ES2786651T3 - Anticuerpos anti-PVRIG y métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo anti-PVRIG (Proteína que Contiene Dominio de Inmunoglobulina Relacionada con Receptor de Virus de la Polio) para uso en el tratamiento de cáncer, donde el anticuerpo activa células T y/o células NK.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos anti-PVRIG y métodos de uso
Antecedentes de la invención
Las células T vírgenes deben recibir dos señales independientes de células presentadoras de antígeno (APC) para activarse productivamente. La primera, Señal 1, es específica de antígeno y se produce cuando los receptores de antígeno de célula T encuentran el complejo antígeno-MHC apropiado sobre las APC. El destino de la respuesta inmune se determina mediante una segunda señal independiente de antígeno (Señal 2) que es proporcionada a través de una molécula coestimuladora de célula T que involucra su ligando expresado por APC. Esta segunda señal podría ser estimuladora (coestimulación positiva) o inhibidora (coestimulación negativa o coinhibición). En ausencia de una señal coestimuladora o en presencia de una señal coinhibidora, la activación de células T se ve afectada o abortada, lo que puede conducir a un estado de falta de respuesta específica de antígeno (conocida como anergia de células T), o puede dar como resultado la muerte apoptótica de células T.
Los pares de moléculas coestimuladoras habitualmente consisten en ligandos expresados en APCs y sus receptores cognados expresados en células T. Los pares ligando/receptor prototipo de moléculas coestimuladoras son B7/CD28 y CD40/CD40L. La familia B7 consiste en ligandos proteínicos de superficie celular relacionados estructuralmente, que pueden proporcionar un aporte estimulador o inhibidor a una respuesta inmune. Los miembros de la familia B7 están relacionados estructuralmente, con el dominio extracelular que contiene al menos un dominio de inmunoglobulina variable o constante.
Las señales coestimuladoras tanto positivas como negativas desempeñan un papel crítico en la regulación de las respuestas inmunes mediadas celularmente, y las moléculas que median en dichas señales han demostrado ser dianas efectivas para la inmunomodulación. En base a este conocimiento, se han desarrollado varias estrategias terapéuticas que implican como dianas moléculas coestimuladoras, y han demostrado ser útiles para la prevención y el tratamiento de cáncer mediante la activación, o evitando la desactivación, de respuestas inmunes en pacientes de cáncer, y para la prevención y el tratamiento de enfermedades autoinmunes y enfermedades autoinflamatorias, así como en el rechazo de trasplantes alogénicos, bien desactivando respuestas inmunes incontroladas, o mediante la inducción de “señal de apagado” por coestimulación negativa (o coinhibición) en sujetos con dichas condiciones patológicas.
La manipulación de las señales derivadas por ligandos B7 ha demostrado potencial en el tratamiento de la autoinmunidad, enfermedades inflamatorias y el rechazo de trasplantes. Las estrategias terapéuticas incluyen el bloqueo de la coestimulación usando anticuerpos monoclonales para el ligando o para el receptor de un par coestimulador, o usando proteínas de fusión solubles compuestas por el receptor coestimulador que puede unirse y bloquear su ligado apropiado. Otra estrategia es la inducción de co-inhibición usando una proteína de fusión soluble de un ligando inhibidor. Estas estrategias se basan, al menos parcialmente, en la eliminación eventual de células T auto- o alo-reactivas (que son responsables de los procesos patogénicos en enfermedades autoinmunes o en trasplantes, respectivamente), presumiblemente porque en ausencia de coestimulación (que induce genes de supervivencia celular) las células T se vuelven altamente susceptibles de inducción de apoptosis. De esta manera, los nuevos agentes que son capaces de modular señales coestimuladoras, sin comprometer la capacidad del sistema inmune para defenderse de patógenos, son altamente ventajosos para el tratamiento y la prevención de dichas afecciones patológicas.
Las rutas coestimuladoras desempeñan un papel importante en el desarrollo de tumores. Cabe destacar que los tumores han demostrado evadir la destrucción inmune impidiendo la activación de células T a través de la inhibición de factores coestimuladores en las familias B7-CD28 y t Nf , así como atrayendo células T reguladoras, que inhiben las respuestas antitumorales de células T (véase Wang (2006), "Immune Suppression by Tumor Specific CD4+ Regulatory T cells in Cancer", Semin. Cáncer. Biol. 16: 73-79; Greenwald, et al. (2005), "The B7 Family Revisited", Ann. Rev. Immunol. 23: 515-48; Watts (2005), "TNF/TNFR Family Members in Co-stimulation of T Cell Responses", Ann. Rev. Immunol. 23: 23-68; Sadum, et al., (2007) "Immune Signatures of Murine and Human Cancers Reveal Unique Mechanisms of Tumor Escape and New Targets for Cancer Immunotherapy", Clin. Canc. Res. 13(13): 4016­ 4025). Dichas moléculas coestimuladoras expresadas por tumor se han convertido en biomarcadores de cáncer atractivos y pueden servir como antígenos asociados a tumor (TAAs). Adicionalmente, se han identificado rutas coestimuladoras como controles inmunológicos que atenúan respuestas inmunes dependientes de células T, tanto a nivel de función de inicio como de función efectora en las metástasis tumorales. A medida que las vacunas diseñadas contra el cáncer continúan mejorando, se hace cada vez más claro que dichos controles inmunológicos son una barrera principal en la capacidad de las vacunas para inducir respuestas anti-tumorales terapéuticas. A este respecto, las moléculas coestimuladoras pueden actuar como adyuvantes para inmunoterapia de cáncer activa (vacunación) y pasiva (mediada por anticuerpos), proporcionando estrategias que desbaraten la tolerancia inmune y estimulen el sistema inmunitario.
A lo largo de la última década, se han desarrollado agonistas y/o antagonistas de varias proteínas coestimuladoras para tratar las enfermedades autoinmunes, el rechazo a injerto, la alergia y el cáncer. Por ejemplo, CTLA4-Ig (Abatacept, Orencia®) ha sido aprobado para el tratamiento de RA, CTLA4-Ig mutado (Betalacept, Nulojix®), para la prevención del rechazo de trasplante de riñón agudo y por el anticuerpo anti-CTLA4 (Ipilimumab, Yervoy®), aprobado recientemente para el tratamiento del melanoma. Se han aprobado otros reguladores de coestimulación, tales como los anticuerpos anti-PD-1 de Merck (Keytruda®) y BMS (Opdivo®), que han sido aprobados para tratamientos contra el cáncer y también están en evaluación para infecciones víricas.
Por consiguiente, un objetivo de la invención es proporcionar anticuerpos inmunomoduladores de PVRIG.
Sumario breve de la invención
Por consiguiente, un objetivo de la descripción es proporcionar métodos para activar células T citotóxicas (CTLs) de un paciente que comprende administrar un anticuerpo anti-PVRIG al paciente, en el que se activa un subconjunto de las CTLs del paciente.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos para activar células NK de un paciente que comprende administrar un anticuerpo anti-PVRIG al paciente, en el que se activa un subconjunto de las células NK del paciente.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos para activar células y§ de un paciente que comprende administrar un anticuerpo anti-PVRIG al paciente, en el que se activa un subconjunto de las células y§ del paciente.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos para activar células Th1 de un paciente que comprende administrar un anticuerpo anti-PVRIG al paciente, en el que se activa un subconjunto de las células Th1 del paciente.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos para inhibir la interacción de PVRIG y PVLR2 en un paciente que padece una afección asociada a dicha interacción, que comprende administrar un anticuerpo anti-PVRIG al paciente.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos para tratar cáncer en un paciente, que comprende administrar un anticuerpo anti-PVRIG al paciente, en el que se trata dicho cáncer.
Otro objetivo adicional de la invención es proporcionar métodos como los descritos anteriormente, donde el anticuerpo anti-PVRIG comprende las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CPA.7.021 y CPA.7.050.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos como los descritos anteriormente, donde el anticuerpo anti-PVRIG compite por la unión con un anticuerpo que comprende las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vIc Dr 3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CPA.7.001, CPA.7.003, CPA.7.004, CPA.7.006, CPA.7.008, CPA.7.009, CPA.7.010, CPA.7.011, CPA.7.012, CPA.7.013, CPA.7.014, CPA.7.015, CPA.7.017, CPA.7.018, CPA.7.019, CPA.7.021, CPA.7.022, CPA.7.023, CPA.7.024, CPA.7.033, CPA.7.034, CPA.7.036, CPA.7.040, CPA.7.046, CPA.7.047, CPA.7.049 y CPA.7.050.
Otro objetivo adicional de la invención es proporcionar métodos como los descritos anteriormente, donde el anticuerpo anti-PVRIG se selecciona del grupo que consiste en CPA.7.021 y CPA.7.050.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos como los descritos anteriormente, donde el anticuerpo anti-PVRIG compite por la unión con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CPA.7.001, CPA.7.003, CPA.7.004, CPA.7.006, CPA.7.008, CPA.7.009, CPA.7.010, CPA.7.011, CPA.7.012, CPA.7.013, CPA.7.014, CPA.7.015, CPA.7.017, CPA.7.018, CPA.7.019, CPA.7.021, CPA.7.022, CPA.7.023, CPA.7.024, CPA.7.033, CPA.7.034, CPA.7.036, CPA.7.040, CPA.7.046, CPA.7.047, CPA.7.049 y CPA.7.050.
Otro objetivo adicional de la invención es proporcionar métodos como los descritos anteriormente, donde el anticuerpo anti-PVRIG comprende las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CHA.7.516, CHA.7.518, CHA.7.524, CHA.7.528, CHA.7.530, CHA.7.537, CHA.7.543 y CHA.7.548.
Otro objetivo adicional de la descripción es proporcionar métodos como los descritos anteriormente, donde dicho anticuerpo anti-PVRIG compite por la unión con un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo anti-PVRIG que comprende las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CHA.7.502, CHA.7.503, CHA.7.506, CHA.7.508, CHA.7.510, CHA.7.512, CHA.7.514, CHA.7.516, CHA.7.518, CHA.7.520.1, CHA.7.520.2, CHA.7.522, CHA.7.524, CHA.7.526, CHA.7.527, CHA.7.528, CHA.7.530, CHA.7.534, CHA.7.535, CHA.7.537, CHA.7.538.1, CHA.7.538.2, CHA.7.543, CHA.7.544, CHA.7.545, CHA.7.546, CHA.7.547, CHA.7.548, CHA.7.549, CHA.7.550, CPA.7.001, CPA.7.003, CPA.7.004, CPA.7.006, CPA.7.008, CPA.7.009, CPA.7.010, CPA.7.011, CPA.7.012, CPA.7.013, CPA.7.014, CPA.7.015, CPA.7.017, CPA.7.018, CPA.7.019, CPA.7.021, CPA.7.022, CPA.7.023, CPA.7.024, CPA.7.033, CPA.7.034, CPA.7.036, CPA.7.040, CPA.7.046, CPA.7.047, CPA.7.049 y CPA.7.050.
Otro objetivo adicional de la invención es proporcionar dominios de unión a antígeno, que incluyen anticuerpos, que son anticuerpos anti-PVRIG, que comprenden las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CPA.7.021 y CPA.7.050.
Otro objetivo de la invención es proporcionar composiciones de dominios de unión a antígeno anti-PVRIG (que incluyen anticuerpos) que son anticuerpos anti-PVRIG, seleccionados del grupo que consiste en CPA.7.021 y CPA.7.050.
Otro objetivo adicional de la invención es proporcionar dominios de unión a antígeno, que incluyen anticuerpos, que son anticuerpos anti-PVRIG, que comprende las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en CHA.7.516, CHA.7.518, CHA.7.524, CHA.7.528, c Ha .7.530, CHA.7.537, CHA.7.543 y CHA.7.548.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: representación esquemática de los mecanismos de acción de la invención.
Figura 2: presenta la expresión de ARNm de PVRIG en diversos tejidos humanos normales.
Figura 3: presenta la expresión de ARNm de PVRIG en diversas poblaciones inmunes derivadas de sangre periférica y de médula ósea (en base a GSE49910).
Figura 4: presenta la expresión de ARNm de PVRIG en diversas poblaciones de linfocitos CD3+ (en base a GSE47855).
Figura 5A, 5B y 5C: presentan la expresión de ARNm de PVRIG en poblaciones celulares específicas. La Figura 5A presenta la expresión de ARNm de PVRIG en poblaciones celulares específicas obtenida mediante microscopía de captura de láser (en base a GSE39397). La Figura 5B presenta la expresión de ARNm de PVRIG en células T CD4 de pacientes normales y de cáncer, así como la expresión de células T CD4 de nodos linfáticos de drenaje y TILs de pacientes de cáncer de mama (en base a GSE36765). La Figura 5C presenta la expresión de ARNm en PVRIG de células T CD8 y CD4 derivadas de tumor de linfoma folicular y de amígdala (en base a GSE27928).
Figura 6: presenta la expresión de PVRIG en tejidos normales basados en GTEx. Los niveles de expresión se muestran en valores de log2(RPKM) (fragmentos identificados por millón de lecturas por kilobase). Los valores por encima de 1 se consideran una expresión elevada. Los tejidos se clasificación de arriba abajo en función de la expresión media. Cada punto del gráfico representa una muestra individual.
Figura 7: presenta la expresión de PVRIG en tejidos cancerosos en base a TCGA. Los niveles de expresión se muestran en valores de log2(RPKM) (fragmentos identificados por millón de lecturas por kilobase). Los valores por encima de 1 se consideran una expresión elevada. Los tejidos se clasificación de arriba abajo en función de la expresión media. Cada punto del gráfico representa una muestra individual.
Figura 8: muestra una representación de mapa de calor de los resultados de análisis de enriquecimiento en tres categorías: interacciones de proteínas, rutas y asociaciones de enfermedad. Los resultados se clasifican de arriba abajo en función del valor-p medio por fila. Solo se muestran los 10 resultados más altos de cada categoría. Los cuadrados grises indican valores-p < 0,05. Cada columna del mapa de calor corresponde a un tejido normal o canceroso, a partir del cual se deriva una lista de genes altamente correlacionados (r>0,55 usando al menos 50 muestras). Tal como se muestra en el mapa de calor, PVRIG se correlaciona con una firma de expresión génica de células T que está asociada fuertemente con la respuesta inmune y las enfermedades inmunes.
Figura 9: presenta la expresión de PVRIG en piel normal frente a melanoma (análisis GTEx y TCGA). Dicha sobre­ expresión se observó en tumores sólidos adicionales y es el resultado de linfocitos y células NK infiltrados en el microentorno del tumor. En condiciones normales, no hay células inmunes infiltradas y por lo tanto los niveles de expresión de PVRIG son muy bajos.
