JP2022548764A - Ｌｉｌｒｂ２に対するシングルドメイン抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）に対するシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、それを含む医薬組成物に関する。【選択図】なし

Description

本発明は免疫療法及び免疫診断の分野に関係する。本発明は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）に対するシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を提供する。

白血球免疫グロブリン（Ｉｇ）様受容体（ＬＩＬＢＲ）は細胞質尾部がＩＴＩＭ（免疫受容体チロシンベースの抑制性モチーフ）で構成されている抑制性受容体である。ＬＩＬＲＢ１はすべての免疫細胞サブセットで発現されるのに対して、ＬＩＬＲＢ２の発現は単球、樹状細胞、及びマクロファージのような抗原提示細胞（ＡＰＣ）に限定される。

ＬＩＬＲＢ２は、ＣＤ１ｄ、補体カスケード由来のいくつかの分子（Ｃ４ｄ、Ｃ３ｄ、Ｃ４ｂ、Ｃ３ｂ、及びｉＣ３ｂ）、アンジオポエチン様２及び５（ＡＮＧＰＴＬ２／５）タンパク質、Ｂ－アミロイド１－４２、及びミエリン由来阻害剤（Ｎｏｇｏ６６、ＭＡＧ）ならびに古典的（ＨＬＡ－Ａ、－Ｂ及び－Ｃ）または非古典的ＭＨＣクラスＩ分子（ＨＬＡ－Ｅ、Ｆ及びＧ）と相互作用する。免疫細胞で発現されるＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ－Ｇとの間の相互作用は細胞機能を阻害し、免疫抑制細胞を誘導できることが特に実証された。実際、樹状細胞（ＤＣ）に存在するＨＬＡ－ＧとＬＩＬＲＢ２との間の相互作用はそれらの成熟を阻害し、それらを寛容原性にする。

興味深いことに、ＬＩＬＲＢ２受容体はいくつかの種類のがんで発現され、転移と頻繁に関連することが示された。ＬＩＬＲＢ２は抑制性受容体であるが、腫瘍によるその発現は腫瘍細胞の増殖と運動性を高めることが示された。実際、ＨＬＡ－ＧまたはＡＮＧＰＴＬ２への結合の際、ＬＩＬＲＢ２受容体は腫瘍細胞の増殖、成長、及び播種を抑制する経路を阻害する。注目すべきことに、ＬＩＬＲＢ２は、特に固形腫瘍の状況において腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）によって発現される。これらのマクロファージは、免疫細胞浸潤の阻害とがん細胞の増殖に有利に働く機能とに関連するＭ２表現型を示す。ＬＩＬＲＢ２受容体の発現は健常な人ではＡＰＣに限定されるので、腫瘍でのその新発現と寛容原性ＤＣ及びＴＡＭによるその強力な上方調節は、ＬＩＬＲＢ２受容体を免疫療法治療の標的となる優れた腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）にする。

しかしながら、今日まで、ＬＩＬＲＢ２を遮断することができる効果的な免疫療法剤はない。抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル遮断抗体（ｍＡｂ）の生成は新しい免疫療法治療への道を開くことになる。しかしながら、ｍＡｂのサイズが大きいこと（約１５０ｋＤａ）は、腫瘍の浸透性が低下するので固形がんへの適用が制限されるため、主な欠点であり、未だに治療が最も難しいがんである。したがって、そのようながんを標的とする新しい且つ改良された薬剤に対する当該技術分野における重要な必要性が依然として存在する。

ラクダ科のメンバーは異なるクラスの抗体：（ｉ）２つの軽鎖と２つの重鎖（約１５０ｋＤａ）を含有する従来の重鎖抗体、（ｉｉ）Ｈ鎖のみを含むホモ二量体重鎖抗体（ＨｃＡｂ；約９５ｋＤａ）及び（ｉｉｉ）固有の重鎖に基づく追加のＩｇＧアイソタイプを自然に産生する。これらの重鎖のみ抗体は、従来のｍＡｂと同様に、それらの抗原に対して高い結合親和性及び特異性を有することが実証されている。

ＨｃＡｂｓの重鎖の可変ドメイン（すなわち、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）またはＮａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）（Ｎｂ））は、抗原の結合と特異性に関与し、結合特性を失うことなくＨｃＡｂから単離することができる。それらの小さいサイズ、一般に約１５～２０ｋＤａは固形腫瘍を標的とする場合の重要な利点である。実際、それらはがん細胞を取り巻く線維性微小環境にさらに効率的に浸透し、この間質に定着したマクロファージのような標的細胞に到達できるはずである。次に、ｓｄＡｂは固形腫瘍及びＴＡＭに表示されるＬＩＬＲＢ２受容体を標的とするという点で優れた候補である。

本発明者らは、抗ＬＩＬＲＢ２シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の開発において当該技術分野に重要な技術的貢献を行った。

本発明は、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、好ましくはヒトＬＩＬＲＢ２に特異的に結合する、またはそれを特異的に認識するシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）に関する。

好ましくは、前記ｓｄＡｂ抗ＬＩＬＲＢ２は白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、好ましくはヒトＬＩＬＲＢ１と結合しない。

一態様では、本発明に係るｓｄＡｂは、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３とは異なるアミノ酸配列を含む、もしくはその配列で構成される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。

好ましくは、本発明に係るｓｄＡｂは３つのＣＤＲを含み、その際、
（ａ）ＣＤＲ１は、配列番号１を含む、配列番号１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２を含む、配列番号２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３を含む、配列番号３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｂ）ＣＤＲ１は、配列番号４を含む、配列番号４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号５を含む、配列番号５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号６を含む、配列番号６のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｃ）ＣＤＲ１は、配列番号７を含む、配列番号７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号８を含む、配列番号８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号９を含む、配列番号９のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号９とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｄ）ＣＤＲ１は、配列番号１０を含む、配列番号１０のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１０とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号１１を含む、配列番号１１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号１２を含む、配列番号１２のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１２とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｅ）ＣＤＲ１は、配列番号１３を含む、配列番号１３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１３とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号１４を含む、配列番号１４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号１５を含む、配列番号１５のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１５とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｆ）ＣＤＲ１は、配列番号１６を含む、配列番号１６のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１６とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号１７を含む、配列番号１７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号１８を含む、配列番号１８のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１８とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｇ）ＣＤＲ１は、配列番号１９を含む、配列番号１９のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１９とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２０を含む、配列番号２０のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２０とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号２１を含む、配列番号２１のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２１とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｈ）ＣＤＲ１は、配列番号２２を含む、配列番号２２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２３を含む、配列番号２３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２３とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号２４を含む、配列番号２４のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２４とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２５を含む、配列番号２５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２６を含む、配列番号２６のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２６とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号２７を含む、配列番号２７のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２７とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｊ）ＣＤＲ１は、配列番号２８を含む、配列番号２８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２９を含む、配列番号２９のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２９とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３０を含む、配列番号３０のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３０とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｋ）ＣＤＲ１は、配列番号３１を含む、配列番号３１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号３２を含む、配列番号３２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３３を含む、配列番号３３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３３とは異なるアミノ酸配列を有する。

特に、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは３つのＣＤＲを含み、その際、ＣＤＲ１は配列番号１を含む、またはそのものであり、ＣＤＲ２は配列番号２を含む、またはそのものであり、且つＣＤＲ３は配列番号３を含む、またはそのものである。

特定の態様では、ｓｄＡｂ抗ＬＩＬＲＢ２は、配列番号３４～配列番号４４の配列のいずれかで定義される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またはその配列で構成される。

特に、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは配列番号３４で定義される配列を含む、またはその配列で構成される。

好ましくは、本発明に係るｓｄＡｂ抗ＬＩＬＲＢ２は、ＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用及び／またはＬＩＬＲＢ２とアンジオポエチン様２（ＡＮＧＰＴＬ２）との間の相互作用を阻害する。

別の態様では、本発明は、本発明に係るｓｄＡｂ抗ＬＩＬＲＢ２をコードする配列を含む、好ましくは配列番号４５～５５から成る群で選択される配列によって定義される単離された核酸に関する。

本発明はまた、本発明に係る単離された核酸を含むベクターに関するが、本発明に係るｓｄＡｂまたは単離された核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）にも関する。

特定の態様では、本発明は、本発明に係る単離された核酸またはベクターを含む細胞、または本明細書で開示されているＣＡＲを発現する細胞に関する。好ましくは、細胞はＴ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球及び樹状細胞から成る群から選択され、好ましくは、細胞はＴ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である。

本発明はさらに、本発明に係るｓｄＡｂ、単離された核酸、ベクター、ＣＡＲまたはＣＡＲを発現する細胞と、任意で薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。

一態様では、本発明に係るｓｄＡｂ、単離された核酸、ベクター、ＣＡＲ、細胞または医薬組成物はがんの治療に使用するためのものであり、好ましくはその際、がんはＬＩＬＢＲ２を過剰発現し、さらに好ましくは、がんは肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、膵管癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、卵巣癌、乳癌、大腸癌、神経膠腫、胃癌、腎癌、精巣癌、食道癌、子宮頸癌、マウスのルイス肺癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、尿路癌及び頭頸部癌から成る群から選択される。

