (GIST) 을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 질환의 치료 또는 예방에는, 이러한 질환, 바람직하게는 GPR20 단백질을 발현하고 있는 개체에 있어서의 이러한 질환의 발증의 예방, 증악화 또는 진행의 억제 또는 저해, 이러한 질환으로 이환된 개체가 나타내는 1 개 또는 2 개 이상의 증상의 경감, 증악화 혹은 진행의 억제 또는 관해, 2 차성 질환의 치료 또는 예방 등이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 의약 조성물에는, 치료 또는 예방에 유효한 양의 항 GPR20 항체 또는 그 항체의 기능 단편과 약학상 허용되는 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 보존제 및/또는 보조제를 함유시킬 수 있다.

「치료 또는 예방에 유효한 양」 이란, 특정한 질환, 투여 형태 및 투여 경로에 대해 치료 또는 예방 효과를 발휘하는 양을 의미하고, 「약리학적으로 유효한 양」 과 동일한 의미이다.

본 발명의 의약 조성물에는, pH, 삼투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 그 조성물 또는 그것에 포함되는 항체의 안정성, 용해성, 서방성, 흡수성, 침투성, 제형, 강도, 성상, 형상 등을 변화시키거나, 유지하거나, 유지 (保持) 하거나 하기 위한 물질 (이하, 「제제용의 물질」 이라고 한다) 을 함유시킬 수 있다. 제제용의 물질로는, 약리학적으로 허용되는 물질이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 비독성 또는 저독성이라는 것은, 제제용의 물질이 바람직하게 구비하는 성질이다.

제제용의 물질로서 예를 들어, 아미노산류, 항균제, 항산화제, 완충제, 충전제, 킬레이트제, 착화제, 증량제, 단당류, 이당류, 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제, 친수 폴리머의 방부제, 용매, 당알코올, 현탁제, 계면 활성제, 안정화 증강제, 탄성 증강제, 수송제, 희석제, 부형제, 및/또는 약학상의 보조제 등을 들 수 있고, 그들 물질의 첨가량은, 항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체의 중량에 대하여 0.001 내지 1000 배, 바람직하게는 0.01 내지 100 배, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10 배이다.

항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체를 리포솜 중에 함유시킨 이뮤노리포솜, 항체와 리포솜이 결합하여 이루어지는 항체 수식체 (미국 특허 제6214388호 등) 를 함유하는 의약 조성물도, 본 발명의 의약 조성물에 포함된다.

부형제나 담체는, 통상 액체 또는 고체이고, 주사용의 물, 생리 식염수, 인공 뇌척수액, 그 밖의 경구 투여 또는 비경구 투여용의 제제에 사용되는 물질이면 특별히 한정되지 않는다. 생리 식염수로는, 중성의 것, 혈청 알부민을 포함하는 것 등을 들 수 있다.

완충제로는, 의약 조성물의 최종 pH 가 7.0 내지 8.5 가 되도록 조제된 Tris 버퍼, 동일하게 4.0 내지 5.5 가 되도록 조제된 아세트산 버퍼, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 시트르산 버퍼, 동일하게 5.0 내지 8.0 이 되도록 조제된 히스티딘 버퍼 등을 예시할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 고체, 액체, 현탁액 등이다. 동결 건조 제제를 들 수 있다. 동결 건조 제제를 성형하기 위해서는, 수크로오스 등의 부형제를 사용할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여 경로로는, 경장 (經腸) 투여, 국소 투여 및 비경구 투여 중 어느 것이어도 되고, 예를 들어, 정맥내 투여, 동맥내 투여, 근육내 투여, 피내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 경피 투여, 골내 투여, 관절내 투여 등을 들 수 있다.

이러한 의약 조성물의 조성은, 투여 방법, 항체의 GPR20 단백질 결합 친화성 등에 따라 결정할 수 있다. 본 발명의 항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체의 GPR20 단백질에 대한 친화성이 높을수록 (KD 값이 낮을수록), 적은 투여량으로 그 약효를 발휘할 수 있다.

본 발명의 항 GPR20 항체의 투여량은, 약리학적으로 유효한 양이면 한정되지 않고, 개체의 종, 질환의 종류, 증상, 성별, 연령, 지병, 그 항체의 GPR20 단백질 결합 친화성 또는 그 생물 활성, 그 밖의 요소에 따라 적절히 결정할 수 있지만, 통상, 0.01 내지 1000 ㎎/㎏, 바람직하게는 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 을, 1 내지 180 일간에 1 회, 또는 1 일 2 회 혹은 3 회 이상 투여할 수 있다.

의약 조성물의 형태로는, 주사제 (동결 건조 제제, 점적제 (点滴劑) 를 포함한다), 좌제, 경비형 흡수 제제, 경피형 흡수 제제, 설하제, 캡슐, 정제, 연고제, 과립제, 에어 졸제, 환제, 산제, 현탁제, 유제, 점안제, 생체 매립형 제제 등을 예시할 수 있다.

항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물은 다른 의약과 동시에 혹은 개개로 투여할 수 있다. 예를 들어, 다른 의약을 투여한 후에 항 GPR20 항체 또는 그 항체의 기능 단편을 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물을 투여하거나, 이러한 의약 조성물을 투여한 후에, 다른 의약을 투여하거나, 또는 당해 의약 조성물과 다른 의약을 동시에 투여해도 된다. 다른 의약으로는, 화학 요법제, 방사선 요법 등 각종 항암제 등을 들 수 있다. 그것들을 종합하여 본 발명의 항체와 「다른 약제와의 병용」 이라고 부르고, 본 발명의 항체, 그 기능 단편 또는 그 수식체에 더하여 추가적인 약제를 포함하는 의약 조성물도 본 발명에 포함된다.

본 발명은 암 등 GPR20 에 관련되는 질환의 치료 방법 또는 예방 방법, 그 질환의 치료용 또는 예방용 의약 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 항체의 사용, 그 질환의 치료 또는 예방을 위한 본 발명의 항체의 사용도 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 치료용 또는 예방용 키트도 본 발명에 포함된다.

5. 진단용 조성물

본 발명은 항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체를 포함하는 검사용 또는 진단용 조성물 (이하, 종합하여 「진단용 조성물」 이라고 한다) 도 제공한다.

본 발명의 진단용 조성물은, 암, 소화관 간질 종양 (GIST) 등 GPR20 에 관련되는 질환, GPR20 발현의 검사 또는 진단에 유용하다. 본 발명에 있어서 검사 또는 진단에는, 예를 들어, 이환 리스크의 판정 또는 측정, 이환의 유무의 판정, 진행이나 증악화의 정도의 측정, 항 GPR20 항체 등의 의약 조성물에 의한 약물 치료의 효과의 측정 또는 판정, 약물 치료 이외의 치료의 효과의 측정 또는 판정, 재발 리스크의 측정, 재발의 유무의 판정 등이 포함되지만, 검사 또는 진단이면 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 진단용 조성물은, 항 GPR20 항체 혹은 그 기능 단편 또는 그 수식체, 그것들을 포함하는 조성물, 그것들을 포함하는 의약 조성물을 투여하는 개체의 동정에 유용하다.

이러한 진단용 조성물에는, pH 완충제, 삼투압 조절제, 염류, 안정화제, 방부제, 현색제, 증감제, 응집 방지제 등을 함유시킬 수 있다.

본 발명은 암 등 GPR20 에 관련되는 질환의 검사 방법 또는 진단 방법, 그 질환의 진단용 조성물을 조제하기 위한 본 발명의 항체의 사용, 그 질환의 검사 또는 진단을 위한 본 발명의 항체의 사용도 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 검사 또는 진단용 키트도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 진단용 조성물을 사용한 검사 또는 진단의 방법으로는 샌드위치 ELISA 가 바람직하지만, 통상적인 ELISA 법이나 RIA 법, ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot) 법, 도트 블롯법, 옥터로니법, CIE (Counterimmunoelectrophoresis) 법, CLIA (Chemiluminescent immuno assay), FCM (Flow Cytometry) 등의 항체를 이용한 검출 방법이 이용 가능하다. 항체의 표지법으로는 비오틴 외에, HRP, 알칼리포스파타아제, FITC 나 ALEXA 등의 발형광단, 방사성 동위 원소 등의 라벨 등 생화학적 해석에 실시 가능한 표지법을 이용할 수 있다. 효소 표지를 이용한 검출에는 TMB (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)), BCIP (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트 (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)), ρ-NPP (ρ-니트로페닐 포스페이트 (ρ-nitrophenyl phosphate)), OPD (o-페닐렌디아민 (o-Phenylenediamine)), ABTS (3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산 (3-Ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)), SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate (서모 피셔 사이언티픽사) 등의 발색 기질이나 QuantaBlu (등록상표) Fluorogenic Peroxidase Substrate (서모 피셔 사이언티픽사) 형광 기질 외에, 화학 발광 기질을 사용할 수 있다. 본 측정에는, 인간 또는 비인간 동물 유래의 시료에 더하여, 재조합 단백질 등의 인공적인 처리를 더한 시료도 제공할 수 있다. 생물 개체 유래의 피검 시료로는, 예를 들어, 혈액, 관절액, 복수, 림프액, 뇌척수액, 조직 호모지네이트 상청, 조직 절편 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항체를 포함하는 검사 또는 진단용의 샌드위치 ELISA 키트에는, 컨트롤 (GPR20 유래 펩티드의 표준액), 발색 시약, 희석용 완충액, 고상용 항체, 검출용 항체, 그리고 세정액 등이 포함되어도 된다. 항원에 결합한 항체량을 측정하는 방법으로는, 흡광법, 형광법, 발광법, RI (Radioisotope) 법 등이 바람직하게 적용되고, 측정에는, 흡광 플레이트 리더, 형광 플레이트 리더, 발광 플레이트 리더, RI 액체 신틸레이션 카운터 등이 바람직하게 사용된다.

상기의 면역 조직학적 시험뿐만 아니라, 시료 중의 세포, 조직 또는 장기 혹은 그 일부로부터, 통상적인 방법에 따라 가용화한 단백을 조제하고, 당해 가용화 단백에 표지화 항체를 반응시킴으로써 가용화 단백 중의 GPR20 의 존부 (存否) 를 확인하는 웨스턴 블로팅법이나 도트 블롯법에 있어서도 사용할 수 있다. 대상이 되는 피검 시료로는, 혈액 등의 체액 중에 포함되는 세포, 혈중 순환 종양 세포, 암세포를 포함하는 여러 가지 세포가 분비하는 엑소좀 등으로 조제한 가용화 단백질이 포함되지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 면역 조직 화학 (immunohistochemistry : IHC) 의 분석에 유용한 항체, 그 기능 단편 및 그 수식체, 그리고 그것들을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물도 본 발명의 「진단용 조성물」 에 포함된다.