Figura 10: presenta las correlaciones de PVRIG y PD1 en melanoma de muestras de TCGA, con varios marcadores de células T en adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon y melanoma. El marcador CD3 es un marcador general para células T y también está expresado en células NKT. Los marcadores CD4 y CD8 se usan para caracterizar la subpoblación de células T.
Figura 11: muestra la expresión de PVRIG en PBLs humanos. Se evaluaron PBLs humanos derivados de dos donantes para determinar la expresión de PVRIG. Tanto el donante 61 como el donante 40 mostraron una tinción significativa con Ab anti-PVRIG específico.
Figura 12: muestra que PVRIG-Ig exhibe una fuerte unión con las cuatro líneas celulares de melanoma humano MEL-23, Mel-624, Mel-624.38 y mel-888 evaluadas. La unión no se ve afectada por el co-cultivo con células T específicas de melanoma modificadas. La línea gris corresponde al control de isotipo, la línea continua negra corresponde a PVRIG-ECD-Ig.
Figura 13: correlación de PVRIG con células T y subpoblaciones de células T. CD3G es un componente del complejo de receptor de célula T, CD4 es un marcador para células T colaboradoras y CD8A es un componente de la proteína CD8 usado para identificar células T citotóxicas. PVRIG se correlaciona de forma elevada con células T en muchos tipos de tumores, que incluyen adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon y melanoma, que se muestran en la presente figura.
Figura 14: presenta imágenes representativas del cribado de Confirmación/Especificidad. Todas las coincidencias del cribado Primario, y el vector que expresa EGFR (control negativo), fueron re-ordenados/expresados por duplicado y sondeados con PVRIG a 20 pg/mL. Una coincidencia específica con una elevada intensidad se muestra en verde (PVRL2). Las coincidencias no específicas se muestran en negro. Otra coincidencia débil (MAG) posteriormente se demostró que también se une a otros ligandos, lo que sugiere que no es específica.
Figura 15A-15E: presenta el efecto de diversas proteínas PVRIG-ECD-Ig M:M en la activación de células T CD4 T de ratón. Se recubrieron placas con mAb anti-CD3 (2 pg/mL) en presencia de 10 pg/mL de PVRIG-ECD Ig (lote n°198) o mIgG2a de control, según se describe en la sección de materiales y métodos. Los pocillos fueron llevados a placa con 1x105 células T CD4+CD25- de ratón por pocillo en presencia de 2 pg/mL de anti-CD28 soluble. (A) La expresión de CD69 se analizó mediante citometría de flujo a 48h post-estimulación, se muestran histogramas representativos. Cada barra es la media de cultivos duplicados, las barras de error indican la desviación estándar. (B-C) Se recogieron los sobrenadantes de cultivo a 48 h post-estimulación y se analizaron los niveles de IL-2 e IFNy de ratón mediante ELISA. Los resultados se muestran como Media ± error estándar de muestras duplicadas. (D) Efecto de respuesta a dosis de PVRIG-ECD Ig inmovilizada (se presenta la Figura 92BB sobre CD69 superficial (D) y secreción de IFNy (E)). Cada barra es la media de cultivos triplicados, las barras de error indican los errores estándar.
Figura 16: presenta el análisis FACS de PBLs transducidos con PVRIG usando un anticuerpo específico. Se proporciona el porcentaje de células con tinción positiva (respecto a vector vacío transducido) correspondiente a la proteína.
Figura 17: presenta el análisis FACS de PVRIG (tanto co-expresado con TCR F4 o en un vector bi-cistrónico con PBLs transducidos con TCR F4 y NGFR usando un anticuerpo específico). Se proporciona el porcentaje de células con tinción positiva (respecto a vector vacío transducido) correspondiente a la proteína.
Figura 18A-18B: presenta el análisis FACS llevado a cabo sobre PBLs estimulados transducidos con TCR para el experimento 1 (Figura 18A) y el experimento 2 (Figura 18B) usando un anticuerpo monoclonal específico que reconoce el domino extra-celular de la cadena beta del TCR específico transducido. Se proporciona el porcentaje de células con tinción positiva.
Figura 19: muestra que la expresión de PVRIG sobre PBLs que expresan F4 produce una reducción de la secreción de IFNy al co-cultivar con SK-MEL23, MEL-624 y MEL-624.38 en comparación con la expresión de un vector vacío.
Figura 20A-20B: muestra que la expresión de PVRIG y F4 en PBLs mediante co-transducción (Figura 20A) no afecta a la secreción de IFNy en co-cultivo con líneas celulares de melanoma. La expresión de PVRIG y F4 en PBLs con un vector bi-cistrónico (Figura 20B) produce una reducción de la secreción de iFNy al co-cultivar con SK-MEL23, MEL-624 y MEL-624.38 en comparación con la expresión de un vector vacío.
Figura 21: muestra que la expresión de PVRIG y F4 en PBLs con un vector bi-cistrónico produce una reducción de la citotoxicidad mediada por células T al co-cultivar con líneas celulares de melanoma.
Figura 22: muestra la expresión de PVRIG en 3 subgrupos de niveles bajos, sin cambio y elevados de células T agotadas. Las células T agotadas fueron seleccionadas en base al nivel de expresión elevado de 4 marcadores: CD8A, PD-1, TIM-3 y TIGIT. Las muestras de baja expresión no se muestran, ya que ninguna presentó niveles detectables de PVRIG.
Figura 23A-23B: análisis de transferencia Western de proteína PVRIG humana expresada ectópicamente. Se analizaron extractos de célula completa de agrupamientos de células HEK293, transfectadas previamente con construcción de expresión que codifica PVRIG-flag humana (calle 2) o con vector vacío (calle 1) mediante WB con un anticuerpo anti-flag (23A) o con anticuerpos anti-PVRIG (23B).
Figura 24: expresión de superficie celular de proteína PVRIG-flag humana expresada ectópicamente por células HEK293 mediante análisis FACS. Se usó pAb anti-PVRIG (Abnova) para analizar células HEK293 que expresan de forma estable la proteína PVRIG-flag humana. Como control negativo se usaron células que expresan el vector vacío. La detección se llevó a cabo mediante Ab secundario conjugado a PE anti-ratón de cabra y se analizó mediante FACS.
Figura 25: muestra la secuencia de longitud completa de PVRIG humana (que muestra dos puntos de inicio de metionina diferentes) y la proteína de fusión PVRIG Fc usada en los Ejemplos. El péptido señal está subrayado, el ECD está doblemente subrayado, y el dominio Fc está subrayado con puntos.
Figura 26: muestra la secuencia de la proteína 2 relacionada con receptor de virus de la Polio humano (PVLR2, también conocida como nectina-2, CD112 o mediador B de entrada de virus del herpes, (HVEB)), el compañero de unión de PVRIG tal como se muestra en el Ejemplo 5. PVLR2 es una glicoproteína de membrana de plasma humano.
Figura 27: especificidad de anticuerpo de PVRIG hacia células HEK modificadas para sobreexpresar PVRIG. Los datos muestran medidas MFI geométrica (gMFI) absolutas en función del aumento de concentración de anticuerpos. La línea negra discontinua con cuadrados muestra la tinción de células HEK hPVRIG con un anticuerpo anti-PVRIG humana representativo (CPA.7.021), y la línea negra continua con círculos muestra la tinción de células progenitoras HEK con el mismo anticuerpo.
Figura 28: se evaluó el ARN de PVRIG en varias líneas celulares de cáncer mediante qPCR. Los datos mostrados son la expresión relativa de ARN de PVRIG en líneas celulares como tasa de cambio respecto a los niveles células expi determinados mediante el método 2('ññCt).
Figura 29: se evaluó el ARN de PVRIG en subconjuntos clasificados de PBMC mediante qPCR. Los datos mostrados son la expresión relativa de ARN de PVRIG en cada subconjunto como tasa de cambio respecto a los niveles en células HEK GFP determinados mediante el método 2('ññCt). D47-D49 denotan tres donantes individuales. CD4 denota células T CD4, CD8 denota células T CD8, CD14 denota monocitos y CD56 denota células NK.
Figura 30A-30B. Figura 30A: se evaluó el ARN de PVRIG en células T CD4 clasificadas (CD4) y en células NK (NK) en condiciones vírgenes y activadas mediante qPCR. Las células T CD4 fueron estimuladas con dynabeads estimuladoras de células T humanas y 50 U/mL de IL-2 durante 3 días. Las células NK fueron estimuladas en 50 U/mL de IL-2 durante 3 días. Los datos mostrados son la expresión relativa de ARN de PVRIG en cada subconjunto como tasa de cambio respecto a los niveles de células expi determinados mediante el método 2('ññCt). Se incluye Jurkat como control positivo. D47-D49 denotan tres donantes individuales. Figura 30B: se evaluó el ARN de PVRIG en células T CD8 clasificadas en condiciones vírgenes y activadas mediante qPCR. Las células T CD8 fueron estimuladas con dynabeads estimuladoras de células T humanas y 100 U/mL de IL-2 durante 3 días. Los datos mostrados son la expresión relativa de ARN de PVRIG en cada subconjunto como tasa de cambio respecto a los niveles de células expi determinados mediante el método 2('ññCt). Se incluye Jurkat como control positivo. D49, 70 y 71 indican tres donantes individuales.
Figura 31A-31B: características de unión de PVRIG a líneas celulares modificadas con HEK hPVRIG, células progenitoras HEK, células CA46 y células Jurkat. HEK OE denota células HEK hPVRIG, HEK par denota células HEK progenitoras. Para los datos de Jurkat y CA46, gMFIr indica la tasa de diferencia en MFI geométrica de tinción de anticuerpo de PVRIG respecto a sus controles. La concentración indica aquella a la que se calculó la gMFIr. Ajuste no fiable indica que las características de unión de anticuerpo no cumplen los requisitos de ajuste matemático apropiados. Algunos anticuerpos no fueron evaluados en algunas condiciones debido a las malas características de unión, especificidad o fabricabilidad.
Figura 32A-32B: características de unión de PVRIG a PBMC humanas primarias, células cyno de sobre-expresión transitoria, y PBMC cyno primarias. Expi cyno OE denota células expi transfectadas transitoriamente con cPVRIG, expi par denota células expi progenitoras. gMFIr indica la tasa de diferencia en MFI geométrica de la tinción de anticuerpo de PVRIG respecto a sus controles. La concentración indica aquella a la que se calculó la gMFIr. Algunos anticuerpos no fueron evaluados en algunas condiciones debido a unas malas características de unión, especificidad o fabricabilidad, como en la Figura 31. Adicionalmente, los anticuerpos seleccionados fueron sometidos a triaje para cribado en subconjuntos de PBMC de cyno en base a su capacidad para unirse a células transitorias de cPVRIG o su funcionalidad. La expresión de PVRIG en células T CD4 es similar a la descrita en la tabla para células T CD8.
Figura 33: especificidad de anticuerpos PVRIG hacia CA46 y células Jurkat. Los datos muestran medidas de MFI geométrica (gMFI) absolutas mediante FACS en función de la concentración creciente de anticuerpos. La línea negra continua con triángulos muestra tinción de células CA46 con anticuerpo anti-PVRIG humana (c Pa .7.021) y la línea negra continua con cuadrados muestra la tinción de células Jurkat. Como controles negativos, se muestran OV-90 (línea discontinua con triángulos invertidos) y NCI-H4411 (línea discontinua con diamantes).
Figura 34A-34D: Reactividad cruzada de anticuerpos de PVRIG con células transitorias de cPVRIG. Los datos muestran un ejemplo de un anticuerpo que es un aglomerante negativo (a-b, CPA.7.021) y un aglomerante positivo (c-d, CPA.7.024) en células transitorias de cPVRIG. Los histogramas grises sólidos indican anticuerpo de control, los histogramas negros huecos indican el anticuerpo de interés. Las células fueron teñidas con cada anticuerpo a una concentración de 5 pg/mL.
Figura 35: se evaluó el ARN de cPVRIG en subconjuntos clasificados de PBMC de cyno mediante qPCR. Los datos mostrados son los valores Ct medidos de tres donantes cyno, detectados mediante dos conjuntos de cebadores dirigidos a dos áreas distintas del gen cPVRIG.
Figura 36A-36C: la proteína cPVRIG fue evaluada en a) linfocitos CD16+ (células NK), b) células mieloides CD14+CD56+ (monocitos), y c) linfocitos CD3+ (células T) mediante FACS. Los datos se muestran como MFI geométrica absoluta, indicando la línea negra continua los niveles de fluorescencia de fondo. Los datos son representativos de una muestra de nuestro panel de anticuerpos anti-PVRIG humana evaluados en tres donantes cyno.
Figura 37A-37B: muestra las secuencias CDR correspondientes a Fabs que se determinó que bloquean con éxito la interacción de PVRIG con su contrapartida PVRL2, tal como se describe en el Ejemplo 5.
Figura 38A-38AA: muestra las secuencias de aminoácido de los dominios variables pesados y ligeros, las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, y las CDRs pesadas variables y ligeras variables correspondientes a las secuencias anti-PVRIG de CPA humanas enumeradas de la invención, que se unen a PVRIG y bloquean la unión de PVRIG y PVLR2.
Figura 39A-39H: muestra las secuencias de aminoácido de los dominios variables pesados y ligeros, las cadenas pesadas y ligeras de longitud completa, y las CDRs pesadas variables y ligeras variables correspondientes a ocho secuencias anti-PVRIG de CPA humanas enumeradas de la invención, que se unen a PVRIG y bloquean la unión de PVRIG y PVLR2.
Figura 40A-40D: muestra las CDRs correspondientes a todas las secuencias de anticuerpo anti-PVRIG CPA generadas que se unen a PVRIG, incluyendo aquellas que no bloquean la unión de PVRIG y PVLR2.
Figura 41A a 41DD: muestra las cadenas variables pesadas y ligeras, así como las secuencias de vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de cada uno de los anticuerpos CHA de la invención, CHA.7.502, CHA.7.503, CHA.7.506, CHA.7.508, CHA.7.510, CHA.7.512, CHA.7.514, CHA.7.516, CHA.7.518, CHA.7.520.1, CHA.7.520.2, CHA.7.522, CHA.7.524, CHA.7.526, CHA.7.527, CHA.7.528, CHA.7.530, CHA.7.534, CHA.7.535, CHA.7.537, CHA.7.538.1, CHA.7.538.2, CHA.7.543, CHA.7.544, CHA.7.545, CHA.7.546, CHA.7.547, CHA.7.548, CHA.7.549 y CHA.7.550 (éstas incluyen las secuencias variables pesadas y ligeras correspondientes a secuencias de ratón (de Hibridomas)).
Figura 42: muestra los resultados de agrupamientos del Ejemplo 11. No agrupado: CPA.7.029 y CPA.7.026 (no unión al antígeno).