本発明は最終的に、試験管内または生体外で腫瘍細胞または腫瘍組織にてＬＩＬＲＢ２を検出するための、本発明に係るｓｄＡｂ抗ＬＩＬＲＢ２の使用に関する。

アルパカの免疫化及びＶＨＨの特異性の同定。Ａは、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質によるアルパカ免疫化のプロトコール。Ｂは、免疫したアルパカからの血清をさまざまな希釈率でのＥＬＩＳＡにて調べた。Ｃは、ＶＨＨの選択はファージディスプレイベクターとバイオパニング技術を使用して行い、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃに対して評価した。陽性の抗ＬＩＬＲＢ２ ＶＨＨを実線で囲み、陰性の抗ＬＩＬＲＢ２ ＶＨＨを点線で囲む。 Ｂ８、Ｃ７、及びＣ９のＮｂはｒｈＬＩＬＲＢ２の線状エピトープを認識する。変性ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ（ｒｈＩＬＴ４－Ｆｃ）、ｒｈＬＩＬＲＢ２（ｒｈＩＬＴ４）及びｒｈＬＩＬＲＢ１（ｒｈＩＬＴ２）のタンパク質をウエスタンブロッティングによって膜に移した。Ａは、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ、ｒｈＬＩＬＲＢ２及びｒｈＬＩＬＲＢ１のタンパク質を対照の抗ＬＩＬＲＢ２ Ａｂ（Ｈ－３００及び４２Ｄ１）、対照の抗ＬＩＬＲＢ１（ＧＨＩ／７５及びＨＰ－Ｆ１）と共にインキュベートした。Ｂは、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ、ｒｈＬＩＬＲＢ２、及びｒｈＬＩＬＲＢ１のタンパク質をＢ８、Ｃ７、及びＣ９のＮｂと共にインキュベートした。Ａｂの結合は、Ｈ－３００用のＨＲＰ標識ヤギ抗ラット抗体及び４２Ｄ１、ＧＨＩ／７５、ＨＰ－Ｆ１用のＨＲＰ標識ヤギ抗マウス抗体、及びＨＲＰ標識マウス抗ｃ－ＭｙｃタグＮｂを使用して検出した。 変性したｒｈＩＬＴ４（Ｄ１－Ｄ４ドメイン）へのＮｂ（Ｂ８、Ｃ７、Ｃ９）の結合、及び変性したｒｈＩＬＴ２（Ｄ１－Ｄ４）に対するＮｂ（Ｂ８、Ｃ７、Ｃ９）の結合の非存在を示す図である。 ＬＩＬＲＢ２で形質導入したＤ１．１細胞株に対するＮｂの特異性を示す図である。ＬＩＬＲＢ２ Ｄ１．１細胞株を、４２Ｄ１対照抗体または抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂと共培養し、フローサイトメトリーで分析した。 ＰＢＭＣの単球上のＬＩＬＲＢ２受容体に対するＮｂの特異性を示す図である。単球をＰＢＭＣから単離し、無関係な対照Ｎｂと比較して４２Ｄ１対照抗体とＮｂによってＬＩＬＲＢ２受容体の発現について染色し、フローサイトメトリーで分析した。単球は、抗ＣＤ１４及び抗ＬＩＬＲＢ１抗体によって他の白血球から特定された。 ＬＩＬＲＢ２／ＨＬＡ－Ｇ６の相互作用に対する抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂの遮断能力を示す図である。試験設計パネル（右上）に示されているように、マイクロタイタープレートを個々のＮｂと同時インキュベートする前に、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質でコーティングした。次に、ＨＬＡ－Ｇ６ Ｖ５タグ付きタンパク質を添加し、ＨＲＰ結合抗Ｖ５ Ａｂを使用してＨＬＡ－Ｇ６－Ｖ５タンパク質の検出を行った。値は、陰性対照（Ｎｂまたは対照Ａｂの非存在下でＨＬＡ－Ｇ６－Ｖ５タンパク質のみとインキュベートしたｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ）の平均吸光度強度に対して基準化した（ｎ＝３）。 ＬＩＬＲＢ２／ＡＮＧＰＴＬ２の相互作用に対する抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂの遮断能力を示す図である。試験設計パネル（右上）に示されているように、マイクロタイタープレートを個々のＮｂと同時インキュベートする前に、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質でコーティングした。次に、ＡＮＧＰＴＬ２タンパク質を添加し、抗ＡＮＧＰＴＬ２精製Ａｂ、続いてＨＲＰ結合抗ウサギＡｂを使用してＡＮＧＰＴＬ２の検出を行った。値は、陰性対照（Ｎｂまたは対照Ａｂの非存在下でＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のみとインキュベートしたｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ）の平均吸光度強度に対して基準化した（ｎ＝１）。

定義
本明細書で使用されるとき、「白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２」または「ＬＩＬＲＢ２」は、２または４の細胞外免疫グロブリンドメインと、膜貫通ドメインと、２～４の細胞質免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）とを含有する白血球免疫グロブリン様受容体（ＬＩＲ）ファミリーのメンバー、特にＬＩＲ受容体のサブファミリーＢクラスを指す。ＬＩＬＲＢ２は免疫細胞で発現され、抗原提示細胞上のＭＨＣクラスＩ分子に結合し、免疫応答の刺激を阻害する負のシグナルを伝達する。それは、炎症反応及び細胞傷害性を制御して、免疫反応に集中し、自己反応性を制限するのに役立つと考えられている。ＬＩＬＲＢ２は、例えば、ＬＩＲ２、ＣＤ８５抗原様ファミリーメンバーＤ、ＣＤ８５Ｄ、免疫グロブリン様転写物４、ＩＬＴ４、単球／マクロファージ免疫グロブリン様受容体１０またはＭＩＲ－１０のような既知の別名を有する。本発明の文脈では、この用語は特にヒトＬＩＬＲＢ２を指す。ヒトＬＩＬＲＢ２は、例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８Ｎ４２３のもとで当該技術分野にて知られている。例えば、ヒトＬＩＬＲＢ２のアミノ酸配列は約５９８アミノ酸であり、遺伝子は染色体領域１９ｑ１３．４にてクラスター内に位置する。ヒトＬＩＬＲＢ２は選択的スプライシングによって生成される４の既知のアイソフォームを有する。アイソフォーム１が標準配列として選択されており、受入番号ＵｎｉｐｒｏｔＱ８Ｎ４２３－１のもとで説明され、アイソフォーム２は４３７位のアミノ酸の欠失によってアイソフォーム１とは異なり、受入番号ＵｎｉｐｒｏｔＱ８Ｎ４２３－２のもとで説明され、アイソフォーム３は、４９５位～５１０位及び５１１位～５９８位でのアミノ酸の欠失によってアイソフォーム１とは異なり、受入番号ＵｎｉｐｒｏｔＱ８Ｎ４２３－３のもとで説明され、アイソフォーム４は１～１１６位のアミノ酸の欠失によってアイソフォーム１と異なり、受入番号ＵｎｉｐｒｏｔＱ８Ｎ４２３－４のもとで説明されている。本発明の文脈では、「ＬＩＬＲＢ２」という用語はＬＩＬＲＢ２のすべてのアイソフォームを包含する。

本明細書で使用されるとき、「重鎖抗体」（ＨＣＡｂ）は軽鎖を欠き、２つの重鎖から成る免疫グロブリンを指す。各重鎖は特異的な抗原、エピトープ、またはリガンドへの結合を可能にする定常領域（ＣＨ）及び可変ドメイン（ＶＨ）を含む。本明細書で使用されるとき、ＨＣＡｂは、各重鎖がＶＨＨと呼ばれる可変ドメイン及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含むラクダ型の重鎖抗体を包含する。注目すべきことに、ラクダ科動物のＨＣＡｂは最初の定常ドメイン（ＣＨ１）を欠く。特定の抗原に対するそのような重鎖抗体は免疫したラクダ科動物から得ることができる。本明細書で使用されるとき、「ラクダ科動物」はヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ及びアルパカを包含する。ラクダ科動物のＨＣＡｂはＨａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３，３６３：４４６によって記載されている。ＨＣＡｂの他の例は、コモリザメ（Ｇｉｎｇｌｙｍｏｓｔｏｍａ ｃｉｒｒａｔｕｍ）やテンジクザメ（Ｏｒｅｃｔｏｌｏｂｕｓ ｍａｃｕｌａｔｅｓ）のような軟骨魚類に由来する免疫グロブリン様構造（Ｉｇ－ＮＡＲ）である。

本明細書で使用されるとき、「シングルドメイン抗体」（ｓｄＡｂまたはＮｂ）は、抗原、エピトープ、またはリガンドと単独で結合することができる、重鎖のみ抗体に由来する単一可変ドメインを指す、つまり、別の結合ドメインを必要としない。シングルドメイン抗体は、ＶＨＨもしくはＶ－ＮＡＲに由来してもよく、またはＶＨＨもしくはＶ－ＮＡＲにあってもよい。ＶＨＨはラクダ科のＨＣＡｂに見られる可変ドメインを指す。Ｖ－ＮＡＲは軟骨魚類で発見された免疫グロブリン様構造（Ｉｇ－ＮＡＲ）に見られる可変ドメインを指す。別の方法として、シングルドメイン抗体はナイーブな合成ライブラリーから入手されてもよい。シングルドメイン抗体に関する概説については、人はＳａｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２００８，８：６００－６０８，Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２００９，Ｍａｒ，１５；１２８（１－３）：１７８－８３，及び／またはＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２０１３，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０１３；８２：７７５－９７を参照してもよく、その開示は参照によって組み込まれている。

本明細書で使用されるとき、「結合する」または「結合すること」は、抗原を認識して接触するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、及び抗体（ｓｄＡｂを含む）を指す。「特異的に結合する」または「免疫特異的に結合する」とは、抗体が特定の抗原を認識するが、試料における他の分子または抗原を実質的に認識もせず、それと結合もしないことを意味する。場合によっては、「特異的結合」または「特異的に結合すること」という用語は、抗体、タンパク質、またはペプチドと第２の化学種との相互作用に関連して使用されて、相互作用が特定の構造（例えば、抗原決定基またはエピトープ）の存在に依存することを意味することができる。本明細書で使用されるとき、「特異的結合」という用語は少なくとも１０^－６Ｍまたは１０^－７Ｍの結合親和性での抗体と抗原との間の接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は少なくとも約１０^－８Ｍ、好ましくは１０^－９Ｍ、１０－^１０Ｍ、１０－^１１Ｍ、１０－^１２Ｍの親和性で結合する。

本明細書で使用されるとき、「ＬＩＬＲＢ２に特異的に結合するｓｄＡｂ」という用語及び類似の用語は、ＬＩＬＲＢ２を特異的に認識し、他の抗原（例えば、ＬＩＬＲＢ１のようなＬＩＬＲファミリーの他のメンバーを含む）を認識しない、または弱く認識するｓｄＡｂを指す。好ましくは、ＬＩＬＲＢ２に特異的に結合するｓｄＡｂは、他のＬＩＬＲファミリーメンバー、例えばＬＩＬＲＢ１などを含む他の抗原またはその断片に対する親和性と比較した場合、好ましくは少なくとも１０、１００または１０００倍、この抗原に対してさらに高い親和性を有する。

抗体またはｓｄＡｂの親和性は、単一の抗原－抗体部位での特定の抗原との結合の尺度であることができ、本質的に、抗体の抗原結合部位と特定のエピトープとの間の相互作用に存在するすべての引力及び反発力の合計である。特定の抗原（例：ＬＩＬＲＢ２）に対する抗体またはｓｄＡｂの親和性は、抗体結合部位の親和性を表す方程式Ｋｄ＝［Ａｇ］［Ａｂ］／［ＡｇＡｂ］で定義される、解離の平衡定数Ｋで表されてもよく；その際、［Ａｇ］は遊離抗原の濃度（Ｍ）であり、［Ａｂ］は遊離抗体の濃度（Ｍ）であり、［ＡｇＡｂ］は抗原－抗体複合体の濃度（Ｍ）である。抗原と抗体またはｓｄＡｂが強く反応する場合、遊離抗原または遊離の抗体またはｓｄＡｂはほとんど存在しないため、抗体またはｓｄＡｂの平衡定数または親和性は低いであろう。