면역 조직 화학은, 조직 절편을 항원에 결합하는 항체 (1 차 항체) 와 반응시켜, 항원에 결합한 1 차 항체를 검출하는 수법이면 특별히 한정되지 않는다.

조직 절편은, 바람직하게는 포르말린 고정 후에 파라핀 포매 처리한다. 파라핀 포매 후, 박절 (薄切) 한 조직 절편을 탈파라핀 처리한 후, 항원 부활 처리 및 비특이적 반응 억제 처리를 실시한다. 항원 부활 처리의 방법으로는, 가열 처리, 프로테아제 등에 의한 효소 처리를 예시할 수 있고, 바람직하게는 가열 처리이다. 가열 처리의 조건으로는, 통상, 온도 90 내지 110 ℃, pH8 내지 10, 처리 시간 20 내지 60 분의 범위가 바람직하다. ph 의 조정에는 Tris-EDTA 완충액 (예를 들어, 1 mM 의 EDTA 를 함유하는 10 mM 트리스 완충액) 등을 사용할 수 있다. 비특이적 반응 억제 처리로는, 발색에 사용하는 효소와 동일하거나 또는 유사한 촉매 활성을 갖는 내인성의 효소를 불활성화하는 방법이 통상 사용된다. 퍼옥시다아제 반응에 의해 발색시키는 경우, 미리 조직 중에 존재하는 내인성의 퍼옥시다아제를 H₂O₂ 등으로 저해하는 것이 바람직하다. H₂O₂ 의 용매는 물, 메탄올 등을 사용할 수 있고, H₂O₂ 의 농도는 0.1 내지 3 ％, 바람직하게는 0.3 내지 3 ％ 이다. H₂O₂ 용액에는 아지화나트륨을 첨가할 수 있다. 또, 혈청이나 카세인에 의해 블로킹하는 방법도 비특이적 반응 억제 처리로서 사용할 수 있다. 혈청이나 카세인은, 1 차 항체 반응 전에 조직을 처리할 수 있지만, 1 차 항체를 희석시키는 용매에 함유시킬 수도 있다.

1 차 항체의 반응 조건은 특별히 한정되지 않지만, 온도 4 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 내지 37 ℃, 보다 바람직하게는 24 ℃ 이다. 반응 시간은 5 분 내지 일주야 (一晝夜), 바람직하게는 10 분 내지 4 시간, 보다 바람직하게는 30 분 내지 1 시간이다.

1 차 항체의 검출에는, 바람직하게는, 가시화할 수 있고 또한 1 차 항체에 결합하는 항체 (2 차 항체) 를 사용할 수 있다. 2 차 항체 자체에 결합하는 항체 (3 차 항체) 를 사용하여 3 회 이상의 반응을 실시하는 경우도 있다. 2 차 항체 또는 3 차 항체의 가시화법으로는, 퍼옥시다아제나 알칼리포스파타아제 등의 효소를 그들의 항체에 결합시키거나, 또는 그들 항체에 비오틴 등을 부가하여 상기 효소를 결합시킨 스트렙토아비딘 등과 결합시키고, 그들 효소에 대응하는 발색 기질을 반응시키는 방법을 바람직하게 사용할 수 있다. 효소를 2 차 항체 또는 3 차 항체에 결합시키는 방법으로는, 덱스트린 폴리머나 아미노산 폴리머에 상기 효소와 2 차 항체를 다수 결합시킨 시약을 사용하는 방법 (폴리머법) 을 예시할 수 있다. 비오틴화 2 차 항체 및 퍼옥시다아제 표지한 스트렙토아비딘을 반응시키는 방법 (LSAB 법) 에서는, 발색 기질로서 DAB 등을 사용할 수 있다. 또, 형광 색소 등으로 표지된 2 차 항체를 사용할 수도 있다. 형광 표지 2 차 항체로 처리했을 경우, 처리 후에 형광 현미경을 사용하여 양성 세포를 검출한다.

스미어법에서는, 적출 세포를 유리에 도포 또는 원심 분리기로 분리하고, 세포 성분과 액성 성분으로 나누고, 세포 성분에 대해 면역 염색을 실시한다. 즉, 세포 성분을 슬라이드 유리 상에 도포하고, 에탄올액 또는 10 ％ 포르말린액 등으로 고정시킨 후, 조직 절편과 동일한 면역 염색을 실시할 수 있다.

동결 포매법에서는, 적출 조직을 OCT 콤파운드 등으로의 포매 후에 액체 질소 등으로 급속 동결시키고, 크라이오스탯으로 박절함으로써 슬라이드 표본을 제조한다. 이 표본을 10 ％ 포르말린이나 에탄올액 등으로 고정시킨 후, 조직 절편과 동일한 면역 염색을 실시할 수 있다.

면역 조직 화학에 관련된 조작은, 반응액, 반응 조건, 세정 횟수 등을 프로그램하여 면역 장치에 장착하고, 자동화하여 실시할 수 있다.

화상 진단의 경우에는, 약학적으로 허용 가능한 방사성 핵종이나 발광체를 항체에 라벨하고, 피험자에게 그 항체를 투여하며, PET/CT 등의 화상 진단 기술을 사용하여 화상을 취하여, GPR20 의 존재를 판정 또는 검사할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 항체, 그 기능 단편 또는 그 수식체는, 바람직하게는 GPR20 에 결합하는 항체, 즉 GPR20 선택성을 갖는 항체, 그 기능 단편 또는 그 수식체이다.

인간 GPR20 선택성을 갖는 항체로는, 래트 04-093 항체의 중사슬의 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 을 포함하는 중사슬, 그리고 경사슬의 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 을 포함하는 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체, 래트 04-093 항체의 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 포함하여 이루어지는 항체, 래트 04-093 항체의 중사슬 및 경사슬을 포함하여 이루어지는 항체 등을 예시할 수 있다. 이러한 항체로는, 래트 04-093 항체, 04-093 항체 유래의 키메라 항체, 04-093 항체 유래의 토끼화 항체, 04-093 항체 유래의 인간화 항체 등을 들 수 있지만, 그것들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 하나의 바람직한 양태에 있어서, 진단용 조성물은, GPR20 검출용 또는 측정용이다.

본 발명은 피검 샘플 중의 인간 GPR20 을 검출 또는 측정하는 방법을 제공한다.

이들 검출 또는 측정 방법에는, 본 발명의 진단용 조성물을 사용할 수 있다. 이러한 측정 방법 및 진단용 조성물은, 인간 GPR20 양성암, 바람직하게는, 소화관 간질 종양의 진단용 또는 검사용으로서도 본 발명에 포함된다.

본 발명에는, GPR20 을 표적으로 하는 의약 조성물이 투여되는 개체 (환자) 를 동정하는 방법도 포함된다. 이러한 동정 방법에 있어서는, 그 개체 유래 샘플 중의 인간 GPR20 을 측정하고, 그 샘플 중에, 인간 GPR20 이 검출되거나, 또는 정상 개체 유래 샘플 중에 검출된 인간 GPR20 의 양과 비교하여 보다 많은 인간 GPR20 이 검출되었을 경우에, 그 개체를 양성으로 판정하고, GPR20 을 표적으로 하는 의약 조성물이 투여되는 개체로 동정할 수 있다.

또, GPR20 을 표적으로 하는 의약 조성물이 투여되는 개체를 동정하기 위해서는, 피험자 유래의 샘플 중에서 GPR20 의 발현이 확인되었을 경우 외에, 추가로 발현량이나 면역 염색에 의한 염색 비율이나 염색의 강도를 지표로 할 수 있다. 일례로는, 항 GPR20 항체로 면역 염색했을 때의 염색 정도에 따라 표 1 에 나타내는 0 내지 3 의 스코어를 설정하고, 스코어 1 이상, 2 이상 또는 3 이상의 피험자를, GPR20 을 표적으로 하는 의약 조성물이 투여되는 환자로 동정하는 방법을 들 수 있다.

[표 1]

당해 방법에는, 본 발명의 진단용 조성물을 사용할 수 있다.

또, 이러한 동정 방법의 바람직한 일 양태에 있어서, 그 개체는 암, 바람직하게는 소화관 간질 종양으로 이환하고 있거나 또는 그 리스크가 있다는 판정에 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 의약 조성물은, 그 일 양태에 있어서, 이러한 동정 방법에 있어서 양성으로 판정된 개체에 투여될 수 있다.

6. 시약

본 발명의 항체 혹은 그 항원 결합성 단편 또는 그 수식체는, 시약으로서도 유용하다. 이러한 시약은, 상기 서술한 검사 또는 진단용, 연구용 및 그 밖의 용도에서 사용된다.

실시예

이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 사용하였다. 또, 본 명세서에 있어서, 특별히 기재가 없는 시약, 용매 및 출발 재료는, 시판되는 공급원으로부터 용이하게 입수 가능하다.

실시예 1 : 래트 항인간 GPR20 항체의 제조

1)-1 인간 GPR20 발현 벡터의 구축

인간 GPR20 단백질 (NP_005284) 을 코드하는 cDNA 는, 당업자에게 공지된 방법에 따라 인간 뇌 유래 cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해 증폭되고, 포유 동물 발현용 벡터에 삽입함으로써 인간 GPR20 발현 벡터 pcDNA3.1-hGPR20 이 제조되었다. 인간 GPR20 의 아미노산 서열을 서열표의 서열 번호 1 에 나타낸다. pcDNA3.1-hGPR20 플라스미드 DNA 의 대량 조제는, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN 사) 를 사용하여 실시하였다.

1)-2 래트 면역

면역에는 6 주령의 WKY/Izm 래트의 암컷 (닛폰 SLC 사) 이 사용되었다. 먼저 래트 양다리 하퇴부를 히알루로니다아제 (Hyaluronidase) (SIGMA-ALDRICH 사) 로 전처리 후, 동일한 부위에 인간 GPR20 발현 벡터 pcDNA3.1-hGPR20 이 근육내 주사되었다. 계속해서, ECM830 (BTX 사) 을 사용하고, 2 니들 전극을 사용하고, 동일한 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 2 주에 한 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 반복한 후, 79 일째에 래트의 림프절을 채취하고 하이브리도마 제조에 사용하였다.

