TW202144417A - Ｐｖｒｉｇ結合蛋白及其醫藥用途 - Google Patents
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Abstract
本公開涉及PVRIG結合蛋白及其醫藥用途。具體而言，本公開提供抗PVRIG單域抗體及抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，含有所述抗體的醫藥組成物及治療癌症的方法和製藥用途。
Description
本公開要求2020年03月13日提交的中國專利申請(申請號CN202010174835.4)的優先權。
本公開涉及PVRIG結合蛋白，例如抗PVRIG抗體及其與抗TIGIT抗體形成的雙特異性抗體，及其作為藥物用於治療癌症。
癌症是當今人類社會長期面臨的最大健康挑戰。傳統的療法如手術、化療和放療在治療播散的實體腫瘤中收效甚微。腫瘤免疫治療是腫瘤治療領域一個熱點，其中T細胞的腫瘤免疫治療又處於其核心位置。腫瘤免疫治療是充分利用、調動腫瘤患者體內的殺傷性T細胞，對腫瘤進行殺傷作用，它可能是最有效的也是最安全的治療腫瘤的途徑。腫瘤免疫療法目前對治療幾種不同類型的癌症，包括播散的轉移性腫瘤已具有很好的前景。
人體內T細胞的活化採取了兩條信號通路的系統，除了需要藉由抗原呈遞細胞(APC)遞呈MHC-抗原肽給T細胞提供第一信號外，還需要一系列協同刺激分子提供第二信號，進而才能使T細胞產生正常的免疫應答。這個雙信號通路系統對體內免疫系統的平衡起著至關重要的作用，它嚴格調控機體對自
身和非自身抗原產生不同的免疫應答。如果缺少協同刺激分子提供的第二信號，將會導致T細胞的無應答或持續特異性免疫應答，從而產生耐受。因此，第二信號通路在機體免疫應答的整個過程中起著非常關鍵的調節作用。
PVRIG，又名CD112R，是細胞表面表達的蛋白，與TIGIT、CD96和CD226等同屬於B7/CD28超家族，在免疫系統中其重要作用。它包含一個胞外區，一個跨膜區，和一個胞內區。當其配體PVRL2(又叫CD112)結合PVRIG時，會活化PVRIG胞內區的ITIM結構域，使PVRIG起到免疫抑制的作用。
PVRIG主要表達在CD4+T細胞，CD8+T細胞和NK細胞的表面。PVRIG和其配體PVRL2在很多實體瘤中都有高表達，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、胃癌、子宮內膜癌、頭頸癌等。PVRIG在這些癌症中的表達與TIGIT和PD-1有高度相關性。與PD-1和TIGIT相似，PVRIG陽性的T細胞也會呈現Eomes陽性和Tbet陰性，表明PVRIG與T細胞的耗竭有關。因此，PVRIG可能代表了除了PD-1和TIGIT之外的有一個新的免疫檢查點，並發揮冗餘(redundancy)的作用。體外細胞實驗和小鼠模型中顯示，對小鼠PVRIG的敲除或抑制，可以有效抑制腫瘤的生長，並與PD-1和TIGIT抑制劑發生協調作用。
另一個所關注的靶標TIGIT在淋巴細胞上高度表達，包括浸潤不同類型腫瘤的腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)和Treg。已經證明TIGIT序號傳導與其同源配體PVR(也稱為CD155)的接合藉由其細胞質ITIM結構域直接抑制NK細胞的細胞毒性。PVR也在腫瘤中廣泛表達，表明TIGIT-PVR信號軸可能是癌症的主要免疫逃逸機制。
但是，目前尚未有PVRIG/TIGIT雙特異性抗體藥物進入臨床。Compugen公司的COM701是全球首個獲FDA批准進入臨床的針對PVRIG的人源化
融合瘤抗體，目前處於I期臨床階段，用於治療癌症。Surface Oncology也有抗PVRIG抗體SRF-813在開發。抗TIGIT抗體有Genentech的tiragolumab、Ono Pharmaceutical與BMS合作開發的BMS-986207、默沙東的MK-7684、iTeos Therapeutics的EOS-884448、Arcus Biosciences的AB-154，均在臨床II期階段。
現有技術中仍然缺乏能夠抑制體內癌症或腫瘤生長的高親和力、高選擇性、高生物活性的抗PVRIG抗體、抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，本公開旨在提供這樣的抗體，藉由阻斷PVRIG和/或TIGIT的抑制通路，活化免疫，以治療癌症。
本公開提供PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(例如VHH)及其與抗TIGIT抗體的雙特異性抗體，及其編碼核酸、載體、宿主細胞、醫藥組成物、用於治療癌症的方法和製藥用途。
第一方面，本公開提供PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體。
一些實施方案中，PVRIG結合蛋白包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該至少一個免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1選自SEQ ID NO：7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、37、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示的胺基酸序列或與之具有3、2、1個或更多胺基酸差異的胺基酸序列，和/或
CDR2選自SEQ ID NO：8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65任一所示的胺基酸序列或與之具有3、
2、1個或更多胺基酸差異的胺基酸序列，和/或
CDR3選自SEQ ID NO：9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、150、151任一所示的胺基酸序列或與之具有3、2、1個或更多胺基酸差異的胺基酸序列。
其中，SEQ ID NO：7-21、150、151是依據Kabat編碼規則，SEQ ID NO：22-36是依據Chothia編碼規則，SEQ ID NO：37-51是依據IMGT編碼規則，SEQ ID NO：52-66是依據AbM編碼規則。
一些實施方案中，PVRIG結合蛋白包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該至少一個免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：2、75-79任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：3、80-84任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：4、86-90任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：5、91-95任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：6、96-100任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1、CDR2、CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，一些具體實施方案中，CDR是根據Kabat編號規則確定的。
一些實施方案中，依據Kabat編碼規則，PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、8、9所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、8、150所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、11、12
所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、11、151所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：13、14、15所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：16、17、18所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：19、20、21所示。
一些實施方案中，依據Chothia編碼規則，PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、23、24所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、26、27所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：28、29、30所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、32、33所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、35、36所示。
一些實施方案中，依據IMGT編碼規則，PVRIG結合蛋白的免疫球
蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：37、38、39所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、41、42所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、44、45所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：46、47、48所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：49、50、51所示。
一些實施方案中，依據AbM編碼規則，PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：52、53、54所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：55、56、57所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：58、59、60所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：61、62、63所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：64、65、66
所示。
在一些實施方案中，提供了PVRIG結合蛋白，其包含免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含CDR1、CDR2和CDR3，其中根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別
如SEQ ID NO：7、8和9所示；或
如SEQ ID NO：7、8和150所示：或
如SEQ ID NO：10、11和12所示；或
如SEQ ID NO：10、11和151所示；或
如SEQ ID NO：13、14和15所示；或
如SEQ ID NO：16、17和18所示：或
如SEQ ID NO：19、20和21所示。
在一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白是抗體或其抗原結合片段，較佳為VHH抗體，更佳為人源化的和/或經親和力成熟的VHH抗體。
在一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：2-6中任一所示，或與之具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。一些實施方案中，PVRIG結合蛋白為變體蛋白，其在上述PVRIG結合蛋白的CDR1具有3、2、1個或更多胺基酸差異，和/或在CDR2具有3、2、1個或更多胺基酸差異，和/或在CDR3具有3、2、1個或更多胺基酸差異。
一些實施方案中，提供抗PVRIG抗體，其包含如上PVRIG結合蛋白中的CDR1、CDR2、CDR3。其可以人源化的和/或經親和力成熟的。一些具體實
施方案中，抗PVRIG抗體的胺基酸序列如SEQ ID NO：2-6、75-84、86-100任一所示，或與之具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性。一些具體實施方案中，抗PVRIG單域抗體與人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc區連接，例如，其與有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變的IgG4的Fc區連接(例如SEQ ID NO：101或153所示)。
一些實施方案中，本公開PVRIG結合蛋白中的免疫球蛋白單一可變結構域是單域抗體(VHH)，一些具體實施方案中，該VHH是人源化的和/或經親和力成熟的VHH。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白包含抗體。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白是抗體(例如，VHH)。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白是駱駝抗體、人源化抗體、全人抗體。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白或其中的免疫球蛋白單一可變結構域為駱駝抗體，其中VHH的胺基酸序列如SEQ ID NO：2-6任一所示，或與之具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白或其中的免疫球蛋白單一可變結構域為人源化抗體，抗體的框架區為人種系範本的重鏈框架區，如IGHV3-7，具體如IGHV3-7 *01、IGHV3-30 *02。
一些具體實施方案中，本公開的抗PVRIG人源化抗體的胺基酸序列如SEQ ID NO：75-84、86-100任一所示，或與之具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性。
在一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白包含或為人源化抗體，其包含人種系範本的重鏈框架區。
在一些實施方案中，該人種系範本的重鏈框架區為IGHV3-7 *01或IGHV3-30 *02。
在一些實施方案中，該人源化抗體的免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列如SEQ ID NO：75-84和86-100中任一所示，或與之具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白還包含人免疫球蛋白Fc區，例如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4的Fc區。一些具體實施方案中，該人免疫球蛋白Fc區是人IgG4的Fc區。一些具體實施方案中，該人免疫球蛋白Fc區是人IgG1的Fc區。Fc區可以有突變，例如S228P、F234A、L235A和/或K447A的胺基酸突變(例如SEQ ID NO：101或153所示)。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白中，能夠特異性結合PVRIG的免疫球蛋白單一可變結構域直接或藉由接頭與免疫球蛋白Fc區連接。該接頭可以是長1-20、1-30、1-40、1-50個或更多個胺基酸、無二級以上結構的非功能性胺基酸序列。該接頭可以是柔性接頭，例如GS、GAP、ASGS、G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G4S)6、YGNGT、(YGNGT)2、(YGNGT)3、(YGNGT)4、(YGNGT)5、(YGNGT)6等。
一些具體實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白中Fc區允許該PVRIG結合蛋白形成包含兩個或四個PVRIG結合結構域的二聚體分子。這樣的PVRIG結合蛋白也稱為二價或四價PVRIG結合蛋白。該二聚體例如是同二聚體。
本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體具有下述特徵中的至少
一個：
(a)結合人PVRIG的KD值小於1×10-7M；
(b)阻斷PVRIG與其配體(例如，PVRL2)的相互作用；
(c)解除樹突狀細胞對T細胞的抑制作用，活化T細胞；
(d)解除腫瘤細胞對NK細胞的抑制作用；
(e)抑制腫瘤生長。
本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體結合PVRIG的KD值可以小於1×10-7M，小於1×10-8M，小於1×10-9M，小於1×10-10M。
本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體能夠抑制腫瘤生長至少約10%，至少約20%，至少約30%，至少約40%，至少約50%，至少約60%，至少約70%，至少約80%。
本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體可以是單體，和/或PEG化的，和/或糖基化的，和/或白蛋白綴合或融合的，和/或Fc融合的，和/或羥乙基化的，和/或去除O-糖基化的。
第二方面，本公開提供抗PVRIG的雙特異性抗體。
一些實施方案中，提供雙特異性抗體，包含第一抗原結合結構域和第二抗原結合結構域，其中，第一抗原結合結構域特異性結合PVRIG。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的第一抗原結合結構域特異性結合PVRIG，該第一抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)，該至少一個免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)包含三個互補決定區區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1選自SEQ ID NO：7、10、13、16、19、22、25、28、31、34、