Figura 43: matriz binaria de bloque por pares (“0”, cuadro rojo) o de sándwich (“1”, cuadro verde) de antígeno para 35 mAbs anti-PVRIG. Los mAbs enumerados verticalmente a la izquierda de la matriz son mAbs inmovilizados covalentemente sobre la matriz ProteOn. Los mAbs enumerados horizontalmente en la parte superior de la matriz fueron analitos inyectados con antígeno pre-mezclado. El clon CPA.7.041 se estudió solo como como analito. Los cuadros negros recogen cuatro contenedores de epítopo según los patrones de bloqueo de los mAbs.
Figura 44: dendograma de agrupamiento jerárquico de los patrones de unión vertical de cada mAb de la matriz binaria de la Figura 43. Existen cuatro contenedores de mAbs con patrones de bloqueo de epítopo idénticos en cada grupo. La única diferencia entre los contenedores 1 y 2 es que los mAbs del contenedor 1 bloquean la unión a antígeno al clon CPA.7.039, mientras que los mAbs del contenedor 2 pueden formar un sándwich entre el antígeno y el CPA.7.039. El clon CPA.7.050 puede formar un sándwich entre el antígeno y los demás clones.
Figura 45A-45JJ: sensogramas que indican el patrón de bloqueo de antígeno correspondiente a CPA.7.036 con todos los demás mAbs inmovilizados, que constituyen datos representativos para el Contenedor n° 1. Cada panel representa un punto de la matriz de chip ProteOn que tiene un mAb inmovilizado diferente. Las respuestas azules son controles solo de antígeno. Las respuestas negras son disoluciones pre-mezcladas de CPA.7.036 en exceso molar de antígeno. Las respuestas grises son inyecciones de control solo de mAb. CPA.7.36 bloquea la unión de antígeno a los demás mAbs excepto para CPA.7.050 (JJ).
Figura 46A-46JJ: sensogramas que indican el patrón de bloqueo de antígeno correspondiente a CPA.7.034 con todos los demás mAbs inmovilizados, que constituyen datos representativos para el Contenedor n° 2. Cada panel representa un punto de la matriz de chip ProteOn que tiene un mAb inmovilizado diferente. Las respuestas azules son controles solo de antígeno. Las respuestas negras son disoluciones pre-mezcladas de CPA.7.34 en exceso molar de antígeno. Las respuestas grises son inyecciones de control solo de mAb. CPA.7.34 bloquea la unión de antígeno a los demás mAbs excepto para CPA.7.039 (DD) y CPA.7.050 (JJ).
Figura 47A-47JJ: sensogramas que indican el patrón de bloqueo de antígeno correspondiente a CPA.7.039 con todos los demás mAbs inmovilizados. CPA.7.039 es el único mAb del Contenedor n° 3. Cada panel representa un punto de la matriz de chip ProteOn que tiene un mAb inmovilizado diferente. Las respuestas azules son controles solo de antígeno. Las respuestas negras son disoluciones pre-mezcladas de CPA.7.039 en exceso molar de antígeno. Las respuestas grises son inyecciones de control solo de mAb. Los paneles C, F, H, J, L, N, R, S, Z, EE, GG, HH, II y JJ muestran formación de sándwich con el antígeno.
Figura 48A-48JJ: sensogramas que indican el patrón de bloqueo de antígeno correspondiente a CPA.7.050 con todos los demás mAbs inmovilizados. CPA.7.050 es el único mAb del Contenedor n° 4. Cada panel representa un punto de la matriz de chip ProteOn que tiene un mAb inmovilizado diferente. Las respuestas azules son controles solo de antígeno. Las respuestas negras son disoluciones pre-mezcladas de CPA.7.50 en exceso molar de antígeno. Las respuestas grises son inyecciones de control solo de mAb. Solo el panel JJ muestra bloque de antígeno, que es donde el CPA.7.050 fue inyectado con antígeno sobre sí mismo.
Figura 49: muestra los resultados de los experimentos SPR del Ejemplo 12.
Figura 50A-50Q SPR: datos de sensograma de concentraciones múltiples fabs anti-PVRIG en sobrenadante inyectado en proteína de fusión PVRIG humana capturada (líneas negras). Las líneas rojas muestran el ajuste cinético global 1:1 de múltiples concentraciones de los fabs para estimar la ka y la kd de las interacciones. Las letras indican el clon enumerado en la Tabla 1, que también incluye las constantes cinéticas resultantes y la Kd calculada.
Figura 51A-51C: sensogramas SPR correspondientes a la unión de los clones CPA.7.009 (A), CPA.7.003 (B), y CPA.7.014 (C) a proteína de fusión PVRIG humana capturada. Se trata de ejemplos en los que los sensogramas mostraron cinéticas multi-fásicas complejas y, por tanto, las constantes cinéticas no pudieron estimarse con fiabilidad.
Figura 52A-52B: muestra los resultados de los estudios de bloqueo del “Estudio de validación adicional 4” del Ejemplo 5.
Figura 53: muestra que después de la alo-activación, la expresión de PVRIG fue regulada al alza en células T CD4+, así como en células T CD8+, y células T gamma delta doble negativas. Esta regulación al alza se observó en PBMCs de uno de cada dos donantes evaluados.
Figura 54: muestra las líneas celulares humanas evaluadas en el Ejemplo 1G.
Figura 55: muestra las líneas celulares de ratón evaluadas en el Ejemplo 1G.
Figura 56A-56C: expresión de tránscrito de PVRIG humana en diversas líneas celulares de cáncer. La verificación del tránscrito humano en varias líneas celulares se llevó a cabo mediante qRT-PCR usando la sonda TaqMan. El diagrama de columnas representa los datos observados usando la sonda TaqMan Hs04189293_g1. Los valores Ct se detallan en la tabla. Análisis que indica un tránscrito elevado en las líneas celulares Jurkat, HUT78 y HL60, y niveles menores en THP1 y RPMI8226.
Figura 57A-57B: expresión de tránscrito de PVRIG de ratón en diversas líneas celulares de cáncer. La verificación del tránscrito de ratón en varias líneas celulares se llevó a cabo mediante qRT-PCR usando la sonda TaqMan. El diagrama de columnas representa los datos observados usando la sonda TaqMan CC70L8H. Los valores Ct se detallan en la tabla. Análisis que indica un tránscrito elevado en las líneas celulares NIH/3T3, Renca, SaI/N y J774A.1, y niveles menores en CT26 y B104-1-1.
Figura 58: la expresión endógena de proteína PVRIG se analizó mediante WB con el anticuerpo comercial policlonal de conejo anti-PVRIG humana (Sigma, cat. N° HPA047497), usando extractos celulares enteros de diversas líneas celulares. Los extractos de células HEK293 que sobre-expresan ectópicamente PVRIG humana (calle 2) o de células transfectadas con vector vacío (calle 1), se usaron como controles positivo y negativo, respectivamente.
Figura 59: análisis qRT-PCR de tránscrito de PVRIG en la línea celular Jurkat transfectada con siARN de PVRIG. La línea celular de cáncer humano Jurkat, transfectada con siARN de PVRIG humana o con siARN mixto fue analizada mediante qRT-PCR usando la sonda TaqMan de PVRIG humana n° Hs04189293_g1, y se normalizó con geo-media de dos genes domésticos indicados en la tabla anterior. Los valores Ct se detallan en la tabla. Se indica la desviación estándar de triplicados técnicos de la reacción de PCR.
Figura 60: expresión de membrana de proteína PVRIG humana en la línea celular humana Jurkat transfectada con siARN de PVRIG humana. Las células Jurkat transfectadas con siARN de PVRIG humana fueron teñidas con Ab Inc monoclonal anti-PVRIG, CPA.7.021 (panel izquierdo, línea verde) o con anticuerpo de control de isotipo IgG2 (panel izquierdo, línea azul) y con Ab Sigma (panel derecho, línea roja) o con IgG (panel derecho, línea azul). Las células transfectadas con siARN mixto fueron teñidas con el mismo anti-PVRIG (naranja) o control de isotipo (panel izquierdo, línea roja, para tinción de mAb; panel derecho, línea verde, para Sigma Ab). Tras un lavado celular, se añadió Ab secundario conjugado anti-ratón de cabra-PE solo a Sigma Ab.
Figura 61: indica un resumen de los descubrimientos descritos en este informe, destacando las líneas celulares que muestran correlación entre qPCR y FACS, confirmada mediante bloqueo, HSKG- gen doméstico, - Positivo, NT- No evaluado, X- negativo, KD- bloqueado.
Figura 62: indica un resumen de los descubrimientos descritos en este informe, destacando las líneas celulares que muestran correlación entre qPCR y FACS, confirmada mediante bloqueo, HSKG- gen doméstico, - Positivo, NT- No evaluado, X- negativo, KD- bloqueado.
Figura 63A-63D: muestra las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 de cada uno de los anticuerpos CPA enumerados en la invención, de CPA.7.001 a CPA.7.050 son secuencias humanas (de visualización de fagos).
Figura 64A-64B: muestra los resultados del cribado del Ejemplo 1B.
Figura 65: anticuerpos específicos y concentración de tinción usada en el Ejemplo 11.
Figura 66A-66C: muestra las secuencias de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas.
Figura 67: muestra un número de fragmentos ECD de PVRIG humana.
Figura 68: muestra la curva de unión correspondiente a CPA.7.021 tal como se muestra en el Ejemplo 13.
Figura 69A-69C: Detección de la expresión superficial de CD137 y PD-1. Se activaron células T CD8+, células T CD4+ y TILs y se monitorizaron a lo largo del tiempo en 4 puntos temporales tal como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Las células en reposo o activadas fueron acotadas en primer lugar para linfocitos (FSC-A frente a SSC-A), seguido de acotamiento de células vivas, acotamiento posterior para singletes (FSC-H frente a FSC-A), células positivas CD4/CD8 y acotamiento adicional para CD137 y PD1. Expresión superficial de PD-1 (izquierda) y CD137 (derecha) en (A) células T CD8+, (B) células T CD4+ y (C) TILs a diferentes tiempos finales normalizada respecto al control de isotipo a lo largo del tiempo de transcurso de la activación.
Figura 70A-70C: expresión de PVRIG en células T CD4+ y T CD8+ en reposo y activadas. Las células T CD4+ y CD8+ fueron activadas y monitorizadas a lo largo de cuatro puntos temporales como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Las células fueron teñidas con colorante de viabilidad, a continuación se incubaron con anti-PVRIG y control de isotipo (7,5 pg/mL), y se evaluaron mediante citometría de flujo. (A) Expresión de células T CD4+. Expresión de PVRIG en células CD4+ vivas en reposo (tiempo 0) y activadas tras acotamiento de singlete para 24, 48, 72h y 144h en comparación con el control de isotipo. (B) Expresión en células T CD8+. Expresión de PVRIG en células CD8+ vivas en reposo (tiempo 0) y activadas tras acotamiento de singlete para 24, 48, 72h y 144h en comparación con el control de isotipo. Mostrada como la Media Geométrica de los valores de intensidad fluorescente obtenida. (C) Normalización de tinción de inducción de plegamiento con ab anti-PVRIG-CPA.7.021 en comparación con el isotipo de IgG2 humana con el tiempo en el transcurso de la activación.
Figura 71A-71C: expresión de PVRIG en TILs en reposo y activadas. Se activaron TILs Mart1 y 209 y se monitorizaron a lo largo del tiempo en cuatro puntos temporales, tal como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Las células fueron teñidas con colorante de viabilidad, a continuación se incubaron con anti-PVRIG y control de isotipo (7,5 pg/mL), y se evaluaron mediante citometría de flujo. (A) Expresión en TIL Mart1. Expresión de PVRIG en TIL vivas en reposo (tiempo 0) y activadas después de acotamiento de singlete para 24, 48, 72h y 144h en comparación con el control de isotipo. (B) Expresión en TIL 209. Expresión de PVRIG en TIL vivas en reposo (tiempo 0) y activadas después de acotamiento de singlete para 24, 48, 72h y 144h en comparación con control de isotipo. Se muestran las Medias Geométricas de los valores de intensidad fluorescente obtenidos. (C) Normalización de tinción de inducción de pliegue con ab anti PVRIG-CPA.7.021 en comparación con el control de isotipo de IgG2 con el tiempo en el transcurso de la activación.
Figura 72: Expresión de PVRL2 en DC derivadas de monocitos. Se muestra la expresión de PVRL2 (triángulos con línea discontinua) en función del tiempo (días) respecto del control de isotipo (círculos con línea continua). Día después de diferenciación indica el tiempo después de la adición de GM-CSF e IL-4 a los monocitos.
Figura 73A-73B: Expresión de PVRIG en células T CD4 y CD8 en el MLR. Se muestra la expresión de PVRIG en células T en proliferación (CFSE bajo) y no proliferación (CFSE alto). Los datos derivan de tres donantes de células T CD3 individuales y un rango de anticuerpos de PVRIG. CFSE se mide en el eje X y la expresión de PVRIG se mide en el eje Y. Las 3 series superiores de representaciones de puntos indican la expresión de PVRIG en células T CD4, y las 3 series inferiores indican la expresión en células T CD8.
Figura 74A-74B: Expresión normalizada de PVRIG en células T CD4 y CD8 en el MLR. Se muestra la expresión de PVRIG normalizada respecto al control de isotipo de mIgG1 de tres donantes de células T CD3 individuales para todos los anticuerpos analizados.
Figura 75A-75B: Los anticuerpos de PVRIG aumentan la proliferación de células T en el MLR. Se muestran los porcentajes de niveles bajos de CFSE a partir de los ensayos de MLR tratados con los anticuerpos de PVRIG indicados. Cada gráfico representa un donante de células T c D3 individual.
Figura 76: Análisis de epítopos basado en FACS de anticuerpos de PVRIG en células T. Se indica el nivel de unión de CPA.7.021 conjugado (derivado de la campaña de fagos) tras la pre-incubación de células T con anticuerpos de PVRIG no conjugados derivados de nuestra campaña de hibridoma, así como los controles relevantes. El análisis se llevó a cabo en células T de CFSE bajo derivadas del MLR.
Figura 77: Especificidad de anticuerpo de PVRIG hacia células HEK diseñadas para sobre-expresar PVRIG. Los datos muestran las medidas de MFI geométrica (gMFI) absoluta en función del incremento de concentración de anticuerpos. La línea negra discontinua con cuadrados muestra la tinción de células HEK hPVRIG con un anticuerpo de PVRIG anti-humano representativo (CHA.7.518), y la línea negra continua con círculos muestra la tinción de células HEK progenitoras con el mismo anticuerpo.