1)-3 하이브리도마 제조

림프절 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포를 Hybrimune Hybridoma Production System (Cyto Pulse Sciences 사) 을 사용하여 전기 세포 융합한 후, ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사) 에 현탁하고, 희석시켜 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 배양하였다. 출현한 각각의 하이브리도마 콜로니는, 모노 클론으로서 회수되고, ClonaCell-HY Selection Medium E (StemCell Technologies 사) 에 현탁하여 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 배양하였다. 적당히 세포가 증식한 후, 각각의 하이브리도마 세포의 동결 스톡을 제조함과 함께, 배양 상청이 회수되고, 항 GPR20 항체를 산생하는 하이브리도마의 스크리닝에 사용되었다.

1)-4 Cell-ELISA 법에 의한 항체 산생 하이브리도마의 스크리닝

1)-4-1 Cell-ELISA 용 항원 유전자 발현 세포의 조제

293α 세포 (인테그린 αv 및 인테그린 β3 을 발현하는 HEK293 유래의 안정 발현 세포주) 를 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중 5 x 10⁶ 세포/10 ㎖ 가 되도록 조제하였다. Lipofectamine 2000 (인비트로젠사) 을 사용한 형질 이입 순서에 따라, 이 293α 세포에 대해, pcDNA3.1-hGPR20 혹은 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1 의 DNA 를 도입하고, 96-웰 플레이트 (Corning 사) 에 100 ㎕ 씩 분주 후, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 24 내지 27 시간 배양하였다. 얻어진 형질 이입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.

1)-4-2 Cell-ELISA

실시예 1)-4-1 에서 조제한 발현 벡터 도입 293α 세포의 배양 상청을 제거 후, pcDNA3.1-hGPR20 또는 pcDNA3.1 도입 293α 세포의 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 500 배로 희석시킨 토끼에서 생성된 항-래트 IgG-퍼옥시다아제 항체 (Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit) (SIGMA 사) 를 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 3 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산 3 나트륨, 0.1 M 인산수소 2 나트륨·12 물 pH4.5) 에 o-페닐렌디아민 2 염산염 (와코우 순약사), H₂O₂ 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 100 ㎕/웰로 첨가하였다. 가끔 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1M HCl 을 100 ㎕/웰로 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 인간 GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체를 산생하는 하이브리도마를 선택하기 위해, 컨트롤의 pcDNA3.1 도입 293α 세포와 비교하여, pcDNA3.1-hGPR20 발현 벡터 도입 293α 세포쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 산생하는 하이브리도마를 항인간 GPR20 항체 산생 양성으로서 선택하였다.

1)-5 플로우 사이토메트리에 의한 인간 GPR20 결합 항체의 스크리닝

1)-5-1 플로우 사이토메트리 해석용 항원 유전자 발현 세포의 조제

293T 세포를 5 × 10⁴ 세포/㎠ 가 되도록 225 ㎠ 플라스크 (스미토모 베이크라이트사 제조) 에 파종하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, pcDNA3.1-hGPR20 및 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1 을 각각 293T 세포에 Lipofectamine 2000 을 사용하여 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 다음날, 발현 벡터 도입 293T 세포를 TrypLE Express (Life Technologies 사 제조) 로 처리하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 으로 세포를 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로우 사이토메트리 해석에 사용하였다.

1)-5-2 플로우 사이토메트리 해석

실시예 1)-4-2 의 Cell-ELISA 에서 양성으로 판정된 하이브리도마가 산생하는 항체의 인간 GPR20 에 대한 결합 특이성을 플로우 사이토메트리법에 의해 더욱 확인하였다. 실시예 1)-5-1 에서 조제한 일과성 발현 293T 세포의 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 항-래트 IgG FITC 접합체 (conjugate) (SIGMA 사 제조) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 2 ㎍/㎖ 7-아미노액티노마이신 D (Molecular Probes 사 제조) 를 포함하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500 : BeckmanCoulter 사 제조) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo (TreeStar 사 제조) 로 실시하였다. 7-아미노액티노마이신 D 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 작성하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1 도입 293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대해 pcDNA3.1-hGPR20 도입 293T 세포의 히스토그램이 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 항체를 산생하는 하이브리도마를 인간 GPR20 에 결합하는 항체 산생 하이브리도마로서 178 클론 선택하였다. 도 9 에 인간 GPR20 에 특이적으로 결합한 항체의 예로서 클론 번호 04-093, 13-001, 13-006, 13-010, 13-040 및 13-046, 그리고 1 차 항체를 첨가하고 있지 않은 음성 컨트롤 (w/o 1stAb) 의 결과를 나타낸다. 도 9 의 가로축은 클론 번호, 세로축은 MFI (mean fluorescence intensity) 에 의한 항체 결합량을 나타낸다.

1)-6 펩티드-ELISA 법에 의한 스크리닝

인간 GPR20 의 N 말단측 48 아미노산에 대한 결합성을 펩티드-ELISA 법에 의해 평가하였다. 96-웰 Maxisorp 플레이트 (Nunc 사) 에 PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석시킨 NeutrAvidin (Pierce 사) 을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 0.05 ％ Tween20 함유 PBS (이하 PBST) 로 3 회 세정한 후, C 말단이 비오틴화된 인간 GPR20 의 N 말단측 1-48 아미노산 (서열 번호 29) 으로 이루어지는 합성 펩티드 1 을 PBS 로 10 nM 에 용해시킨 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 동일하게 C 말단이 비오틴화된, GPR20 의 아미노산 서열과는 상이한 서열을 갖는 합성 펩티드를 첨가한 플레이트를 음성 컨트롤로서 준비하고, 이하 동일하게 처리하였다. 플레이트로부터 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, 1 ％ BSA 함유 PBS 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, 1 ％ BSA 함유 PBS 로 2 배 희석시킨 항인간 GPR20 항체 산생 하이브리도마의 배양 상청을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, PBS 로 500 배 희석시킨 토끼에서 생성된 항-래트 IgG-퍼옥시다아제 항체 (Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit) (SIGMA 사) 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 10 분간 가만히 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ARVO, PerkinElmer 사) 로 화학 발광을 측정하였다. 도 10 에 인간 GPR20 의 N 말단측 1-48 아미노산에 특이적인 결합을 나타낸 6 종의 항체의 전형적인 반응예를 나타낸다. 도 10 의 가로축은 클론 번호, 세로축은 화학 발광량 (CPS) 에 의한 항체 결합량을 나타낸다.

1)-7 래트 모노클로날 항체의 서브 클래스, 타입의 결정

래트 항인간 GPR20 모노클로날 항체의 중사슬의 서브 클래스, 경사슬의 타입은, RAT MONOCLONAL ANTIBODY ISOTYPING TEST KIT (DS 파머 바이오메디컬사) 에 의해 결정되었다. 그 결과, 04-093, 13-001, 13-006, 13-010, 13-040 및 13-046 은, 모두 IgG2b, κ 사슬인 것이 확인되었다. 또, 실시예 4 에 기재된 방법과 동일한 방법에 의해 염기 서열을 해석한 결과, 13-001, 13-006, 13-010, 13-040 의 각 항체의 아미노산 서열은 높은 상동성을 나타내는 서열을 가지고 있고, 동일한 에피토프를 인식하는 것이 추정되었다.

1)-8 래트 항인간 GPR20 항체의 조제

래트 항인간 GPR20 모노클로날 항체 04-093, 13-001 및 13-046 은, 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제되었다.

먼저, 각각의 항 GPR20 항체 산생 하이브리도마를 ClonaCell-HY Selection Medium E 로 충분량까지 증식시킨 후, Ultra Low IgG FBS (Life Technologies 사) 를 20 ％ 첨가한 Hybridoma SFM (Life Technologies 사) 에 배지 교환하고, 4 - 5 일간 배양하였다. 본 배양 상청을 회수하고, 0.8 ㎛ 의 필터에 통과시킨 후, 추가로 0.2 ㎛ 의 필터에 통과시켜 불용물을 제거하였다.

항체는, 상기의 하이브리도마 상청으로부터 Protein G 어피니티 크로마토그래피로 정제하였다. Protein G 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사) 에 항체를 흡착시키고, PBS 로 칼럼을 세정 후에 0.1 M 글리신/염산 수용액 (pH2.7) 으로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl (pH9.0) 을 첨가하여 pH7.0 ∼ 7.5 로 조정한 후에, Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사) 으로 HBSor (25 mM 히스티딘/5 ％ 소르비톨, pH6.0) 로의 버퍼 치환을 실시함과 함께 항체의 농축을 실시하고, 항체 농도를 0.7 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막에 Minisart-Plus 필터 (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.

실시예 2 : 래트 항인간 GPR20 항체의 IHC 적성 평가

2)-1 GPR20 일과성 발현 293T 세포를 사용한 GPR20 염색성 평가

2)-1-1 셀 블록의 제조

293T 세포는, Lipofectamine 2000 (Life Technologies 사) 을 사용하여, pcDNA3.1-hGPR20 또는 pcDNA3.1 (빈 벡터) 로 트랜스펙션되었다 (GPR20 발현 293T 세포). 이 GPR20 발현 293T 세포의 펠릿을 포르말린 고정 후에 파라핀 포매 블록으로 하였다. 동일하게 pcDNA3.1 (빈 벡터) 을 트랜스펙션한 293T 세포 (컨트롤 293T 세포) 에 대해서도 포르말린 고정 후에 파라핀 포매 블록으로 하였다.

2)-1-2 GPR20 일과성 발현 293T 세포의 면역 염색

1)-8 에서 조제한 래트 모노클로날 항인간 GPR20 항체 04-093, 13-001 및 13-046 과 시판되는 토끼 폴리클로날 항인간 GPR20 항체의 GPR20 염색성을 비교하였다. 시판되는 항체는, 모두 인간 GPR20 에서 유래하는 합성 펩티드를 항원으로 하여 제조되어 있고, LS Bio 사 제조의 LS-A101 (C 말단), LS-A102 (N 말단), LS-A103 (세포질 도메인), LS-A104 (C 말단), LS-B7724 (291 ∼ 340 아미노산), abcam 사 제조의 ab75559, Novus Biologicals 사 제조의 NLS101 (C 말단), Santa Cruz Biotechnology 사 제조의 sc-87141 (N 말단) 이 사용되었다. 또한, 괄호 안은 각 토끼 폴리클로날 항체 제조시의 면역에 사용된 합성 펩티드의 GPR20 내의 부위를 나타내고 있다.