37、40、43、46、49、52、55、58、61、64任一所示的胺基酸序列或與之具有3、2、1個或更多胺基酸差異的胺基酸序列，和/或
CDR2選自SEQ ID NO：8、11、14、17、20、23、26、29、32、35、38、41、44、47、50、53、56、59、62、65任一所示的胺基酸序列或與之具有3、2、1個或更多胺基酸差異的胺基酸序列，和/或
CDR3選自SEQ ID NO：9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42、45、48、51、54、57、60、63、66、150、151任一所示的胺基酸序列或與之具有3、2、1個或更多胺基酸差異的胺基酸序列。
其中，SEQ ID NO：7-21是依據Kabat編碼規則，SEQ ID NO：22-36是依據Chothia編碼規則，SEQ ID NO：37-51是依據IMGT編碼規則，SEQ ID NO：52-66是依據AbM編碼規則。
一些實施方案中，雙特異性抗體中特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該至少一個免疫球蛋白單一可變結構域包含SEQ ID NO：2、75-79任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：3、80-84任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：4、86-90任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：5、91-95任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或包含SEQ ID NO：6、96-100任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3，該CDR1、CDR2、CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的，一些具體實施方案中，CDR是根據Kabat編號規則確定的。
一些具體實施方案中，依據Kabat編碼規則，特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域(如VHH)包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其
中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、8、9所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：7、8、150所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、11、12所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、11、151所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：13、14、15所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：16、17、18所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：19、20、21所示。
一些具體實施方案中，依據Chothia編碼規則，特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域(如VHH)包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：22、23、24所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：25、26、27所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：28、29、30所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：31、32、33所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：34、35、36所示。
一些具體實施方案中，依據IMGT編碼規則，特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域(如VHH)包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：37、38、39所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：40、41、42所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：43、44、45所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：46、47、48所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：49、50、51所示。
一些具體實施方案中，依據AbM編碼規則，特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域(如VHH)包含三個互補決定區CDR1、CDR2和CDR3，其中：
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：52、53、54所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：55、56、57所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：58、59、60所示；
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：61、62、63所示；或
CDR1、CDR2、CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：64、65、66所示。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的第一抗原結合結構域(如VHH)包含SEQ ID NO：2-6、75-84、86-100任一所示胺基酸序列，或與之具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%同一性的序列。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體中：
第一抗原結合結構域為第一抗體，其是VHH；
第二抗原結合結構域為第二抗體，其包括重鏈(HC)和輕鏈(LC)；
該VHH作為第一抗體位於第二抗體的重鏈或輕鏈的N端和/或C端。
一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體包含1個第二抗體和2個VHH的第一抗體；該第二抗體包括兩條HC和兩條LC，第二抗體的一條HC的VH與一條LC的VL形成抗原結合部位，另一條HC的VH與另一條LC的VL形成抗
原結合部位。
一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體中的一個VHH的第一抗體位於第二抗體的重鏈或輕鏈的N端，另一個VHH的第一抗體位於第二抗體的重鏈或輕鏈的C端。
一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體中每個VHH的第一抗體分別位於第二抗體的兩條重鏈或兩條輕鏈的N端；或者，每個VHH的第一抗體分別位於第二抗體的兩條重鏈或兩條輕鏈的C端。
一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體中的每個VHH的第一抗體分別位於第一抗體的兩條重鏈的N端；或者，每個VHH的第一抗體分別位於第一抗體的兩條重鏈的C端；
一些具體實施方案中，本公開的第一抗體可以連接有1、2、3、4、5、6、7、8個VHH的第二抗體，該VHH的第二抗體可以是相同的或不同的，可以均連接在第一抗體的重鏈N端，或均連接在第一抗體的重鏈C端，或均連接在第一抗體的輕鏈N端，或均連接在第一抗體的輕鏈C端，或重鏈N端、重鏈C端、輕鏈N端、輕鏈C端的任意組合。
一些具體實施方案中，本公開的雙特異性抗體中的VHH的第一抗體直接或藉由連接子與第二抗體的每條重鏈的N端或C端連接。該連接子選自：如(GmSn)x或(GGNGT)x或(YGNGT)x所示的胺基酸序列，其中m、n各自獨立地選自1-8的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)，x獨立地選自1-20的整數(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20)。例如，連接子為G4S、(G4S)2、(G4S)3、(G4S)4、(G4S)5、(G4S)6所示的胺基酸序列。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的第二抗體的重鏈包含
重鏈可變區(VH)和重鏈恆定區(CH)，輕鏈包含輕鏈可變區(VL)和輕鏈恆定區(CL)。第二抗體可以為全長抗體。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的第二抗體的重鏈為IgG同種型，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4，例如為IgG1同種型；和/或，該第二抗體的輕鏈為Kappa同種型。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的第二抗體的兩條HC包含相同的CDR和/或兩條LC包含相同的CDR。一些具體實施方案中，第二抗體的兩條HC包含相同的VH和/或兩條LC包含相同的VL。一些具體實施方案中，第二抗體的兩條HC具有相同的胺基酸序列和/或兩條LC具有相同的胺基酸序列。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的兩個VHH的第一抗體具有相同或不相同的胺基酸序列。例如，兩個該VHH的第一抗體具有相同的胺基酸序列。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體包含兩條第一多肽鏈和兩條第二多肽鏈，其中對於每條多肽鏈：a)第一多肽鏈各自獨立地包含VHH的第一抗體和第二抗體的重鏈(HC)；和b)第二多肽鏈各自獨立地包含第二抗體的輕鏈(LC)；其中，VHH藉由接頭與第一抗體的HC的N端和/或C端相連。
或者，i)第一多肽鏈各自獨立地包含第二抗體的重鏈(HC)；和ii)第二多肽鏈各自獨立地包含VHH的第一抗體和第二抗體的輕鏈(LC)；其中，VHH直接或藉由接頭與第二抗體的LC的N端和/或C端相連。
一些具體實施方案中，本公開雙特異性抗體包含兩條相同的第一多肽鏈和兩條相同的第二多肽鏈。
一些實施方案中，本公開的雙特異性抗體的第二抗原結合結構域
為任意的抗TIGIT抗體。此處全文引入WO2009126688、WO2014089113、WO2015009856、WO2015143343、WO2015174439、WO2016028656、WO2016106302、WO2017053748、WO2017030823、US20160176963、US20130251720、WO2019232484、WO2019062832中的TIGIT抗體。例如，TIGIT抗體可以為CPA.9.083.H4(S241P)、CPA.9.086.H4(S241P)、CHA.9.547.7.H4(S241P)和CHA.9.547.13.H4(S241P)中的任一種(參見WO2019232484)。
一些實施方案中，本公開雙特異性抗體的第二抗原結合結構域為第二抗體。此處全文引入WO2019062832中的抗TIGIT抗體作為第二抗體。該第二抗體中：
重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：115、116和117所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：118、119和120所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：121、122和123所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：124、125和126所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：127、128和129所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：130、131和132所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：133、134和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：136、137和138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：139、140和141所示的HCDR1、
HCDR2和HCDR3；輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：142、143和144所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
一些具體實施方案中，本公開雙特異性抗體中的第一抗原結合結構域或第一抗體(如VHH)包含如SEQ ID NO：7、8、9所示的CDR1、CDR2、CDR3，或包含如SEQ ID NO：7、8、150所示的CDR1、CDR2、CDR3；第二抗原結合結構域或第二抗體的重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：121、122、123所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：124、125、126所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
一些具體實施方案中，本公開雙特異性抗體中的第一抗原結合結構域或第一抗體(如VHH)包含如SEQ ID NO：10、11、12所示的CDR1、CDR2、CDR3，或包含如SEQ ID NO：10、11、151所示的CDR1、CDR2、CDR3；第二抗原結合結構域或第二抗體的重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：121、122、123所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：124、125、126所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
一些具體實施方案中，本公開雙特異性抗體中的VHH的第一抗體包含如SEQ ID NO：6、79、81、92、98、99之一所示的胺基酸序列或與之具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性；第二抗體包含如SEQ ID NO：145-147任一項所示的VH、SEQ ID NO：148-149任一項所示的VL或如SEQ ID NO：102所示的HC和SEQ ID NO：103所示的LC或與該VH、HC或VL、LC具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。
一些具體實施方案中，本公開雙特異性抗體包含：
如SEQ ID NO：104所示第一多肽鏈，如SEQ ID NO：103所示第二多肽鏈；
如SEQ ID NO：105所示第一多肽鏈，如SEQ ID NO：103所示第二多肽鏈；
如SEQ ID NO：102所示第一多肽鏈，如SEQ ID NO：106所示第二多肽鏈；
如SEQ ID NO：102所示第一多肽鏈，如SEQ ID NO：107所示第二多肽鏈；
如SEQ ID NO：108-112、114任一所示第一多肽鏈，如SEQ ID NO：103所示所示第二多肽鏈；或
與上述第一多肽鏈和/或第二多肽鏈具有至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性的變體。
一些實施方案中，本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體及其與抗TIGIT的雙特異性抗體的Fc區有突變，包括選自以下的一個或多個胺基酸突變：
i)改變CH1的鉸鏈區中的半胱胺酸殘基的數量，以便於輕鏈和重鏈的組裝或提高或降低抗體的穩定性；
ii)使得與Fc γ RIIIa的結合增強的突變，以引起增強的ADCC，使得與Fc γ RIIb的結合減弱的突變，例如236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、299T、297N或其任意組合；
iii)延長生物半衰期的突變，例如T252L、T254S、T256F、428L、434A、434S428L/434S或其任意組合；
iv)234、235、236、237、297、318、320和322位元的一個或多個胺基酸突變或其任意組合，以改變抗體對效應配體的親和力，同時保留親本抗體的抗原結合能力；
v)329、331和322位元的一個或多個胺基酸突變或其任意組合，使得抗體具有改變了的C1q結合和/或降低或消除補體依賴性細胞毒性(CDC)；
vi)231-239內的一個或多個胺基酸突變或其任意組合，使得抗體固定補體的能力改變；
vii)238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439中的一個或多個胺基酸突變或其任意組合，以提高ADCC的能力和/或提高抗體對Fc γ受體的親和力；
viii)S228P、F234A、L235A和/或K447A的胺基酸突變；
ix)S354C，E356D，M358L和/或T366W的胺基酸突變。