２つのアミノ酸配列（Ａ）と（Ｂ）との間の「同一性割合」の「同一性」は、比較のウィンドウを通して最適な方法で整列させた２つの配列を比較することによって決定される。配列の前記配列比較は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのグローバル配列比較のためのアルゴリズムを使用して周知の方法によって実行することができる。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、種々の置換、欠失、及びその他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似した配列を合わせる。完全な配列比較が得られたら、配列（Ａ）と（Ｂ）の間の最長の配列に含有される残基の総数で整列させた同一のアミノ酸残基の総数を割ることによって同一性の割合を得ることができる。配列同一性は通常、配列分析ソフトウェアを使用して決定される。２つのアミノ酸配列を比較するために、例えば、ＥＭＢＬ－ＥＢＩによって提供され、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｗｅｂ／ｔｏｏｌｆｏｒｍ．ｅｂｉ？ｔｏｏｌ＝ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ＆ｃｏｎｔｅｘｔ＝ｐｒｏｔｅｉｎで利用可能なタンパク質のペアワイズ配列の配列比較のためのツール「エンボスニードル」を、初期設定：（ｉ）マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２、（ｉｉ）ギャップ開放：１０、（ｉｉｉ）ギャップ拡張：０．５、（ｉｖ）出力形式：ペア、（ｖ）エンドギャップペナルティ：偽、（ｖｉ）エンドギャップ開放：１０、（ｖｉｉ）エンドギャップ拡張：０．５を用いて使用することができる。

本明細書で使用されるとき、「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチドのアミノ酸配列における変化を意味する。「アミノ酸の変化」とも呼ばれてもよい「アミノ酸の修飾」は、本明細書では、ポリペプチド配列における置換、挿入、及び／または欠失のようなアミノ酸変異を含む。本明細書における「アミノ酸置換」または「置換」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸を別のアミノ酸で置換することを意味する。好ましくは、置換はサイレント置換である。「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列の特定の位置にあるアミノ酸の除去を意味する。アミノ酸置換は保存的であってもよい。保存的置換とは、所与のアミノ酸残基を、同様の化学的特性（例えば、電荷、容積及び／または疎水性）を持つ側鎖（「Ｒ－基」）を有する別の残基で置換することである。一般に、保存的なアミノ酸置換はタンパク質の機能特性を実質的に変化させないであろう。保守的な置換及び対応する規則は最新技術で十分に説明されている。

本明細書で使用されるとき、「親ポリペプチド」または「ポリペプチド親」はその後、修飾されて変異型を生成する修飾されていないポリペプチドを指す。本発明の文脈では、親ポリペプチドは天然に存在するＨＣＡｂ由来のＶＨＨであってもよい。

本明細書で使用されるとき「変異型ポリペプチド」、「ポリペプチド変異型」または「変異型」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾に起因して親ポリペプチド配列のものとは異なるポリペプチド配列を指す。例えば、本発明の文脈では、変異型は天然に存在するＨＣＡｂ由来のＶＨＨの変異型であってもよい。通常、変異型は１～５０アミノ酸修飾、好ましくは１～４０アミノ酸修飾を含む。特に、変異型はその親と比べて１～３０のアミノ酸変化、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０のアミノ酸変化を有してもよい。変異型は、１またはいくつかのアミノ酸置換、及び／または１またはいくつかのアミノ酸挿入、及び／または１またはいくつかのアミノ酸欠失を含んでもよい。いくつかの実施形態では、変異型は、例えば、上記に示されるように１またはいくつかの保存的置換を含んでもよい。いくつかのさらなる実施形態では、ｓｄＡｂの変異型は親ｓｄＡｂのＣＤＲドメインにて１またはいくつかのアミノ酸修飾を含んでもよい。ＣＤＲ３は同じ認識パターンを有するｓｄＡｂファミリーを定義するために一般的に使用されるので、ＣＤＲ３におけるそのような修飾は親ｓｄＡｂと比べて異なる結合特性（例えば、結合特性の増加）を有する新しいｓｄＡｂファミリーにつながってもよいのに対して、ＣＤＲ１またはＣＤＲ２における修飾は同じファミリーの異なるメンバー（すなわち、同じＣＤＲ３を有するが、異なるＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２を有する）を定義することにつながってもよい。いくつかの他の実施形態では、親ｓｄＡｂの変異型は少なくとも１つのフレームワークドメインにて１またはいくつかのアミノ酸修飾を含んでもよい。

「治療」という用語は、疾患または疾患の症状の治療、防止、予防及び遅延のような患者の健康状態を改善することを目的としたどんな行為も指す。それは疾患の治癒的治療及び／または予防的治療の双方を指摘する。治癒的治療は、治癒をもたらす治療、または疾患もしくは疾患の症状もしくはそれが直接的または間接的に引き起こす苦痛を緩和する、改善する及び／または排除する、軽減する及び／または安定化させる治療として定義される。予防的治療は、疾患の予防をもたらす治療と、疾患の進行及び／または発生率またはその発生のリスクを減らす及び／または遅延させる治療との双方を含む。ある特定の実施形態では、そのような用語は、疾患、障害、感染症、またはそれに関連する症状の改善または根絶を指す。他の実施形態では、この用語はがんの広がりまたは悪化を最小限に抑えることを指す。本発明に係る治療は、必ずしも１００％の治療または完全な治療を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益または治療効果を有すると認識する治療の程度はさまざまである。

本明細書で使用されるとき、「障害」または「疾患」という用語は、遺伝的なもしくは発達上のエラー、感染、毒、栄養の不足または不均衡、毒性または不利な環境要因の影響から生じる、身体の誤って機能する臓器、部分、構造、またはシステムを指す。好ましくは、これらの用語は、健康の障害または疾患、例えば、正常な身体的または精神的な機能を破壊する病気を指す。さらに好ましくは、障害という用語は、がんのような動物及び／またはヒトに影響を与える免疫及び／または炎症性の疾患を指す。

本明細書で使用されるとき「がん」という用語は、異常な細胞の急速で制御されていない増殖を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または例えば、転移にて血流やリンパ系を介して体の他の部分に広がることができる。

本明細書で使用されるとき、「対象」、「宿主」、「個体」、または「患者」という用語はヒト及び獣医の対象、特に動物、好ましくは哺乳動物、一層さらに好ましくは成人及び小児を含むヒトを指す。しかしながら、「対象」という用語はまた、非ヒト動物、特に、とりわけイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ及び非ヒト霊長類のような哺乳動物も包含する。

本明細書で使用されるとき、「医薬組成物」は、例えば、本発明に係る抗ＬＩＬＲＢ２抗体またはｓｄＡｂの抗原結合ドメインを含む活性剤の１以上の、生理的に好適な担体及び賦形剤のような任意の他の化学成分との調製物を指す。医薬組成物または獣医用組成物の目的は生物への活性剤の投与を容易にすることである。本発明の組成物は、任意の従来の投与経路または使用経路に好適な形態であることができる。一実施形態では、「医薬組成物」は通常、活性剤、例えば、化合物または組成物と、不活性の（例えば、検出可能な薬剤または標識）または活性がある天然に存在するまたは天然に存在しない担体、例えば、補助剤、希釈剤、結合剤、安定剤、緩衝液、塩、親油性溶媒、防腐剤、補助剤などとの組み合わせを意図し、且つ薬学的に許容される担体を含む。

本明細書で言及されるとき「許容されるビヒクル」または「許容される担体」は、医薬組成物または獣医用組成物を製剤化するのに有用であることが当業者に知られている任意の既知の化合物または化合物の組み合わせである。

「治療有効量」は、対象に投与されたときに、標的となる疾患もしくは障害を治療するために、または所望の効果を生み出すために必要とされる活性剤の量である量である。「有効量」は薬剤（複数可）、疾患及びその重症度、ならびに治療される対象の年齢、体重、及び特徴に応じて異なるであろう。

本明細書で使用されるとき、「薬物」という用語は、障害及び／または疾患に対する治癒的特性または予防的特性を持つ任意の物質または組成物を指す。

ＬＩＬＲＢ２に対するシングルドメイン抗体
上記のように、ｓｄＡｂ分子は軽鎖を自然に欠いている重鎖のみ抗体の可変領域に対応する。ｓｄＡｂの抗原結合表面は、ふつう平坦または凹面である従来の抗体の表面よりも凸状（または突出）である。

本発明に係るシングルドメイン抗体は、抗原またはエピトープ（例えば、ＬＩＬＢＲ２）と単独で、すなわち、別の結合ドメインを必要とせずに、結合することができる抗体に由来する単一の可変ドメインを含む。特に、本発明に係るシングルドメイン抗体は軽鎖またはその断片を欠いている。本発明に係るｓｄＡｂ分子は、ラクダ科、軟骨魚類、ナイーブライブラリーから、または抗体の重鎖可変ドメインの操作された形態から単離されてもよい重鎖のみ抗体（ＨｃＡｂ）の抗原結合ドメインを含む、またはそれから成る、または本質的にそれらから成るポリペプチドである。好ましくは、ｓｄＡｂはラクダ科動物のＨＣＡｂに由来し、好ましくはアルパカＨＣＡｂに由来する。

いくつかの好ましい実施形態では、シングルドメイン抗体はＶＨＨ、Ｉｇ－ＮＡＲ由来のＶ－ＮＡＲ、操作されたＶ－ＮＡＲ、ＶＨＨ変異型、特にヒト化ＶＨＨまたは最適化されたＶＨＨ、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される。

一実施形態では、ＬＩＬＲＢ２に対するｓｄＡｂは最適化されたｓｄＡｂである。最適化されたｓｄＡｂは、天然に存在するｓｄＡｂと比べて１またはいくつかのアミノ酸修飾を含む単離されたＨＣＡｂに由来するｓｄＡｂの変異型を指し、前記修飾は、例えば、ｓｄＡｂの安定性を高めること、またはＬＩＬＲＢ２に対するｓｄＡｂ変異型の親和性及び／または選択性を向上させることを可能にする。

別のまたはさらなる実施形態では、ＬＩＬＲＢ２に対するｓｄＡｂはヒト化ｓｄＡｂである。ヒト化ｓｄＡｂは、天然に存在するｓｄＡｂと比べて１またはいくつかのアミノ酸修飾を含むｓｄＡｂ変異型を指し、前記修飾はＬＩＬＲＢ２に対する親和性を著しく低下させることなく、ヒト対象に関するその免疫原性を減らすのを可能にする。本発明に係るヒト化ｓｄＡｂは、ラクダ科または軟骨魚のｓｄＡｂ配列における１以上のアミノ酸を、好ましくはヒトコンセンサス配列に見られるような、それらのヒト対応物で置き換えることによって得られてもよいが、前記アミノ酸修飾は得られるｓｄＡｂの抗原結合能力にも、またはＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する能力のようなその特性にも大きな影響を与えないという条件がある。そのような方法は当業者に周知である。当該技術分野は、本発明の文脈で使用することができるＶＨＨのためのヒト化足場のいくつかの例を提供する。ヒト化ｓｄＡｂｓは部分的にヒト化されたｓｄＡｂｓ及び完全にヒト化されたｓｄＡｂｓを包含する。