Figura 78: Los anticuerpos de PVRIG muestran especificidad hacia células Jurkat. Los datos muestran las medidas de MFI geométrica (gMFI) absoluta por FACS en función del incremento de concentración de anticuerpos. La línea negra discontinua con cuadrados muestra la tinción de células Jurkat con el anticuerpo de PVRIG anti-humano (CHA.7.518), y la línea negra continua con círculos muestra la tinción con un anticuerpo de control mIgG1.
Figura 79A-79B: Características de unión a anticuerpo de hibridoma de PVRIG a líneas celulares modificadas de HEK hPVRIG, células HEK progenitoras y células Jurkat. HEK OE denota células HEK hPVRIG, HEK par denota células HEK progenitoras. Para los datos de Jurkat, gMFIr indica la tasa de diferencia en MFI geométrica de la tinción de anticuerpos de PVRIG respecto a sus controles. La concentración indica aquella a la cual se calculó la gMFIr. No unión indica que el anticuerpo no se une a la línea celular evaluada. Los anticuerpos resaltados son los cuatro primeros anticuerpos de interés.
Figura 80A-80B: Características de unión de anticuerpo de hibridoma de PVRIG a PBMC humanas primarias, células cyno de sobre-expresión, y PBMCs de cyno primarias. Expi cyno OE denota células expi transfectadas transitoriamente con cPVRIG, expi par denota células parenterales expi. gMFIr indica la tasa de diferencia en MFI geométrica de tinción de anticuerpo de PVIRG respecto a sus controles. Las concentraciones indican aquellas a las que se calculó la gMFIr. No evaluado indica los anticuerpos que no fueron evaluados debido a una ausencia de unión a HEK hPVRIG humana, células cPVRIG expi, o no que cumplen los requerimientos de unión a subconjuntos de PBMC. Los anticuerpos destacados son los cuatro primeros anticuerpos de interés.
Figura 81A-81B: Resumen de la capacidad de bloqueo de los anticuerpos de PVRIG en el ensayo competitivo basado en FACS. Se indica la IC50 de la inhibición. No IC50 indica que dichos anticuerpos son no-bloqueantes. Los anticuerpos destacados son los cuatro primeros anticuerpos de interés.
Figura 82: Validación de KD llevada a cabo en TILs 24h después de electroporación con siARN. Las TILs fueron teñidas con anti PVRIG o anti PD-1 analizado con FACS. El porcentaje de población KD se calcula respecto a SCR teñido con el Ab relevante.
Figura 83A-83C: Se co-cultivaron KD TILs (específicas de MART-1) con células de melanoma 624 en E:T 1:1 durante 18 h y se tiñeron con anticuerpo anti CD8a, así como con anticuerpo anti CD137, y se analizaron mediante FACS. Se representa la intensidad de fluorescencia media geométrica (A). Asimismo, se recolectó el sobrenadante de co-cultivo, y se evaluó en un ensayo de matriz de perlas citométricas Th1 Th2 Th17 para detectar citoquinas secretadas. Se detectaron los niveles de IFNy y TNF (B,C). El porcentaje de efecto de un tratamiento se calcula comparand o dicho tratamiento con el control de SCR. La figura muestra datos representativos de 2 experimentos independientes. Los tratamientos se comparan con el test-t de Student (*P < 0,05, **P < 0,01) de muestras triplicadas.
Figura 84A-84B: Se co-cultivaron KD TILs (específicas de F4 gp100) con células de melanoma 624 en E:T 1:3 durante 18h y se tiñeron con anticuerpo anti CD8a, así como con anticuerpo anti CD137, y se analizaron mediante FACS. Se representa la intensidad de fluorescencia media geométrica (A). Asimismo, se recolecto el sobrenadante de co-cultivo y se evaluó en un ensayo de matriz de perlas citométrico Th1 Th2 Th17 para detectar las citoquinas secretadas. Se detectaron los niveles de IFNy (B). Se ha calculado el porcentaje del efecto de tratamiento comparando cada tratamiento con el control de SCR. La Figura muestra los datos representativos de 2 experimentos independientes. Se compararon los tratamientos mediante test-t de Student (*P < 0,05, **P < 0,01) de muestras triplicadas.
Figura 85A-85B: Se co-cultivaron TILs con células de melanoma 624 a E:T 1:1 durante 18h en presencia de Ab anti-PVRIG (CPA.7.021; 10 pg/mL), anti-TIGIT (clon 10A7; 10 pg/mL) o en combinación. Se recolectó el sobrenadante y se evaluó en un ensayo de matriz de perlas citométricas Th1 Th2 Th17 para detectar citoquinas secretadas. Se detectaron los niveles de IFNy (A) y TNF (B). Los tratamientos se compararon con el test-t de Student (*P < 0,05, **P < 0,01) de muestras triplicadas.
Figura 86A-86F: se co-cultivaron TILs MART-1 o 209 con células de melanoma 624 a E:T 1:1 durante 18h en presencia de Ab anti-PVRIG (CPA.7.021; 10 pg/mL), anti-DNAM1 (clon DX11; 10 pg/mL) o en combinación. Se recolectó el sobrenadante y se evaluó en un ensayo de matriz de perlas citométricas Th1 Th2 Th17 para detectar citoquinas secretadas. Se detectaron los niveles de IFNy (A,D) y TNF (B,E). Las TILs fueron teñidas para expresión superficial de CD137 (C,F).
Figura 87A-87B: se co-cultivaron TILs (F4) con células de melanoma 624 a E:T 1:3 durante 18h en presencia de Ab anti-PVRIG (CPA.7.021; 10 pg/mL), anti-TIGIT (clon 10A7; 10 pg/mL), anti-PD1 (mAb 1B8, Merck; 10 pg/mL) o en combinación. Se recolectó el sobrenadante y se evaluó en un ensayo de matriz de perlas citométricas Th 1 Th2 Th17 para detectar citoquinas secretadas. Se detectaron los niveles de IFNy (A) y TNF (B).
Figuras 88A-88II: Muestra cuatro secuencias humanizadas correspondientes a CHA.7.518, CHA.7.524, CHA.7.530, CHA.7.538_1 y CHA.7.538_2. Nótese que la cadena ligera de ChA.7.538_2 es la misma que la de CHA.7.538_1. La “H1” de cada una es una “permuta de CDR” sin cambios en la estructura humana. Las secuencias posteriores alteran cambios estructurales mostrados en fuente negrita más grande. Las secuencias de CDR se muestran en negrita. Las definiciones de CDR son AbM de la web www.bioinf.org.uk/abs/. Las secuencias de línea germinal human y de unión de IMGT® el sistema de información internacional de ImMunoGeneTics® www.imgt.org (fundador y director: Marie Paule Lefranc, Montpellier, Francia). La numeración de residuos mostrada como secuencial (seq) o de acuerdo a Chothia, del sitio web www.bioinf.org.uk/abs/ (AbM). “b” denota cadena lateral enterrada; “p” denota parcialmente enterrada; “i” denota cadena lateral en la interfaz entre los dominios VH y VL. Diferencias de secuencias entre líneas germinales humana y de ratón denotadas mediante asterisco (*). Las potenciales mutaciones adicionales en las estructuras se indican debajo de la secuencia. Los potenciales cambios en las secuencias CDR se indican debajo de cada secuencia CDR, tal como se indica en la figura (n° de sustituciones de desamidación: Q/S/A; éstas pueden prevenir la desamidación de asparagina (N). @ sustituciones de oxidación de triptófano: Y/F/H; éstas pueden prevenir la oxidación de triptófano; @ sustituciones de oxidación de metionina: L/F/A.
Figuras 89A-E: muestran una recopilación de las secuencias humanizadas de cinco anticuerpos CHA.
Figura 90: muestra esquemas para combinar los anticuerpos CHA VH y VL humanizados de las Figuras 88 y las Figuras 89. “chimVH” y “chimVL” son las secuencias variables de cadena pesada y ligera de ratón unidas a un dominio constante de IgG humana.
Figura 91: Características de unión a anticuerpo de hibridoma de PVRIG a PBMC humanas primarias, células cyno sobre-expresadas, y PBMCs cyno primarias. Expi cyno OE denota células expi transfectadas transitoriamente con cPVRIG, expi par denota células progenitoras expi. gMFIr indica la tasa de diferencia en MFI geométrica de tinción de anticuerpo de PVRIG respecto a sus controles. Las concentraciones indican aquellas a las que se calculó la gMFIr. No evaluado indica anticuerpos que no fueron evaluados debido a una ausencia de unión a HEK hPVRIG, células cPVRIG expi, o no que no cumplen los requerimientos de unión a subconjuntos de PBMCs. Los anticuerpos resaltados son cuatro anticuerpos para los cuales se realizó la humanización (véase la Figura 90).
Figura 92: Resumen de la capacidad bloqueante de anticuerpos de PVRIG en el ensayo competitivo basado en FACS. Se indica la IC50 de inhibición. No IC50 indica que dichos anticuerpos son no-bloqueantes. Los anticuerpos destacados son cuatro anticuerpos para los cuales se ha realizado la humanización (véase la Figura 90).
Figura 93A-93C. Efecto de los anticuerpos de PVRIG en el bloqueo de la interacción entre PVRIG y PVRL2. (a-b) Los datos muestran cambios en la gMFI absoluta que representan cambios en la unión de PVRIG soluble a células HEK cuando se añaden cuatro anticuerpos de PVRIG para alterar la interacción. También se indican los valores de IC50 de cada anticuerpo en cada ensayo. A) Los datos muestran la disrupción de PVRIG soluble en células HEK cuando los anticuerpos son pre-incubados con antígeno. B) Los datos muestra la disrupción de PVRIG soluble con células HEK cuando se añaden los anticuerpos concomitantemente con el antígeno. C) Los datos muestran cambios en gMFI absoluta que representan cambios en la unión de PVRL2 Fc soluble a células HEK hPVRIG cuando se añaden cuatro anticuerpos de PVRIG para alterar la interacción. Se indican los valores de IC50 de cada anticuerpo. ND denota no determinado.
Figura 94A-94H: Expresión de receptor y ligando de células NK en células Reh. Se muestra la expresión de receptores de célula NK tales como a) PVRIG, b) DNAM-1, c) TIGIT. Se muestra la expresión de ligandos de receptor n K tales como d) PVR, e) PVRL2, f) ULBP2/5/6, g) ULBP3 y h) MICA/B. Los histogramas gris sólidos representan los controles de isotipo y los histogramas negros huecos representan el anticuerpo de interés.
Figura 95: Efecto de anticuerpos de PVRIG en el aumento de la citotoxicidad mediada por células NK contra células Reh. Se examinó el efecto de 5 pg/mL de CPA.7.002 (a), CPA.7.005 (b), CPA.7.021 (a-c), y CPA.7.050 (c) en ensayos de citotoxicidad de células NK contra células Reh, donde el número de células NK fue valorado contra un número constante de células Reh. d) Se examinó el efecto de variar la concentración de CPA.7.002 y CPA.7.021 sobre la citotoxicidad mediada por células NK con un número constante de células NK respecto a Reh (5:1). Se examinó DNAM-1 (e) y TIGIT (f) en ensayos con condiciones como las descritas en los paneles a-c.
Figura 96A-96H: Expresión de receptor y ligando de células NK en células MOLM-13. Se muestra la expresión de receptores de células NK tales como a) PVRIG, b) DNAM-1, e) TIGIT. Se muestra la expresión de ligandos de receptor NK tales como d) PVR, e) PVRL2, f) ULBP2/5/6, g) ULBP3, y h) MICA/B. Los histogramas grises sólidos representan los controles de isotipo y los histogramas negros abiertos representan el anticuerpo de interés.
Figura 97A-97B: Efecto de anticuerpos de PVRIG sobre el aumento de la citotoxicidad mediada por células NK contra células MOLM-13. a) Se examinó el efecto de 5 pg/mL de CPA.7.002, CPA.7.005, y CPA.7.021 en ensayos de citotoxicidad de células NK contra células MOLM-13, donde el número de células NK fue valorado contra un número constante de células MOLM-13. b) Se examinó TIGIT de forma similar al panel a.
Figura 98: Resumen de la capacidad de bloqueo de anticuerpos de PVRIG en el ensayo bioquímico celular. Se indica la permutación de ensayo y orientación, y la IC50 de inhibición. (P) indica la permutación de ensayo donde los anticuerpos de PVRIG son pre-incubados con antígeno de PVRIG antes de la adición a células HEK. (NP) indica la adición concomitante de anticuerpos de PVRIG y de antígeno de PVRIG a células HEK. El aumento de unión indica que la unión de PVRL2 Fc a células HEK hPVRIG se vio potenciada, en lugar de inhibida.
Figura 99: Resumen de la actividad de anticuerpos de PVRIG seleccionados en ensayos de citotoxicidad de células NK contra células Reh y MOLM-13. La tasa de cambio de la citotoxicidad respecto al control se calculó dividiendo el nivel absoluto de muerte (%) en la condición con anticuerpo de PVRIG, por el nivel absoluto de muerte (%) con anticuerpo de control. La tasa de cambio se calcula a partir de la ratio efector a diana de 5:1.
Figura 100: Alineamiento de secuencia de ortólogos de PVRIG. Secuencias alineadas del dominio extra-celular de PVRIG de humano, cynomolgus, marmoset y Rhesus. Las diferencias entre humanos y cynomolgus están resaltadas en amarillo.
Figura 101: Unión de anticuerpos anti-PVRIG humana a variantes de PVRIG de cyno, humanas e híbridas cyno/humana. Se muestra la unión de anticuerpos a PVRG natural de cyno (•), H61R cyno PVRIG (■), P67S cyno PVRIG (▲), L95R/T97I cyno PVRIG (▼) y human PVRIG humana natural (♦). Se representan las señales ELISA en función de la concentración de anticuerpos.
Figura 102: Correlación de grupo de epítopos y reactividad cruzada con cyno de anticuerpos anti-PVRIG humana.
Figura 103A-103BX: muestra una serie de secuencias de uso en la invención.