一些實施方案中，提供與本公開的PVRIG結合蛋白、PVRIG\TIGIT結合蛋白、抗PVRIG單域抗體、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體競爭性結合相同表位的抗體。
在一些實施方案中，本公開提供了PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域，
該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域包含免疫球蛋白單一
可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：
SEQ ID NO：3、80-84任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或
SEQ ID NO：2、75-79任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或
SEQ ID NO：4、86-90任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或
SEQ ID NO：5、91-95任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；或
SEQ ID NO：6、96-100任一所示序列中的CDR1、CDR2、CDR3；
該CDR1、CDR2、CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的。
根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別
如SEQ ID NO：7、8和9所示；或
如SEQ ID NO：7、8和150所示；或
如SEQ ID NO：10、11和12所示；或
如SEQ ID NO：10、11和151所示；或
如SEQ ID NO：13、14和15所示；或
如SEQ ID NO：16、17和18所示；或
如SEQ ID NO：19、20和21所示。
在具體的實施方案，該PVRIG/TIGIT結合蛋白的第一抗原結合結構域包含SEQ ID NO：2-6、75-84和86-100中任一所示或與之具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。
在具體的實施方案，該PVRIG/TIGIT結合蛋白的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：115、116和117所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：118、119和120所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：121、122和123所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：124、125和126所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：127、128和129所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：130、131和132所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：133、134和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：136、137和138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：139、140和141所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：142、143和144所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在具體的實施方案中，該PVRIG/TIGIT結合蛋白的第二抗原結合結構域包含全長重鏈(HC)和全長輕鏈(LC)；
具體地，該全長重鏈為IgG1或IgG4同種型，該全長輕鏈為Kappa同種型；
更具體地，該重鏈序列為SEQ ID NO：102所示或與之具有至少90%序列同一性，該輕鏈序列為SEQ ID NO：103所示或與之具有至少90%序列同一性。
在本公開的PVRIG/TIGIT結合蛋白的具體實施方案中，該特異性結
合PVRIG的第一抗原結合結構域的VHH位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區或全長重鏈的N端；
該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的VHH位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區或全長重鏈的C端；
該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的VHH位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區或全長輕鏈的N端；和/或
該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的VHH位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區或全長輕鏈的C端。
在本公開的PVRIG/TIGIT結合蛋白的具體實施方案中，該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的VHH與特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；
較佳地，該連接子為具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數；
更佳地，該連接子為(G4S)2、(G4S)3所示的胺基酸序列。
在一些實施方案中，本公開提供的PVRIG/TIGIT結合蛋白包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：
該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：108-112和114中任一所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；或者
該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：104或105所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；或者
該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：106或107所示的胺基酸序列。
協力廠商面，本公開提供多核苷酸，其編碼前述PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)或抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。該多核苷酸可以是DNA或RNA。
一些實施方案中，提供多核苷酸組合物，包含：
第一核酸，編碼包含本公開抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體的VH或HC；和第二核酸，編碼包含本公開抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體的VL或LC。
第四方面，本公開提供含有如上所述的多核苷酸或多核苷酸組合物的表達載體或表達載體組合物，表達載體可以是真核表達載體、原核表達載體、病毒載體。
一些實施方案中，提供表達載體組合物，包含：
第一表達載體，包含上述多核苷酸組合物中第一核酸；和
第二表達載體，包含上述多核苷酸組合物中第二核酸。
第五方面，本公開提供用如上所述的表達載體、表達載體組合物轉化的或含有該表達載體、表達載體組成物的宿主細胞，其可以是真核細胞、原核細胞。
一些實施方案中，該宿主細胞為細菌、酵母菌、哺乳動物細胞。一些具體實施方案中，該宿主細胞為大腸桿菌、畢赤酵母、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞。
第六方面，本公開提供一種製備方法，包括：在如前所述的宿主細胞中表達PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，並自該宿主細胞中分離、回收PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如
VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。
在具體的實施方案中，本公開提供了製備PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、或抗PVRIG抗體或其抗原結合片段的方法，包括：
在本公開的宿主細胞中本公開的多核苷酸，以及
從該宿主細胞中分離表達的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白或抗PVRIG抗體或其抗原結合片段。
第七方面，本公開提供組成物(如醫藥組成物)，其含有治療有效量的如上所述的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體、或PVRIG/TIGIT結合蛋白，以及可用的賦形劑、稀釋或載體。
一些實施方案中，組成物(如醫藥組成物)中含有本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體(如VHH)，和抗TIGIT抗體。該TIGIT抗體可以是如前所述的任意抗TIGIT抗體，例如本公開表23、表24中的抗TIGIT抗體。以及，組合物種可以含有可藥用的賦形劑、稀釋或載體。
一些具體實施方案中，該抗TIGIT抗體含有如SEQ ID NO：121、122、123所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：124、125、126所示的LCDR1、LCDR2、LCDR3。
在一些具體實施方式中，該醫藥組成物單位計量中可含有0.01至99重量%的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，或醫藥組成物單位劑量中含PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體的量為0.1-2000mg，或1-1000mg。
第八方面，提供本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體、PVRIG/TIGIT結合蛋白、編碼多核苷
酸本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體、編碼多核苷酸中的任一項或其任意組合，用於診斷、治療、預防疾病的方法和製備藥物、醫藥組成物的用途(例如，用於治療或預防增殖性病症(例如癌症或腫瘤)或延緩相關病症進展)。
一些實施方案中，提供治療、緩解受試者病症的方法，包含向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，該病症是癌症。
一些實施方案中，提供活化受試者的細胞毒性T細胞(CTL)的方法，包含向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，其中該受試者的該CTL的亞組被活化。
一些實施方案中，提供活化受試者的NK細胞的方法，包含向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，其中該受試者的該NK細胞的亞組被活化。
一些實施方案中，提供活化受試者的γ δ T細胞的方法，包含向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，其中該受試者的該γ δ T細胞的亞組被活化。
一些實施方案中，提供活化受試者的Th1細胞的方法，包含向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體，其中該受試者的該Th1細胞的亞組被活化。
一些實施方案中，提供活化、減少或消除受試者體內的調節性T細胞(Treg)中的至少一種的細胞數量和/或活性的方法，包括向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。
一些實施方案中，提供增加受試者體內的干擾素-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，包括向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。
一些實施方案中，提供抑制受試者體內的PVRIG和PVLR2的相互作用的方法，包括向該受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。
一些實施方案中，提供治療受試者的方法，包括向該受試者或受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。
一些具體實施方案中，上述受試者的病症為增殖性病症(例如癌症或腫瘤)或患有增殖性病症(例如癌症或腫瘤)。該癌症或腫瘤選自以下或其組合：前列腺癌、肝癌(HCC)、結直腸癌、卵巢癌、子宮內膜癌、乳腺癌、三陰性乳腺癌、胰腺癌、胃(stomach/gastric)癌、宮頸癌、頭頸癌、甲狀腺癌、睾丸癌、尿路上皮癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、黑素瘤、非黑素瘤皮膚癌(鱗狀和基底細胞癌)、神經膠質瘤、腎癌(RCC)、淋巴瘤(NHL或HL)、急性骨髓性白血病(AML)、T細胞急性淋巴母細胞性白血病(T-ALL)、彌漫性大B細胞淋巴瘤、睾丸生殖細胞腫瘤、間皮瘤、食道癌、默克細胞癌(Merkel Cells cancer)、高MSI癌、KRAS突變腫瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症(MDS)。上述病症可以是與PVRIG和\或TIGIT異常表達相關的。一些具體實施方案中，該癌症或腫瘤選自由以下癌症或其組合：三陰性乳腺癌、胃癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、默克細胞癌、高MSI癌、KRAS突變腫瘤、成人T細胞白血病/淋巴瘤和骨髓增生異常綜合症(MDS)。一些具體實施方案中，該癌症或腫瘤選自由以下
癌症或其組合：三陰性乳腺癌、胃癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌)、默克細胞癌和高MSI癌。
一些實施方案中，上述受試者具有與PVRIG和/或TIGIT相關的病況。一些具體方案中，受試者病況包括表達或不表達PVRIG的癌症並且進一步包括非轉移性或非浸潤性以及浸潤性或轉移性癌症，其中免疫細胞、基質細胞或發生病變的細胞的PVRIG表達抑制抗腫瘤反應和抗浸潤性免疫反應。本公開的方法尤其適合於治療血管化腫瘤。
一些實施方案中，提供治療或預防受試者感染或膿毒症的方法，包括向該受試者或受試者施用本公開的PVRIG結合蛋白、抗PVRIG抗體(如VHH)、抗PVRIG和TIGIT的雙特異性抗體。一些具體方案中，該感染是病原體感染，以病毒特異性T細胞反應的不同程度的功能性障礙為特徵，如HIV、HCV、HBV。一些具體方案中，該膿毒症包括重度膿毒症、膿毒性休克、全身炎症反應綜合症(SIRS)、菌血症、敗血症、毒血症、膿毒性綜合症。
在一些實施方案中，提供了本公開上述的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、抗PVRIG抗體或其抗原結合片段、多核苷酸、或組合物，其用於治療或延緩疾病，較佳地，該疾病為增殖性疾病；
更佳地，該增殖性疾病為癌症；
更佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症。
一些實施方案中，提供診斷疾病的方法，包含：
a)使來自受試者的組織與本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體接觸；並且
b)判定該組織中PVRIG的過表達的存在作為疾病或病症存在的指示。
該組織可以是血液樣品、實體腫瘤活檢樣品。該PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體可以經過標記，進一步地，可以使結合到該PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體的第二標記抗體與前述樣品接觸。一些具體實施方案中，該PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體是被標記的，包括放射性同位素、染料(如具有生物素-抗生蛋白鏈菌素複合體)、造影劑、螢光化合物或分子以及用於磁共振成像(MRI)的增強劑(例如，順磁性離子)。一些具體實施方案中，該疾病或病症是如上所述的癌症或腫瘤、感染或膿毒症。
第九方面，本公開提供PVRIG結合蛋白的檢測用途。
本公開提供檢測PVRIG的組合物，該組合物包含PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體。本公開還提供用於體內或體外檢測PVRIG的方法、系統或裝置，其包括使用PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體。
一些實施方案中，體外檢測方法、系統或裝置可能例如包括(1)使樣品與PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體接觸；(2)檢測在PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體和樣品之間形成的複合物；和/或(3)使參比樣品(例如，對照樣品)與抗體接觸；和(4)藉由與參比樣品比較，確定抗體和樣品之間複合物形成的程度。如與對照樣品或受試者中相比，樣品或受試者中複合物形成的變化(例如，統計學上的顯著變化)表示樣品中存在PVRIG。