潜在的に有用なヒト化するアミノ酸修飾、特に置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を１以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することによって決定することができ、その後、このように決定された潜在的に有用なヒト化する置換（またはそれらの組み合わせ）の１以上を、（それ自体が知られている任意の方法で）前記ＶＨＨ配列に導入することができ、得られるヒト化されたＶＨＨ配列を、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さ及びレベル及び／または他の所望の特性について調べることができる。このようにして、限られた程度の試行錯誤によって、好適なヒト化する置換（またはそれらの好適な組み合わせ）を当業者が決定することができる。別の方法として、当業者はＬＩＬＲＢ２に対して向けられた所望のヒト化ｓｄＡｂを得るために、当該技術分野で記載されているＶＨＨのヒト化足場内にＶＨＨのＣＤＲを移植してもよい。ｓｄＡｂをヒト化するための方法と同様にヒト化されたｓｄＡｂの足場は、例えば、特許出願ＵＳ２０１０／０２１５６６４、ＷＯ２０１１／１１７４２３、またはＣｏｎｒａｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，３５０：１１２－１２５及びＶｉｎｃｋｅ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００９，２８４，３２７３－３２８４のような刊行物に提供されている。

別の方法として、ＬＩＬＲＢ２に対して向けられた所望のｓｄＡｂを得るために、当業者は当該技術分野で記載されているｓｄＡｂの普遍的な足場内にＣＤＲを移植してもよい（Ｓａｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５），３５２，５９７－６０７）。本発明のｓｄＡｂは、例えば、Ｓａｅｒｅｎｓ， ｅｔ ａｌ．に示されているように、普遍的なフレームワーク足場を含み、且つ以下に定義される少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは３つのＣＤＲを含むＶＨＨであってもよい。

本発明のシングルドメイン抗体はその結合特異性を決定する少なくとも１つ、好ましくは３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。好ましくは、シングルドメイン抗体はフレームワーク領域（ＦＲ）間に分布するいくつかの、好ましくは３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲ及びＦＲは好ましくは、天然に存在する抗体可変ドメイン由来の断片、変異型または誘導体である。ＣＤＲは一般に５～３０アミノ酸の長さを有し、抗原結合に関与し、抗原特異性を提供する配列内容と構造コンフォーメーションの双方で高い変動性を示す。

好ましくは、シングルドメイン抗体は４つのフレームワーク領域または「ＦＲ」を含み、これらは、当該技術分野及び本明細書ではそれぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」、「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」、「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」、及び「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域は３つの相補性決定領域または「ＣＤＲ」によって中断され、これらは、当該技術分野ではそれぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」、「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」、及び「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。これらのフレームワーク領域及び相補性決定領域は、好ましくは、以下の順序：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４（アミノ末端からカルボキシ末端へ）で操作可能に連結される。

所与のｓｄＡｂのＣＤＲは当業者に利用可能な任意の方法によって決定することができる。例えば、非限定的な方法で、ＣｈｌｏｔｈｉａまたはＫａｂａｔの方法を使用してＣＤＲを決定することができる（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４２，８７７－８８３；Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ）。ＣｈｌｏｔｈｉａとＫａｂａｔの間のＡｂＭ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア）と呼ばれる中間法、または利用可能な複雑な構造の分析に基づくいわゆる「接触」法（Ｓａｅｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００５）のようなＣＤＲを決定する代替法も使用することができ、またはＬｅｆｒａｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７：５５－７７（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）にて開示されているようなＩＭＧＴ法にて使用することもできる。
従来のヒト抗体ＶＨと比べて、ｓｄＡｂのＦＲ２領域及びＣＤＲにていくつかのアミノ酸を置換することができる。例えば、ＦＲ２領域における高度に保存された疎水性アミノ酸（例えば、Ｖａｌ４７、Ｇｌｙ４９、Ｌｅｕ５０、及び／またはＴｒｐ５２）は親水性アミノ酸（Ｐｈｅ４２、Ｇｌｕ４９、Ａｒｇ５０、Ｇｌｙ５２）によって置き換えられることが多く、構造全体をさらに親水性にし、高い安定性、溶解性、凝集に対する耐性に寄与する。

いくつかの特定の実施形態では、本発明のシングルドメイン抗体は配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０または３３に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０または３３とは異なるアミノ酸配列を含む、もしくはその配列で構成されるＣＤＲ３を含む。好ましくは、本発明のシングルドメイン抗体は、配列番号３、６または９に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３、６または９とは異なるアミノ酸配列を含む、もしくはその配列で構成されるＣＤＲ３を含む。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾は、得られるｓｄＡｂの抗原結合能にも、またはＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する能力のようなその特性にも重大な影響を及ぼさない。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾はサイレント置換のような置換である。

いくつかの特定の実施形態では、本発明のシングルドメイン抗体は、配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９または３２に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２、５、８、１１、１４、１７、２０、２３、２６、２９または３２とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２を含む。好ましくは、本発明のシングルドメイン抗体は、配列番号２、５または８に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２、５または８とは異なるアミノ酸配列を含む、もしくはその配列で構成されるＣＤＲ２を含む。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾は、得られるｓｄＡｂの抗原結合能にも、またはＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する能力のようなその特性にも重大な影響を及ぼさない。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾はサイレント置換のような置換である。

いくつかの特定の実施形態では、本発明のシングルドメイン抗体は、配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８または３１に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１、４、７、１０、１３、１６、１９、２２、２５、２８または３１とは異なるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１を含む。好ましくは、本発明のシングルドメイン抗体は、配列番号１、４または７に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１、４または７とは異なるアミノ酸配列を含む、もしくはその配列で構成されるＣＤＲ１を含む。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾は、得られるｓｄＡｂの抗原結合能にも、またはＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する能力のようなその特性にも重大な影響を及ぼさない。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾はサイレント置換のような置換である。

いくつかの特定の実施形態では、本発明のシングルドメイン抗体は、
（ａ）ＣＤＲ１は、配列番号１を含む、配列番号１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２を含む、配列番号２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３を含む、配列番号３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｂ）ＣＤＲ１は、配列番号４を含む、配列番号４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号５を含む、配列番号５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号６を含む、配列番号６のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｃ）ＣＤＲ１は、配列番号７を含む、配列番号７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号８を含む、配列番号８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号９を含む、配列番号９のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号９とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｄ）ＣＤＲ１は、配列番号１０を含む、配列番号１０のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１０とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号１１を含む、配列番号１１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号１２を含む、配列番号１２のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１２とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｅ）ＣＤＲ１は、配列番号１３を含む、配列番号１３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１３とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号１４を含む、配列番号１４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号１５を含む、配列番号１５のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１５とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｆ）ＣＤＲ１は、配列番号１６を含む、配列番号１６のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１６とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号１７を含む、配列番号１７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号１８を含む、配列番号１８のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１８とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｇ）ＣＤＲ１は、配列番号１９を含む、配列番号１９のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１９とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２０を含む、配列番号２０のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２０とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号２１を含む、配列番号２１のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２１とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｈ）ＣＤＲ１は、配列番号２２を含む、配列番号２２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２３を含む、配列番号２３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２３とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号２４を含む、配列番号２４のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２４とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２５を含む、配列番号２５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２６を含む、配列番号２６のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２６とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号２７を含む、配列番号２７のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２７とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｊ）ＣＤＲ１は、配列番号２８を含む、配列番号２８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２９を含む、配列番号２９のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２９とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３０を含む、配列番号３０のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３０とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｋ）ＣＤＲ１は、配列番号３１を含む、配列番号３１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号３２を含む、配列番号３２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３３を含む、配列番号３３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３３とは異なるアミノ酸配列を有する；を含む、またはその配列で構成される３つのＣＤＲを含む。

好ましくは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは３つのＣＤＲを含み、その際、
（ａ）ＣＤＲ１は、配列番号１を含む、配列番号１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号２を含む、配列番号２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号３を含む、配列番号３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｂ）ＣＤＲ１は、配列番号４を含む、配列番号４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号５を含む、配列番号５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号６を含む、配列番号６のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有する；または
（ｃ）ＣＤＲ１は、配列番号７を含む、配列番号７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ２は、配列番号８を含む、配列番号８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
ＣＤＲ３は、配列番号９を含む、配列番号９のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号９とは異なるアミノ酸配列を有する。

好ましくは、そのようなアミノ酸修飾は、得られるｓｄＡｂの抗原結合能にも、またはＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する能力のようなその特性にも重大な影響を及ぼさない。好ましくは、そのようなアミノ酸修飾はサイレント置換のような置換である。

一層さらに好ましくは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは３つのＣＤＲを含み、その際、ＣＤＲ１は配列番号１を含む、または配列番号１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾、好ましくは１、２、もしくは３のサイレント変異、一層さらに好ましくは１、２、もしくは３のサイレント置換に起因して配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有し、且つＣＤＲ２は配列番号２を含む、または配列番号２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾、好ましくは１、２、もしくは３のサイレント変異、一層さらに好ましくは１、２、もしくは３のサイレント置換に起因して配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有し、且つＣＤＲ３は配列番号３を含む、または配列番号３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾、好ましくは１、２、もしくは３のサイレント変異、一層さらに好ましくは１、２、もしくは３のサイレント置換に起因して配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有する。

いくつかの実施形態では、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは配列番号３４～配列番号４４の配列のいずれかで定義される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくともそれに対して９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、または本質的にそれから成る。

好ましくは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは配列番号３４、配列番号３５及び配列番号３６から成る群で選択される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またはその配列で構成される。

一実施形態では、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは、配列番号３４で定義される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またはその配列で構成される。好ましくは、配列番号３４に対して少なくとも８０％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またはその配列で構成される抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは、好ましくは配列番号３４で定義される配列を含む、またはその配列で構成される抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂと同様の親和性でＬＩＬＲＢ２に依然として結合することができ、ＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する能力のような同じ特性を保全する。

いくつかの特定の実施形態では、本発明のｓｄＡｂは約１１ｋＤａ～約１８ｋＤａ、例えば、１４～１６ｋＤａ、または１４．５～１５．５ｋＤａ、例えば、約１５ｋＤａのような１１ｋＤａ～１７ｋＤａの分子量を有する。

ある特定の態様では、ｓｄＡｂは少なくとも約１０^－６Ｍまたは１０^－７Ｍ、好ましくは少なくとも１０^－８Ｍ、１０^－９Ｍ、１０^－１０Ｍまたは１０^－１１Ｍの親和性でＬＩＬＲＢ２と結合する。特に、見かけのＫ_ｄは０．１ｎＭ～１０μＭの間、特に１μＭ～１ｎＭの間で構成される。結合親和性は、当業者に利用可能な任意の方法によって、特に表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定することができる。

好ましい実施形態では、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂはＬＩＬＲＢ２以外のＬＩＬＢＲファミリーの他のメンバーを認識しない。好ましくは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂはＬＩＬＲＢ１を認識しない。あるいは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂはＬＩＬＲＢ１を弱く認識する。好ましくは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは特に１０倍、１００倍または１０００倍、ＬＩＬＲＢ２よりも少なくＬＩＬＲＢ１を認識する。