탈파라핀 및 항원 부활은 Autostainer Link 용 전처리 시스템 (PT Link : DAKO 사 제조) 을 사용하고, 항원 부활액 (Target Retrieval Solution High pH : DAKO 사 제조), 97 ℃ 에서 20 분간 실시하였다. 그 후의 염색 작업은 자동 염색 장치 (다코 Autostainer Link48 : DAKO 사 제조) 를 사용하여 실온에서 실시하였다. EnVision FLEX 세척 버퍼 (WASH BUFFER) (DAKO 사 제조) 로 1 회 세정한 후, Peroxidase Block 3 ％ H2O2 (DAKO 사 제조) 를 첨가하고 5 분간 인큐베이트하고, EnVision FLEX 세척 버퍼로 1 회 세정하였다. Protein Block serum free (DAKO 사 제조) 를 첨가하고, 15 분간 인큐베이트하고, 에어 블로우 (Air blow) 로 액을 제거하였다. 항 GPR20 항체를 Signal stain Antibody diluent (Cell Signaling Technology 사 제조) 로 표 2-1 및 표 2-2 에 기재된 농도로 희석시키고, 30 분간 반응시켰다. EnVision FLEX 세척 버퍼로 3 회 세정 후, 1 차 항체의 종에 따라 래트 항체에는 Histofine simplestain mouse MAX PO (Rat) #414311 (니치레이 바이오사이언스사 제조), 토끼 항체에는 EnVision+ System-HRP 표지 중합체 항-토끼 (Labelled Polymer Anti-Rabbit) #K4003 (DAKO 사 제조) 을 첨가하고 30 분 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼로 2 회 세정하였다.

DAKO Liquid DAB+Substrate Chromogen System 을 첨가하고 합계 10 분 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼로 1 회 세정하였다. EnVision FLEX 헤마톡실린 (Hematoxylin) 을 첨가하고 5 분간 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼 및 이온 교환수로 합계 3 회 세정하였다.

각 항체의 전형적인 염색 결과를 도 11-1, 도 11-2, 및 도 11-3 에 나타낸다. 또, 도 11-1, 도 11-2, 및 도 11-3 에 있어서의 각 항체의 염색 강도를 스코어화한 결과를 표 2-1 및 표 2-2 에 나타낸다. 표 중에 있어서, +++ 는 강양성, ++ 는 양성, + 는 약양성, - 는 음성을 나타내고 있다. 래트 모노클로날 항 GPR20 항체 04-093, 13-001, 13-046 은 토끼 폴리클로날 항 GPR20 항체에 비해, GPR20 발현 293T 세포 (293-GPR20) 에 강한 염색성을 나타냈다. 한편, 음성 컨트롤 293T 세포 (293-EV) 에 대해, 래트 모노클로날 항 GPR20 항체는 염색성을 나타내지 않았으므로, GPR20 특이적인 염색성이 확인되었다.

[표 2-1]

[표 2-2]

2)-2 임상 GIST 조직 절편의 면역 염색

2)-2-1 GIST 조직 어레이의 염색

임상 검체에 있어서의 항 GPR20 항체의 염색성을 GIST481, Gastrointestinal stromal tumor tissue array, 24 cases/48 cores (US Biomax 사 제조) 를 사용하여 검토하였다.

탈파라핀 및 항원 부활은 Autostainer Link 용 전처리 시스템 (PT Link : DAKO 사 제조) 을 사용하고, 항원 부활액 (Target Retrieval Solution High pH : DAKO 사 제조), 97 ℃ 에서 20 분간 실시하였다. 그 후의 염색 작업은 자동 염색 장치 (다코 Autostainer Link48 : DAKO 사 제조) 를 사용하여 실온에서 실시하였다. EnVision FLEX 세척 버퍼 (DAKO 사 제조) 로 1 회 세정한 후, Peroxidase Block 3 ％ H2O2 (DAKO 사 제조) 를 첨가하고 5 분간 인큐베이트하고, EnVision FLEX 세척 버퍼로 1 회 세정하였다. Protein Block serum free (DAKO 사 제조) 를 첨가하고, 15 분간 인큐베이트하고, 에어 블로우로 액을 제거하였다. 래트 모노클로날 항 GPR20 항체 혹은 토끼 폴리클로날 항 GPR20 항체를 Signal stain Antibody diluent (Cell Signaling Technology 사 제조) 로 10 ㎍/㎖ 또는 5 ㎍/㎖ 로 희석시키고, 30 분간 반응시켰다. EnVision FLEX 세척 버퍼로 3 회 세정 후, Histofine simple stain mouse MAX PO (Rat) #414311 (니치레이 바이오사이언스사 제조) 을 첨가하고 30 분 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼로 2 회 세정하였다.

DAKO Liquid DAB+Substrate Chromogen System 을 첨가하고 합계 10 분 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼로 1 회 세정하였다. EnVision FLEX 헤마톡실린을 첨가하고 5 분간 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼 및 이온 교환수로 합계 3 회 세정하였다.

도 12 에 있어서 (도 12-1) 위 GIST, (도 12-2) 소장 GIST, (도 12-3) 대장 GIST 에 대한 각 항체의 GPR20 염색성을 비교한 결과, 래트 항 GPR20 항체 04-093 이 가장 고감도였다.

실시예 3 : 래트 항인간 GPR20 항체 04-093 의 서열 해석

3)-1 04-093 산생 하이브리도마로부터의 총 RNA (total RNA) 의 조제

04-093 의 중사슬 및 경사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 증폭시키기 위해, 04-093 산생 하이브리도마로부터 TRIzol Reagent (Ambion 사) 를 사용하여 총 RNA 를 조제하였다.

3)-2 5'-RACE PCR 에 의한 04-093 의 중사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 뉴클레오티드 서열의 결정

04-093 의 중사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 3)-1 에서 조제한 총 RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다. 04-093 의 중사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 중사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.

5'-RACE PCR 로 증폭시킨 중사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 플라스미드에 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 시그널 서열과 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 서열의 시퀀스 해석을 실시하였다.

3)-3 5'-RACE PCR 에 의한 04-093 의 경사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 증폭과 뉴클레오티드 서열의 결정

실시예 3)-2 와 동일한 방법으로 실시하였다. 단, 04-093 의 경사슬의 시그널 서열과 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 경사슬의 정상 영역의 서열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.

04-093 항체의 중사슬 및 경사슬의 전체 길이 서열은, 공지된 정상 영역의 서열과 연결함으로써 결정되었다. 래트의 중사슬 IgG2b 의 정상 영역의 염기 서열과 아미노산 서열은 IMGT, the international ImMunoGeneTics information system (등록상표) 에 게재되어 있는 AABR03048905 (IGHG2B*01) 의 염기 서열과 아미노산 서열을 참조하였다. 또, 래트의 경사슬 IgK 의 정상 영역의 염기 서열과 아미노산 서열은 동 시스템에 게재되어 있는 V01241 (IGKC*01) 의 염기 서열과 아미노산 서열을 참조하였다.

04-093 항체의 중사슬은, 서열표의 서열 번호 3 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 서열표의 서열 번호 3 에 나타내는 중사슬 아미노산 서열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 내지 133 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 134 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 당해 가변 영역은, 서열표의 서열 번호 3 에 있어서, 45 내지 54 번째의 아미노산 서열 (GFTFNNYWMT) 또는 50 내지 54 번째의 아미노산 서열 (NYWMT) 로 이루어지는 CDRH1, 69 내지 78 번째의 아미노산 서열 (SITNIDGSSY) 또는 69 내지 85 번째의 아미노산 서열 (SITNIDGSSYYPDSVKG) 로 이루어지는 CDRH2, 118 내지 122 에 기재된 아미노산 서열 (GSFDY) 로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. 04-093 항체의 중사슬 가변 영역은 서열표의 서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 04-093 항체의 CDRH1 은 서열표의 서열 번호 5 또는 8 에 나타내는 아미노산 서열을 갖고, CDRH2 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 6 또는 9 에 나타내는 아미노산 서열을 갖고, CDRH3 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 또, 04-093 항체의 중사슬의 아미노산 서열은 도 1 에 기재되어 있다.

04-093 항체의 경사슬은, 서열표의 서열 번호 11 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 서열표의 서열 번호 11 에 나타내는 경사슬 아미노산 서열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 시그널 서열이고, 20 내지 126 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 가변 영역이고, 127 내지 232 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 서열은 정상 영역이다. 당해 가변 영역은, 서열표의 서열 번호 11 에 있어서, 43 내지 53 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 69 내지 75 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 108 내지 115 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. 04-093 항체의 경사슬 가변 영역은 서열표의 서열 번호 12 에 나타내는 아미노산 서열을 갖는다. 04-093 항체의 CDRL1 은 서열표의 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열 (KASQNVNKYLN) 을 갖고, CDRL2 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열 (NTNNLQT) 을 갖고, CDRL3 의 아미노산 서열은 서열표의 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열 (FQHVSWLT) 을 갖는다. 또, 04-093 항체의 경사슬의 아미노산 서열은 도 2 에 기재되어 있다.

04-093 항체의 중사슬 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 2 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되어 있다. 서열표의 서열 번호 2 에 나타내는 뉴클레오티드 서열 중의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열이다. 서열표의 서열 번호 2 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 58 내지 399 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 04-093 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 400 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 04-093 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다. 당해 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 2 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 또는 뉴클레오티드 번호 118 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 205 내지 234 또는 205 내지 183 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 352 내지 366 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 04-093 항체의 중사슬의 시그널 서열과 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열표의 서열 번호 16 에도 나타나 있다. 서열표의 서열 번호 16 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 58 내지 399 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 중사슬 가변 영역을 코드하고 있다. 서열 번호 2 의 서열은 도 1 에도 기재되어 있다.

04-093 항체의 경사슬 아미노산 서열은, 서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 뉴클레오티드 서열에 의해 코드되어 있다. 서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열이다. 서열표의 서열 번호 10 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 58 내지 378 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 04-093 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 379 내지 696 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 04-093 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다. 당해 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 서열은, 서열 번호 10 에 있어서, CDRL1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 127 내지 159 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRL2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 205 내지 225 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRL3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 322 내지 345 에 기재된 뉴클레오티드 서열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 04-093 항체의 경사슬의 시그널 서열과 가변 영역의 뉴클레오티드 서열은 서열표의 서열 번호 17 에도 나타나 있다. 서열표의 서열 번호 17 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 58 내지 378 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 경사슬 가변 영역을 코드하고 있다. 또, 서열 번호 10 의 서열은 도 2 에 기재되어 있다.