另一些實施方案中，體內檢測方法、系統或裝置可以包括：(1)向
受試者施用PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體；和(2)檢測在PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體和受試者之間複合物的形成。檢測可以包括確定形成複合物的位置或時間。結合PVRIG的抗體可以直接或間接地用可檢測物質標記以促進所結合的或未結合的抗體的檢測。合適的可檢測物質包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質和放射性物質。可以藉由測量與PVRIG結合或不結合的抗體或使其視覺化，檢測在PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體和PVRIG之間的複合物形成。可以使用常規檢測測定法，例如，酶聯免疫吸附測定(ELISA)、放射免疫測定(RIA)或組織免疫組織化學。一些實施方案中，藉由競爭免疫測定法分析樣品中PVRIG的存在，該競爭免疫測定法使用以可檢測物質標記的標準物和未標記的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體。檢測或測定的活體樣品可以是組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
一些實施方案中，出於檢測目的，本公開的PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體可以用螢光團和發色團標記。
一些實施方案中，還提供試劑盒，該試劑盒包含與PVRIG結合蛋白或抗PVRIG抗體，還可以包含診斷使用說明。試劑盒還可以含有至少一種額外的試劑，如標記物或額外的診斷劑。對於體內使用，抗體可以配製為醫藥組成物。
本公開實施例提供的PVRIG抗體、抗PVRIG和TIGIT雙抗對PVRIG和/或TIGIT具有高特異性、高親和力；人源化抗體的免疫原性大大降低，同時完全保留了優異的體內外活性；具有良好的大鼠和人體的代謝動力學特性；具有長半衰期、高生物利用度；具有良好的長期穩定性，無明顯異常化學修飾，高濃度下無明顯聚集，有較高的純度和熱穩定性；具有良好的增強T細胞和NK細胞活性、抑制腫瘤發生發展的效果。
圖1為抗PVRIG抗體的PVRIG報告基因細胞活性檢查結果。
圖2為抗PVRIG抗體在NK細胞殺傷實驗中啟動NK細胞的活性檢測結果。
圖3為抗PVRIG抗體在MLR實驗中啟動T細胞的活性檢測結果。
圖4A-圖4B為人源化的抗PVRIG抗體在PVRIG報告基因細胞活性檢測結果。
圖5A及圖5B為人源化的抗PVRIG抗體在NK細胞殺傷實驗中啟動NK細胞的活性檢測結果。
圖6A至圖6E分別顯示人源化的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人PVRIG重組蛋白、人PVRIG過表達細胞、食蟹猴PVRIG重組蛋白、食蟹猴PVRIG過表達細胞的結合活性、以及阻斷人PVRIG與人PVRL2結合的活性檢測結果。
圖7A至圖7E分別顯示人源化的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人TIGIT重組蛋白、人TIGIT過表達細胞、食蟹猴TIGIT重組蛋白、食蟹猴TIGIT過表達細胞的結合活性、以及阻斷人TIGIT與人PVR結合的活性檢測結果。
圖8為人源化的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在MLR實驗中啟動T細胞的活性檢測結果。
圖9A及圖9B分別顯示抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中對小鼠體重和腫瘤體積的影響。
圖10A及圖10B分別顯示抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中對小鼠體重和腫瘤體積的影響。
一、術語
為了更容易理解本公開，以下具體定義了某些技術和科學術語。除顯而易見在本檔中的它處另有明確定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本公開所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。
“PVRIG”或“PVRIG蛋白質”或“PVRIG多肽”可以任選地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型PVRIG，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型，並且尤其是PVRIG的可溶性胞外域(ECD)片段。此處ECD的定義如專利WO2016134333中的。完整的人類PVRIG序列可以GenBank登錄號AAH73861.1找到。
“PVRIG結合蛋白”意指任何能夠特異性結合PVRIG的蛋白或包含該蛋白的任何分子。PVRIG結合蛋白可以包括針對PVRIG的如本公開定義的抗體、其抗原結合片段或其綴合物。PVRIG結合蛋白還涵蓋免疫球蛋白超家族抗體(IgSF)或CDR移植分子。本公開的“PVRIG結合蛋白”可以包含至少一個結合PVRIG的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。在一些實施方案中，“PVRIG結合蛋白”可以包含2、3、4或更多個結合PVRIG的免疫球蛋白單一可變結構域(如VHH)。本公開的PVRIG結合蛋白除包含PVRIG的免疫球蛋白單一可變結構域外，也可包含接頭和/或具有效應器功能的部分，例如半衰期延長部分(如結
合血清白蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域)、和/或融合配偶體(如血清白蛋白)和/或綴合的聚合物(如PEG)和/或Fc區。在一些實施方案中，本公開的“PVRIG結合蛋白”還涵蓋雙/多特異性抗體，其含有結合不同抗原的免疫球蛋白(如結合第一抗原(如PVRIG)的第一抗體和結合第二抗原(如TIGIT)的第二抗體，可選的，包括結合第三抗原的第三抗體，進一步可選的，包括結合第四抗原的第四抗體。
“TIGIT”或“TIGIT蛋白質”或“TIGIT多肽”可以任選地包括任何這類蛋白質或其變異體、結合物或片段，包括(但不限於)如本文所述的已知或野生型TIGIT，以及任何天然產生的剪接變異體、胺基酸變異體或同工型。完整的TIGIT序列可以GenBank登錄號AAI01289.1找到。
“與PVRIG結合”，指能與PVRIG或其表位相互作用，該PVRIG或其表位可以是人源的。“與TIGIT結合”，指能與TIGIT或其表位相互作用，該TIGIT或其表位可以是人源的。“抗原結合位點”指抗原上不連續的，由本公開抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。
“抗體”或“免疫球蛋白”廣義上涵蓋傳統的抗體(由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構抗體)，以及具有抗原結合活性的Fab、Fv、sFv、F(ab’)2、線性抗體、單鏈抗體、scFv、sdAb、sdFv、奈米抗體、肽抗體peptibody、結構域抗體(重鏈(VH)抗體、輕鏈(VL)抗體)和多特異性抗體(雙特異性抗體、diabody、triabody和tetrabody、串聯二-scFv、串聯三-scFv)，因而，本公開中使用的術語“抗體”包括全長抗體、其單個的鏈及其任意具有抗原結合活性的部分、結構域或片段以及包含其單個的鏈及任意具有抗原結合活性的部分、結構域或片段的多特異性抗體(包括但不限於抗原結
合結構域或片段，分別例如VHH結構域或VH/VL結構域)。傳統的抗體或免疫球蛋白通常是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ(kappa)鏈或λ(lambda)鏈。在一些實施例中，本公開的抗體特異性地或基本上特異性地結合到PVRIG和/或TIGIT。
本公開的“抗體”包括但不限於：(i)由VL、VH、CL和CH1結構域組成的Fab片段；(ii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iii)F(ab’)2片段，一種包含兩個連接著的Fab片段的二價片段；(vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中VH結構域和VL結構域藉由肽連接子連接，該肽連接子允許兩個結構域結合形成抗原結合位點；(Bird等人，1988，《科學(Science)》242：423-426；Huston等人，1988，《美國國家科學院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)》85：5879-5883)242，藉由引用完全併入本文中)；(iv)“雙功能抗體”或“三功能抗體”，藉由基因融合構造的多價或多特異性片段(Tomlinson等人，2000，《酶學方法(Methods Enzymol.)》326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，《美國美國國家科學院院刊》90：6444-6448，全部藉由引用完全併入本文中)；(v)“結構域抗體”或“dAb”(有時稱為“免疫球蛋白單一可變結構域”)，包括來自其它物種的免疫球蛋白單一可變結構域，如齧齒動物(例如，如WO00/29004中所公開)、護士鯊和駱駝科V-HH dAb；(vi)SMIP(小分子免疫藥物)、駱駝抗體、奈米抗體以及IgNAR；(vii)上述(i)-(vi)的人
源化抗體。
在未特殊指明的情況下，本公開的抗體通常使用Kabat編號系統。Kabat中的EU編號一般也用於恆定結構域和/或Fc結構域。
本公開的抗體可以是多株的、單株的、異種的、同種異體的、同基因的或其經過修飾的形式，其中單株抗體尤其適用於多個實施例中。一般來說，本公開的抗體是重組抗體。如本文所用的“重組”泛指例如細胞或核酸、蛋白質或載體等產品，表示該細胞、核酸、蛋白質或載體已經藉由引入異源核酸或蛋白質或改變天然核酸或蛋白質而加以修飾，或該細胞來源於如此修飾的細胞。例如，重組細胞表達天然(非重組)細胞形式內不存在的基因或表達原本異常表達、低表達或完全不表達的天然基因。
“單株抗體”和“單株抗體組成物”是指僅含有一個物種的能夠與特定抗原表位發生免疫反應的抗原結合位點的抗體分子群體，而“多株抗體”和“多株抗體組合物”是指含有多個物種的能夠與特定抗原相互作用的抗原結合位點的抗體分子群體。單株抗體組成物典型地對與其發生免疫反應的特定抗原展現出單一的結合親和力。
“抗原”指用於免疫接種免疫活性的脊椎動物的分子，以產生識別抗原的抗體，或篩選表達文庫(例如尤其是噬菌體、酵母或核糖體展示文庫)。在本文中，抗原被更廣義地定義，並且一般預期包括由抗體特異性識別的靶分子，因此包括用於產生抗體的免疫接種過程或用於選擇抗體的文庫篩選中使用的分子的一部分或模擬物。
“序列”(例如在“免疫球蛋白序列”、“抗體序列”、“單一可變結構域序列”、“VHH序列”或“蛋白序列”等的術語中)一般應理解為既
包括相關胺基酸序列，又包括編碼該序列的核酸序列或核苷酸序列，除非本公開需要進一步限定的解釋。
“多核苷酸”或“核酸”指任何長度的核苷酸鏈，包括DNA和RNA。核苷酸可為去氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經修飾的核苷酸或堿基和/或其類似物、或者可藉由DNA或RNA聚合酶摻入鏈內的任何底物。多核苷酸可包含經修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸及其類似物。如果存在的話，可在鏈組裝之前或鏈組裝之後賦予對核苷酸結構的修飾。多核苷酸還可含有本領域一般已知的核糖或去氧核糖糖的類似形式，包括例如2′-O-甲基-、2′-O-烯丙基、2′-氟-或2′-疊氮基-核糖、碳環糖類似物、α-或β-異頭糖、差向異構糖(如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖)、無環類似物和無堿基核苷類似物如甲基核糖苷。
“同源性”或“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同堿基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100%的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或同源，那麼兩個序列為60%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同源性百分率時進行比較。
多肽或蛋白的“結構域”是指折疊蛋白結構，其能夠獨立於蛋白的其餘部分維持其三級結構。一般而言，結構域負責蛋白的單個功能性質，且在許多情況下可添加、移除或轉移至其他蛋白而不損失蛋白的其餘部分和/或結構域的功能。
“免疫球蛋白結構域”是指抗體鏈(例如常規四肽鏈結構抗體的鏈或重鏈抗體的鏈)的球形區域，或是指基本上由這類球形區域組成的多肽。免疫球蛋白結構域的特徵在於其維持抗體分子的免疫球蛋白折疊特徵，其由排列在兩個β折疊中任選由保守二硫鍵穩定的約7個反平行β折疊股的2層夾層組成。
“免疫球蛋白可變結構域”是指基本上由本領域及下文中分別稱為“框架區1”或“FR1”、“框架區2”或“FR2”、“框架區3”或“FR3”、及“框架區4”或“FR4”的四個“框架區”組成的免疫球蛋白結構域，其中該框架區由本領域及下文中分別稱為“互補決定區1”或“CDR1”、“互補決定區2”或“CDR2”、及“互補決定區3”或“CDR3”的三個“互補決定區”或“CDR”間隔開。因此，免疫球蛋白可變結構域的一般結構或序列可如下表示為：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。免疫球蛋白可變結構域因具有抗原結合位點而賦予其對抗原的特異性。
“抗體框架(FR)”，是指可變結構域的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。
對於“CDR”的確定或定義，能夠藉由分辨抗體的結構和/或分辨抗體-配體複合物的結構來完成CDR的確定性描繪和包含抗體的結合位點的殘基的鑒定。這可藉由本領域技術人員已知的各種技術中的任一種，例如X射線晶體學來實現。多種分析方法可用於鑒定CDR，包括但不限於Kabat編號系統、Chothia編號系統、AbM編號系統、IMGT編號系統、接觸定義、構象定義。Kabat編號系統是用於編號抗體中殘基的標準並且通常用於鑒定CDR區域(參見例如Johnson&Wu，2000，Nucleic Acids Res.，28：214-8)。Chothia編號系統與Kabat編
號系統類似，但Chothia編號系統考慮了某些結構環區域的位置。(參見例如Chothia等，1986，J.Mol.Biol.，196：901-17；Chothia等人，1989，Nature，342：877-83)。AbM編號系統使用建模抗體結構的由Oxford Molecular Group生產的電腦程式集成套件(參見例如Martin等，1989，ProcNatl Acad Sci(USA)，86：9268-9272；“AbMTM，A Computer Program for ModelingVariable Regions of Antibodies，”Oxford，UK；Oxford Molecular，Ltd)。AbM編號系統使用知識資料庫和從頭開始方法的組合，從基本序列建模抗體的三級結構(參見Samudrala等，1999，在PROTEINS，Structure，Function and Genetics Suppl.，3：194-198中的“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined HierarchicalApproach”描述的那些)。接觸定義基於可用複雜晶體結構的分析(參見例如MacCallum等，1996，J.Mol.Biol.，5：732-45)。構象定義中，CDR的位置可鑒定為對抗原結合做出焓貢獻的殘基(參見例如Makabe等，2008，Journal ofBiological Chemistry，283：1156-1166)。另外其它的CDR邊界定義可能不嚴格遵循上述方法之一，但仍然與Kabat CDR的至少一部分重疊，儘管根據特定殘基或殘基組不顯著影響抗原結合的預測或實驗結果，它們可縮短或延長。如本文使用的，CDR可指藉由本領域已知的任何方法(包括方法的組合)定義的CDR。本文使用的方法可利用根據這些方法中的任一種定義的CDR。對於包含超過一個CDR的任何給定實施例，可根據Kabat、Chothia、延伸的、AbM、IMGT、接觸和/或構象定義中的任一個來定義CDR。
“免疫球蛋白單一可變結構域”通常用於指可以在不與其他可變結構域相互作用的情況下(例如在沒有如常規四鏈單株抗體的VH和VL結構域之間所需要的VH/VL相互作用的情況下)，形成功能性抗原結合位點的免疫球蛋白可變結構域(其可以是重鏈或輕鏈結構域，包括VH、VHH或VL結構域)。“免疫
球蛋白單一可變結構域”的實例包括奈米抗體(包括VHH、人源化VHH和/或駱駝化VH，例如駱駝化人VH)、IgNAR、結構域、作為VH結構域或衍生自VH結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)和作為VL結構域或衍生自VL結構域的(單結構域)抗體(諸如dAbsTM)。基於和/或衍生自重鏈可變結構域(諸如VH或VHH結構域)的免疫球蛋白單一可變結構域通常是較佳的。免疫球蛋白單一可變結構域的一個具體實例為如下文定義的“VHH結構域”(或簡稱為“VHH”)。
“VHH結構域”，亦稱為重鏈單域抗體、VHH、VHH抗體片段、VHH抗體、奈米抗體，是稱為“重鏈抗體”(即“缺乏輕鏈的抗體”)的抗原結合免疫球蛋白的可變結構域(Hamers-Casterman C，Atarbouch T，Muyldermans S，Robinson G，Hamers C，Songa EB，Bendahman N，Hamers R.：“Naturally occurring antibodies devoid of light chains”；Nature363，446-448(1993))。使用術語“VHH結構域”以將該可變結構域與存在於常規四肽鏈結構抗體中的重鏈可變結構域(其在本公開中稱為“VH結構域”)以及輕鏈可變結構域(其在本公開中稱為“VL結構域”)進行區分。VHH結構域特異性結合表位而無需其他抗原結合結構域(此與常規四肽鏈結構抗體中的VH或VL結構域相反，在該情況下表位元由VL結構域與VH結構域一起識別)。VHH結構域為由單一免疫球蛋白結構域形成的小型穩定及高效的抗原識別單元。術語“重鏈單域抗體”、“VHH結構域”、“VHH”、“VHH結構域”、“VHH抗體片段”、“VHH抗體”以及“結構域”(“Nanobody”為Ablynx N.V.公司，Ghent，Belgium的商標)可互換使用。“VHH結構域”包括但不限於經駱駝科動物產生的天然抗體，也可以是駱駝科動物產生的抗體後再經人源化的，也可以是經噬菌體體展示技術篩選獲得的。