特定の実施形態では、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂはＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を競合して阻害する、またはヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）のＬＩＬＲＢ２への結合を競合して阻害する。

「競合して阻害する」という用語は、本発明に係るｓｄＡｂがＬＩＬＲＢ２へのタンパク質、抗体またはリガンドの結合、または任意のタンパク質、抗体またはリガンドとＬＩＬＲＢ２との間の相互作用、特に試験管内、生体外または生体内での相互作用を低減する、または阻害する、または置き換えることができることを示す。競合アッセイは、例えば、競合ＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイのような標準的な技法を使用して実施することができる。ｓｄＡｂがＬＩＬＲＢ２へのタンパク質、抗体、またはリガンドの結合の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％を阻害するまたは置き換える場合、それは競合性であると見なされる。好ましい競合するｓｄＡｂｓは、ＬＩＬＲＢ２上のタンパク質、抗体、またはリガンドによって認識されるまたは結合されるエピトープと共通のアミノ酸残基を共有するエピトープと結合する。

本明細書で使用されるとき、「ＨＬＡ－Ｇ」という用語は少なくとも７つのアイソフォームを含むヒト白血球抗原Ｇを示し、その際、４つは膜結合型（ＨＬＡ－Ｇ１、ＨＬＡ－Ｇ２、ＨＬＡ－Ｇ３及びＨＬＡ－Ｇ４）であり、３つは可溶性（ＨＬＡ－Ｇ５、ＨＬＡ－Ｇ６及びＨＬＡ－Ｇ７）である。ＨＬＡ－Ｇヒトアイソフォームは、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号、ＨＬＡ－Ｇ１についてはＰ１７６９３－１、ＨＬＡ－Ｇ２についてはＰ１７６９３－２、ＨＬＡ－Ｇ３についてはＰ１７６９３－３、ＨＬＡ－Ｇ４についてはＰ１７６９３－４、ＨＬＡ－Ｇ５についてはＰ１７６９３－５、ＨＬＡ－Ｇ６についてはＰ１７６９３－６、ＨＬＡ－Ｇ７についてはＰ１７６９３－７のもとで説明される。

特定の実施形態では、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂはＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ－Ｇ６との間の相互作用を競合して阻害する、またはＨＬＡ－Ｇ６のＬＩＬＲＢ２への結合を競合して阻害する。

別の実施形態では、本発明に係るｓｄＡｂはＬＩＬＲＢ２へのアンジオポエチン様２（ＡＮＧＰＴＬ２）の結合を競合して阻害する、またはＬＩＬＲＢ２とＡＮＧＰＴＬ２との間の相互作用を競合して阻害する。本明細書で使用されるとき、「ＡＮＧＰＴＬ２」はその血管新生促進及び抗アポトーシス能力について当該技術分野で知られている血管内皮増殖因子ファミリーのメンバーである。この用語は、好ましくはヒトＡＮＧＰＴＬ２を指す。ヒトＡＮＧＰＴＬ２は、例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ受入番号Ｏ１５１２３のもとで説明される。

本発明はまた、少なくとも１つの分子にコンジュゲートされた、上記で定義されたような１以上の抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂを含むキメラ薬剤（本明細書では相互交換可能に「コンジュゲート」とも呼ばれる）にも関する。ｓｄＡｂにコンジュゲートされた分子は、例えば、薬物、画像化分子、診断剤、トレーサー、タグまたは染料のような、医学において有用な任意の活性化合物であってもよい。キメラ薬剤はまた、前記活性化合物に加えて、またはその代わりに、ｓｄＡｂまたはコンジュゲートの血漿半減期を増やす安定化基（例えば、ＦｃまたはＩｇＧ）も含有してもよい。そのようなキメラ薬剤は、ｓｄＡｂと分子との間のカップリングを使用して、当該技術分野で知られている任意の方法によって、好ましくは化学的、生化学的または酵素的な経路によって、または遺伝子工学によって調製することができる。

特定の実施形態では、本発明の抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは、標識手段、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素、ＧＦＰのような蛍光タンパク質、フルオレセイン、ローダミンのような蛍光標識、標識、化学発光標識、またはルミナル、発色団のような生物発光標識、例えば、生体内、生体外または試験管内の画像化または診断好適な放射性同位体から選択される分子またはタンパク質に融合されてもよいし、またはコンジュゲートされてもよい。

別の特定の実施形態では、本発明に係るｓｄＡｂはＣＡＲ構築物に含まれる。本明細書で使用されるとき「キメラ抗原受容体」（ＣＡＲ）、「操作された細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」（ＩＣＲ）という用語は、抗原結合特異性を免疫細胞に移植するので、抗原結合ドメインの抗原結合特性を免疫細胞の免疫原性活性、例えば、Ｔ細胞の溶解能や自己再生と組み合わせる操作された受容体を指す。特に、ＣＡＲは、任意でシグナルペプチド、抗原と結合することができる細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、任意でヒンジドメイン及び少なくとも１つの細胞内ドメインを含む融合タンパク質を指す。好ましい実施形態では、ＣＡＲは細胞外ドメインまたは抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、任意でヒンジドメイン、及び少なくとも１つの細胞内ドメインとして本明細書で開示されているような抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂを含む。

核酸、ベクター、及び宿主細胞
本発明のさらなる態様は、上記で定義されたようなｓｄＡｂをコードする単離された核酸構築物またはポリペプチド構築物に関する。核酸は一本鎖または二本鎖、またはその２つの混合物であってもよい。核酸は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡまたはｇＤＮＡ）、ＲＮＡ、またはそれらの混合物であることができる。それは、例えば、修飾された結合、修飾されたプリン塩基またはピリミジン塩基、または修飾された糖を含む修飾されたヌクレオチドを含むことができる。それは、化学合成、組換え、及び／または突然変異誘発を含む、当業者に知られている任意の方法によって調製することができる。

本発明に係る核酸は、本発明に係るｓｄＡｂ分子のアミノ酸配列から推定されてもよく、コドン使用頻度は、核酸が転写される宿主細胞に従って適合させてもよい。これらの工程は、当業者に周知の方法に従って実施されてもよく、そのいくつかは、参照マニュアルＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．Ｒｕｓｓｅｌｌ Ｄ（２００１），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載されている。そのような核酸配列の具体例には、配列番号６１～７５のいずれかを含む配列、及びそれに相補性の配列が挙げられる。

本発明はまた、任意で調節配列（例えば、プロモーター、ターミネーターなど）の制御下にある、そのような単離された核酸を含有するベクターにも関する。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージミド、または人工染色体であってもよい。

本発明はさらに、宿主細胞を形質転換する、それに形質移入するまたは形質導入するための本発明に係る核酸またはベクターの使用に関する。

したがって、本発明はまた、本発明の１またはいくつかの核酸及び／または本発明の１またはいくつかのベクター及び／または本発明のｓｄＡｂをコードする１またはいくつかのポリペプチドを含む宿主細胞も提供する。

宿主細胞は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような原核生物宿主細胞、または例えば、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株（ＨｅＬａ、ＣＯＳ及びＰＥＲＣ６を含む）、Ｓｆ９細胞及びＳｆ＋細胞を含む（培養された）哺乳動物、植物、昆虫、真菌または酵母の宿主細胞を含む、本発明のｓｄＡｂを発現させるまたは産生することができる任意の宿主細胞であってもよい。適切な宿主細胞は酵母及び糸状菌のような真核微生物の細胞を包含する。好ましい酵母宿主細胞には、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、及びＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓが含まれる。「宿主細胞」という用語はまた、複製中に起こる突然変異のために親宿主細胞と同一ではない親宿主細胞の任意の子孫も包含する。好ましくは、細胞はヒト胚性幹細胞ではない。

本発明のさらなる目的は、本発明に係るｓｄＡｂを作製するための方法であり、この方法は、
ａ）以前に定義されたように宿主細胞を培養する工程、及び
ｂ）細胞培養から、上記で定義されたようなｓｄＡｂをコードする前記核酸、ベクターまたはポリペプチドを回収する工程を含む。

工程ａ）は、宿主細胞による所望の核酸、ベクターまたはポリペプチドの発現を可能にする条件下で行われることは言うまでもない。好適な発現条件には、好適な培地の使用、好適な食物源及び／または好適な栄養素の存在、好適な温度、及び任意で好適な誘導因子または誘導化合物の存在（例えば、本発明のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合）が挙げられてもよく；これらのすべては当業者によって選択されてもよい。

そのような条件下で、本発明のｓｄＡｂは構成的様式で、一時的様式で、または好適に誘導された場合にのみ発現されてもよい。

次に、本発明のｓｄＡｂは、例えば、クロマトグラフィー及び／または電気泳動技術、差次的沈殿技術、親和性技術などのようなそれ自体が知られているタンパク質単離及び／または精製の技術を使用して、宿主細胞から及び／または前記宿主細胞が培養された培養培地から単離されてもよい。ｓｄＡｂは、精製目的でヒスチジンタグまたはストレプトアビジンタグのようなタグも含んでもよい。

本発明はまた、本明細書で定義されるようなＬＩＬＲＢ２に対するｓｄＡｂを得るための方法も提供する。本発明に係るｓｄＡｂを得る及び／または選択するための方法は、細胞ディスプレイ、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、ｍＲＮＡディスプレイ、ＤＮＡディスプレイまたはプラスミドディスプレイのような、しかし、これらに限定されないタンパク質選択技術に基づいてもよい。これらの技術は当該技術分野で十分に説明されている。例えば、バクテリオファージに表示されるＶＨＨのライブラリーを生成するために、当業者はその開示が参照によってその中に組み込まれる、Ｍｕｙｄｅｒｍａｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００１，７４，２７７－３０２、特に組換えＶＨＨと題されたセクションを参照することができる。バクテリオファージに表示されるＶ－ＮＡＲのライブラリーを生成するために、当業者はＤｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００３，４０：２５－３０を参照してもよい。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、機能的ｓｄＡｂ、特にＬＩＬＲＢ２を認識することができるｓｄＡｂ、またはＬＩＬＲＢ２とＨＬＡ－Ｇとの間の相互作用を競合して阻害することができる、及び／またはＬＩＬＲＢ２とＡＮＧＰＴＬ２との間の相互作用を競合して阻害することができるｓｄＡｂを選択することを可能にする１またはいくつかの工程を包含してもよい。

特定の実施形態では、本発明に係るｓｄＡｂを含むＣＡＲは細胞によって発現される。細胞は原核細胞または真核細胞であってもよい。好ましくは、細胞は哺乳動物細胞のような真核細胞である。好ましくは、本発明に係るｓｄＡｂを含むＣＡＲを発現する細胞は免疫細胞である。細胞は、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ、単球及び樹状細胞から成る群から選択することができる。好ましくは、細胞はヒト胚性幹細胞ではない。

医薬組成物
本発明はまた、上記で定義された少なくとも１つのｓｄＡｂ、ＣＡＲまたは細胞と、任意で１以上の薬学的に許容される賦形剤とを含むことを特徴とする医薬組成物にも関する。