Descripción detallada de la invención
I. Introducción
El cáncer puede considerarse como una incapacidad del paciente para reconocer y eliminar células cancerosas. En muchos casos, dichas células transformadas (p.ej., cancerosas) contrarrestan la inmunovigilancia. Existen mecanismos de control naturales que limitan la activación de células T en el cuerpo para prevenir la actividad incontrolada de células T, que pueden ser aprovechados por las células cancerosas para evadir o suprimir la respuesta inmune. La restauración de la capacidad de las células inmunes efectoras, especialmente las células T, para reconocer y eliminar el cáncer es la meta de la inmunoterapia. El campo de la inmuno-oncología, a veces referida como “inmunoterapia”, está evolucionando rápidamente, con varias aprobaciones recientes de anticuerpos inhibidores de punto de control de células T, tales como Yervoy, Keytruda y Opdivo. Dichos anticuerpos generalmente se denominan “inhibidores de punto de control” debido a que bloquean los reguladores normalmente negativos de la inmunidad de células T. De forma general, se entiende que se puede usar una variedad de señales inmunomoduladoras, tanto coestimuladoras como coinhibidoras, para orquestar una respuesta inmune específica de antígeno óptima. Generalmente, dichos anticuerpos se unen a proteínas inhibidoras de puntos de control tales como CTLA-4 y p D-1 , lo que en circunstancias normales previene o suprime la activación de células T citotóxicas (CTLs). Con la inhibición de la proteína de punto de control, por ejemplo a través del uso de anticuerpos que se unen a dichas proteínas, se puede conseguir un aumento de la respuesta de células T contra tumores. Es decir, dichas proteínas de punto de control cancerosas suprimen la respuesta inmune; cuando las proteínas son bloqueadas, por ejemplo usando anticuerpos para la proteína de punto de control, el sistema inmunitario se activa, dando lugar a una estimulación inmune, que da como resultado el tratamiento de afecciones tales como el cáncer y enfermedades infecciosas.
La presente invención está dirigida al uso de anticuerpos para la Proteína que Contiene Dominio de Inmunoglobulina Relacionada con Receptor, o “PVRIG”, a veces también denominada aquí “proteína PV”. La PVRIG se expresa sobre la superficie celular de células NK y T y comparte varias similitudes con otros puntos de control inmunes conocidos.
Se usaron algoritmos computacionales para analizar el genoma humano a fin de identificar nuevos puntos de control inmunes. Se identificaron genes que se predice que son proteínas superficiales celulares, que tienen un dominio de Ig y que se expresan en células inmunes dentro del microentorno tumoral, específicamente en linfocitos infiltrantes de tumor (TILs), que se presume que son receptores. Se identificaron las proteínas que tienen un único dominio IgV y que tiene una estructura de tipo ITIM intracelular, lo que sugiere que están actuando como punto de control inmune y que presentan un efecto inhibidor sobre las células T y/o las células NK. Una vez identificados computacionalmente, se realizaron varios experimentos de validación, que incluyen: estudios de expresión que demuestran que la PVRIG se expresa sobre linfocitos y sobre linfocitos dentro del microentorno tumoral y que tiene un efecto inhibidor sobre las células NK y T (demostrados ambos con experimentos de bloqueo y con anticuerpos dirigidos a PVRIG). Se identificó/confirmó que PVRL2 es la contrapartida de PVRIG. Se generaron anticuerpos que se unen a PVRIG, y a continuación se identificó un subconjunto de los mismos que se unía a PVRIG y que bloqueaba la interacción de PVRIG y PVLR2.
Por consiguiente, cuando la PVRIG se une a su ligando (PVRL2), se activa una señal inhibidora que actúa para atenuar la respuesta inmune de células NK y T contra una célula diana (es decir, análogo a PD-1/PDL1). El bloqueo de la unión de PVRL2 a PVRIG desconecta dicha señal inhibidora de la PVRIG y como resultado modula la respuesta inmune de las células NK y T. El uso de un anticuerpo contra PVRIG que bloquea la unión a PVRL2 es una estrategia que podría potenciar la muerte de células cancerosas por células NK y T. Se han generado anticuerpos de bloqueo que se unen a PVRIG y que bloquean la unión de su ligando, PVRL2.
Tal como se muestra en la sección de Ejemplos más adelante, la expresión de PVRIG ha sido correlacionada positivamente con la expresión de PD-1, una proteína de punto de control inmune conocida. Adicionalmente, se demostró que la introducción de PVRIG (como proteína de fusión de dominio extracelular (ECD)) inhibe la activación de células T, y por tanto el uso de anticuerpos anti-PVRIG conduce a la activación de células T. Por consiguiente, se pueden usar anticuerpos anti-PVRIG para tratar afecciones para las cuales se desea la activación de células T o NK, tal como en el cáncer.
Los efectos funcionales de los anticuerpos de bloqueo de PVRIG sobre las células NK y T puede determinarse in vitro (y en algunos casos in vivo, tal como se describe más detalladamente en secciones posteriores) midiendo los cambios en los siguientes parámetros: proliferación, liberación de citoquinas y marcadores de superficie celular. Para las células NK, los incrementos de la proliferación celular, la citotoxicidad (capacidad para matar células diana, medida por un aumento de CD107a, granzima, y expresión de perforina, o midiendo indirectamente la muerte de células diana), la producción de citoquinas (p.ej., IFN-y y TNF), y la expresión de receptor de superficie celular (p.ej., CD25) son indicativos de modulación inmune, p.ej., de un aumento de la muerte de células cancerosas. Para las células T, los aumentos de la proliferación, los aumentos de la expresión de marcadores de superficie celular de activación (p.ej., CD25, CD69, CD137 y PD1), la citotoxicidad (capacidad para matar células diana), y la producción de citoquinas (p.ej., IL-2, IL-4, IL-6, IFNy, TNF-a, IL-10, IL-17A) son indicativos de modulación inmune, p.ej., de un aumento de la muerte de células cancerosas.
Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos, que incluyen dominios de unión a antígeno, que se unen a pps PVRIG humana y a métodos para activar las células T y/o las células NK para tratar enfermedades tales como el cáncer.
II. Proteínas PVRIG
La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a proteínas PVRIG. “Proteína” en este contexto se usa de forma intercambiable con “polipéptido”, e incluye también péptidos. La presente invención proporciona anticuerpos que se unen específicamente a proteínas PVRIG. La PVRIG es una proteína de dominio de transmembrana de 326 aminoácidos de longitud, con un péptido señal (que se extiende desde al aminoácido 1 al 40), un dominio extracelular (que se extiende desde el aminoácido 41 al 171), un dominio transmembrana (que se extiende desde el aminoácido 172 al 190) y un dominio citoplásmico (que se extiende del aminoácido 191 al 326). La proteína PVRIG de longitud completa se muestra en la Figura 25. Existen dos metioninas que pueden ser codones de inicio, pero las proteínas maduras son idénticas.
Por consiguiente, tal como se usan en la presente memoria, los términos “PVRIG” o “proteína PVRIG” o “polipéptido PVRIG” pueden incluir opcionalmente cualquiera de dichas proteínas, o variantes, conjugados o fragmentos de los mismos, que incluyen aunque sin limitación la PVRIG conocida o natural, tal como se describe en la presente memoria, así como cualesquier variantes de división naturales, variantes de aminoácido naturales o isoformas, y en particular el fragmento ECD de PVRIG. El término forma “soluble” de la PVRIG también se usa de forma intercambiable con los términos “ectodominio soluble (ECD)” o “ectodominio” o “dominio extracelular (ECD), así como “fragmentos de polipéptidos de PVRIG”, que pueden referirse de forma amplia a uno o más de los siguientes polipéptidos opcionales:
Las proteínas PVRIG contienen un dominio de inmunoglobulina (Ig) dentro del dominio extracelular, que es un dominio de pliegue Ig de tipo PVR. El dominio de pliegue Ig de tipo PVR puede ser responsable de la unión de contrapartida funcional, por analogía con los otros miembros de la familia B7. El dominio de pliegue Ig de tipo PVR del dominio extracelular incluye un enlace de disulfuro formado entre los residuos de cisteína intra dominio, como es típico para este pliegue y puede ser importante para la estructura-función. Estas cisteínas están localizadas en los residuos 22 y 93 (o 94). En una realización, se proporciona un fragmento soluble de PVRIG que puede usarse en la evaluación de anticuerpos de PVRIG.
Dentro de la definición de proteínas PVRIG se incluyen los fragmentos ECD de PVRIG. Opcionalmente, los fragmentos ECD de PVRIG también se refieren a una cualquiera de las secuencias de polipéptido enumeradas en la Figura 67, que de forma razonable es de esperar que comprendan regiones funcionales de la proteína PVRIG. Esta expectativa se basa en un análisis sistemático de un conjunto de complejos proteínicos con estructuras 3D resueltas, que contenían complejos de proteínas Ig (por ejemplo, PDB ID 1i85 que describe el complejo de CTLA4 y CD86). Se recolectaron los residuos de contacto intermolecular de cada “co-estructura” de cada PDB y se proyectaron sobre la secuencia de PVRIG. Se identificaron varias regiones con agrupaciones de residuos en interacción soportado por varios mapas de contacto y se sintetizaron como una serie de péptidos, y de forma razonable es de esperar que imiten la estructura de la proteína de longitud completa intacta y que con ello modulen uno o más de los efectos de la PVRIG sobre la inmunidad y sobre los tipos específicos de célula inmune. Según al menos algunas de las realizaciones de la invención, los fragmentos ECD de PVRIG representados por las secuencias de polipéptido enumeradas en la Figura 67 se localizan como se indica a continuación (en comparación con el ECD de PVRIG humana de la Figura 25, contando desde el primer aminoácido del ECD): Fragmento A de PVRIG, está localizado en las posiciones 46 a 66: Fragmento B de PVRIG, está localizado en las posiciones 46 a 79; Fragmento C de PVRIG, está localizado en las posiciones 63 a 79; Fragmento D de PVRIG, está localizado en las posiciones 91 a 106; Fragmento E de PVRIG, está localizado en las posiciones 91 a 114; Fragmento F de PVRIG, está localizado en las posiciones 11 a 25; Fragmento G de PVRIG, está localizado en las posiciones 3 a 24; Fragmento H de PVRIG, está localizado en las posiciones 18 a 36; Fragmento I de PVRIG, está localizado en las posiciones 29 a 52; Fragmento J de PVRIG, está localizado en las posiciones 73-98.
Tal como se indica en la presente memoria y se describe más detalladamente a continuación, los anticuerpos anti-PVRIG (que incluyen los fragmentos de unión a antígeno) que se unen a PVRIG y que evitan la activación por PVRL2 (p.ej., del modo más común, bloqueando la interacción de PVRIG y PVLR2), se usan para potenciar la activación de células T y/o células NK, y se usan para tratar enfermedades tales como el cáncer y la infección de patógenos.
III. Anticuerpos
Por consiguiente, la invención proporciona anticuerpos anti-PVRIG. PVRIG, también denominada Proteína que Contiene Dominio de Inmunoglobulina Relacionada con Receptor de Polivirus, Q6DKI7 o C7orf15, se refiere a las secuencias de aminoácidos y de ácido nucleico mostradas en el identificador de acceso RefSeq NP_076975, mostrado en la Figura 25. Los anticuerpos de la invención son específicos del dominio extracelular de PVRIG, tal como se detalla en la presente memoria.
Tal como se discute más adelante, el término “anticuerpo” se usa de forma general. Los anticuerpos que tienen uso en la presente invención pueden adoptar una serie de formatos como se describe en la presente memoria, que incluyen anticuerpos tradicionales, así como derivados de anticuerpos, fragmentos y miméticos, descritos más adelante. En general, el término “anticuerpo” incluye cualquier polipéptido que incluye al menos un dominio de unión a antígeno, como se describe más detalladamente más adelante. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, xenogénicos, alogénicos, singénicos o formas modificadas de los mismos, tal como se describe en la presente memoria, siendo particularmente útiles los anticuerpos monoclonales en muchas realizaciones. En algunas realizaciones, los anticuerpos de la invención se unen específicamente o de forma sustancialmente específica a moléculas de PVRIG. Los términos “anticuerpos monoclonales” y “composición de anticuerpos monoclonales”, tal como se usan en la presente memoria, se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solo una especie de sitio de unión a antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular de un antígeno, mientras que el término “anticuerpos policlonales” y “composición de anticuerpos policlonales” se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen múltiples especies de sitios de unión a antígeno capaces de interaccionar con un antígeno particular. Una composición de anticuerpos monoclonales, típicamente presenta una única afinidad por un antígeno particular, con el cual inmunorreacciona.
Las unidades estructurales de anticuerpo de longitud completa tradicionales típicamente comprenden un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto típicamente por dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada para con una cadena “ligera” (que presenta típicamente un peso molecular de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (que presenta típicamente un peso molecular de aproximadamente 50-70 kDa). Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras kappa y lambda. La presente invención está dirigida a la clase IgG, que tiene varias subclases, que incluyen, aunque sin limitación IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Por tanto, “ isotipo” tal como se usa en la presente memoria significa cualquiera de las subclases de inmunoglobulinas definidas por las características químicas y antigénicas de sus regiones constantes. Aunque los ejemplos de anticuerpos designados en la presente memoria como “CPA” se basan en regiones constantes pesadas de IgG1, tal como se muestra en la Figura 38, los anticuerpos anti-PVRIG de la invención incluyen aquellos que usan secuencias de IgG2, IgG3 e IgG4, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, como es sabido en la técnica, diferentes isotipos de IgG tienen diferentes funciones efectoras que pueden ser deseables o no. Por consiguiente, los anticuerpos CPA de la invención también pueden cambiar los dominios constantes de IgG1 por dominios constantes de IgG2, IgG3 o IgG4 (mostrado en la Figura 66), siendo particularmente útiles la IgG2 y la IgG4 en una serie de situaciones, por ejemplo para facilitar la fabricación, o cuando se desea reducir la función efectora, siendo esto último lo deseado en algunas situaciones.
Para los anticuerpos enumerados de la designación CHA, éstos son anticuerpos de ratón generados en hibridomas (la designación “H”), y por tanto en general están humanizados como se conoce en la técnica, general mente en las regiones estructurales (F1 a F4 de cada una de las regiones variables pesadas y ligeras), y después se injertan en dominios constantes pesados y ligeros de IgG1, IgG2, IgG3 o IgG4 humana (mostrado en la Figura 66), nuevamente siendo particularmente útil la IgG4, tal como se describe detalladamente más adelante.
La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos responsables principales del reconocimiento de antígeno, referidos generalmente en la técnica y en la presente memoria como “dominio Fv” o “región Fv”. En la región variable, se reúnen tres bucles para cada uno de los dominios V de la cadena pesada y de la cadena ligera para formar un sitio de unión a antígeno. Cada uno de los bucles recibe el nombre de región determinante de la complementariedad (referido en la presente memoria a partir de ahora como “CDR”), donde la variación de la secuencia de aminoácidos es más significativa. “Variable” se refiere al hecho de que determinados segmentos de la región variable difieren extensivamente en secuencia entre anticuerpos. La variabilidad dentro de la región variable no está distribuida uniformemente. En su lugar, las regiones V consiste en tiras relativamente invariantes denominadas regiones estructurales (FRs) de 15-30 aminoácidos separadas por regiones más cortas de variabilidad extrema denominadas “regiones hipervariables”.
Cada VH y VL está compuesta de tres regiones hipervariables (“regiones determinantes de complementariedad”, “CDRs”) y cuatro FRs, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxi en el siguiente orden: FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.