如本領域中對於VH結構域及VHH結構域所公知的，各CDR中的胺
基酸殘基的總數可能不同，且可能不對應於由Kabat編號指示的胺基酸殘基的總數(即根據Kabat編號的一個或多個位置可能在實際序列中未被佔據，或實際序列可能含有多於Kabat編號所允許數目的胺基酸殘基)。這意味著一般而言，根據Kabat的編號可能對應或可能不對應於實際序列中胺基酸殘基的實際編號。其它的編號系統或編碼規則包括Chothia、IMGT、AbM。
VHH結構域中的胺基酸殘基的總數將通常在110至120範圍內，常常介於112與115之間。然而應注意較小及較長序列也可適於本公開所述的目的。
VHH結構域(單獨或作為較大多肽的一部分)提供許多優於使用常規VH及VL結構域、scFv或常規抗體片段(例如Fab-或F(ab’)2-片段)的顯著優勢：
-僅需要單一結構域以高親和力及高選擇性結合抗原，從而使得既不需要存在兩個單獨結構域，也不需要確保該兩個結構域以適當空間構象及構型存在(例如scFv一般需要使用經特別設計的接頭)；
-VHH結構域可由單一基因表達且不需要翻譯後折疊或修飾；
-VHH結構域可容易地改造成多價及多特異性格式；
-VHH結構域高度可溶且無聚集趨勢；
-VHH結構域對熱、pH、蛋白酶及其他變性劑或條件高度穩定，且因此可在製備、儲存或運輸中不使用冷凍設備，從而達成節約成本、時間及環境；
-VHH結構域易於製備且相對廉價，甚至在生產所需的規模上亦如此；
-VHH結構域與常規四肽鏈結構抗體及其抗原結合片段相比相對較小(大約15kDa或大小為常規IgG的1/10)，因此相比於常規四肽鏈結構抗體及
其抗原結合片段，顯示較高的組織滲透性且可以較高劑量給藥；
-VHH結構域可顯示所謂腔結合性質(尤其由於與常規VH結構域相比其延長的CDR3環)，從而可到達常規四肽鏈結構抗體及其抗原結合片段不可到達的靶及表位。
獲得結合特定抗原或表位的VHH的方法，先前已公開於以下文獻中：R.van der Linden et al.，Journal of Immunological Methods，240(2000)185-195；Li et al.，J Biol Chem.，287(2012)13713-13721；Deffar et al.，African Journal of Biotechnology Vol.8(12)，pp.2645-2652，17June，2009和WO94/04678。
“Fc變異體”或“變異體Fc”意指在Fc結構域中包含胺基酸修飾的蛋白質。本公開的Fc變異體根據構成其的胺基酸修飾來定義。因此，舉例來說，S228P或228P是相對於親本Fc多肽在位置228處具有脯胺酸取代的Fc變異體，其中編號是根據EU索引。WT胺基酸的身份可以不指明，在此情況下前述變異體稱為228P。
“人源化”的例子包括可將源自駱駝科的VHH結構域藉由以人常規四肽鏈結構抗體VH結構域中相應位置處存在的一個或多個胺基酸殘基置換原始VHH序列的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸殘基而“人源化”(本公開中亦稱為“序列優化”，除人源化外，“序列優化”也可涵蓋藉由提供VHH改良性質的一個或多個突變對序列進行的其他修飾，例如移除潛在的翻譯後修飾位點)。人源化VHH結構域可含有一個或多個完全人框架區序列，且在一些具體實施方案中，可含IGHV3的人框架區序列。“人源化”的又一例子包括將小鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體構架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量小鼠蛋白成分，從而誘導的強烈的抗
體可變抗體反應。人源化方法例如蛋白表面胺基酸人源化(resurfacing)及抗體人源化通用框架移植法(CDR grafting to a universal framework)，即將CDR“移植”於其他“支架”(包括但不限於人支架或非免疫球蛋白支架)上。適於該CDR移植的支架及技術在本領域中是已知的。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列資料庫(在網際網路www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。本公開的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。此外，為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。
“親和力成熟”的抗體，在一個或多個CDR中具有一個或多個變化，該變化導致對抗原的親和力相比於其各自的親本抗體有所增加。親和力成熟的抗體可藉由例如由以下所述的本領域中已知的方法來製備：Marks等人，1992，Biotechnology 10：779-783或Barbas等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci，USA 91：3809-3813.；Shier等人，1995，Gene 169：147-155；Yelton等人，1995，Immunol.155：1994-2004；Jackson等人，1995，J.Immunol.154(7)：3310-9；及Hawkins等人，1992，J.MoI.Biol.226(3)：889896；KS Johnson及RE Hawkins，“Affinity maturation of antibodies using phage display”，Oxford University Press 1996。
通常，本公開的抗體將以如於Biacore或KinExA或Fortibio測定中測量的較佳10-7至10-10莫耳/升(M)、更佳10-8至10-10莫耳/升、甚至更佳10-9至10-10或更低的解離常數(KD)，和/或以至少10-7M、較佳至少10-8M、更佳至少10-9M，更佳至少10-10M的締合常數(KA)結合所要結合的抗原(即PVRIG)。任何大於10-4M
的KD值一般都視為指示非特異性結合。抗原結合蛋白對抗原或表位的特異性結合可以以已知的任何適合方式來測定，包括例如本公開所述的表面等離子體共振術(SPR)測定、Scatchard測定和/或競爭性結合測定(例如放射免疫測定(RIA)、酶免疫測定(EIA)及夾心式競爭性測定。
“表位”或可互換使用的“抗原決定簇”指抗體的互補位所結合的抗原上的任何抗原決定簇。抗原決定簇通常包含分子的化學活性表面基團，例如胺基酸或糖側鏈，並且通常具有特定的三維結構特徵以及特定的電荷特徵。例如，表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸，其可以是“線性”表位或“構象”表位。在線性表位中，蛋白質與相互作用分子(例如抗體)之間的所有相互作用的點沿著蛋白質的一級胺基酸序列線性存在。在構象表位中，相互作用的點跨越彼此分開的蛋白質胺基酸殘基而存在。可使用本領域中熟知的許多表位定位技術鑒別給定抗原的表位(例如Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)，US4708871)。可使用本領域技術人員已知的常規技術，就與相同表位的結合競爭性篩選抗體。例如，可進行競爭和交叉競爭研究，以獲得彼此競爭或交叉競爭與抗原結合的抗體(高通量篩選方法如參見WO03/48731)。因此，可使用本領域技術人員已知的常規技術，獲得與本公開的抗體分子競爭結合PVRIG上的相同表位的抗體及其抗原結合片段。
“特異性結合”、“選擇性結合”是指抗體與預定的抗原上的表位結合。通常，當使用重組人PVRIG、TIGIT或其表位作為分析物並使用抗體作為配體，在儀器中藉由表面等離子體共振(SPR)技術測定時，抗體以大約低於10-7M或甚至更小的平衡解離常數(KD)與預定的抗原或其表位結合，並且其與
預定抗原或其表位結合的親和力是其與預定抗原(或其表位)或緊密相關的抗原之外的非特異性抗原(如BSA等)結合的親和力的至少兩倍。“識別抗原的抗體”在本文中可以與“特異性結合的抗體”互換使用。
“結合親和力”在本文中用作兩個分子(例如抗體或其部分與抗原)之間的非共價相互作用的強度量度，用於描述單價相互作用(固有活性)。兩個分子之間的結合親和力可藉由確定解離常數(KD)來量化。可藉由使用例如表面等離子共振(SPR)方法(Biacore)測量複合物形成和解離的動力學來確定KD。對應於單價複合物的結合和解離的速率常數分別被稱為結合速率常數ka(或kon)和解離速率常數kd(或koff)。KD藉由方程KD=kd/ka與ka和kd有關。解離常數的值可藉由眾所周知的方法直接確定(參見Caceci等人，1984，Byte 9：340-362；Wong&Lohman，1993，PNAS 90：5428-5432)。評估抗體針對靶抗原的結合能力的其它標準測定是本領域已知的，包括例如ELISA、蛋白質印跡、RIA和流式細胞術分析、以及本文其它地方例舉的其它測定。類似地，相互作用的特異性可藉由確定和比較目的相互作用(例如抗體和抗原之間的特異性相互作用)的KD值與非目的相互作用(例如已知不結合PVRIG的對照抗體)的KD值進行評價。在一些實施方案中，本公開的抗PVRIG抗體能夠與其靶結合的親和力比它與另一種非PVRIG分子結合的親和力大至少2倍、10倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1,000倍或10,000倍，這裡不屬於限制性定義。
“保守修飾”適用於胺基酸和核苷酸序列。對於特定的核苷酸序列，保守修飾是指編碼相同或基本相同的胺基酸序列的那些核酸的相互置換，或在核苷酸不編碼胺基酸序列的情況下，是指基本上相同的核苷酸序列。對於胺基酸序列，保守修飾是指具有類似特徵(例如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、
主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molec μ Lar Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。
“胺基酸突變”包括胺基酸取代、缺失、插入、修飾及其任意組合，以實現最終構建體，使得最終構建體擁有期望的特性，例如增強的穩定性、提高的活性。胺基酸序列缺失和插入包括胺基和/或羧基端缺失和胺基酸插入。較佳的胺基酸突變是胺基酸取代。為了改變例如抗PVRIG抗體的結合特性，可以將非保守性的胺基酸取代，即將一個胺基酸用具有不同結構和/或化學特性的另一種胺基酸替換。較佳的胺基酸取代包括用親水性胺基酸替換疏水性胺基酸。胺基酸取代包括由非天然存在的胺基酸或由20種標準胺基酸的天然存在的胺基酸衍生物(例如4-羥脯胺酸、3-甲基組胺酸、鳥胺酸、高絲胺酸、5-羥賴胺酸)替換。可以使用本領域中公知的遺傳或化學方法生成胺基酸突變，包括定點誘變、PCR、基因合成、化學修飾等方法。胺基酸突變可以發生在抗體的CDR區、FR區或Fc區。
對於Fc區的胺基酸突變，可以在本公開的抗體野生型的Fc序列上引入突變用於改變Fc介導的相關活性，該突變包括但不限於：a).改變Fc介導的CDC活性的突變；b).改變Fc介導的ADCC活性的突變；或c).改變FcRn介導的體內半衰期的突變(參見Leonard G Presta，Current Opinion in Immunology 2008，20：460-470；Esohe E.Idusogie et al.，J Immunol 2000，164：4178-4184；RAPHAEL A.CLYNES et al.，Nature Medicine，2000，Volume 6，Number 4：443-446；Paul R.Hinton
et al.，J Immunol，2006，176：346-356)。具體地，包括：對CH1的鉸鏈區進行修飾以使得鉸鏈區中的半胱胺酸殘基的數量發生改變，例如增加或減少(參見US5,677,425，此處全文引入)。引入使得與Fc γ RIIIa的結合增強的突變(以引起增強的ADCC)，使得與Fc γ RIIb的結合減弱的突變，例如236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、299T以及297N(參見US11/124,620、US6,737,056，此處全文引入)。進行Fc修飾以增加其生物半衰期，例如可以引入以下突變中的一種或多種：T252L、T254S、T256F(參見US6,277,375)：為了增加生物半衰期，可以在CH1或CL區內改變抗體以含有從IgG的Fc區的CH2結構域的兩個環獲得的挽救受體結合表位(參見US5,869,046、US6,121,022)；用於增加血清半衰期的額外突變，包括428L、434A、434S和428L/434S(參見US8,883,973號、US6,737,056、US7,371,826，此處全文引入)。藉由將至少一個胺基酸殘基替換來改變Fc區，從而改變抗體的效應子功能，例如可以將一個或多個選自胺基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的胺基酸替換，以使得抗體對效應配體的親和力改變，但是保留親本抗體的抗原結合能力。親和力改變了的效應配體可以是例如補體的Fc受體或C1組分(參見US5,624,821、US5,648,260，此處全文引入)。改變胺基酸位置231和239內的一個或多個胺基酸殘基，從而改變抗體固定補體的能力(參見WO 94/29351，此處全文引入)。藉由修飾以下位置處的一個或多個胺基酸來修飾Fc區以提高抗體介導抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的能力和/或提高抗體對Fc γ受體的親和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、
330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439(參見WO00/42072，全文引入)。此外，人類IgG1上關於Fc γ RI、Fc γ RII、Fc γ RIII和FcRn的結合位點已經映射並且具有改良結合的變異體已有描述(參見Shields，R.L.等人(2001)《生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)》276：6591-6604)。在位置256、290、298、333、334和339處的特異性突變顯示可改良與FcyRIII的結合。另外，以下組合突變體顯示可改良Fc γ RIII結合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S等突變改良了與FcRn的結合並且增加了抗體循環半衰期(參見Chan CA和Carter PJ(2010)《自然綜述免疫學(Nature Rev Immunol)》10：301-316)。
本公開的抗體的修飾包括聚乙二醇化(PEG化)或添加其它水溶性部分，以例如為了增強半衰期。“PEG化”是指至少一個PEG分子與另一個分子(例如治療性蛋白)連接。例如，PEG是在一端與羥基連接的直鏈或支鏈聚醚，並且具有下列常規結構：HO-(CH2CH2O)n-CH2CH2-OH。為了使PEG與分子(多肽、多糖、多核苷酸和小的有機分子)偶聯，可以藉由製備一些或兩個末端具有官能團的PEG的衍生物來活化PEG。蛋白的PEG綴合的常見途徑是用官能團活化PEG，該官能團適合與賴胺酸和N-末端胺基酸基團的反應。尤其是，參與綴合的常見反應基團是賴胺酸的α或ε胺基。聚乙二醇化連接基與蛋白的反應可導致PEG部分主要在下列位元點處的連接：蛋白的N-末端的α胺基、賴胺酸殘基側鏈上的ε胺基、或組胺酸殘基側鏈上的咪唑基。由於大部分重組蛋白質具有單個α和許多ε胺基和咪唑基，可以根據連接基團的化學性質，產生許多位置異構體。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。
比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端。藉由表達與人源抗原特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化、收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩，離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“給予”、“施用”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸，例如治療、藥物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”、“施用”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予受試者內用或外用治療劑，諸如包含本公開的任一種抗體或其醫藥組成物作為治療劑，該受試者已經患有、疑似患有、傾向於患有一種或多種增殖性疾病或其症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療受試者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，無論是藉由誘導這類症狀退化還是抑制這類症狀發展到任何臨床能測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如受試者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在受試者產
生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本公開的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解某個受試者中目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的受試者中應當減輕目標疾病症狀。