실시예 4 : 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체의 제조

4)-1 항 GPR20 항체 04-093 의 토끼 키메라화체의 디자인

토끼 키메라화 서열은, 토끼의 중사슬 정상 영역 IGHG*02 와 토끼의 경사슬 정상 영역 IGKC2*01 을 IMGT (등록상표), the international ImMunoGeneTics information system (등록상표) 으로부터 참조하고, 클론 04-093 의 각각의 가변 영역에 연결함으로써 설계하였다.

토끼 키메라화 항체 중사슬을 OcHch 로 명명하고, 그 아미노산 서열을 서열 번호 19 에 기재하였다. 서열 번호 19 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 19 번째의 아미노산 서열은 시그널 서열을 나타내고, 20 내지 133 번째의 아미노산 서열은 중사슬 가변 영역을 나타내고, 134 내지 456 번째의 아미노산 서열은 중사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.

토끼 키메라화 항체 경사슬을 OcLch 로 명명하고, 그 아미노산 서열을 서열 번호 21 에 기재하였다. 서열 번호 21 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 20 번째의 아미노산 서열은 시그널 서열을 나타내고, 21 내지 127 번째의 아미노산 서열은 경사슬 가변 영역을 나타내고, 128 내지 232 번째의 아미노산 서열은 경사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 나타낸다.

4)-2 항 GPR20 항체 04-093 의 토끼화체의 디자인

토끼화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열은, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 설계하였다. 가변 영역의 아미노산 서열의 동일성과 토끼 생식세포계열 (germline) 서열에 있어서의 중용에 기초하여, 중사슬 억셉터 서열은 IGHV1S7*01 과 IGHJ3*01 을, 경사슬 억셉터 서열은 IGKV1S39*01 과 IGKJ1-2*01 을 선택하였다. 단백질 입체 구조 해석 프로그램 BioLuminate (Schrodinger 사 제조) 로 구축된 클론 04-093 의 호몰로지 모델을 분석하고, 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기를 Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준 등을 참고로 선택하였다. 중사슬 정상 영역은 토끼의 IGHG*02 를, 경사슬 정상 영역은 토끼의 IGKC1*01 을 선택하였다.

토끼화 항체 중사슬은, OcH01 및 OcH02 의 2 종류를 설계하고, 각각의 아미노산 서열을 서열 번호 23 및 25 에 기재하였다. 서열 번호 23 및 25 에 있어서, 1 내지 19 번째의 아미노산 서열은 시그널 서열을 나타내고, 20 내지 133 번째의 아미노산 서열은 가변 영역을 나타내고, 134 내지 456 번째의 아미노산 서열은 정상 영역을 나타낸다.

토끼화 항체 경사슬은, OcL01 의 1 종류를 설계하고, 그 아미노산 서열을 서열 번호 27 에 기재하였다. 서열 번호 27 에 있어서, 1 내지 20 번째의 아미노산 서열은 시그널 서열을 나타내고, 21 내지 127 번째의 아미노산 서열은 가변 영역을 나타내고, 128 내지 230 번째의 아미노산 서열은 정상 영역을 나타낸다.

4)-2 리컴비넌트 항체의 제조

4)-2-1 토끼 키메라화 항 GPR20 항체의 중사슬 발현 벡터의 구축

4)-2-1-1 항체 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축

플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 서열 번호 28 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 결합하고, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.

pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.

4)-2-1-2 토끼 키메라화 항체 중사슬 OcHch 발현 벡터의 구축

서열 번호 18 에 나타내는 토끼 키메라화 항체 중사슬 OcHch 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 서열표의 서열 번호 18 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 내지 82 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 83 내지 424 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 중사슬 가변 영역을 코드하고, 425 내지 1393 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다.

In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여, 합성한 DNA 단편과 pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편을 결합함으로써, 토끼 키메라화 항체 중사슬 OcHch 발현 벡터를 구축하였다.

4)-2-2 토끼 키메라화 항 GPR20 항체의 경사슬 발현 벡터의 구축

4)-2-2-1 토끼 키메라화 항체 경사슬 OcLch 발현 벡터의 구축

서열 번호 20 에 나타내는 토끼 키메라화 항체 경사슬 OcLch 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 서열표의 서열 번호 20 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 내지 85 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 86 내지 406 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 경사슬 가변 영역을 코드하고, 407 내지 721 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다. 실시예 4)-2-1-2 과 동일한 방법으로 토끼 키메라화 항체 경사슬 OcLch 의 발현 벡터를 구축하였다.

4)-2-3 토끼화 항 GPR20 항체의 중사슬 발현 벡터의 구축

4)-2-3-1 토끼화 항체 중사슬 OcH01 의 발현 벡터의 구축

서열 번호 22 에 나타내는 토끼화 항체 중사슬 OcH01 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 서열표의 서열 번호 22 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 내지 82 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 83 내지 424 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 중사슬 가변 영역을 코드하고, 425 내지 1393 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다. 실시예 4)-2-1-2 와 동일한 방법으로 토끼화 항체 중사슬 OcH01 발현 벡터를 구축하였다.

4)-2-3-2 토끼화 항체 중사슬 OcH02 의 발현 벡터의 구축

서열 번호 24 에 나타내는 토끼화 항체 중사슬 OcH02 의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 서열표의 서열 번호 24 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 내지 82 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 83 내지 424 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 중사슬 가변 영역을 코드하고, 425 내지 1393 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다. 실시예 4)-2-1-2 와 동일한 방법으로 토끼화 항체 중사슬 OcH02 발현 벡터를 구축하였다.

4)-2-4 토끼화 항 GPR20 항체의 경사슬 발현 벡터의 구축

4)-2-4-1 토끼화 항체 경사슬 OcL01 의 발현 벡터의 구축

서열 번호 26 에 나타내는 토끼화 항체 경사슬 OcL01 의 아미노산을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사). 서열표의 서열 번호 26 에 나타내는 뉴클레오티드 서열의 26 내지 85 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 시그널 서열을 나타내고, 86 내지 406 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 중사슬 가변 영역을 코드하고, 407 내지 721 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 서열은 정상 영역을 코드하고 있다. 실시예 5)-2-1-2 와 동일한 방법으로 토끼화 항체 경사슬 OcL01 발현 벡터를 구축하였다.

4)-2-5 리컴비넌트 항체의 조제

4)-2-5-1 리컴비넌트 항체의 생산

FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1.2 × 10⁹ 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 3L Fernbach Erlenmeyer 플라스크 (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 로 희석시켜 2.0 × 10⁶ 세포/㎖ 로 조제하였다. 40 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 0.24 ㎎ 의 중사슬 발현 벡터와 0.36 ㎎ 의 경사슬 발현 벡터와 1.8 ㎎ 의 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine) (Polyscience #24765) 을 첨가하여 천천히 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다. 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터로 4 시간, 90 rpm 으로 진탕 배양 후에 600 ㎖ 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 18 ㎖ 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 30 ㎖ 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터로 7 일간, 90 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 1회용 캡슐 필터 (Disposable Capsule Filter) (Advantec #CCS-045-E1H) 로 여과하였다.

리컴비넌트 항체의 발현에 있어서, OcHch 와 OcLch 의 발현 벡터를 조합함으로써 OcChimera, OcH01 과 OcL01 의 발현 벡터를 조합함으로써 OcH1L1, OcH02 와 OcL01 의 발현 벡터를 조합함으로써 OcH2L1 항체를 생산하였다.

4)-2-5-2 리컴비넌트 항체의 정제

실시예 4)-2-5-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피의 1 단계 공정에서 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌 염산염 용액 (pH4.0) 으로 용출하고, 항체가 포함되는 획분을 모았다. 그 획분을 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 에 대한 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF10K, Sartorius 사) 로 항체를 농축하고, IgG 농도를 2 ㎎/㎖ 로 조제하였다. 마지막에 Minisart-Plus 필터 (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.

실시예 5 : 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체를 사용한 면역 염색

5)-1 GIST 세포주의 면역 염색

실시예 4)-2-5 에서 제조한 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체의 염색성을, GIST 세포주 (GIST430, GIST430/654) 및 음성 대조로서 전립선암 세포주 (PC-3) 의 파라핀 포매 표본을 사용하여 검토하였다. 탈파라핀 및 항원 부활은 Autostainer Link 용 전처리 시스템 (PT Link : DAKO 사 제조) 을 사용하고, 항원 부활액 (Target Retrieval Solution High pH : DAKO 사 제조), 97 ℃ 에서 40 분간 실시하였다. 그 후의 염색 작업은 자동 염색 장치 (다코 Autostainer Link48 : DAKO 사 제조) 를 사용하여 실온에서 실시하였다. EnVision FLEX 세척 버퍼 (DAKO 사 제조) 로 1 회 세정한 후, Peroxidase Block 3 ％ H2O2 (DAKO 사 제조) 를 첨가하고 5 분간 인큐베이트하고, EnVision FLEX 세척 버퍼로 1 회 세정하였다. Protein Block serum free (DAKO 사 제조) 를 첨가하고, 30 분간 인큐베이트하고, 에어 블로우로 액을 제거하였다. 래트 모노클로날 항 GPR20 항체 혹은 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체를 REAL Antibody Diluent (DAKO 사 제조) 로 1.0 ㎍/㎖ ∼ 10 ㎍/㎖ 로 희석시키고, 30 분간 반응시켰다. EnVision FLEX 세척 버퍼로 3 회 세정 후, 래트 항체에 대해서는 Histofine simplestain mouse MAX PO(Rat) #414311 (니치레이 바이오사이언스사 제조) 을, 토끼 항체에 대해는 EnVision+ System-HRP Labelled Polymer Anti-Rabbit #K4003 (DAKO 사 제조) 을 첨가하고, 모두 30 분 인큐베이트한 후, EnVision FLEX 세척 버퍼로 2 회 세정하였다.