La región hipervariable generalmente abarca residuos de aminoácido de aproximadamente los residuos de aminoácido 24-34 (LCDR1; “L” denota cadena ligera), 50-56 (LCDR2) y 89-97 (LCDR3) en la región variable de cadena ligera y de aproximadamente 31-35B (HCDR1; “H” denota cadena pesada), 50-65 (HCDR2), y 95-102 (HCDR3) en la región variable de cadena pesada, aunque a veces la numeración se desplaza ligeramente, como apreciarán los especialistas en la técnica; Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5 th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) y/o aquellos residuos que forman un bucle hipervariable (p.ej., los residuos 26-32 (LCDR1), 50-52 (LCDR2) y 91-96 (LCd R3) de la región variable de cadena ligera, y 26-32 (HCDR1), 53-55 (HCDR2) y 96-101 (HCDR3) de la región variable de cadena pesada; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917. Las CDRs específicas de la invención se describen a continuación y se muestran en la Figura 40.
La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante como responsable principal de la función efectora. Kabat et al. recogieron numerosas secuencias primarias de las regiones variables de cadenas pesadas y cadenas ligeras. En base al grado de conservación de las secuencias, clasificaron las secuencias primarias individuales en la CDR y la estructura y prepararon una lista de las mismas (véase SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5 th edition, NIH publication, No. 91-3242, E. A. Kabat et al., incorporado en su plenitud a modo de referencia).
En la subclase IgG de inmunoglobulinas, existen varios dominios de inmunoglobulina en la cadena pesada. Con “dominio de inmunoglobulina (Ig)” en la presente memoria se pretende indicar una región de una inmunoglobulina que tiene una estructura terciaria distinta. De interés en la presente invención son los dominios de cadena pesada, que incluyen, los dominios pesados constantes (CH) y los dominios de bisagra. En el contexto de anticuerpos de IgG, los isotipos de IgG tienen cada uno tres regiones CH. Por consiguiente, los dominios “CH” en el contexto de IgG son los siguientes: “CH1” se refiere a las posiciones 118-220 según el índice EU como en Kabat. “CH2” se refiere a las posiciones 237-340 según el índice EU como en Kabat, y “CH3” se refiere a las posiciones 341-447 según el índice EU como en Kabat.
Por consiguiente, la invención proporciona dominios pesados variables, dominios ligeros variables, dominios constantes pesados, dominios ligeros constantes y dominios Fc para su uso tal como se describe en la presente memoria. Por “región variable” tal como se usa en la presente invención se pretende indicar la región de inmunoglobulina que comprende uno o más dominios de Ig sustancialmente codificados por cualquiera de los genes Vk o Vy, y/o VH que constituyen las localizaciones genéticas de inmunoglobulina kappa, lambda y de cadena pesada, respectivamente. Por consiguiente, el dominio pesado variable comprende vhFR1-vhCDR1-vhFR2-vhCDR2-vhFR3-vhCDR3-vhFR4, y el dominio ligero variable comprende vlFR1-vlCDR1-vlFR2-vlCDR2-vlFR3-vlCDR3-vlFR4. Por “región constante pesada” en la presente memoria se pretende indicar la porción de CH1 -bisagra-CH2-CH3 de un anticuerpo. Por “Fc” o “región Fc” o “dominio Fc” tal como se usan en la presente memoria se pretende indicar el polipéptido que comprenden la región constante de un anticuerpo, excluyendo el primer dominio de inmunoglobulina de región constante y en algunos casos, parte de la bisagra. Por tanto, Fc se refiere a los dos últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgA, IgD e IgG, los tres últimos dominios de inmunoglobulina de región constante de IgE e IgM, y la bisagra flexible N-terminal respecto a dichos dominios. Para IgA e IgM, Fc puede incluir la cadena J. Para IgG, el dominio Fc comprende los dominios de inmunoglobulina Cy2 y Cy3 (Cy2 y Cy3) y la región bisagra inferior entre Cy1 (Cy1) y Cy2 (Cy2). Aunque las fronteras de la región Fc pueden variar, la región Fc de cadena pesada de IgG humana normalmente se define para incluir los residuos C226 o P230 respecto a su extremo carboxilo, donde la numeración es acorde al índice EU como en Kabat. En algunas realizaciones, tal como se describe detalladamente más adelante, se hacen modificaciones de aminoácido en la región Fc, por ejemplo para alterar la unión a uno o más receptores FcyR o al receptor FcRn.
Por tanto, “variante de Fc” o “Fc variante” tal como se usan en la presente memoria pretenden indicar que comprende una modificación de aminoácido en un dominio de Fc. Las variantes de Fc de la presente invención se definen según las modificaciones de aminoácido que las componen. Por tanto, por ejemplo, N434S o 434S es una variante Fc con una sustitución de serina en la posición 434 respecto al polipéptido Fc progenitor, donde la numeración es acorde al índice EU. Del mismo modo, M428L/N434S define una variante de Fc con las sustituciones M428L y N434S respecto al polipéptido Fc progenitor. La identidad del aminoácido WT puede estar sin especificar, en cuyo caso la variante anteriormente mencionada se denomina 428L/434S. Cabe destacar que el orden en el que se proporcionan las sustituciones es arbitrario, eso significa que, por ejemplo, 428L/434S es la misma variante de Fc que M428L/N434S, etcétera. Para todas las posiciones discutidas en la presente invención que se refieren a anticuerpos, a menos que se indique lo contrario, la numeración de la posición de aminoácido es acorde al índice EU.
Por “Fab” o “región Fab” tal como se usan en la presente memoria se pretende indicar el polipéptido que comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1, VL y Cl . Fab se puede referir a esta región en aislamiento, o a esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión Fab. Por “Fv” o “fragmento Fv” o “región Fv” tal como se usan en la presente memoria se pretende indicar un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un único anticuerpo. Como apreciarán los especialistas en la técnica, éstos estarán constituidos de dos cadenas.
A lo largo de la presente especificación, generalmente se usa el sistema de numeración IMTG o el sistema de numeración Kabat cuando se refiere a un residuo del dominio variable (aproximadamente, los residuos 1-107 de la región variable de cadena ligera y los residuos 1-113 de la región variable de cadena pesada) (p.ej., Kabat et al., ver anterior (1991)). La numeración EU como en Kabat se usa generalmente para dominios constantes y/o en los dominios Fc.
Las CDRs contribuyen a la formación del sitio de unión a antígeno, o más específicamente, de unión a epítopo de los anticuerpos. “Epítopo” se refiere a un determinante que interacciona con un sitio de unión a antígeno específico de la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Los epítopos son agrupamientos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y normalmente presentan características estructurales específicas, así como características de carga específicas. Un único antígeno puede tener más de un epítopo.
El epítopo puede comprender residuos de aminoácido implicados directamente en la unión (también denominados componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácido, que no estén implicados directamente en la unión, tal como los residuos de aminoácido que son bloqueados de forma efectiva por el péptido de unión a antígeno específico; en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la huella del péptido de unión a antígeno específico.
Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional es producido por aminoácidos espacialmente yuxtapuestos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es aquel producido por residuos de aminoácido adyacentes en una cadena de polipéptido. Los epítopos conformacionales y no conformacionales pueden distinguirse en que la unión de los primeros, pero no de los segundos, se pierde en presencia de disolventes desnaturalizantes.
Un epítopo típicamente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una única conformación espacial. Los anticuerpos que reconocen el mismo epítopo pueden verificarse en un inmunoensayo sencillo que muestra la capacidad de un anticuerpo para bloquear la unión de otro anticuerpo a un antígeno diana, por ejemplo “compartimentar”. Más adelante se describen los compartimentos o contenedores específicos.
Se incluye dentro de la definición de “anticuerpo” una “porción de unión a antígeno” de un anticuerpo (también usado de forma intercambiable con “fragmento de unión a antígeno”, “fragmento de anticuerpo” y “derivado de anticuerpo”). Es decir, para los propósitos de la invención, un anticuerpo de la invención tiene un requerimiento funcional mínimo de unirse a un antígeno de PVRIG. Como apreciarán los especialistas en la técnica, existe un número grande de fragmentos de antígeno y derivados de antígeno que retienen la capacidad de unirse a un antígeno y aun así presentan estructuras alternativas, que incluyen, aunque sin limitación, (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1, (iii) los fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados, (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), donde un dominio VH y un dominio VL están ligados por un ligando peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión de antígeno (Bird et al., 1988, Science 242: 423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
85: 5879-5883, incorporada en su plenitud a modo de referencia), (iv) “diacuerpos” o “triacuerpos”, fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos mediante fusión génica (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326: 461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-6448, todos incorporados en su plenitud a modo de referencia), (v) “anticuerpos de dominio” o “dAb” (algunas veces referidos como “dominio variable sencillo de inmunoglobulina”, que incluye dominios variables de anticuerpo individual de otras especies tal como roedor (por ejemplo, como se describe en w O 00/29004), tiburón nodriza y dAbs V-HH de camélido, (vi) SMPs (compuestos inmunofarmacéuticos de molécula pequeña), camelicuerpos, nanocuerpos e IgNAR.
Aún más, un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo (fragmento de unión a antígeno, fragmento de anticuerpo, porción de anticuerpo) puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión mayor (a veces referidas como “proteínas de fusión”), formadas mediante asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos adicionales. Los ejemplos de moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región nuclear de la estreptavidina para fabricar una molécula scFv tetramérica y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina C-terminal para fabricar moléculas scFv bivalentes y biotiniladas. Se puede preparar porciones de anticuerpo, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2, a partir de anticuerpos completos usando técnicas convencionales, tal como digestión de papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Además, se pueden obtener anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN recombinante estándares, tal como se describe en la presente memoria.
En general, los anticuerpos anti-PVRIG de la invención son recombinantes. “Recombinante” tal como se usa en la presente memoria, de forma amplia, en referencia a un producto, p.ej., una célula, o ácido nucleico, proteína o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico o proteína heterólogos o mediante la alteración de un ácido nucleico o proteína nativos, o que la célula se deriva de una célula así modificada. Por tanto, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran en la forma nativa (no recombinante) de la célula, o expresan genes nativos que de otro modo son expresados anormalmente, sub-expresados o no expresados en absoluto.
El término “anticuerpo recombinante”, tal como se usa en la presente memoria, incluye todos los anticuerpos que se preparan, expresan, crea o aíslan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (p.ej., un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparados a partir de los mismos (descrito detalladamente más adelante), (b) anticuerpos aislados de una célula hospedante transformada para expresar el anticuerpo humano, p.ej., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados a partir de una biblioteca de anticuerpos humanos combinatoria recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualesquier otros medios que implican la división de secuencias génicas de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes presentan regiones variables en las que las regiones estructurales y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En determinadas realizaciones, no obstante, dichos anticuerpos humanos recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por tanto las secuencias de aminoácidos de las regiones Vh y Vl de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de secuencias VH y VL de línea germinal human, y están relacionadas con ellas, pueden no existir de forma natural dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.
A. Ingeniería de anticuerpos opcional
Los anticuerpos de la invención pueden ser modificados, o diseñados mediante ingeniería, para alterar las secuencias de aminoácidos mediante sustituciones de aminoácidos.
Por “sustitución de aminoácido” o “sustitución” en la presente memoria se pretende indicar el reemplazamiento de un aminoácido de una posición particular de una secuencia de polipéptidos progenitora por un aminoácido diferente. En particular, en algunas realizaciones, la sustitución es por un aminoácido que no existe de forma natural en la posición particular, que no existe de forma natural en el organismo o en ningún organismo. Por ejemplo, la sustitución E272Y se refiere a un polipéptido variante, en este caso una variante de Fc, en la que el ácido glutámico de la posición 272 es reemplazado por tirosina. Para mayor claridad, una proteína que ha sido modificada para cambiar la secuencia codificadora de ácido nucleico pero sin cambiar el aminoácido de partida (por ejemplo, cambiar CGG (que codifica arginina) por CGA (que sigue codificando arginina) para aumentar los niveles de expresión en el organismo hospedante) no es una “sustitución de aminoácido”; es decir, a pesar de la creación de un nuevo gen que codifica la misma proteína, si la proteína tiene el mismo aminoácido en la posición concreta en la que originalmente estaba, no es una sustitución de aminoácido.
Tal como se discute en la presente memoria, se pueden realizar sustituciones de aminoácido para alterar la afinidad de las CDRs por la proteína PVRIG (que incluye tanto aumentar como reducir la unión, como se describe detalladamente más adelante), así como para alterar otras propiedades funcionales adicionales de los anticuerpos. Por ejemplo, se pueden modificar los anticuerpos para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tal como la vida media en suero, fijación de complemento, unión a receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Adicionalmente, un anticuerpo según al menos algunas realizaciones de la invención puede ser modificado químicamente (p.ej., se pueden unir uno o más restos químicos al anticuerpo) o puede ser modificado para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Dichas realizaciones se describen detalladamente más adelante. La numeración de los residuos en la región Fc corresponde al índice EU de Kabat.
En una realización, la región bisagra de CH1 es modificada de tal modo que el número de residuos de cisteína de la región bisagra se ve alterado, p.ej., aumenta o disminuye. Esta estrategia se describe adicionalmente en la Patente de EE.UU. n° 5.677.425, de Bodmer et al. El número de residuos de cisteína de la región bisagra de CH1 es alterada, por ejemplo, para facilitar el ensamblaje de las cadenas ligera y pesada, o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.
En otra realización, la región bisagra de Fc de un anticuerpo es mutada para reducir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácido en la región de interfaz de dominio CH2-CH3 del fragmento de bisagra de Fc, de tal modo que el anticuerpo presenta una unión disminuida a proteína A de Staphylococcus (SpA) respecto a la unión a SpA de dominio de bisagra-Fc. Esta estrategia se describe más detalladamente en la Patente de e E.UU. n° 6.165.745, de Ward et al.