“有效量”包含足以改善或預防醫學病症的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於受試者的有效量可依據以下因素而變化：如待治療的病症、受試者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。本公開的受試者可以是動物或人類受試者。
“宿主細胞”包括各個細胞或細胞培養物，其可為或已是用於摻入多核苷酸插入片段的載體的受體。宿主細胞包括單個宿主細胞的子代，並且由於天然、偶然或有意的突變，子代可不一定與原始親本細胞完全相同(在形態學或基因組DNA互補體中)。宿主細胞包括用本公開的多核苷酸在體內轉染和/或轉化的細胞。“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括其後代。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。
“載體”意指能夠在宿主細胞中遞送並且在一些實施例中表達一種或多種目的基因或序列的構建體。載體的例子包括但不限於病毒載體、裸露
DNA或RNA表達載體、質粒、黏粒或噬菌體載體、與陽離子縮合劑結合的DNA或RNA表達載體、包封在脂質體中的DNA或RNA表達載體、以及某些真核細胞如生產細胞。
“任選”或“任選地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“任選包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述抗體或抗原結合片段或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
“藥學可接受的載體”或“藥學可接受的賦形劑”包括當與活性成分組合時，允許該成分保留生物學活性並且不與受試者的免疫系統反應的任何材料。例子包括但不限於任何標準藥物載體，例如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳劑如油/水乳劑、和各種類型的潤濕劑。在一些實施例中，用於氣霧劑或腸胃外施用的稀釋劑是磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)或生理(0.9%)鹽水。包含此類載體的組合物藉由眾所周知的常規方法配製(參見例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，A.Gennaro，編輯，Mack PublishingCo.，Easton，PA，1990；以及R Remington，The Science and Practice of Pharmacy第20版Mack Publishing，2000)。
本公開的“PVRIG結合蛋白”或“PVRIG抗體”可以例如綴合的方式包含一個或多個效應分子。該“效應分子”包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白(例如酶)、其它抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段(例如DNA、RNA及其片段)、放射性核素，特別地放射性碘化物、
放射性同位素、螯合金屬、納米顆粒和報導基團例如螢光化合物或可藉由NMR或ESR光譜分析檢測的化合物。當效應分子是聚合物時，其通常可以是合成或天然存在的聚合物，例如任選地取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化亞烷基聚合物或分支多糖或未分支多糖，例如同聚或異聚多糖。可存在於上述合成聚合物上的具體的任選取代基包括一個或多個羥基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具體實例包括任選地取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(乙烯醇)或其衍生物，特別地任選地取代的聚(乙二醇)例如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。具體的天然存在的聚合物包括乳糖、直鏈澱粉、葡聚糖、糖原或其衍生物。在一個實施方案中，聚合物是白蛋白或其片段，例如人血清白蛋白或其片段。聚合物與PVRIG結合蛋白或PVRIG抗體的綴和方式可以藉由常規方法實現。
以下結合實施例用於進一步描述，但這些實施例並非限制的範圍。
實施例或測試例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。參見Sambrook等，分子選殖，實驗室手冊，冷泉港實驗室；當代分子生物學方法，Ausubel等著，Greene出版協會，Wiley Interscience，NY。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. PVRIG蛋白質序列及製備
帶his標籤的人PVRIG(h-PVRIG-his)重組蛋白、帶小鼠IgG2a的Fc標籤的人PVRIG(h-PVRIG-mIgG2a Fc)重組蛋白、帶人IgG1的Fc標籤的小鼠PVRIG(m-PVRIG-hIgG1 Fc)為購買自Acrobiosystems公司的純化商業蛋白試劑，其序列見表1。
表1. 重組蛋白質的胺基酸序列
帶his標籤的食蟹猴PVRIG(cyno-PVRIG-his)重組蛋白序列如下：
TPEVWVQVQMEATELSSFTVHCGFLGPGSISLVTVSWGGPDGAGGTKLAVLHPELGTRQWAPARQARWETQSSISLALEDSGASSPFANTTFCCKFASEPEGSWESCGSLPPSSDPGLSAPPTPVPILRADHHHHHH (SEQ ID NO：1)
在HEK293細胞中藉由常規方法進行暫態轉染表達重組蛋白，收集上清並藉由Ni-NTA進行純化。經檢測，獲得cyno-PVRIG-his。
實施例2. 抗人PVRIG單域抗體的產生
抗人PVRIG單株單域抗體藉由免疫駱駝產生。免疫抗原為帶his標籤的人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-his)。用弗氏佐劑(Sigma，Lot No.：F5881/F5506)乳化：首次用弗氏完全佐劑(CFA)CFA，其餘加強免疫用弗氏不完全佐劑(IFA)。免疫注射時間為第0，14，28，42天。於第56天采血進行血檢，用ELISA方法檢測駱駝血清，確定駱駝血清中的抗體滴度。
取200mL駱駝外周血，分離其中的PBMC，用Trizol提取細胞中的RNA，並反轉錄成cDNA。用PCR的方法擴增單域抗體可變區的基因，選殖到噬菌體載體中，從而建立抗人PVRIG單域抗體的噬菌體文庫。
將噬菌體文庫用BSA稀釋封閉，與磁珠Dynabeads(M-280,
invitrogen)共孵育，收集負篩孵育後的噬菌體。用生物素標記的帶有his標籤的人PVRIG包被封閉Dynabeads，將負篩後收集的噬菌體懸液與該Dynabeads孵育，用胰酶沖提噬菌體。經過3輪篩選，挑選第3輪篩選獲得的400個純株進行測序，其中5株單域抗體的重鏈序列如表2所示，不同編碼規則的CDR如表3所示。
表2. 抗PVRIG抗體重鏈可變區(HCVR)序列
表3. 抗PVRIG抗體的重鏈互補決定區(CDR)序列
實施例3. 全長抗PVRIG抗體的製備
將實施例2中5個抗體的重鏈可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，構造形成全長抗PVRIG抗體。其中重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P，F234A，L235A，K447A突變(Eu命名系統)。WO2016134333中所示的抗PVRIG抗體CPA.7.021篩選自抗體噬菌體庫，其亞型為IgG1，能與人PVRIG較好結合，對食蟹猴PVRIG則無結合。將CPA.7.021的重鏈和輕鏈可變區，分別與人IgG4重鏈恆定區(帶有S228P，F234A，L235A，K447A突變)和人Kappa輕鏈恆定區連接，構建陽性抗體Tab5。
5個抗體和陽性抗體的全長序列如表4所示。
表4. 全人源抗PVRIG抗體的重輕鏈全長序列
(註：底線為重鏈的Fc結構域)
合成上述序列，用BamHI和XhoI消化後，藉由BamHI/XhoI酶切位點插入到pcDNA3.1表達載體(Life Technologies Cat.No.V790-20)中。將表達載體和轉染試劑PEI(Polysciences，Inc.Cat.No.23966)以1：2的比例轉染HEK293細胞
(Life Technologies Cat.No.11625019)，並置於CO2孵育箱中孵育4-5天。表達的抗體藉由離心回收後，按常規方法進行抗體純化，經檢測，獲得目的抗體。
實施例4. 抗PVRIG抗體與PVRIG重組蛋白的結合實驗
ELISA實驗被用來檢測抗PVRIG抗體的結合特性。用直接包被帶his標籤的PVRIG重組蛋白，抗體加入後，藉由加入二抗(HRP偶聯的抗一抗Fc的抗體)和HRP底物TMB檢測抗體與抗原結合的活性。
人、食蟹猴或小鼠PVRIG蛋白包被96孔酶標板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍，每孔250μL。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。加入300μL/孔封閉液(PBS+0.05% Tween20+1% BSA)室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μL。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。每孔加100μL用稀釋液稀釋好的抗PVRIG待測抗體。37℃孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μL。每孔加入100μL HRP標記的抗人IgG二抗(Sigma，A8667)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μL。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50μL每孔的0.16M硫酸。Thermo M μ LtiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗PVRIG抗體對PVRIG的結合EC50值。所有抗體均對人或食蟹猴的PVRIG重組蛋白有較強的結合能力，但不結合小鼠PVRIG重組蛋白。
表5. 抗PVRIG抗體對不同種系PVRIG重組蛋白的結合實驗結果
實施例5. 抗PVRIG抗體與表達PVRIG的細胞結合實驗
用流式細胞儀(FACS)來檢測抗PVRIG抗體的結合特性。構建過表達人或食蟹猴PVRIG的細胞株，抗體加入後，藉由加入二抗檢測抗體與抗原結合的活性。
將帶有人或食蟹猴PVRIG基因序列的表達質粒在HEK293細胞中進行轉染，並用抗生素篩選和無限稀釋法獲得過表達穩定轉染單株細胞株。在96孔板中每孔接種2x105個過表達細胞。300g離心5分鐘，去除上清，加入100μL待測抗體，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次，加入100μL 1：500稀釋的用Alexa Fluor 488標記的抗人IgG二抗(Invitrogen，A-11013)，4℃孵育1小時。離心去除上清，用200μL洗液(PBS+2% FBS)洗滌3次。用100μL PBS重新懸浮細胞，用流式細胞儀(BD FACS Calibur或BD FACS Canto_II)檢測。所有抗體均對細胞表面表達的人或食蟹猴的PVRIG有較強的結合能力，明顯強於陽性抗體Tab5，而Tab5甚至完全不結合食蟹猴PVRIG。
表6. 抗PVRIG抗體對不同種系PVRIG的細胞結合實驗結果
(註：N.A.，not available，表示結合太強，在低濃度條件下抗體亦不發生解離，無法擬合得到準確的EC50。)
實施例6. 抗PVRIG抗體阻斷PVRIG和PVRL2結合實驗
本實驗中，藉由體外阻斷實驗，檢測所篩選出來的抗PVRIG抗體阻斷人PVRIG和其配體人PVRL2的結合能力。具體方法是將帶小鼠IgG2a Fc標籤的人PVRIG重組蛋白(h-PVRIG-mIgG2a Fc)包被到96孔酶標板上，加入抗PVRIG抗體充分結合佔據表位後，再加入帶his標籤的PVRL2(PV2-H52E2，AcroBiosystem)，藉由檢測his標籤，來計算PVRIG與PVRL2的結合量，計算抗PVRIG抗體對PVRIG活性位點阻斷的IC50值。
h-PVRIG-mIgG2a Fc蛋白包被96孔酶標板，按1μg/mL濃度每孔100μL，4℃孵育過夜。洗液洗三遍，每孔250μL。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。加入300μL/孔封閉液室溫孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μL。每次洗滌震盪10秒以保證充分清洗。每孔加50μL稀釋好的抗PVRIG待測抗體和50μL帶
his標籤的配體PVRL2，37℃孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μL。每孔加入100μL按1：2000倍稀釋的用HRP標記的抗his標籤的二抗(Genscrpit)。37℃孵育1小時。洗液洗三遍，每孔250μL。每孔加入100μL TMB，避光反應15分鐘。加入50μL每孔的0.16M硫酸。Thermo M μ LtiSkanFc酶標儀讀取450nm OD值，計算抗PVRIG抗體對PVRIG與PVRL2結合阻斷的IC50值。
結果顯示，所有檢測抗體均可以強烈抑制人PVRIG與人PVRL2的結合。
表7. 抗體對人PVRIG/PVRL2結合的阻斷實驗
實施例7. 抗PVRIG抗體與PVRIG的親和力測定
將Protein A生物感測器(Fortebio，#18-5010)浸泡在200μL的KB緩衝液(PBS，pH 7.4，0.02% tween-20，0.1% BSA)中60秒，進行濕潤處理。然後，用KB緩衝液將抗PVRIG抗體稀釋到10μg/mL，將感測器置於200μL該溶液
中，待讀數為1.2nm時停止。將感測器浸泡於KB緩衝液中100秒，以沖提多餘的抗體。將帶有his標籤的人PVRIG用KB緩衝液以2倍梯度稀釋至64nM-4nM之間。將感測器置於該溶液中結合300秒。將感測器置於KB緩衝液中解離600秒。採用動態1：1結合方式擬合，則抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力如表8所示。
結果顯示，所有檢測抗體均具有與人PVRIG的高親和力。
表8. 抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力
實施例8. 抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗
首先，構建plvx-OS8(G418抗性)質粒，轉染293F細胞，G418篩選，用流式細胞儀檢測純株細胞OS8的表達同時檢測OS8對Jurkat細胞的啟動，選擇啟動程度中等的純株，得到293F-OS8細胞株；構建plvx-PVRL2質粒，用它感染293F-OS8細胞，用流式細胞儀篩選出PVRL2表達量最高的純株，從而得到293F-OS8-PVRL2細胞株。
其次，構建plvx-NFAT-Luc(Hygromycin抗性)，包裝成慢病毒，感染Jurkat E6.1細胞，加Hygromycin篩選出有抗性的純株，用OKT3去刺激純株，篩選
出Luciferase信號中等的純株，得到Jurkat-NFAT-Luc細胞系；構建plvx-PVRIG(Puromycin抗性)載體，包裝成慢病毒，感染Jurkat-NFAT-Luc細胞，經流式細胞儀篩選出PVRIG表達量最高的純株，從而得到Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞株。
將1E4個Jurkat-NFAT-Luc-PVRIG細胞與待測抗體在37℃孵育20分鐘。加入1E5個293F-OS8-PVRL2細胞，37℃孵育5小時。離心去除上清，加入Luciferase緩衝液(Promega，E6130)裂解細胞，檢測螢光值。計算EC50值評價抗PVRIG抗體的體外細胞活性。實驗結果如圖1和表9所示。
結果顯示，所有檢測抗體均有較強的啟動Jurkat細胞中Luciferase的能力，活性是陽性抗體的3.7-18.5倍，證明這些抗體可以結合PVRIG並阻斷PVRL2與PVRIG的結合。
表9. 抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗結果
實施例9. 抗PVRIG抗體的NK細胞殺傷實驗
PVRIG在NK細胞上表達，而PVRL2在很多腫瘤細胞(包括K562細
胞)中表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除腫瘤細胞對NK細胞活性的抑制作用。
將培養的NK92細胞系(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的NK細胞)用洗液(包括RPMI 1640，5% FBS，10ng/mL IL-2)洗滌兩次，並重新懸浮至2×106個/mL的密度。在96孔板中每孔加入50μL(總計1×105個)NK92細胞。加入50μL 20nM或100nM待測抗體，37℃孵育30分鐘。用洗液洗滌兩次，重新懸浮至2×105個/mL的密度。加入50μL(總計1×104個)的人慢性髓系白血病K562細胞，使得NK92細胞與K562細胞個數的比例為10：1。37℃孵育4小時。使用CytoTox-Glo細胞毒性系統(Promega，G9292)對殺傷活性進行測量。首先加入50μL AAF-Glo試劑，室溫孵育15分鐘，測量被NK92細胞殺死的K562細胞的螢光。再加入50μL裂解液，室溫孵育15分鐘，裂解孔中所有細胞，測量所有細胞的螢光。準備三種對照組，分別是只包括培養液的樣品(對照組一)，只包括NK92細胞的樣品(對照組二)，150μL只包括K562細胞的樣品(對照組三)，進行同樣的操作。
根據如下公式，計算殺傷活性：
殺傷活性(%)={[(R-BG)-(T-BG)-(E-BG)]/[(TL-BGL)-(T-BG)]}×100
其中，R為加入AAF-Glo後的螢光值，BG為對照組一在加入AAF-Glo的螢光值，E為對照組二在加入AAF-Glo的螢光值，T為對照組三在加入AAF-Glo的螢光值；TL為對照組三在加入裂解液後的螢光值，BGL為對照組一再加入裂解液後的螢光值。