本発明の医薬組成物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ；Ｔｗｅｎｔｙ ｆｉｒｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００５）に記載されているもののような標準的な方法に従って製剤化されてもよい。使用されてもよい薬学的に許容される賦形剤は特に、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；６ｔｈ ｒｅｖｉｓｅｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００９）に記載されている。

一態様では、本発明の組成物は薬学的に許容される担体または賦形剤を有利に含む。薬学的に許容される担体は、例えば、（ａ）充填剤または希釈剤、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、微結晶性セルロース及びケイ酸；（ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース；（ｃ）保湿剤、例えば、グリセロール；（ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定の複合ケイ酸塩、クロスカルメロースナトリウム及び炭酸ナトリウム；（ｅ）溶液遅延剤、例えば、パラフィン；（ｆ）吸収促進剤、例えば、第四級アンモニウム化合物；（ｇ）湿潤剤、例えば、モノステアリン酸グリセロール；（ｈ）吸着剤、例えば、カオリンやベントナイト；（ｉ）潤滑剤、例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム；（ｊ）抗酸化剤；（ｋ）緩衝剤、例えば、クエン酸ナトリウムまたはリン酸ナトリウム；（ｌ）保存剤；（ｍ）香味剤や芳香剤などのような、各投与様式に従って従来使用されている担体から選択することができる。

本発明の医薬組成物は、本発明のｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞またはポリペプチドを、上記に記載されているような少なくとも１つの通常の賦形剤（または担体）と適切な純度で混合することによって得てもよい。特に、本発明のｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞またはポリペプチドは組成物の有効成分である。

有効成分と組み合わせる賦形剤（複数可）は、（ｉ）前記有効成分の安定性を含む物理化学的特性、（ｉｉ）前記有効成分に望まれる薬物動態プロファイル、（ｉｉｉ）ガレヌス製剤形態及び（ｉｖ）投与経路によって異なってもよいことは言うまでもない。

医薬組成物は通常、有効量の本発明のｓｄＡｂ、ＣＡＲ、または細胞を含む。本明細書に記載されているような「治療有効用量」は、所与の条件及び投与スケジュールについて治療効果を与える用量を指す。活性物質の「治療有効量」は、必ずしも疾患または障害を治癒させるわけではないが、その見かけが先延ばしされる、妨げられるもしくは抑えられる、またはその症状が軽減される、またはその期間が修正されるもしくはそれほど深刻ではない、または患者の回復が加速されるように、この疾患または障害の治療を提供する。

本発明の医薬組成物は、例えば、錠剤、カプセルの形態にて経腸経路（すなわち経口）によって、例えば、注射可能な溶液または懸濁液の形態にて非経口、筋肉内、経皮、静脈内の経路によって、及び例えば、ゲル、軟膏、ゲル、ローション、貼付剤、坐剤などの形態にて局所経路によって含む、任意の従来の経路による投与に好適であるように製剤化されてもよい。

いくつかの特定の実施形態では、医薬組成物は、対象に投与される直前に適切なビヒクルに溶解されてもよい凍結乾燥物または凍結乾燥粉末であってもよい。

本発明はまた、上記で定義されたようなｓｄＡｂまたはｓｄＡｂ－診断用または医療用の造影剤コンジュゲート化合物を含むことを特徴とする診断用組成物にも関する。

本発明に係る使用
本発明に係るｓｄＡｂｓ、ＣＡＲ、細胞、組成物及び構築物（すなわち、単離された核酸、ポリペプチド及び／またはベクター）は生物学的研究、生化学産業または医学を含む種々の分野で使用されてもよい。

特に、本発明のｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞、組成物及び構築物は、特に対象にて腫瘍のサイズを縮小する、または腫瘍の成長もしくは再成長を防止する、または免疫抑制微小環境の誘導を防止するために、がんを有するまたは有することが疑われるこれらの対象に適用される。

一実施形態では、治療する対象は非ヒト動物、特に、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、及び非ヒト霊長類のような哺乳動物である。あるいは、治療する対象は、小児、青年、または成人を含む、ヒト、特に任意の年齢のヒトであってもよい。

特に、対象はＬＩＬＢＲ２の発現、特にＬＩＬＢＲ２の過剰発現を伴う疾患に冒されている。一実施形態では、対象は、がん、炎症性障害、例えば、細菌、ウイルスまたは真菌によって引き起こされるような感染症、または自己免疫疾患に罹患している。

好ましくは、対象はがんに罹患しており、一層さらに好ましくは、ＬＩＬＢＲ２陽性のがんに罹患している。例えば、がんのような疾患の治療に好適な対象は、そのような対象がＬＩＬＲＢ２陽性細胞、特にＬＩＬＲＢ２陽性がん細胞、好ましくはＬＩＬＲＢ２を過剰発現するそのような細胞を保有するかどうかを調べることによって特定することができる。疾患及びがんの例は以下にさらに具体的に記載されている。

本発明のさらなる目的は、ＬＩＬＲＢ２受容体が関与する障害または疾患、好ましくはがんなどの治療に使用するための、及び／または薬物またはワクチンとして使用するための本発明に係るｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞、ポリペプチド構築物または医薬組成物である。したがって、本明細書では、それを必要とする対象にて腫瘍の成長または転移の広がりを抑制する方法、及び／またはそれを必要とする患者にてがんを治療する方法が記載されている。腫瘍は、固形腫瘍または液性腫瘍、好ましくは固形腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんはＬＩＬＢＲ２を発現する、または過剰発現する。

ある特定の実施形態では、これらの方法は、対象または患者に、治療有効量の本発明のｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞、組成物、及び構築物を投与することを含む、または代わりに本質的にそれから成る、またはその上さらにそれから成る。さらなる態様では、対象は好ましくは腫瘍がＬＩＬＢＲ２を発現するかどうか、または過剰発現するかどうかを評価するために、診断によって治療について以前に選択されている。

ヒトＬＩＬＲＢ２は、特にがんのような疾患または障害の治療に関連する標的であるので、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂｓは薬物、薬剤、またはワクチンとして使用されてもよい。本発明に係るｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞またはポリペプチド構築物は、薬物もしくはワクチンとして、または対象における疾患、障害、もしくは状態の治療での薬物もしくはワクチンの製造のために使用することができる。いくつかの実施形態では、そのような薬物またはワクチンはがんを治療するために使用することができる。

一実施形態では、本発明のｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞、組成物及び構築物は、ＨＬＡＧ及び／またはＡＮＧＰＴＬ２のＬＩＬＲＢ２への結合の阻害によって予防され、または治療されてもよい病状、疾患及び／または障害の治療に使用するためのものである。したがって、本発明は、ＬＩＬＲＢ２へのＨＬＡＧ及び／またはＡＮＧＰＴＬ２の結合の阻害によって予防され、または治療されてもよい病状、疾患及び／または障害の治療方法に関する。

本発明はまた、ＬＩＬＲＢ２受容体が関与する障害または疾患に罹患している対象を治療する方法にも関するものであり、その際、前記方法は治療有効量の本発明に係るｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞、構築物または医薬組成物を前記対象に投与することを含む。

特定の実施形態では、疾患または障害は、がん、好ましくは固形腫瘍であり、一層さらに好ましくは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、膵管癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、卵巣癌、乳癌、大腸癌、神経膠腫、胃癌、腎癌、精巣癌、食道癌、子宮頸癌、マウスのルイス肺癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、尿路癌、及び頭頸部癌から成る群から選択される。

したがって、本発明はまた、それを必要とする対象にて腫瘍の成長を抑制する方法、及び／または転移の成長及び／または広がりを抑制する方法にも関する。腫瘍は固形腫瘍であってもよく、または液性腫瘍であってもよい。いくつかの実施形態では、腫瘍またはがんはＬＩＬＲＢ２を発現する、または過剰発現する。

本明細書に記載されているｓｄＡｂ、ＣＡＲ、細胞または医薬組成物は、例えば、小分子、放射線療法、化学療法、外科手術、特に抗癌剤を含む他の治療薬と同時にまたは順次投与されてもよい。「抗癌剤」は、例えば、がん細胞を殺傷し、がん細胞にてアポトーシスを誘導し、がん細胞の増殖速度を低下させ、転移の発生率または数を減らし、腫瘍サイズを減少させ、腫瘍増殖を抑制し、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給の減らし、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、がんの進行を阻止しもしくは阻害し、または癌を伴う対象の寿命の増やすことによって対象にてがんに悪影響を与えることができる。さらに一般的には、これらの他の組成物は、細胞を殺傷する、または細胞の増殖を抑制するのに有効な組み合わせた量で提供することができる。

医学の当業者に知られている従来の方法を使用して、治療される疾患の種類または疾患の部位に応じて本明細書で開示されているｓｄＡｂ、組成物、構築物、またはＣＡＲを対象に投与することができる。この組成物は、従来の経路を介して投与することができ、例えば、非経口で（例えば、静脈内、皮下、皮内、または筋肉内の経路によって）、または経口、鼻または肺の経路によって投与することができる。

診断及び予後における使用
シングルドメイン抗体はＬＩＬＲＢ２の精製のためのリガンドとして使用されてもよい。それらはまた、ＬＩＬＲＢ２受容体の結晶化を促進するために結晶化シャペロンとして使用することもできる。

本発明のｓｄＡｂ及びポリペプチドはまた、細胞免疫染色において、生体内または試験管内の画像化において、及び診断目的のためにも使用されてもよい。本発明はまた、ＬＩＬＲＢ２を発現している細胞、好ましくはがん細胞のようなＬＩＬＲＢ２を過剰発現している細胞を診断する、画像化する、または治療するのに使用するための上記に記載されているようなｓｄＡｂ、コンジュゲート、または組成物にも関する。

それらはまた、試験管内アッセイにおける生物学的試薬として、例えば、ＬＩＬＲＢ２受容体を標的とする可能性がある薬物の同定、スクリーニングまたは特徴付けのための試験化合物または競合結合剤としても使用されてもよい。

本明細書で開示されている抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂは診断上使用されて、試験管内または生体外と同様に生体内での臨床試験手順の一部として組織または細胞における発現ＬＩＬＲＢ２のレベルをモニターすることができ、例えば、所与の治療計画の有効性を判定することができる。

本開示の検出方法を使用して、試験管内または生体外と同様に生体内で、例えば、臓器または組織の生検後、生体試料にて発現ＬＩＬＲＢ２のレベルを検出して細胞ががん性であるかどうかを調べることができる。本発明のｓｄＡｂによるＬＩＬＲＢ２の検出のための試験管内または生体外の技法には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の「サンドイッチアッセイ」、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降、放射性免疫アッセイ、及び免疫蛍光法（例えば、ＩＨＣ）が挙げられる。さらに、ＬＩＬＲＢ２ポリペプチドを検出するための生体内技法は、対象に標識した抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂを導入することを含む。本発明のｓｄＡｂによるＬＩＬＲＢ２の検出のための生体内技法では、ｓｄＡｂは、対象におけるその存在及び位置が標準的な画像化技術によって検出され得る放射性マーカーで標識することができる。