도 13 에 전형적인 염색 이미지를 나타낸다. GIST 세포주에 대해 토끼 키메라화 항체 OcChimera 및 토끼화 항체 OcH1L1, OcH2L1 은, 래트 항체 04-093 에 비해 보다 고감도인 염색성을 나타냈다. GPR20 을 발현하고 있지 않은 전립선암 세포주에 대해서는 염색성을 나타내지 않았다.

5)-2 임상 GIST 의 면역 염색

임상 검체에 있어서의 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체의 염색성을 GIST801, Gastrointestinal stromal tumor tissue array, 80 cases/80 cores (US Biomax 사 제조) 를 사용하여 검토하였다. 염색은 실시예 5)-1 과 동일한 방법으로 실시하였다.

도 14 에 있어서 (도 14-1) 위 GIST, (도 14-2) 소장 GIST, (도 14-3) 대장 GIST 에 대한 각 항체의 GPR20 염색성을 비교한 결과, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체는 모두 래트 항 GPR20 항체 04-093 보다 고감도이었다.

실시예 6 : 에피토프의 동정

6)-1 펩티드 ELISA 에 의한 결합능 평가

이하의 합성 펩티드에 대한 래트 항인간 GPR20 항체 04-093 의 결합을 펩티드-ELISA 법에 의해 평가하였다. 96-웰 Maxisorp 플레이트 (Nunc 사) 에 PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석시킨 NeutrAvidin (Pierce 사) 을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, 300 ㎕/웰의 0.05 ％ Tween20 함유 PBS (이하 PBST) 로 3 회 세정한 후, C 말단이 비오틴화된, 인간 GPR20 의 아미노산 번호 1 내지 48 번째 (서열 번호 29) 로 이루어지는 합성 펩티드 1, 인간 GPR20 의 아미노산 번호 30 내지 48 번째 (서열 번호 30) 로 이루어지는 합성 펩티드 2, GPR20 의 아미노산 서열과는 상이한 서열을 갖는 음성 컨트롤의 합성 펩티드를 각각 PBS 로 10 nM 에 용해시킨 용액을 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 플레이트로부터 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, Blocker Casein in PBS (Thermo Fisher Scientific 사) 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 하룻밤 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, Blocker Casein in PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석시킨 04-093 항체를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, PBS 로 500 배 희석시킨 토끼에서 생성된 항-래트 IgG-퍼옥시다아제 항체 (Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit) (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 용액을 제거하고, PBST 로 3 회 세정한 후, SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent Substrate 를 100 ㎕/웰로 첨가하고, 실온에서 10 분간 가만히 정지시킨 후, 플레이트 리더 (SpectraMax M3, Molecular Devices 사) 로 화학 발광을 측정하였다. 도 15 에 각종 항체의 반응예를 나타낸다. 도 15 의 가로축은 클론 번호, 세로축은 화학 발광량 (CPS) 에 의한 항체 결합량을 나타낸다. 04-093 항체는, 합성 펩티드 1 및 합성 펩티드 2 에 대해 동등한 결합 활성을 나타냈다. 한편, 다른 항 GPR20 항체는, 합성 펩티드 2 에 대해 결합성을 나타내지 않았다. 본 결과로부터, 04-093 항체는 GPR20 의 아미노산 번호 30 내지 48 번째로 이루어지는 아미노산 서열 (서열 번호 30 : LEVPLFHLFARLDEELHGT) 에 결합하는 것이 나타났다.

6)-2 GPR20 단편 펩티드를 사용한 결합능 평가

에피토프를 상세하게 해석하기 위해, GPR20 의 아미노산 번호 29 내지 48 번째로 이루어지는 펩티드, 그리고 본 펩티드의 말단의 아미노산을 1 잔기씩 연속적으로 단축한 펩티드를 합성하고, N-말단을 비오틴화, C-말단을 아미드화한 것을 GPR20 단편 펩티드 라이브러리로서 제조하였다 (시그마 알드리치 재팬사). 제조한 GPR20 단편 펩티드와 04-093 항체의 해리 정수는, Octet RED384 시스템 (Pall ForteBio 사 제조) 을 사용하고, GPR20 단편 펩티드를 리간드로서 센서 칩에 포착, 04-093 항체를 아날라이트로 함으로써 측정하였다. 완충액으로서 PBS-T, 센서 칩으로서 스트렙토아비딘 센서 칩 (Pall ForteBio 사 제조) 을 사용하였다. 각 GPR20 단편 펩티드에 대해, 센서 칩을 1 ㎍/㎖ 의 펩티드 용액에 300 초간 담근 후, 04-093 항체의 희석 계열 용액 (0.247 ∼ 20 nM 의 3 배 희석 계열, 5 농도) 에 90 초간 담그고 결합상을 모니터하고, 계속해서 완충액에 담그고 270 초간의 해리상을 모니터하였다. 각 농도의 04-093 항체를 측정 후에는, 센서 칩을 재생하기 위해 시트르산 완충액 pH2.2 에 20 초간 담그고, 또한 평형화를 위해 완충액에 20 초간 담그었다. 데이터의 해석에는 1 : 1 결합 모델을 사용하고, 결합 속도 정수 ka, 해리 속도 정수 kd 및 해리 정수 (KD ; KD = kd/ka) 를 산출하였다.

결과를 표 3 에 나타낸다.

[표 3]

GPR20 단편 펩티드 (GLEVPLFHLFARLD : 서열 번호 29 의 아미노산 번호 29 내지 42) 는 04-093 항체에 강한 결합을 나타냈지만, (GLEVPLFHLFARL : 서열 번호 29 의 아미노산 번호 29 내지 41) 에서는 결합의 저하가 관찰되었다. 또, GPR20 단편 펩티드 (LEVPLFHLFARLDEEL : 서열 번호 29 의 아미노산 번호 30 내지 45) 는 04-093 항체에 강한 결합을 나타냈지만, (EVPLFHLFARLDEEL : 서열 번호 29 의 아미노산 번호 31 내지 45) 에서는 결합의 저하가 관찰되었다. 이러한 결과로부터, 서열 번호 29 의 아미노산 번호 30 내지 42 (LEVPLFHLFARLD : 서열 번호 31) 를 04-093 항체의 에피토프로서 동정하였다.

실시예 7 : 웨스턴 블로팅법에 의한 GPR20 단백질의 검출

293T 세포에 일과성으로 발현시킨 GPR20 단백질을 웨스턴 블로팅법에 의해 검출하였다. 293T 세포에 Lipofectamine 2000 (Life Technologies 사) 을 사용하고, 인간 GPR20 발현 벡터 pcDNA3.1-hGPR20, N 말단에 FLAG 태그를 부가한 인간 GPR20 의 발현 벡터 pFLAG-GPR20 그리고 pcDNA3.1 (빈 벡터) 을 각각 도입하였다. 각 세포로부터 Mem-PER Plus Membrane Protein Extraction Kit (ThermoFisher Scientific 사) 를 사용하여 막획분의 단백질 용해액을 조제하고, BCA protein assay (ThermoFisher Scientific 사) 를 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 농도 조정한 단백질 용액에 NuPAGE^TM LDS 샘플 버퍼 (4 X), NuPAGE^TM 샘플 환원제 (Sample Reducing Agent) (10 X) (Thermo Fisher Scientific 사) 를 1 X 농도가 되도록 첨가하고, 70 ℃ 에서 10 분간 가열한 후, 정법에 따라 Tris/Glysin/SDS 버퍼를 사용한 SDS-PAGE 로 20 ㎍/레인의 단백질을 전기 영동하였다. 영동 후의 겔로부터 Immobilon-FL 막 (Millipore 사) 에 단백질을 전사하였다. 이 Immobilon-FL 막을 Odyssey 블로킹 버퍼 (Blocking Buffer) (LI-COR 사) 로 1 시간 블로킹한 후, 0.1 ％ Tween20/Odyssey 블로킹 버퍼로 희석시킨 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 또는 토끼화 항 GPR20 항체의 1 차 항체 반응액 중에서 4 ℃, 하룻밤 진탕하였다. 또, 대조로서 토끼 IgG 및 마우스 항 FLAG 항체, 마우스 항 β 액틴 항체를 동일하게 1 차 항체 반응액으로서 사용하였다. SNAP i. d. 시스템 (Millipore 사) 을 사용하여 TBS-0.1 ％ Tween20 버퍼로 3 회 세정한 후, 0.1 ％ Tween20/Odyssey 블로킹 버퍼로 희석시킨 2 차 항체액 (1 차 항체가 토끼 항체인 경우에는 IRDye 680CW 염소 항-토끼 IgG, 1 차 항체가 마우스 항체인 경우에는 IRDye 800CW 염소 항-마우스 IgG 를 사용하였다) 으로 반응시킨 후, TBS-0.1 ％ Tween20 버퍼로 2 회, TBS 로 1 회 세정하였다. 형광의 검출에는 Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR 사) 을 사용하였다. 도 17 에 있어서, 토끼화 항 GPR20 항체 OcH1L1, OcH2L1, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 OcChimera 는, 인간 GPR20 을 발현하는 293T-pcDNA3.1-GPR20 세포 또는 N 말단에 FLAG 태그를 부가한 인간 GPR20 을 발현하는 293T-pFLAG-GPR20 세포에 대해 반응성을 나타내고, 복수의 밴드가 검출되었다. 한편, 음성 컨트롤인 293T-pcDNA3.1 세포에서는 밴드가 검출되지 않았다. 또, 마우스 항 FLAG 항체는 293T-pFLAG-GPR20 에 대해서만 반응성을 나타내고, 복수의 밴드가 검출되었다. 이상의 결과로부터, 토끼 키메라화 항 GPR20 항체 및 토끼화 항 GPR20 항체는 웨스턴 블로팅법에 의한 GPR20 의 검출에 유용하다는 것이 나타났다.

본 발명이 제공하는 항 GPR20 항체를 사용함으로써 GPR20 을 발현하고 있는 각종 암의 검사 또는 진단이 가능해지고, 본 발명의 항 GPR20 항체를 포함하는 GPR20 을 발현하고 있는 각종 암의 검사 또는 진단용 키트 등을 제공할 수 있다. 또, 본 발명의 항 GPR20 항체를 유효 성분으로서 포함하는 의약 조성물 등을 제공할 수 있다.