En algunas realizaciones, las sustituciones de aminoácido se pueden realizar en la región Fc, en general para alterar la unión a receptores FcyR. Por “receptor gamma Fc”, “FcyR” o “FcgammaR”, tal como se usa en la presente memoria, se pretende indicar cualquier miembro de la familia de proteína que se une a la región Fc del anticuerpo IgG y que está codificada por un gen FcyR. En humanos, dicha familia incluye, aunque sin limitación, FcyRI (CD64), que incluye las isoformas FcYRIa, FcYRIb y FcyRIc; FcyRII (CD32), que incluye las isoformas FcYRIIa (que incluye los alotipos H131 y R131 ), FcYRIIb (que incluye FcYRIIb-1 y FcYRIIb-2), y FcyRIIc; y FcyRIII (CD16), que incluye las isoformas FcYRIIIa (que incluye los alotipos V158 y F158) y FcYRIIIb (que incluye los alotipos FcYRIIIb-NA1 y FcYRIIIb-NA2) (Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65, incorporada en su plenitud a modo de referencia), así como cualquier FcyR humano no descubierto o cualesquier isoformas o alotipos humanos de FcyR no descubiertas. Un FcyR puede proceder de cualquier organismo, que incluye, aunque sin limitación, humanos, ratones, ratas, conejos y monos. Los FcyRs de ratón incluyen, aunque sin limitación, FcyRi (CD64), FcyRII (CD32), FcyRIII-1 (CD16) y FcyRIII-2 (CD16-2), así como cualquier FcyR de ratón no descubierto o cualesquier isoformas o alotipos de ratón de FcyR no descubiertos.
Existe una serie de sustituciones Fc útiles que pueden realizarse para alterar la unión a uno o más de los receptores FcyR. Las sustituciones que dan como resultado un aumento de la unión, así como una reducción de la unión, pueden ser útiles. Por ejemplo, se sabe que un aumento de la unión a FcYRIIIa generalmente da como resultado un aumento de la ADCC (citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo; la reacción mediada celularmente en la que las células citotóxicas no específicas que expresan FcyRs reconocen anticuerpo ligado en una célula diana y posteriormente causan la lisis de la célula diana). De forma similar, una reducción de la unión a FcYRIIb (un receptor inhibidor) también puede ser beneficiosa en algunas circunstancias. Las sustituciones de aminoácido que encuentran utilidad en la presente invención incluyen aquellas enumeradas en las Solicitudes de EE.UU. con n° de serie 11/124.620 (particularmente la Fig. 41), y en la Patente de EE.UU. n° 6.737.056, ambas se incorporan de forma expresa a la presente memoria a modo de referencia en su plenitud, y específicamente para las variantes descritas en las mismas. Las variantes particulares que presentan utilidad incluyen, aunque sin limitación, 236A, 239D, 239E,
332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 299T y
297N.
Adicionalmente, los anticuerpos de la invención se modifican para aumentar su vida media biológica. Es posible utilizar varias estrategias. Por ejemplo, se pueden introducir una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, tal como se describe en la Patente de EE.UU. n° 6.277.375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, se puede alterar el anticuerpo dentro de la región Ch1 o Cl para contener un epítopo de unión a receptor de rescate tomado de dos bucles de un domino CH2 de una región Fc de una IgG, tal como se describe en las Patentes de EE.UU. n° 5.869.046 y 6.121.022, de Presta et al. Otras mutaciones adicionales para aumentar la vida media en suero se describen en las Patentes de EE.UU. n° 8.883.973, 6.737.056 y 7.371.826, e incluyen 428L, 434A, 434S y 428L/434S.
En otras realizaciones adicionales, la región Fc es alterada reemplazando al menos un residuo de aminoácido por un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos seleccionados entre los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318,
320 y 322 por un residuo de aminoácido diferente, de tal modo que el anticuerpo presente una afinidad alterada por un ligando efector pero retenga la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector para el cual se altera la afinidad, por ejemplo, es un receptor de Fc o el componente C1 de complemento. Esta estrategia se describe más detalladamente en las Patentes de EE.UU. n° 5.624.821 y 5.648.260, ambas de Winter et al.
En otro ejemplo, se pueden reemplazar uno o más aminoácidos seleccionados entre los residuos de aminoácido 329,
331 y 322 por un residuo de aminoácido diferente, de tal modo que el anticuerpo presente una unión a C1q alterada y/o una citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) reducida o eliminada. Esta estrategia se describe con más detalle en la Patente de EE.UU. n° 6.194.551, de Idusogie et al.
En otro ejemplo, se alteran uno o más residuos de aminoácido de las posiciones de aminoácido 231 y 239 para alterar con ello la capacidad del anticuerpo para fijar complemento. Esta estrategia se describe más detalladamente en la Publicación PCT WO 94/29351, de Bodmer et al.
En otro ejemplo adicional, la región Fc se modifica para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o para aumentar la afinidad del anticuerpo por un receptor
Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258,
265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Esta estrategia se describe más detalladamente Publicación PCT WO 00/42072 de Presta. Además, se han mapeado los sitios de unión de IgG1 humana para FcyRI, FcyRII, FcyRIII y FcRn y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R. L. et al. (2001) J Biol. Chem.
276: 6591-6604). Las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 han demostrado mejorar la unión a FcyRIII. Adicionalmente, se ha demostrado que los siguientes mutantes de combinación mejora la unión a FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A. Adicionalmente, mutaciones tales como M252Y/S254T/T256E o M428L/N434S mejoran la unión a FcRn y aumentan la vida media en circulación del anticuerpo
(véase Chan CA y Carter PJ (2010) Nature Rev Immunol 10: 301-316).
En otra realización adicional, el anticuerpo puede modificarse para abolir el intercambio de brazo Fab in vivo.
Específicamente, este proceso implica el intercambio de medias moléculas de IgG4 (una cadena pesada más una cadena ligera) entre otros anticuerpos IgG4 que da como resultado efectivamente anticuerpos biespecíficos que son funcionalmente monovalentes. Las mutaciones en la región bisagra y en los dominios constantes de la cadena pesada puede abolir dicho intercambio (véase Aalberse, RC, Schuurman J., 2002, Immunology 105: 9-19).
En otra realización adicional, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo por antígeno o para reducir una función efectora, tal como la ADCC. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden llevar a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia del anticuerpo, por ejemplo N297. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácido que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de la estructura de región variable para eliminar de este modo la glicosilación en dicho sitio.
Adicional o alternativamente, se puede preparar un anticuerpo que presente un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que presente cantidades reducidas de residuos de fucosilo, o un anticuerpo que presente un aumento de estructuras GlcNac de bisección. Se ha demostrado que dichos patrones de glicosilación alterados aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidrato se pueden llevar a cabo, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedante con maquinaria de glicosilación alterada. Las células con maquinaria de glicosilación alterada se han descrito en la técnica, y pueden usarse como células hospedantes en las que expresar anticuerpos recombinantes de acuerdo a al menos algunas realizaciones de la invención, produciendo con ello un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (a (1,6) fucosiltransferasa), de tal modo que en los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 falta fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8 son creadas mediante disrupción dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de reemplazamiento (véase la Publicación de Patente de EE.UU. N° 20040110704, de Yamane et al. y Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87: 614-22). Como ejemplo adicional, el documento EP 1.176.195 de Hanai et al. describe una línea celular con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica una fucosil transferasa, de tal modo que los anticuerpos expresados en dicha línea celular exhiben hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima relacionada con el enlace a 1,6. Hanai et al. también describen líneas celulares que presentan baja actividad enzimática para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo, o que no presentan la actividad enzimática, por ejemplo la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662). La publicación PCT WO 03/035835 de Presta describe una línea de células CHO variante, las células Lec13, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos ligados a Asn(297), dando como resultado también una hipofucosilación de anticuerpos expresados en dicha célula hospedante (véase también Shields, R. L. et al. (2002) J Biol. Chem. 277: 26733-26740). La publicación PCT WO 99/54342 de Umana et al. describe líneas celulares modificadas para expresar glicosil transferasas modificadoras de glicoproteína (p.ej., p(1,4)-N-acetilglucosaminil transferasa III (GnTIII)) de tal modo que los anticuerpos expresados en las líneas celulares modificadas exhiben un aumento de estructuras bisectantes GlcNac, lo que da como resultado un aumento de la actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17: 176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo se pueden eliminar usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa a-L-fucosidasa elimina residuos de fucosilo de anticuerpos (Tarentino, A. L. et al. (1975) Biochem. 14: 5516-23).
Otra modificación de los anticuerpos de la presente memoria que se contempla por la invención es la peguilación o la adición de otros restos solubles en agua, típicamente polímeros, p.ej., a fin de potenciar la vida media. Un anticuerpo puede peguilarse, por ejemplo, para aumentar la vida media biológica (p.ej., en suero) del anticuerpo. Para peguilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilen glicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado de aldehído de PEG, en condiciones en las que uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la peguilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Tal como se usa en la presente memoria, el término “polietilen glicol” pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que han sido usadas para derivatizar otras proteínas, tal como mono (C1-C10) alcoxi- o ariloxi-polietilen glicol o polietilen glicol-maleimida. En determinadas realizaciones, el anticuerpo a peguilar es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para peguilar proteínas son conocidos en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos según al menos algunas realizaciones de la invención. Véase, por ejemplo, el documento EP 0154316 de Nishimura et al. y el documento EP 0401 384 de Ishikawa et al.
Además de las sustituciones realizadas para alterar la afinidad de unión a FcyRs y/o FcRn y/o para aumentar la vida media en suero in vivo, se pueden realizar modificaciones de anticuerpo adicionales, tal como se describe más detalladamente a continuación.
En algunos casos, se realiza una maduración de afinidad. Las modificaciones de aminoácido en las CDRs a menudo se refieren como “maduración de afinidad”. Un anticuerpo “madurado de afinidad” es aquel que presenta una o más alteraciones en una o más CDRs, lo que da como resultado una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con un anticuerpo progenitor que no posee dicha(s) alteración(es). En algunos casos, aunque raros, puede ser deseable reducir la afinidad de un anticuerpo por su antígeno, pero esto generalmente no es lo preferible.
En algunas realizaciones, se realizan una o más modificaciones de aminoácido en una o más de las CDRs de los anticuerpos VISG1 de la invención. En general, solo 1 o 2 o 3 aminoácidos son sustituidos en cualquier CDR individual, y generalmente no se realizan más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 cambios en un conjunto de CDRs. Sin embargo, debería apreciarse que cualquier combinación de no sustituciones, 1, 2 o 3 sustituciones en cualquier CDR se puede combinar independientemente y opcionalmente con cualquier otra sustitución.
Se puede realizar una maduración de afinidad para aumentar la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno de PVRIG en al menos aproximadamente de 10% a 50-100-150% o más, o entre 1 y 5 veces en comparación con el anticuerpo “progenitor”. Los anticuerpos madurados para afinidad preferidos presentarán afinidades nanomolares o incluso picomolares por el antígeno de PVRIG. Los anticuerpos madurados para afinidad se producen mediante procedimientos conocidos. Véase, por ejemplo, Marks et al., 1992, Biotechnology 10: 779-783, que describe la maduración de afinidad mediante un barajado de dominio de cadena pesada variable (VH) y cadena ligera variable (VL). La mutagénesis aleatoria de residuos de CDR y/o estructurales se describe en: Barbas, et al. 1994, Proc. Nat.
Acad. Sci, USA 91: 3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169: 147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155: 1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7): 3310-9; y Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226: 889-896, por ejemplo.
Alternativamente, se pueden realizar modificaciones de aminoácido en una o más de las CDRs de los anticuerpos de la invención que están “silenciados”, p.ej., que no alteran significativamente la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Éstas se pueden realizar por una serie de razones, que incluyen optimizar la expresión (como puede hacerse para los ácidos nucleicos que codifican los anticuerpos de la invención).
Por tanto, dentro de la definición de las CDRs y los anticuerpos de la invención se incluyen CDRs y anticuerpos variantes; es decir, los anticuerpos de la invención pueden incluir modificaciones de aminoácido en una o más de las CDRs de los anticuerpos enumerados de la invención. Adicionalmente, como se describe más adelante, también se pueden realizar modificaciones de aminoácido de forma independiente y opcional en cualquier región fuera de las CDRs, que incluye las regiones estructurales y constantes.
IV. Anticuerpos de PVRIG
La presente invención proporciona anticuerpos anti-PVRIG. (Por conveniencia, se emplea indistintamente “anticuerpos anti-PVRIG” y “anticuerpos de PVRIG”). Los anticuerpos anti-PVRIG de la invención se unen específicamente a PVRIG humana, y preferiblemente a la ECD de VISG1 humana, tal como se muestra en la Figura 25.
Se puede exhibir unión específica a PVRIG o a un epítopo de PVRIG, por ejemplo, con un anticuerpo que tiene una KD de al menos aproximadamente 10'4 M, al menos aproximadamente 10'5 M, al menos aproximadamente 10'6 M, al menos aproximadamente 10'7 M, al menos aproximadamente 10'8 M, al menos aproximadamente 10'9 M, alternativamente de al menos aproximadamente 10'10 M, al menos aproximadamente 10'11 M, al menos aproximadamente 10-12 M, o superior, donde KD se refiere a una tasa de disociación de una interacción anticuerpoantígeno particular. Típicamente, un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno tendrá una KD que es 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 veces mayor para una molécula de control en comparación con el antígeno o epítopo de PVRIG.
Sin embargo, tal como se muestra en los Ejemplos, para una unión óptima de PVRIG expresada sobre la superficie de células NK y T, los anticuerpos preferiblemente presentan una KD inferior a 50 nM y lo más preferiblemente inferior a 1 nM, encontrando utilidad en los métodos de la invención menos de 0,1 nM y menos de 1 pM y 0,1 pM.
Asimismo, la unión específica a un antígeno o epítopo particular puede ser exhibida, por ejemplo, por un anticuerpo que presenta una KA o Ka para un antígeno o epítopo de PVRIG de al menos 20, 50, 100, 500, 1000, 5000, 10000 veces mayor para el epítopo en comparación con un control, donde KA o Ka se refiere a una tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PVRIG de la invención se unen a PVRIG humana con una Kd de 100 nM o menos, 50 nM o menos, 10 nM o menos, o 1 nM o menos (es decir, mayor afinidad de unión), o de 1 pM o menos, donde Kd se determina mediante métodos conocidos, p.ej., resonancia de plasmón superficial (SPR, p.ej., ensayos Biacore), ELISA, KINEXA y lo más típicamente SPR a 25°C o 37°C.
A. Anticuerpos anti-PVRIG específicos
La invención proporciona dominios de unión a antígeno, que incluyen anticuerpos de longitud completa, que contienen una serie de conjuntos de 6 CDRs específicos enumerados.