本発明はまた、対象がＬＩＬＲＢ２の発現または活性の上昇に関連する医学的な疾患または状態を発症するリスクがあるかどうかを判定するための診断アッセイ、予後アッセイまたは予測アッセイ（例えば、ＬＩＬＲＢ２を過剰発現する前がん性またはがん性の細胞の検出）も提供する。そのようなアッセイは、予後または予測の目的で使用し、それによって、ＬＩＬＢＲ２の発現または過剰発現を特徴とするまたはそれに関連する医学的な疾患または状態の発症前に個人を予防的に治療することができる。

本発明はまた、診断的な予後アッセイ法または予測アッセイ法も提供し、その際、本発明に係るｓｄＡｂは、抗ＬＩＬＲＢ２ ｓｄＡｂによる治療に適格な対象を選択するために使用され、例えば、ＬＩＬＲＢ２は患者の選択のための生体マーカーであり、ＬＩＬＲＢ２は腫瘍細胞のような細胞にて過剰発現される。

キット
本明細書に記載されているｓｄＡｂ、組成物、ＣＡＲ、細胞、ベクター、ポリペプチドまたは核酸構築物のいずれかが本発明によって提供されるキットに含まれてもよい。

ある特定の実施形態では、キットは、例えば、好適な容器手段、細胞、緩衝液、細胞培地、ベクター、プライマー、制限酵素、塩などを含む。キットはまた、無菌の、薬学的に許容される緩衝液及び／または他の希釈剤を含有するための手段も含んでもよい。

いくつかの実施形態では、個体から試料を採取する手段及び／または試料をアッセイする手段はキットにて提供されてもよい。

いくつかの実施形態では、キットはさらに、がんまたは感染症を治療するための追加の薬剤を含み、追加の薬剤は本発明のキットのｓｄＡｂ、組成物、ＣＡＲ、細胞、ベクター、ポリペプチドもしくは核酸構築物、もしくは他の構成要素と併用されてもよく、またはキットにて別個に提供されてもよい。

本発明のいくつかの場合では、キットはまた、例えば、化学療法及び／または他の免疫療法のような第２のがん療法も含む。キット（複数可）はＬＩＬＲＢ２を発現または過剰発現しているがんのような特定のがんに合うように調整されてもよい。

容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、複数用量パッケージ）またはサブ単位用量であってもよい。一実施形態では、本発明は単回用量の投与単位について上記で定義されたようなキットに関する。本発明のキットはまた、乾燥した／凍結乾燥した二官能性分子を含む第１の受容器と、水性製剤を含む第２の受容器とを含有してもよい。本発明のある特定の実施形態では、単一区画の及び複数区画の予め充填された注射器（例えば、液体注射器及びリオシリンジ）を含有するキットが提供される。本発明のキットは好適なパッケージに入っている。好適なパッケージングには、バイアル、ボトル、瓶、可撓性パッケージング（例えば、密封マイラーまたはプラスチック袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書に記載されているｓｄＡｂ、組成物、ＣＡＲ、細胞、ベクター、ポリペプチドまたは核酸構築物の使用に関連する説明書には一般に、投与量、投薬スケジュール、意図された治療のための投与経路、またはそのような成分を再構成するもしくは希釈するための手段に関する情報が含まれる。本発明のキットで供給される説明書は通常、ラベルまたは添付文書（例えば、チラシまたは取扱説明書の形でキットに含まれる紙シート）に書かれた説明書である。いくつかの実施形態では、キットは本明細書に記載されている方法のいずれかに従って使用するための説明書を含むことができる。含まれる説明書は、特にがんのような本明細書に記載されている疾患の治療の文脈では、本明細書に記載されているｓｄＡｂ、組成物、ＣＡＲ、細胞、ベクター、ポリペプチドまたは核酸構築物の投与の説明を含むことができる。キットはさらに、その個体がＬＩＬＢＲ２に関連する疾患、例えば、本明細書に記載されているものを有するかどうかを特定することに基づいて治療に好適な個体を選択する説明を含んでもよい。

本発明の他の態様及び利点は、以下の実施例を検討することで明らかになるであろうが、これらの実施例は本質的に例示に過ぎず、本出願の範囲を限定するものではない。

ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃに特異的なＶＨＨの同定。
先ず、完全フロイントアジュバント中のＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質でアルパカを免疫し、その後、不完全フロイントアジュバント中のＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質で２回追加免疫した。従来の抗体サブクラス（すなわちＩｇＧ１）、及びＶＨＨをアルパカ血清から分画した。血清を連続希釈し、ＥＬＩＳＡによってＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質について調べた。次に、アルパカからＢリンパ球を精製し、３，５．１０^７クローンを含有するライブラリーを得た。ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃに対するディスプレイを使用したバイオスパニングを実施し、選択したＶＨＨにてプレプラズマ（ＰＥ）－ＥＬＩＳＡを実施した。４００のコロニーを調べ、ＬＩＬＲＢ２に対する１３０の陽性クローンを同定したが、これらを実線で囲み、陰性クローンを点線で囲む（図１）。すべての陽性クローンを配列決定し、ＶＨＨの１２の固有の配列を生成し、精製した。

Ｂ８、Ｃ７、及びＣ９のＮｂはｒｈＬＩＬＲＢ２の線状エピトープを認識する。
本発明者らは先ず、生成されたＮｂがＬＩＬＲＢ１受容体に対する交差反応性を示さずにＬＩＬＲＢ２受容体に特異的であるかどうかを検討した。そのために、還元条件でウエスタンブロッティングを行った。精製された二量体ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ、単量体ｒｈＬＩＬＲＢ２及び単量体ｒｈＬＩＬＲＢ１のタンパク質を使用してさまざまなＮｂの抗原特異性を比較した。Ｎｂの特異性を、対照抗体Ｈ－３００（ＬＩＬＲＢ１、－２、－４、－５、－６に特異的）、４２Ｄ１（ＬＩＬＲＢ２に特異的）、ＧＨＩ／７５（ＬＩＬＲＢ１に特異的）、及びＨＰ－Ｆ１（ＬＩＬＲＢ１に特異的）に対して評価した。Ｈ－３００ポリクローナル抗体（ＬＩＬＲＢ１、－２、－４、－５、及び－６タンパク質に特異的）で標識した膜は、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ及びｒｈＬＩＬＲＢ２のサイズにそれぞれ対応する約１０５ｋＤａ及び７７ｋＤａのバンドを示した（図２）。４２Ｄ１モノクローナル抗体（ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ受容体に特異的）と共にインキュベートした膜は、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃのサイズに対応する１０５ｋＤａに固有のバンドを示し、７７ｋＤａにはバンドがないということは、４２Ｄ１ ｍＡｂがｒｈＬＩＬＲＢ２を認識しなかったことを示している。ＧＨＩ／７５及びＨＰ－Ｆ１のモノクローナル抗体と共にインキュベートした膜はｒｈＬＩＬＲＢ１のサイズに対応する８４ｋＤａのバンドを示した。１５のＮｂのうち、Ｂ８、Ｃ７及びＣ９のみがｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃの分子量に対応する約１０５ｋＤａのバンドを示し（図３）、ｒｈＬＩＬＲＢ２のＤ１及びＤ２ドメインの分子量に対応する約７７ｋＤａのバンドも示した。さらに、Ｂ８及びＣ７のＮｂとのインキュベートは８４ｋＤａ付近のバンド示さなかった。これはＢ８及びＣ７のＮｂがｒｈＬＩＬＲＢ１に結合しないことを意味する。それでも、Ｃ９ Ｎｂは８４ｋＤａ付近に弱いバンドを示し、Ｃ９の特異性がｒｈＬＩＬＲＢ２受容体に完全には限定されていないことを示唆している。まとめると、これらのデータは、ＮｂがＮｂを誘導するのに使用された免疫原である変性二量体ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ（Ｄ１－Ｄ２－Ｆｃ）タンパク質、と同様に変性単量体ＬＩＬＲＢ２（Ｄ１－Ｄ２－Ｄ３－Ｄ４ドメイン）タンパク質を認識することができることを実証した。ウエスタンブロット実験については、ｃ－Ｍｙｃ＜．９Ｅ１０＞純粋（Ｅ－Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｅｆ １４－６７８４－８２）抗体を使用した。

ＬＩＬＲＢ２形質導入Ｄ１．１細胞株上のＬＩＬＲＢ２受容体に対するＮｂの特異性。
次に、本発明者らは、得られたＮｂが立体構造のＬＩＬＲＢ２受容体に結合することができるかどうかを決定しようとした。彼らは立体構造ＬＩＬＲＢ２受容体に対する１５のＮｂの結合特異性を評価した。そのために、本発明者らはＩｎｖｅｃｔｙｓによって生成されたＬＩＬＲＢ２－Ｄ１．１形質導入細胞株に対するＮｂの特異性を評価した。この目的のために、ＬＩＬＲＢ２－Ｄ１．１細胞株をＮｂと共にインキュベートし、４２Ｄ１対照Ａｂと比較した。図４に示すように、ＬＩＬＲＢ２－Ｄ１．１細胞の６２．６％が４２Ｄ１対照Ａｂによって標識された。興味深いことに、ＬＩＬＲＢ２－Ｄ１．１細胞株の９３．２％、７６．４％、７５．２％はそれぞれＢ８、Ｃ９、Ｃ７のＮｂで標識されたのに対して（図７）、ＬＩＬＲＢ２－Ｄ１．１細胞株の４０％未満がＡ２のような他のＮｂによって標識された（データは示さず）。本発明者らは、Ｂ８、Ｃ７及びＣ９によって認識されるエピトープは４２Ｄ１対照抗体及び他のＮｂのエピトープよりもアクセスしやすいという仮説を立てた。フローサイトメトリーについては、Ｍｙｃタグに対するマウスモノクローナル抗体［９Ｅ１０］－フィコエリトリン（Ａｂｃａｍ，Ｒｅｆ：ａｂ７２４６８）を使用した。