서열표 프리 텍스트

서열 번호 18 : 토끼 키메라화 항체 중사슬 OcHch 의 아미노산 서열을 코드하는 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 19 : 토끼 키메라화 항체 중사슬 OcHch 의 아미노산 서열

서열 번호 20 : 토끼 키메라화 항체 경사슬 OcLch 의 아미노산 서열을 코드하는 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 21 : 토끼 키메라화 항체 경사슬 OcLch 의 아미노산 서열

서열 번호 22 : 토끼화 항체 중사슬 OcH01 의 아미노산 서열을 코드하는 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 23 : 토끼화 항체 중사슬 OcH01 의 아미노산 서열

서열 번호 24 : 토끼화 항체 중사슬 OcH02 의 아미노산 서열을 코드하는 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 25 : 토끼화 항체 중사슬 H02 의 아미노산 서열

서열 번호 26 : 토끼화 항체 경사슬 OcL01 의 아미노산 서열을 코드하는 서열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 서열

서열 번호 27 : 토끼화 항체 경사슬 OcL01 의 아미노산 서열

서열 번호 28 : 인간 경사슬 시그널 서열 및 인간 κ 사슬 정상 영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 포함하는 DNA 단편

서열 번호 29 : 합성 펩티드 1 인간 GPR20 의 1 내지 48 번째의 아미노산 서열

<110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED <120> Anti-GPR20 Antibody <130> DSPCT-FP1813 <150> JP2017-067164 <151> 2017-03-30 <160> 31 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 358 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Pro Ser Val Ser Pro Ala Gly Pro Ser Ala Gly Ala Val Pro Asn 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Thr Thr Val Arg Thr Asn Ala Ser Gly Leu Glu Val 20 25 30 Pro Leu Phe His Leu Phe Ala Arg Leu Asp Glu Glu Leu His Gly Thr 35 40 45 Phe Pro Gly Leu Trp Leu Ala Leu Met Ala Val His Gly Ala Ile Phe 50 55 60 Leu Ala Gly Leu Val Leu Asn Gly Leu Ala Leu Tyr Val Phe Cys Cys 65 70 75 80 Arg Thr Arg Ala Lys Thr Pro Ser Val Ile Tyr Thr Ile Asn Leu Val 85 90 95 Val Thr Asp Leu Leu Val Gly Leu Ser Leu Pro Thr Arg Phe Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Gly Ala Arg Gly Cys Leu Arg Cys Ala Phe Pro His Val Leu 115 120 125 Gly Tyr Phe Leu Asn Met His Cys Ser Ile Leu Phe Leu Thr Cys Ile 130 135 140 Cys Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val Arg Pro Glu Gly Ser Arg Arg 145 150 155 160 Cys Arg Gln Pro Ala Cys Ala Arg Ala Val Cys Ala Phe Val Trp Leu 165 170 175 Ala Ala Gly Ala Val Thr Leu Ser Val Leu Gly Val Thr Gly Ser Arg 180 185 190 Pro Cys Cys Arg Val Phe Ala Leu Thr Val Leu Glu Phe Leu Leu Pro 195 200 205 Leu Leu Val Ile Ser Val Phe Thr Gly Arg Ile Met Cys Ala Leu Ser 210 215 220 Arg Pro Gly Leu Leu His Gln Gly Arg Gln Arg Arg Val Arg Ala Met 225 230 235 240 Gln Leu Leu Leu Thr Val Leu Ile Ile Phe Leu Val Cys Phe Thr Pro 245 250 255 Phe His Ala Arg Gln Val Ala Val Ala Leu Trp Pro Asp Met Pro His 260 265 270 His Thr Ser Leu Val Val Tyr His Val Ala Val Thr Leu Ser Ser Leu 275 280 285 Asn Ser Cys Met Asp Pro Ile Val Tyr Cys Phe Val Thr Ser Gly Phe 290 295 300 Gln Ala Thr Val Arg Gly Leu Phe Gly Gln His Gly Glu Arg Glu Pro 305 310 315 320 Ser Ser Gly Asp Val Val Ser Met His Arg Ser Ser Lys Gly Ser Gly 325 330 335 Arg His His Ile Leu Ser Ala Gly Pro His Ala Leu Thr Gln Ala Leu 340 345 350 Ala Asn Gly Pro Glu Ala 355 <210> 2 <211> 1398 <212> DNA <213> rat <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 2 atggacatca ggctcagctt ggttttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag 60 gtgcagctgg tggagtctgg gggaggccta gtgcagcctg gaaggtctct gaaactatcc 120 tgtgtagcct ctggattcac attcaacaac tactggatga cctggatccg ccaggctcca 180 gggaaggggc tggagtgggt tgcatccatt actaatattg atggtagcag ttactatcca 240 gactctgtga agggccgatt cactatctcc agagataatg taaaaagcac cctatacctg 300 caaatgaaca gtctgaggtc tgaggacacg gccacttatt actgtacaag aggatccttt 360 gattactggg gccaaggagt catggtcaca gtctcctcag cccaaacaac agccccatct 420 gtctatccac tggctcctgg atgtggtgat acaaccagct ccacggtgac tctgggatgc 480 ctggtcaagg gctatttccc tgagccagtc accgtgacct ggaactctgg agccctgtcc 540 agcgatgtgc acacctttcc agctgtcctg cagtctgggc tctacactct caccagctca 600 gtgacctcca gcacctggcc cagccagacc gtcacctgca acgtagccca cccggccagc 660 agcaccaagg tggacaagaa agttgagcgc agaaatggcg gcattggaca caaatgccct 720 acatgcccta catgtcacaa atgcccagtt cctgaactct tgggtggacc atctgtcttc 780 atcttcccgc caaagcccaa ggacatcctc ttgatctccc agaacgccaa ggtcacgtgt 840 gtggtggtgg atgtgagcga ggaggagccg gacgtccagt tcagctggtt tgtgaacaac 900 gtagaagtac acacagctca gacacaaccc cgtgaggagc agtacaacag caccttcaga 960 gtggtcagtg ccctccccat ccagcaccag gactggatga gcggcaagga gttcaaatgc 1020 aaggtcaaca acaaagccct cccaagcccc atcgagaaaa ccatctcaaa acccaaaggg 1080 ctagtcagaa aaccacaggt atacgtcatg ggtccaccga cagagcagtt gactgagcaa 1140 acggtcagtt tgacctgctt gacctcaggc ttcctcccta acgacatcgg tgtggagtgg 1200 accagcaacg ggcatataga aaagaactac aagaacaccg agccagtgat ggactctgac 1260 ggttctttct tcatgtacag caagctcaat gtggaaagga gcaggtggga tagcagagcg 1320 cccttcgtct gctccgtggt ccacgagggt ctgcacaatc accacgtgga gaagagcatc 1380 tcccggcctc cgggtaaa 1398 <210> 3 <211> 466 <212> PRT <213> rat <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <400> 3 Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Val Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Arg Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Asn Tyr Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Asn Ile Asp Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Ser 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met 115 120 125 Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu 130 135 140 Ala Pro Gly Cys Gly Asp Thr Thr Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys 145 150 155 160 Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser 165 170 175 Gly Ala Leu Ser Ser Asp Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser 195 200 205 Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val 210 215 220 Asp Lys Lys Val Glu Arg Arg Asn Gly Gly Ile Gly His Lys Cys Pro 225 230 235 240 Thr Cys Pro Thr Cys His Lys Cys Pro Val Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Ile Leu Leu Ile 260 265 270 Ser Gln Asn Ala Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Glu 275 280 285 Glu Pro Asp Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His 290 295 300 Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys 325 330 335 Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly Leu Val Arg Lys Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Val Met Gly Pro Pro Thr Glu Gln Leu Thr Glu Gln Thr Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Thr Ser Gly Phe Leu Pro Asn Asp Ile Gly Val Glu Trp 385 390 395 400 Thr Ser Asn Gly His Ile Glu Lys Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val 405 410 415 Met Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Met Tyr Ser Lys Leu Asn Val Glu 420 425 430 Arg Ser Arg Trp Asp Ser Arg Ala Pro Phe Val Cys Ser Val Val His 435 440 445 Glu Gly Leu His Asn His His Val Glu Lys Ser Ile Ser Arg Pro Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 4 <211> 114 <212> PRT <213> rat <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Thr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Thr Asn Ile Asp Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val 100 105 110 Ser Ser <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> rat <400> 5 Gly Phe Thr Phe Asn Asn Tyr Trp Met Thr 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> rat <400> 6 Ser Ile Thr Asn Ile Asp Gly Ser Ser Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> rat <400> 7 Gly Ser Phe Asp Tyr 1 5 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> rat <400> 8 Asn Tyr Trp Met Thr 1 5 <210> 9 <211> 17 <212> PRT <213> rat <400> 9 Ser Ile Thr Asn Ile Asp Gly Ser Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 10 <211> 696 <212> DNA <213> rat <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 10 atggctccag ttcaactctt agggctgctg ctgctctggc tcccagccat gagatgtgac 60 atccagatga cccagtctcc ttcagtcctc tctgcatctg tgggagacag agtcactctc 120 aactgcaaag caagtcagaa tgttaacaag tacttaaact ggtttcagca aaagcttgga 180 gaacctccca aactcctgat atataataca aacaatttgc aaacgggcat cccatcaagg 240 ttcagtggca gtggatctgg tacagattac acactcacca tcagcagcct gcagcctgaa 300 gatgttgcca catatttctg ctttcagcat gttagttggc tcacgttcgg ttctgggacc 360 aagctggaga tcaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat ctatcttccc accatccacg 420 gaacagttag caactggagg tgcctcagtc gtgtgcctca tgaacaactt ctatcccaga 480 gacatcagtg tcaagtggaa gattgatggc actgaacgac gagatggtgt cctggacagt 540 gttactgatc aggacagcaa agacagcacg tacagcatga gcagcaccct ctcgttgacc 600 aaggctgact atgaaagtca taacctctat acctgtgagg ttgttcataa gacatcatcc 660 tcacccgtcg tcaagagctt caacaggaat gagtgt 696 <210> 11 <211> 232 <212> PRT <213> rat <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(19) <400> 11 Met Ala Pro Val Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro Ala 1 5 10 15 Met Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Val Leu Ser Ala 20 25 30 Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val 35 40 45 Asn Lys Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Glu Pro Pro Lys 50 55 60 Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg 65 70 75 80 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser 85 90 95 Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Phe Gln His Val Ser 100 105 110 Trp Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp 115 120 125 Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala 130 135 140 Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 145 150 155 160 Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly 165 170 175 Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 180 185 190 Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn 195 200 205 Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val 210 215 220 Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 225 230 <210> 12 <211> 107 <212> PRT <213> rat <400> 12 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Val Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Leu Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Leu Gly Glu Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Phe Gln His Val Ser Trp Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 11 <212> PRT <213> rat <400> 13 Lys Ala Ser Gln Asn Val Asn Lys Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> rat <400> 14 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> rat <400> 15 Phe Gln His Val Ser Trp Leu Thr 1 5 <210> 16 <211> 399 <212> DNA <213> rat <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 16 atggacatca ggctcagctt ggttttcctt gtccttttca taaaaggtgt ccagtgtgag 60 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nucleotide sequence for chimeric rabbit antibody heavy chain OcHch <220> <221> sig_peptide <222> (26)..(82) <400> 18 ccagcctccg gactctagag ccaccatgaa gcacctgtgg ttctttctgc tgctggtggc 60 cgctcctaga tgggtgctgt ctgaagtgca gctggtggaa tctggcggag gactggttca 120 gcctggcaga agcctgaagc tgagctgtgt ggccagcggc ttcaccttca acaactactg 180 gatgacctgg atccggcagg cccctggcaa aggacttgaa tgggtcgcca gcatcaccaa 240 catcgacggc agcagctact accccgacag cgtgaagggc agattcacca tcagccggga 300 caacgtgaag tctaccctgt acctgcagat gaacagcctg cggagcgagg ataccgccac 360 ctactactgt accagaggca gcttcgacta ctggggccag ggcgtgatgg tcacagttag 420 ctctggacag cccaaggctc ccagcgtttt ccctctggct ccttgctgtg gcgatacccc 480 tagcagcaca gtgacactgg gctgtctggt caagggctac ctgcctgaac ctgtgaccgt 540 gacctggaat agcggcaccc tgaccaacgg cgtgcggaca tttcctagcg tcagacagag 600 cagcggcctg tactctctga gcagcgtggt gtctgtgacc agcagctctc agcctgtgac 660 ctgcaatgtg gcccatcctg ccaccaacac caaggtggac aaaaccgtgg ctccctccac 720 ctgtagcaag cccacatgtc ctccaccaga gctgctcgga 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sig_peptide <222> (26)..(85) <400> 26 ccagcctccg gactctagag ccaccatggt tctgcagaca caggtgttca tcagcctgct 60 gctgtggatc tctggcgcct acggcgacat cgtgatgacc cagacacctt ctccagtgtc 120 tgccgccgtt ggcggcaccg tgacaatcaa ttgcaaggcc agccagaacg tgaacaagta 180 cctgaactgg ttccagcaga agcccggcca gcctcctaag ctgctgatct acaacaccaa 240 caacctgcag accggcgtgc ccagcagatt ttctggctct ggcagcggca ccgactacac 300 cctgacaatt tctggcgtgc agtgcgacga tgccgccacc tactactgct ttcagcacgt 360 gtcctggctg acctttggcg gcggaacaga ggttgtggtc aagggcgatc ctgtggctcc 420 taccgtgctg atctttccac cagccgctga tcaggtggcc acaggcacag tgaccattgt 480 gtgcgtggcc aacaagtact tccccgacgt gaccgtgacc tgggaagtcg atggcaccac 540 acagaccacc ggcatcgaga acagcaagac ccctcagaac agcgccgact gcacctacaa 600 cctgagcagc acactgaccc tgacctccac acagtacaac agccacaaag agtacacctg 660 taaagtcacc cagggcacca ccagcgtggt gcagagcttc aatagaggcg actgctgagt 720 ttaaacgggg gaggctaact 740 <210> 27 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> amino acid sequence for rabbit type antibody light chian OcL01 <220> <221> SIGNAL <222> (1)..(20) <400> 27 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val Ser 20 25 30 Ala Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Val Asn Lys Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Gly Val Gln Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln His Val 100 105 110 Ser Trp Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys Gly Asp 115 120 125 Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp Gln Val 130 135 140 Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr Phe Pro 145 150 155 160 Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr Thr Gly 165 170 175 Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr Tyr Asn 180 185 190 Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys 195 200 205 Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser 210 215 220 Phe Asn Arg Gly Asp Cys 225 230 <210> 28 <211> 449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA fragment comprising human light chain signal sequence and human kappa chain constant region <400> 28 gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60 gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120 cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180 cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240 gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300 cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360 cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420 ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449 <210> 29 <211> 48 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Met Pro Ser Val Ser Pro Ala Gly Pro Ser Ala Gly Ala Val Pro Asn 1 5 10 15 Ala Thr Ala Val Thr Thr Val Arg Thr Asn Ala Ser Gly Leu Glu Val 20 25 30 Pro Leu Phe His Leu Phe Ala Arg Leu Asp Glu Glu Leu His Gly Thr 35 40 45 <210> 30 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Leu Glu Val Pro Leu Phe His Leu Phe Ala Arg Leu Asp Glu Glu Leu 1 5 10 15 His Gly Thr <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Leu Glu Val Pro Leu Phe His Leu Phe Ala Arg Leu Asp 1 5 10