實驗結果如圖2和表10所示，表明所有檢測的抗PVRIG抗體均可以明顯的啟動NK92細胞、殺傷K562細胞。
表10. 抗PVRIG抗體的NK細胞殺傷實驗
實施例10. 抗PVRIG抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗
PVRIG在T細胞上表達，而PVRL2在樹突狀細胞(DC細胞)中表達。抗PVRIG抗體可以藉由阻斷PVRL2與PVRIG的結合，解除樹突狀細胞對T細胞的抑制作用，活化T細胞。
混合淋巴細胞反應，是指兩個無關個體、功能正常的淋巴細胞在體外混合培養時，由於主要組織相容性抗原不同，可相互刺激對方的T細胞發生增殖。從第一個個體來源的外周血中分離PBMC，將細胞培養於含10% FBS的RPMI 1640培養基中，以50ng/mL GM-CSF(Peprotech，300-03-100UG)和50ng/mL IL-4(Peprotech，200-04-100UG)的終濃度添加細胞因子，每2-3天添加含細胞因子的新鮮培養基；培養6天後，加入1μg/mL LPS(Sigma，L2880-25MG)孵育24小時，收集分化成熟得到的DC細胞。從第二個來源的外周血中分離PBMC，使
用EasySep人CD3+T細胞分離試劑盒(Stemcell，17952)從中分離CD3+ T細胞。調整CD3+ T細胞和DC細胞的密度，使得每孔加入1×105個CD3+T細胞和2×104個DC細胞。加入待測抗體，37℃孵育120h，取上清，用ELISA試劑盒(R&D，DY202)檢測上清中的IFN γ含量。
實驗結果如圖3和表11所示，表明，相比對照抗體IgG4，所有檢測抗PVRIG抗體均可以明顯的啟動T細胞分泌IFN γ。並且，在低劑量(如4nM、20nM)時，本公開的抗體較之陽性對照Tab5的效果更優。
表11. 抗PVRIG抗體混合淋巴細胞反應IFN γ分泌量
實施例11. 抗PVRIG抗體的人源化改造
在所獲得的駱駝單域抗體20、抗體30、抗體38、抗體39和抗體151的VH典型結構的基礎上，將重鏈可變區序列與抗體GermLine資料庫比較，獲得同源性高的人種系範本。將駱駝單域抗體的框架區替換為人種系範本的重鏈框架區，CDR(根據Kabat編號系統)保留，再與人源IgG的Fc區域(帶有S228P，
F234A，L235A，K447A突變的IgG4 Fc)重組。以駱駝單域抗體的三維結構為基礎，對包埋殘基、與CDR區有直接相互作用的殘基，以及對可變區的構象有重要影響的殘基進行回復突變，並對CDR區化學不穩定胺基酸殘基優化，產生一系列人源化單域抗體。各個單域抗體的人種系範本以及人源化抗體重鏈可變區序列如表12-16所示。
表12. 抗體20的人種系範本和人源化抗體序列
根據表12，抗體20H1-20H5包含如TDCMG(SEQ ID NO：7)所示的CDR1，如HIDSDGIPRYVDSVKG(SEQ ID NO：8)所示的CDR2，和如GFKFDEDYCAPND(SEQ ID NO：150)所示的CDR3。
表13. 抗體30的人種系範本和人源化抗體序列
根據表13，抗體30H1-30H5包含如GDCMG(SEQ ID NO：10)所示的CDR1，如TIDNAGRIKYADSVKG(SEQ ID NO：11)所示的CDR2，如
GWTFGGQCSPAD(SEQ ID NO：151)所示的CDR3。
表14. 抗體38的人種系範本和人源化抗體序列
表15. 抗體39的人種系範本和人源化抗體序列
表16. 抗體151的人種系範本和人源化抗體序列
將上述人源化抗體重鏈可變區與人IgG4重鏈Fc區域連接，構造形成全長抗PVRIG抗體。其中重鏈Fc區域包括鉸鏈(hinge)區，並帶有S228P、F234A、L235A、K447A突變。
>人IgG4重鏈Fc區域(S228P/F234A/L235A/K447A)
>人IgG4重鏈Fc區域(S228P/K447A)
按常規方法進行抗體的表達和純化，經檢測，得到目的抗體。
實施例12. 人源化抗PVRIG抗體與表達PVRIG的細胞結合實驗
依照實施例5的方法，用流式細胞儀檢測人源化抗PVRIG抗體與人或食蟹猴PVRIG的結合。實驗結果如表17所示。
表17. 人源化抗PVRIG單域抗體對不同種系PVRIG的FACS結合實驗結果
(註：N.T.，not tested，未測試。)
實施例13. 人源化抗PVRIG抗體與PVRIG的親和力測定
依照實施例7的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力。結果如表18所示。表中列出的所有抗體均具有與人PVRIG的高親和力。
表18. 人源化抗PVRIG抗體與人PVRIG的親和力
實施例14. 人源化抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗
依照實施例8的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體在報告基因細胞中的活性。實驗結果如圖4A及圖4B和表19所示。表中列出的抗體均具有啟動Jurkat細胞的能力。
表19. 人源化抗PVRIG抗體報告基因細胞活性實驗
實施例15. 人源化抗PVRIG抗體的活化NK細胞殺傷能力實驗
依照實施例9的方法，檢測人源化抗PVRIG抗體對NK細胞的活化能力。實驗結果如圖5A及圖5B和表20-表21所示。結果顯示，本公開人源化抗PVRIG抗體都有明顯的活化NK細胞的能力，促進NK細胞對於靶細胞K562的殺傷。
表20. 人源化抗PVRIG抗體的NK細胞殺傷實驗
表21. 人源化抗PVRIG抗體的NK細胞殺傷實驗
實施例16. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的製備
為探索不同構造的抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對抗體功能的影
響，將抗PVRIG單域抗體151藉由GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：152)連接子與抗TIGIT抗體1708的重鏈或輕鏈的N端或C端相連。形成4個抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體，命名為1708-151-1、1708-151-2、1708-151-3、1708-151-4，分別對應151被連接在1708的重鏈N端、重鏈C端、輕鏈N端和輕鏈C端。抗TIGIT抗體1708採用人IgG4亞型，並帶有S228P(Eu命名系統)的突變。抗TIGIT抗體1708和其與151形成的雙特異性抗體序列如下表22所示，抗TIGIT抗體序列資訊如表23-24所示。此處全文引入WO2019062832A中的TIGIT抗體。
表22. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的第一、第二多肽鏈序列
表23. 抗TIGIT抗體重鏈及輕鏈CDR區序列(Kabat編號規則)
表24. 抗TIGIT抗體重鏈VH及輕鏈VL序列
按常規方法進行抗體的暫態轉染、表達和純化，經鑒定，得到本公開的全長抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體。雙特異性抗體的表達量和純度如表25所示。將奈米抗體偶聯到普通單株抗體上，無論是重、輕鏈的N端還是C端，均
顯示了良好的表達量和純度。
表25. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的表達量和純度
實施例17. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與PVRIG和TIGIT的結合以及對相應配體的阻斷實驗
不同質性的雙特異性抗體與人PVRIG的結合及對配體PVRL2的阻斷
依照實施例4、實施例5和實施例6的方法，進行實驗，結果如表26所示。結果表明，不同質性的雙特異性抗體，與人PVRIG重組蛋白和過表達人PVRIG細胞的結合，以及對PVRL2結合PVRIG的阻斷，基本一致、無差異。
表26. 雙特異性抗體對PVRIG的結合和配體阻斷
不同質性的雙特異性抗體與人TIGIT的結合及對配體PVR的阻斷
依照實施例4、實施例5和實施例6的方法(相應的受體和配體換為人TIGIT和人PVR)，進行實驗，結果如表27所示。結果表明，不同質性的雙特異性抗體和抗TIGIT抗體，與人TIGIT重組蛋白和過表達人TIGIT細胞的結合，以及對TIGIT結合其配體PVR的阻斷，基本一致、無差異。抗PVRIG抗體151的連接方式對於抗TIGIT抗體與TIGIT的結合基本無影響。
表27. 雙特異性抗體對TIGIT的結合和配體阻斷
綜合表24-25的資料，我們發現抗PVRIG抗體無論是連接到抗TIGIT抗體的重、輕鏈的N端或C端，都保持了對PVRIG和TIGIT的結合和配體的阻斷，並且都顯示了良好的表達量、純度。
實施例18. 人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的製備
將不同的人源化抗PVRIG抗體(20H5、30H2、39H2、151H7、151H8)連接到抗TIGIT抗體1708的重鏈N端，即採用1708-151-1類似的雙特異性抗體構造，構建雙抗，序列如表28所示。
表28. 人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的第一和第二多肽鏈全長序列
按常規方法進行抗體的暫態轉染、表達和純化，經鑒定，得到目的雙抗。
實施例19. 人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體與PVRIG和TIGIT的結合以及對相應配體的阻斷
依照實施例4、5、6的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人和食蟹猴PVRIG的結合，對人PVRIG的配體阻斷。結果如表29和圖6A至圖6E所示。結果表明，各個人源化雙特異性抗體，均可以結合人PVRIG，阻斷PVRIG結合PVRL2。1708-151H8對食蟹猴PVRIG結合較弱。
表29. 人源化雙特異性抗體對PVRIG的結合和配體阻斷
與實施例4、5、6類似地，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對人和食蟹猴TIGIT的結合，對人TIGIT與配體結合的阻斷，其中將PVRIG蛋白替換為TIGIT，並將PVRL2替換為PVR。結果如表30和圖7A至圖7E所示。結果表明，各雙抗均可以結合人和食蟹猴TIGIT，阻斷TIGIT結合PVR。
表30. 人源化雙特異性抗體對TIGIT的結合和配體阻斷
利用Biacore檢測人源化雙特異性抗體與人PVRIG，食蟹猴PVRIG，和人TIGIT的親和力。將人源化雙特異性抗體捕獲於Biacore儀器(Biacore X100，GE)的Protein A生物傳感晶片(GE lifesciences，29127557)上，然後於晶片表面流經一系列濃度梯度下的人PVRIG抗原(AcroBiosystem，PVG-H52H4)，食蟹猴PVRIG抗原(SEQ ID NO：1)，或人TIGIT抗原(AcroBiosystem，TIT-H52H3)。
利用Biacore儀器(Biacore X100，GE)即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。實驗得到的資料用BiacoreX100 evaluation software2.0 GE軟體以(1：1)Binding模型進行擬合，得出親和力數值，見表31。
表31. 人源化雙特異性抗體與人PVRIG，食蟹猴PVRIG，和人TIGIT的親和力
實施例20. 人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的混合淋巴細胞反應(MLR)實驗
依照實施例10的方法，檢測人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對T細胞的活化能力。實驗結果如圖8和表32所示。結果顯示，人源化抗PVRIG/TIGIT
雙特異性抗體1708-151H8具有明顯的活化T細胞的能力，促進T細胞分泌IFN γ。重要的是，雙特異性抗體的活性強於單用抗PVRIG抗體151H8，單用抗TIGIT抗體1708。
表32. 人源化雙特異性抗體混合淋巴細胞反應IFN γ分泌量
實施例21. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在人黑色素瘤A375混合人PBMC的小鼠皮下移植瘤模型中的抗腫瘤作用評估
為進一步探究雙特異性抗體亞型在動物藥效中的作用，除了上述IgG4亞型的雙特異性抗體，我們也合成了相應的IgG1亞型的抗體，用於動物藥效試驗。在該實驗中用到的其他之前未描述的抗體序列如表33。
表33. IgG1型人源化抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體的第一和第二多肽鏈全長序列
NCG小鼠，雌性，4-8週，體重約18-22g，購自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。所有的NCG小鼠按照SPF級動物房IVC恆溫恆壓系統條件培養。
A375細胞培養在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養液中。收集指數生長期的A375細胞，HBSS重新懸浮至適合濃度用於NCG小鼠皮下腫瘤接種。共培養所用的A375細胞需經過Mitomycin C處理2h後，PBS洗三次。取正常人外周血，用密度梯度離心法分離人PBMC，計數。然後用RPMI1640培養基(含IL2和10% FBS)將PBMC重新懸浮至3×106個/mL的濃度，與Mitomycin C處理後的A375細胞共培養。共培養6天後，收取PBMC，同時收取新鮮消化下來的A375細胞。每隻老鼠接種：PBMC 5×105個，A375細胞4×106個；接種體積：0.2mL/隻(含50% Matrigel)；接種於雌性NCG小鼠右側皮下。根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表34，分組給藥當天為第0天。由於抗PVRIG抗體和抗TIGIT抗體的分子量不同，該給藥劑量保證了抗PVRIG抗體與抗TIGIT抗體擁有同樣的起始莫耳濃度。
表34. 給藥方案
(註：N：使用動物數量；i.p.：腹腔注射；Q2D：兩天一次；給藥體積：根據荷瘤鼠體重調整給藥體積(0.1mL/10g)。)
給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表35-36和圖9A及圖9B。
表35. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體對小鼠體重的影響
表36. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在小鼠人源A375腫瘤模型中的抑瘤效果
(註：與對照組(hIgG1)組比較，×P<0.05，××P<0.01，×××P<0.001即認為具有顯著性差異。)
實驗結束時(給藥後第26天)，與對照組相比，抗PVRIG抗體151單藥組沒有明顯差異。抗TIGIT抗體1708-IgG1單藥組，抗PVRIG抗體151與抗TIGIT抗體1708-IgG1聯用組，1708-151-IgG1雙抗組，腫瘤體積下降。而1708-151-IgG4雙抗組甚至可以完全抑制腫瘤的生長，與其它組間具有顯著性差異(見圖9B)。
根據小鼠體重隨機進行分組給藥，詳細的給藥方法、給藥劑量和給藥途徑見表37，分組給藥當天為第0天。
表37. 給藥方案
(註：N：使用動物數量；i.p.：腹腔注射；Q2D：兩天一次；給藥體積：根據荷瘤鼠體重調整給藥體積(0.1mL/10g)。)
給藥開始後，小鼠每週2次測量體重及腫瘤體積。實驗結果分別見表38-39和圖10A及圖10B。
表38. 抗P RIG/TIGIT雙特異性抗體對小鼠體重的影響
表39. 抗PVRIG/TIGIT雙特異性抗體在小鼠人源A375腫瘤模型中的抑瘤效果
(註：與對照組(hIgG1)組比較，×P<0.05，××P<0.01，×××P<0.001即認為具有顯著性差異。)
實驗結束時(給藥後第28天)，與對照組相比，1708-30H2 IgG4與1708-151H7 IgG4雙抗組均可以在低劑量下有效抑制腫瘤生長，與對照組間具有顯著性差異(見圖10A和圖10B)。
雖然以上描述了本公開的具體實施方式，但是本領域的技術人員應當理解，這些僅是舉例說明，在不背離本發明的原理和實質的前提下，可以對這些實施方式做出多種變更或修改。因此，本公開的保護範圍由所附申請專利範圍限定。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司(JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD.)
上海盛迪醫藥有限公司(SHANGHAI SHENGDI PHARMACEUTICAL CO.,LTD.)
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<170> Patentfn version 3.5
<210> 1
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> his1PVRIG(cyno-PVRIG-his)
<400> 1
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20-HCVR
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 30-HCVR
<400> 3
<210> 4
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38-HCVR
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 39-HCVR
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 11
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 30 HCDR3
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<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38 HCDR1