単球によって発現されるＬＩＬＲＢ２受容体に対するＮｂの特異性
単球は、その表面で単量体または二量体のＬＩＬＲＢ２受容体を強く発現し、マクロファージＬＩＬＲＢ２の発現を研究するための関連モデルである。したがって、本発明者らは健常ドナーＰＢＭＣから精製された単球に対する抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂの特異性を評価した。単球は、抗ＣＤ１４、抗ＬＩＬＲＢ１ Ａｂ、及び抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂで標識することによって表現型を決定した。単球の３８％が４２Ｄ１対照Ａｂについて陽性であり、５％が無関係なＮｂ（例えば、ＩＬＴ４ではない抗原に対してアルパカで産生されたＮｂ）について陽性だった。抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂによって５０％を超える単球が標識された：Ａ２ Ｎｂで６８．３％、Ｂ８ Ｎｂで５０．８％、Ｃ７ Ｎｂで６２％、Ｃ９ Ｎｂで５８．１％、Ｄ８ Ｎｂで５３．５％、Ｇ３ Ｎｂで５７％及びＧ１０ Ｎｂで４６．７％（図５）。それでも、単球はＤ１２、Ｆ５、及びＨ１２のＮｂについて陰性だった（データは示さず）。要するに、本発明者らは、Ｂ８、Ｃ７及びＣ９のＮｂが単量体または二量体のいずれかのＬＩＬＲＢ２受容体内の線状エピトープに強く特異的であると判定した。試験管内でのＬＩＬＲＢ２－Ｄ１．１で生成された細胞株または生体外での単球に対するＬＩＬＲＢ２エピトープのアクセス可能性は、Ｎｂよりも対照Ａｂ ４２Ｄ１の方が難しくてもよい。４２Ｄ１モノクローナル抗体に対するこの弱い結合は、抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂ、特にＢ８、Ｃ７、及びＣ９のＮｂに影響を与えない立体障害に関連している可能性がある。

Ｎｂ抗ＬＩＬＲＢ２はＬＩＬＲＢ２／ＨＬＡ－Ｇの相互作用を阻害する。
ＬＩＬＲＢ２受容体はＨＬＡ－Ｇ及びＡＮＧＰＴＬ２のいずれかと相互作用して免疫細胞応答を阻害し、それぞれ腫瘍の発生を誘導する。次に、本発明者らは免疫細胞機能を回復し、腫瘍増殖を防ぐために、抗ＬＩＬＲＢ２がこれらの相互作用を遮断することができるかどうかを検討した。ＬＩＬＲＢ２／ＨＬＡ－Ｇ相互作用の阻害を研究するために、本発明者らは先ず、Ｎｂの遮断能力を評価するためのＥＬＩＳＡアッセイを設計した。この目的で、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングしたのち、Ｎｂの存在下または非存在下でＨＬＡ－Ｇ６タンパク質と同時インキュベートした。ｒｈ－ＬＩＬＲＢ２－Ｆｃ受容体は可溶性ＨＬＡ－Ｇ６アイソフォームに対して強い親和性を有することが実証されている。図６に示すように、アイソタイプ対照モノクローナル抗体は、ＨＬＡ－Ｇ６／ＬＩＬＲＢ２相互作用（２４％の遮断）を妨害し、同様に遮断が報告されていなかったＨ－３００ポリクローナル抗体（２６％の遮断）も妨害する。しかしながら、抗ＬＩＬＲＢ２モノクローナル遮断抗体２７Ｄ６はＨＬＡ－Ｇ６とＬＩＬＲＢ２受容体との間の相互作用を強力に無効にした（１００％の遮断）。抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂに関して、本発明者らは７つのＮｂ（Ａ２、Ｃ７、Ｃ９、Ｄ８、Ｅ７、Ｆ５及びＧ１０）が相互作用を弱く阻害し（＜３０％）、３つのＮｂが部分的阻害：Ｄ１２（４４．８％）、Ｇ３（３９．４％）及びＨ１２（５０％）を示したのに対して、Ｂ８ ＮｂはＨＬＡ－Ｇ６／ＬＩＬＲＢ２相互作用を完全に阻害する（１００％の遮断）ことを特定した。

Ｂ８ ＮｂはＬＩＬＲＢ２／ＡＮＧＰＴＬ２の相互作用を部分的に阻害する
ＬＩＬＲＢ２／ＡＮＧＰＴＬ２の相互作用が腫瘍の発生を促進することが実証された。実際、がん細胞によって発現されるＬＩＬＲＢ２受容体とＡＮＧＰＴＬ２タンパク質のオートクリン発現との間の相互作用は腫瘍増殖、腫瘍アポトーシスの阻害、及び腫瘍細胞の分化をもたらす。抗ＬＩＬＲＢ２ Ｎｂがこの相互作用を遮断することができるかどうかを判定するために、本発明者らはｒｈＬＩＬＲＢ２－ＦｃとＡＮＧＰＴＬ２タンパク質との間の相互作用を評価するＥＬＩＳＡを設定した。前述のように、ｒｈＬＩＬＲＢ２－Ｆｃタンパク質をマイクロタイタープレートにコーティングしたのち、抗ＬＩＬＲＢ２の抗体またはＮｂの存在下または非存在下でｒｈＡＮＧＰＴＬ２と同時インキュベートした。一部のＮｂは、ＬＩＬＲＢ２／ＡＮＧＰＴＬ２の相互作用を部分的に遮断した（＜２４％の結合阻害）（データは示さず）。Ｂ８ ＮｂはＮｂを含まない対照と比べてこの相互作用を強力に遮断した（５１．４％の結合阻害）一方で、Ａ２、Ｈ１２、及びＧ１０は弱い遮断（それぞれ２４％、２０％、及び８％）を示した（図７）。

Claims (17)

1. 白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー２（ＬＩＬＲＢ２）、好ましくはヒトＬＩＬＲＢ２に特異的に結合するシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）。
2. 前記ｓｄＡｂが、白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーＢメンバー１（ＬＩＬＲＢ１）、好ましくはヒトＬＩＬＲＢ１と結合しない、請求項１に記載のｓｄＡｂ。
3. 前記ｓｄＡｂが、配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３に示される配列を含む、もしくはその配列で構成される、または１、２、または３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３、６、９、１２、１５、１８、２１、２４、２７、３０もしくは３３とは異なるアミノ酸配列を含む、もしくはその配列で構成される少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１または２に記載のｓｄＡｂ。
4. 前記ｓｄＡｂが３つのＣＤＲを含み、その際、
   （ａ）ＣＤＲ１は、配列番号１を含む、配列番号１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号２を含む、配列番号２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号３を含む、配列番号３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｂ）ＣＤＲ１は、配列番号４を含む、配列番号４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号５を含む、配列番号５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号６を含む、配列番号６のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号６とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｃ）ＣＤＲ１は、配列番号７を含む、配列番号７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号８を含む、配列番号８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号９を含む、配列番号９のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号９とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｄ）ＣＤＲ１は、配列番号１０を含む、配列番号１０のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１０とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号１１を含む、配列番号１１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号１２を含む、配列番号１２のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１２とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｅ）ＣＤＲ１は、配列番号１３を含む、配列番号１３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１３とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号１４を含む、配列番号１４のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１４とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号１５を含む、配列番号１５のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１５とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｆ）ＣＤＲ１は、配列番号１６を含む、配列番号１６のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１６とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号１７を含む、配列番号１７のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１７とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号１８を含む、配列番号１８のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号１８とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｇ）ＣＤＲ１は、配列番号１９を含む、配列番号１９のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号１９とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号２０を含む、配列番号２０のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２０とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号２１を含む、配列番号２１のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２１とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｈ）ＣＤＲ１は、配列番号２２を含む、配列番号２２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号２３を含む、配列番号２３のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２３とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号２４を含む、配列番号２４のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２４とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号２５を含む、配列番号２５のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２５とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号２６を含む、配列番号２６のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２６とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号２７を含む、配列番号２７のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号２７とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｊ）ＣＤＲ１は、配列番号２８を含む、配列番号２８のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２８とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号２９を含む、配列番号２９のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号２９とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号３０を含む、配列番号３０のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３０とは異なるアミノ酸配列を有する；または
   （ｋ）ＣＤＲ１は、配列番号３１を含む、配列番号３１のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３１とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ２は、配列番号３２を含む、配列番号３２のものである、または１、２、もしくは３のアミノ酸修飾に起因して配列番号３２とは異なるアミノ酸配列を有する、且つ
   ＣＤＲ３は、配列番号３３を含む、配列番号３３のものである、または１、２、３、もしくは４のアミノ酸修飾に起因して配列番号３３とは異なるアミノ酸配列を有する、請求項１～３のいずれかに記載のｓｄＡｂ。
5. 前記ｓｄＡｂが３つのＣＤＲを含み、ＣＤＲ１が配列番号１を含む、またはそれから成り、ＣＤＲ２が配列番号２を含む、またはそれから成り、ＣＤＲ３が配列番号３を含む、またはそれから成る、請求項１～３のいずれかに記載のｓｄＡｂ。
6. 配列番号３４～配列番号４４の配列のいずれかで定義される配列、またはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、またはその配列で構成される、請求項１～５のいずれかに記載のｓｄＡｂ。
7. 配列番号３４で定義される配列を含む、またはその配列で構成される、請求項１～５のいずれかに記載のｓｄＡｂ。
8. 前記ｓｄＡｂが、ＬＩＬＲＢ２とヒト白血球抗原－Ｇ（ＨＬＡ－Ｇ）との間の相互作用を阻害する、請求項１～７のいずれかに記載のｓｄＡｂ。
9. 前記ｓｄＡｂが、ＬＩＬＲＢ２とアンジオポエチン様２（ＡＮＧＰＴＬ２）との間の相互作用を阻害する、請求項１～８のいずれかに記載のｓｄＡｂ。
10. 請求項１～９のいずれか１項に記載のｓｄＡｂをコードする配列を含む単離された核酸であって、好ましくは配列番号４５～５５から成る群で選択される配列によって定義される、前記単離された核酸。
11. 請求項１０に記載の単離された核酸を含むベクター。
12. 請求項１～９のいずれか１項に記載のｓｄＡｂまたは請求項８に記載の単離された核酸を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
13. 請求項１０に記載の単離された核酸、または請求項１１に記載のベクターを含む、または請求項１２に記載のＣＡＲを発現する細胞。
14. 前記細胞がＴ細胞、ＣＤ４^＋Ｔ細胞、ＣＤ８^＋Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球及び樹状細胞から成る群から選択され、好ましくは前記細胞がＴ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞である、請求項１３に記載のＣＡＲを発現する細胞。
15. 請求項１～７のいずれか１項に記載のｓｄＡｂ、請求項１０に記載の単離された核酸、請求項１１に記載のベクター、または請求項１２に記載のＣＡＲ、または請求項１３もしくは１４に記載のＣＡＲを発現する細胞と、任意で薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
16. がんの治療に使用するための、好ましく、前記がんがＬＩＬＲＢ２を過剰発現し、さらに好ましくはがんが肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、膵管癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、子宮内膜癌、肝細胞癌、黒色腫、卵巣癌、乳癌、大腸癌、神経膠腫、胃癌、腎癌、精巣癌、食道癌、子宮頸癌、マウスのルイス肺癌、白血病、甲状腺癌、肝臓癌、尿路癌及び頭頸部癌から成る群から選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載のｓｄＡｂ、請求項１０に記載の単離された核酸、請求項１１に記載のベクター、請求項１２に記載のＣＡＲ、請求項１３～１４のいずれか１項に記載の細胞、または請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 試験管内または生体外で腫瘍細胞または腫瘍組織上のＬＩＬＲＢ２を検出するための、請求項１～９のいずれか１項に記載のｓｄＡｂの使用。

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