Claims

서열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 48 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
GPR20 에 대한 결합에 대해, 서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 내지 466 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 11 의 아미노산 번호 20 내지 232 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 갖는 항체와 경합 저해 활성을 갖는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
LEVPLFHLFARLD (서열 번호 31) 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
중사슬 서열이, 서열 번호 5 또는 8 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, 서열 번호 6 또는 9 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2, 그리고 서열 번호 7 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는 가변 영역을 포함하고 ;
경사슬 서열이 서열 번호 13 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, 서열 번호 14 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2, 및 서열 번호 15 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 4 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 서열 번호 12 에 나타내는 경사슬 가변 영역을 포함함으로써 이루어지는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 3 의 아미노산 번호 20 내지 466 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 중사슬, 및 서열 번호 11 의 아미노산 번호 20 내지 232 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 경사슬로 이루어지는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 7 항에 있어서, 정상 영역이 토끼 항체 유래인 것을 특징으로 하는, 키메라 항체.
제 1 항 내지 제 5 항, 제 7 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 19 의 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬 및 서열 번호 21 의 아미노산 번호 21 내지 232 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬을 포함하는 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
토끼화되어 있는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화되어 있는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 당해 항체의 기능성 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
이하의 (a) 또는 (b) 에 기재된 중사슬, 및 (c) 에 기재된 경사슬을 포함하는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편 :
(a) 서열 번호 23 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(b) 서열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 중사슬,
(c) 서열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열로 이루어지는 경사슬.
제 1 항 내지 제 5 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 23 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 중사슬, 및 서열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 경사슬로 이루어지는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 5 항 및 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
서열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 456 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 중사슬, 및 서열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 230 에 나타내는 아미노산 서열을 포함함으로써 이루어지는 경사슬로 이루어지는, 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
Fab, F(ab')2, Fab' 및 Fv 로 이루어지는 군에서 선택되는, 항체의 항원 결합성 단편.
제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
scFv 인 것을 특징으로 하는, 항체.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 조성물.
제 17 항에 있어서,
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 당해 항체의 항원 결합성 단편을 포함하고, 파라핀 포매 처리한 후 탈파라핀 처리한 조직 표본 (이하, 간단히 「표본」 이라고 한다) 중의 GPR20 의 검출 또는 측정 방법에 사용되는, 조성물.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서,
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편과 피검 표본을 접촉시키는 공정을 포함하는, 표본 중의 GPR20 의 검출 또는 측정 방법에 사용되는, 조성물.
제 18 항 또는 제 19 항에 있어서,
GPR20 의 검출 또는 측정 방법이, 피검 표본에 있어서 GPR20 이 검출 혹은 측정되었거나, 또는 피검 표본에 있어서의 GPR20 의 발현 레벨 혹은 발현량이 사전에 결정된 기준과 동등하거나 또는 그것보다 높은 경우, 그 피검 표본을 양성으로 판정하고, 피검 표본에 있어서 GPR20 이 검출 혹은 측정되지 않았거나, 또는 피검 표본에 있어서의 GPR20 의 발현 레벨 혹은 발현량이 사전에 결정된 기준과 동등하거나 또는 그것보다 낮은 경우, 그 피검 표본을 음성으로 판정하는 공정을 포함하는, 조성물.
제 17 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,
GPR20 양성 질환의 검사 또는 진단 방법에 사용되는, 조성물.
제 17 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서,
GPR20 양성 질환의 검사 또는 진단 방법이, GPR20 의 검출 또는 측정에 있어서, 양성으로 판정된 피검 표본이 유래하는 피험자는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정을 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 또는 예방 방법에 적합하다고 판정하고, 음성으로 판정된 피검 표본이 유래하는 피험자는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정을 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 또는 예방 방법에는 적합하지 않다고 판정하는 것을 포함하는, 조성물.
제 21 항 또는 제 22 항에 있어서,
GPR20 양성 질환이 GPR20 양성암인, 조성물.
제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
GPR20 양성 질환이 소화관 간질 종양 (GIST) 인, 조성물.
하기 (a) 내지 (c) 중 어느 하나에 기재된 피험자에게 투여되는, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 포함하는 의약 조성물 :
(a) 제 17 항 내지 제 19 항 및 제 21 항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 사용하여 GPR20 이 검출 또는 측정된 피검 표본이 유래하는 피험자 ;
(b) 제 20 항에 기재된 조성물을 사용한 GPR20 의 검출 또는 측정에 있어서 양성으로 판정된 피검 표본이 유래하는 피험자 ;
(c) 제 22 항 또는 제 24 항에 기재된 조성물을 사용하여, GPR20 에 특이적으로 결합하는 항체 혹은 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정을 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 또는 예방에 적합하다고 판정된 피험자.
이하의 공정 (a) 및 (b) 를 포함하는 GPR20 양성 질환의 치료 방법 :
(a) 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편, 제 17 항 내지 제 19 항, 제 21 항에 기재된 조성물을 사용하여 검체의 GPR20 을 검출 또는 측정하는 공정 ;
(b) (a) 에 있어서 GPR20 의 발현이 검출 또는 측정된 검체가 유래하는 피험자에게 항 GPR20 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 투여하는 공정.
제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 27 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
제 27 항에 기재된 폴리뉴클레오티드 또는 제 28 항에 기재된 벡터를 포함하는 세포.
하기 공정 (a) 및 (b) 를 포함하는, 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편의 제조 방법 :
(a) 제 29 항에 기재된 세포를 배양하는 공정 ;
(b) 공정 (a) 의 배양물로부터 모노클로날 항체 또는 그 항체의 항원 결합성 단편을 회수하는 공정.