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<210> 14
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38 HCDR2
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38 HCDR3
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 17
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 39 HCDR2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<400> 21
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 20 HCDR3 CHO
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 30 HCDR1 CHO
<400> 25
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 30 HCDR2 CHO
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<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 30 HCDR3 CHO
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<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38 HCDR1 CHO
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<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38 HCDR2 CHO
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<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 38 HCDR3 CHO
<400> 30
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 39 HCDR2 CHO
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<210> 33
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
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<220>
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<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 151 HCDR3 CHO
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<220>
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<223> 20 HCDR3
<400> 150
<210> 151
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 30 HCDR3
<400> 151
<210> 152
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 蟀諉赽
<400> 152
<210> 153
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IgG4笭蟈Fc郖ㄗ S228P/K447A ㄘ
<400> 153
Claims (21)
- 一種PVRIG結合蛋白，其包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：SEQ ID NO：3、80-84任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：2、75-79任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：4、86-90任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：5、91-95任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：6、96-100任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；該CDR1、CDR2和CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；較佳地，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、11和12或151所示；或如SEQ ID NO：7、8和9或150所示；或如SEQ ID NO：13、14和15所示；或如SEQ ID NO：16、17和18所示；或如SEQ ID NO：19、20和21所示。
- 如請求項1所述的PVRIG結合蛋白，其中該PVRIG結合蛋白的免疫球蛋白單一可變結構域為VHH，較佳為人源化的和/或經親和力成熟的VHH；更佳地，該人源化的和/或經親和力成熟的VHH包含人種系範本的重鏈框架區IGHV3-7 *01或IGHV3-30 *02。
- 如請求項1或2所述的PVRIG結合蛋白，其中該免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、80-84中任一所示；或SEQ ID NO：2、75-79中任一所示；或SEQ ID NO：4、86-90中任一所示；或SEQ ID NO：5、91-95中任一所示；或SEQ ID NO：6、96-100中任一所示；或與前述序列任一具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。
- 如請求項1至3中任一項所述的PVRIG結合蛋白，其還包含人免疫球蛋白Fc區；較佳地，該Fc區是人IgG1或IgG4的Fc區；更佳地，該人IgG4的Fc區具有S228P、F234A、L235A和/或K447A突變。
- 一種PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域和特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域，該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域包含至少一個免疫球蛋白單一可變結構域，該免疫球蛋白單一可變結構域包含：SEQ ID NO：3、80-84任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：2、75-79任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：4、86-90任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；或SEQ ID NO：5、91-95任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3：或SEQ ID NO：6、96-100任一所示序列中的CDR1、CDR2和CDR3；該CDR1、CDR2、CDR3是根據Kabat、IMGT、Chothia、AbM或Contact編號系統定義的；較佳地，根據Kabat編號系統，該免疫球蛋白單一可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：10、11和12或151所示：或如SEQ ID NO：7、8和9或150所示；或如SEQ ID NO：13、14和15所示；或如SEQ ID NO：16、17和18所示；或如SEQ ID NO：19、20和21所示。
- 如請求項5所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中該第一抗原結合結構域中的免疫球蛋白單一可變結構域的胺基酸序列分別如SEQ ID NO：3、80-84中任一所示；或SEQ ID NO：2、75-79中任一所示；或SEQ ID NO：4、86-90中任一所示；或SEQ ID NO：5、91-95中任一所示；或SEQ ID NO：6、96-100中任一所示；或與前述序列任一具有至少80%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%的序列同一性。
- 如請求項5或6中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：121、122和123所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：124、125和126所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：115、116和117所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：118、119和120所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：127、128和129所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：130、131和132所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：133、134和135所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：136、137和138所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或該重鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：139、140和141所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，該輕鏈可變區包含分別如SEQ ID NO：142、143和144所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
- 如請求項7所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區包含如SEQ ID NO：145-147中任一所示或與之具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列，輕鏈可變區包含如SEQ ID NO：148-149中任一所示或與之具有至少90%、至少95%、至少98%、至少99%序列同一性的胺基酸序列。
- 如請求項8所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含全長重鏈(HC)和全長輕鏈(LC)；較佳地，該全長重鏈為IgG1或IgG4同種型，該全長輕鏈為Kappa同種型；更佳地，該重鏈序列為SEQ ID NO：102所示或與之具有至少90%序列同一性，該輕鏈序列為SEQ ID NO：103所示或與之具有至少90%序列同一性。
- 如請求項5至9中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，該特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域包含重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)，其中：該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區的N端；該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的重鏈可變區的C端；該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區的N端；和/或該特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域位於特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域的輕鏈可變區的C端。
- 如請求項10所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，其中，特異性結合PVRIG的第一抗原結合結構域的免疫球蛋白單一可變結構域與特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域直接或藉由連接子相連接；較佳地，該連接子為具有如(G4S)x所示的胺基酸序列，其中，x獨立地選自1-20的整數；更佳地，該連接子為(G4S)2、(G4S)3所示的胺基酸序列。
- 如請求項5至11中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白，其包含第一多肽鏈和第二多肽鏈，其中：該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：108至112和114中任一所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；或者該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：104或105所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：103所示的胺基酸序列；或者該第一多肽鏈包含如SEQ ID NO：102所示的胺基酸序列，該第二多肽鏈包含如SEQ ID NO：106或107所示的胺基酸序列。
- 一種抗PVRIG抗體或其抗原結合片段，其含有如請求項1至3或5至6中任一項所述的免疫球蛋白單一可變結構域；較佳地，其還包含如請求項7所述的特異性結合TIGIT的第二抗原結合結構域。
- 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至4中任一項所述的PVRIG結合蛋白、如請求項5至12中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白或如請求項13所述的抗PVRIG抗體或其抗原結合片段。
- 一種宿主細胞，其包含如請求項14所述的多核苷酸。
- 一種製備PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白、或抗PVRIG抗體或其抗原結合片段的方法，包括：在如請求項15所述的宿主細胞中表達如請求項14所述的多核苷酸，以及從該宿主細胞中分離表達的PVRIG結合蛋白、PVRIG/TIGIT結合蛋白或抗PVRIG抗體或其抗原結合片段。
- 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至4中任一項所述的PVRIG結合蛋白、如請求項5至12中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白、或如請求項13所述的抗PVRIG抗體或其抗原結合片段，以及，可藥用的賦形劑、稀釋劑或載體。
- 一種治療疾病或延緩疾病進展的方法，包括：向受試者施用治療或延緩疾病有效量的如請求項1至4中任一項所述的PVRIG結合蛋白、如請求項5至12中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白、或如請求項13所述的抗PVRIG抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的多核苷酸、或如請求項17所述的醫藥組成物，或其任意組合，較佳地，該疾病為增殖性疾病；更佳地，該增殖性疾病為癌症；更佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症。
- 一種活化NK細胞、γδT細胞和/或Th1細胞的方法，包含向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至4中任一項所述的PVRIG結合蛋白、如請求項5至12中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白、或如請求項13所述的抗PVRIG抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的多核苷酸、或如請求項17所述的醫藥組成物或其任意組合。
- 一種增加受試者體內的干擾素-γ產生和/或促炎性細胞因子分泌的方法，包含向有需要的受試者施用有效量的如請求項1至4中任一項所述的PVRIG結合蛋白、如請求項5至12中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白、或如請求項13所述的抗PVRIG抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的多核苷酸、或如請求項17所述的醫藥組成物或其任意組合。
- 一種如請求項1至4中任一項所述的PVRIG結合蛋白、如請求項5至12中任一項所述的PVRIG/TIGIT結合蛋白、或如請求項13所述的抗PVRIG抗體或其抗原結合片段、如請求項14所述的多核苷酸、或如請求項17所述的醫藥組成物，用於治療或延緩疾病，較佳地，該疾病為增殖性疾病；更佳地，該增殖性疾病為癌症；更佳地，該癌症選自肺癌、前列腺癌、乳腺癌、頭頸部癌、食管癌、胃癌、結腸癌、結直腸癌、膀胱癌、宮頸癌、子宮癌、卵巢癌、肝癌、黑色素 瘤、腎癌、鱗狀細胞癌、血液系統癌症或者任何特徵在於不受控細胞生長的其它疾病或病症。
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