Los anticuerpos descritos en la presente memoria son etiquetados con se indica a continuación. Los anticuerpos tienen números de referencia, por ejemplo “CPA.7.013”. Estos representan la combinación de las cadenas pesada variable y ligera variable, tal como se muestra en la Figura 38 y la Figura 39, por ejemplo. "CPA.7.013.VH" se refiere a la porción pesada variable de CPA.7.013, mientras que "CPA.7.013.VL" es la cadena ligera variable. "CPA.7.013.vhCDR1", "CPA.7.013.vhCDR2", "CPA.7.013.vhCDR3", "CPA.7.013.vlCDR1", "CPA.7.013.vlCDR2", y "CPA.7.013.vlCDR3", se refieren a las CDRs indicadas. “CPA.7.013.HC” se refiere a la cadena pesada completa (p.ej., dominio variable y constante) de dicha molécula, y “CPA.7.013.LC” se refiere a la cadena ligera completa (p.ej., dominio variable y constante) de la misma molécula. “CPA.7.013.H1” se refiere a un anticuerpo de longitud completa que comprende los dominios variables pesado y ligero, que incluye el dominio constante de IgG1 humana (por tanto, el H1; las secuencias de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 se muestran en la Figura 66). Por consiguiente, “CPA.7.013.H2” serían los dominios variables de CPA.7.013 ligados a IgG2 humana. “CPA.7.013.H3” serían los dominios variables de CPA.7.013 ligados a IgG3 humana, y “CPA.7.013.H4” serían los dominios variables de CPA.7.013 ligados a IgG4 humana.
La invención proporciona además dominios variables pesados y ligeros, así como cadenas pesadas y ligeras de longitud completa.
En muchas realizaciones, los anticuerpos de la invención son humanos (derivados de fagos) y bloquean la unión de PVRIG y PVLR2. Tal como se muestra en la Figura 52, los anticuerpos CPA que se unen y bloquean la interacción receptor-ligando son como se indica a continuación, con sus componentes descritos también:
CPA.7.021, CPA.7.021.VH, CPA.7.021.VL, CPA.7.021.HC, CPA.7.021.LC, CPA.7.021.H1, CPA.7.021.H2, CPA.7.021.H3 CPA.7.021.H4; CPA.7.021.vhCDR1, CPA.7.021.vhCDR2, CPA.7.021.vhCDR3, CPA.7.021.vlCDR1, CPA.7.021.vlCDR2 y CPA.7.021.vlCDR3; y
CPA.7.050, CPA.7.050.VH, CPA.7.050.VL, CPA.7.050.HC, CPA.7.050.LC, CPA.7.050.H1, CPA.7.050.H2, CPA.7.050.H3, CPA.7.050.H4, CPA.7.050.vhCDR1, CPA.7.050.vhCDR2, CPA.7.050.vhCDR3, CPA.7.050.vlCDR1, CPA.7.050.vlCDR2 y CPA.7.050.vlCDR3.
Tal como se discute en la presente memoria, la invención proporciona además variantes de los anteriores componentes, que incluyen variantes de las CDRs, tal como se ha descrito antes. Adicionalmente, las cadenas variables pesadas pueden ser idénticas en un 80%, 90%, 95%, 98% o 99% a las secuencias “VH” de la presente memoria, y/o contienen entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 cambios de aminoácido, o más, cuando se usan las variantes Fc. Se proporcionan cadenas variables ligeras que pueden ser idénticas en un 80%, 90%, 95%, 98% o 99% a las secuencias “VL” de la presente memoria, y/o contienen entre 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 cambios de aminoácido, o más, cuando se usan las variantes Fc. De forma similar, se proporciona cadenas pesadas y ligeras que son idénticas en un 80%, 90%, 95%, 98% o 99% a las secuencias “HC” o “LC” de la presente memoria, y/o contienen entre 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 cambios de aminoácido, o más, cuando se usan las variantes Fc.
Adicionalmente, la presente invención proporciona una serie de anticuerpos CHA, que son anticuerpos de ratón generados a partir de hibridomas. Como es bien conocido en la técnica, las seis CDRs son útiles cuando se introducen en las regiones estructurales variable pesada y variable ligera, o cuando los dominios variables pesado y ligero son humanizados.
Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos, normalmente de longitud completa o dominios scFv, que comprenden los siguientes conjuntos CHA de CDRs, cuyas secuencias se muestran en la Figura 41:
CHA.7.516.vhCDR1, CHA.7.516.vhCDR2, CHA.7.516.vhCDR3, CHA.7.516.vlCDR1, CHA.7.516.vlCDR2 y CHA.7.516.vlCDR3.
CHA.7.518.vhCDR1, CHA.7.518.vhCDR2, CHA.7.518.vhCDR3, CHA.7.518.vlCDR1, CHA.7.518.vlCDR2, y CHA.7.518.vlCDR3.
CHA.7.524.vhCDR1, CHA.7.524.vhCDR2, CHA.7.524.vhCDR3, CHA.7.524.vlCDR1, CHA.7.524.vlCDR2, y CHA.7.524.vlCDR3.
CHA.7.528.vhCDR1, CHA.7.528.vhCDR2, CHA.7.528.vhCDR3, CHA.7.528.vlCDR1, CHA.7.528.vlCDR2, y CHA.7.528.vlCDR3.
CHA.7.530.vhCDR1, CHA.7.530.vhCDR2, CHA.7.530.vhCDR3, CHA.7.530.vlCDR1, CHA.7.530.vlCDR2, y CHA.7.530.vlCDR3.
CHA.7.537.vhCDR1, CHA.7.537.vhCDR2, CHA.7.537.vhCDR3, CHA.7.537.vlCDR1, CHA.7.537.vlCDR2, y CHA.7.537.vlCDR3.
CHA.7.543.vhCDR1, CHA.7.543.vhCDR2, CHA.7.543.vhCDR3, CHA.7.543.vlCDR1, CHA.7.543.vlCDR2, y CHA.7.543.vlCDR3.
CHA.7.548.vhCDR1, CHA.7.548.vhCDR2, CHA.7.548.vhCDR3, CHA.7.548.vlCDR1, CHA.7.548.vlCDR2, y CHA.7.548.vlCDR3.
Como antes, estos conjuntos de CDRs también pueden ser variantes de aminoácidos como se ha descrito anteriormente.
Adicionalmente, las regiones estructurales de las cadenas variable pesada y variable ligera se pueden humanizar como es conocido en la técnica (generando variantes ocasionales en las CDRs, si es necesario), y por tanto se pueden generar variantes humanizadas de las cadenas VH y VL de la Figura 41. Adicionalmente, los dominios humanizados variables pesado y ligero pueden fusionarse entonces con regiones constantes humanas, tal como las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.
En particular, tal como se conoce en la técnica, se pueden humanizar cadenas VH y VL de ratón como se conoce en la técnica, por ejemplo, usando el programa IgBLAST de la página web de NCBI, tal como se describe en Y e et al. Nucleic Acids Res. 41: W34-W40 (2013), incorporado a la presente memoria a modo de referencia en su plenitud para los métodos de humanización. IgBLAST toma una secuencia VH y/o VL de ratón y la compara con una biblioteca de secuencias de línea germinal humana conocidas. Tal como se muestra en la presente memoria, para las secuencias humanizadas generadas en la presente memoria, las bases de datos usados fueron genes Vh humanos IMGT (F+ORF, 273 secuencias de línea germinal) y genes VL kappa humanos IMGT (F+ORF, 74 secuencias de línea germinal). Se eligieron cinco secuencias c HA ejemplares: ChA.7.518, CHA.7.530, CHA.7.538_1, CHA.7.538_2 y CHA.7.524 (véase la Figura 41 para las secuencias VH y VL). Para esta humanización, se eligió IGHV1-46(alelo1) de línea germinal humana para las 5 como secuencia aceptora y la región de unión IGHJ4(alelo1) de cadena pesada humana (gen J). Para tres de las cuatro (CHA.7.518, CHA.7.530, CHA.7.538_1 y CHA.7.538_2), se eligió IGKV1-39(alelo 1) de línea germinal humana como secuencia aceptora y se eligió IGKJ2(alelo1) de cadena ligera humana (gen J). El gen J se eligió entre secuencias de región de unión compiladas en IMGT® el sistema de información ImMunoGeneTics, en www.imgt.org. Las CDRs se definieron según la definición de AbM (véase www.bioinfo.org.uk/abs/). Las Figuras 88 muestran secuencias humanizadas, así como algunos cambios potenciales para optimizar la unión a PVRIG.
Los anticuerpos humanizados específicos de anticuerpos CHA incluyen los mostrados en las Figuras 88, las Figuras 89 y la Figura 90. Como apreciarán los especialistas en la técnica, cada secuencia pesada variable humanizada (Pesada Humanizada; HH) y ligera variable humanizada (Ligera Humanizada, HL) puede combinarse con las regiones constantes de IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Es decir, CHA.7.518.HH1 es la primera cadena pesada variable humanizada, y CHA.7.518.HH1.1 es la cadena pesada de longitud completa, que comprende la secuencia humanizada “HH1” con una región constante de IgG1 (CHA.7.518.HH1.2 es CHA.7.518.HH1 con IgG2, etc.).
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PVRIG de la presente invención incluyen anticuerpos anti-PVRIG en los que las secuencias Vh y Vl de diferentes anticuerpos anti-PVRIG pueden “mezclarse y emparejarse” para crear otros anticuerpos anti-PVRIG. La unión a PVRIG de dichos anticuerpos “mezclados y emparejados” puede evaluarse usando los ensayos de unión descritos anteriormente, p.ej., ELISAs). En algunas realizaciones, cuando las cadenas Vh y Vl se mezclan y emparejan, una secuencia Vh de un emparejamiento Vh/Vl particular es reemplazada por una secuencia Vh estructuralmente similar. Del mismo modo, en algunas realizaciones, una secuencia Vl de un emparejamiento VH/VL particular es reemplazada por una secuencia VL estructuralmente similar. Por ejemplo, las secuencias Vh y Vl de anticuerpos homólogos son particularmente susceptibles de ser mezcladas y emparejadas.
Por consiguiente, los anticuerpos de la invención comprenden secuencias de aminoácido de CDR seleccionadas del grupo que consiste en (a) secuencias como las enumeradas en la presente memoria; (b) secuencias que difieren de las secuencias de aminoácidos de CDR especificadas en (a) en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más sustituciones de aminoácido; (c) secuencias de aminoácido que tienen una identidad de secuencia del 90% o más, 95% o más, 98% o más, o 99% o más con respecto a las secuencias especificadas en (a) o (b); (d) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido que tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica los aminoácidos tal como se enumeran en la presente memoria.
Adicionalmente, en la definición de anticuerpos de PVRIG se incluyen anticuerpos que comparten identidad con los anticuerpos de PVRIG enumerados en la presente memoria. Es decir, en determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-PVRIG según la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácido que son homólogas a las secuencias de aminoácido anti-PVRIG aisladas de moléculas inmunes anti-PVRIG preferidas, respectivamente, donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-PVRIG progenitores. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = n° de posiciones idénticas / n° total de posiciones X 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden realizar usando un algoritmo matemático, tal como se describe más adelante en los ejemplos no limitativos.
El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácido se puede determinar usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)) que ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización de hueco de 4. Adicionalmente, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que ha sido incorporado en el programa GAP del paquete de software GCG (disponible comercialmente), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 o 6.
Adicional o alternativamente, las secuencias de proteína de la presente invención pueden usarse adicionalmente como “secuencia de consulta” para llevar a cabo una búsqueda en bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden llevar a cabo usando el programa x BlAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las moléculas de anticuerpo según al menos algunas realizaciones de la invención. Para obtener alineamientos con huecos con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST tal como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los respectivos programas (p.ej., XBLAST y NBLAST).
En general, el porcentaje de identidad para comparación entre anticuerpos de PVRIG es al menos del 75%, al menos 80%, al menos 90%, prefiriéndose un porcentaje de identidad de al menos aproximadamente 95, 96, 97, 98 o 99%. El porcentaje de identidad puede ser a lo largo de toda la secuencia de aminoácidos, por ejemplo, la cadena pesada o ligera completas, o a lo largo de una porción de las cadenas. Por ejemplo, en la definición de anticuerpos anti-PVRIG de la invención se incluyen aquellos que comparten identidad a lo largo de la región variable completa (por ejemplo, cuando la identidad es del 95 o el 98% a lo largo de las regiones variables), o a lo largo de la región constante completa, o a lo largo solo del dominio Fc.
Adicionalmente, también se incluyen secuencias que pueden presentar CDRs idénticas pero también cambios en el dominio variable (o en la cadena pesada o ligera completas). Por ejemplo, los anticuerpos de PVRIG incluyen aquellos con CDRs idénticas a las mostradas en la Figura 63, pero cuya identidad a lo largo de la región variable puede ser menor, por ejemplo idénticas en un 95 o 98%.
B. Anticuerpos de PVRIG que compiten por la unión con los anticuerpos enumerados
La presente invención proporciona no solo los anticuerpos enumerados, sino también anticuerpos adicionales que compiten con los anticuerpos enumerados (los números de CPA y CHA enumerados en la presente memoria que se unen específicamente a PVRIG) por la unión específica a la molécula de PVRIG. Tal como se muestra en el Ejemplo 11, los anticuerpos de PVRIG de la descripción se “agrupan” en diferentes contenedores de epítopo. Existen cuatro contenedores separados descritos en la presente memoria; 1) el contenedor de epítopo en el que entran CPA.7.002, CPA.7.003, CPA.7.005, CPA.7.007, CPA.7.010, CPA.7.012, CPA.7.015, CPA.7.016, CPA.7.017, CPA.7.019, CPA.7.020, CPA.7.021, CPA.7.024, CPA.7.028, CPA.7.032, CPA.7.033, CPA.7.036, CPA.7.037, CPA.7.038, CPA.7.043, CPA.7.046 y CPA.7.041; 2) el contenedor de epítopo en el que entran CPA.7.004, CPA.7.009, CPA.7.011, CPA.7.014, CPA.7.018, CPA.7.022, CPA.7.023, CPA.7.034, CPA.7.040, CPA.7.045 y CPA.7.047; 3) CPA.7.039, que define la distinción entre el contenedor 1 y el contenedor 2, en que el contenedor 1 bloquea la unión de CPA.7.039 y el contenedor 2 forma un sándwich con el ligando y CPA.7.039, y el contenedor 4) con CPA.7.050.
Por tanto, la descripción proporciona anticuerpos anti-PVRIG que compiten por la unión con anticuerpos que están en el contenedor 1, con anticuerpos que están en el contenedor 2, con anticuerpos que están en el contenedor 3 y/o con anticuerpos que están en el contenedor 4.
Otros anticuerpos adicionales que compiten con los anticuerpos enumerados se generan como es sabido en la técnica, y tal como se describe de forma general más adelante. Se pueden realizar estudios de unión competitiva como es conocido en la técnica, usando de forma general ensayos de unión SPR/Biacore®, así como ensayos ELISA y basados en células.
C. Generación de anticuerpos adicionales
Se pueden preparar anticuerpos adicionales para PVRIG humana como es bien conocido en la técnica, usando métodos bien conocidos tales como los descritos en los ejemplos. De esta manera, se pueden generar anticuerpos anti-PVRIG adicionales mediante métodos tradicionales tales como inmunizando ratones (a veces usando inmunización de ADN, por ejemplo, tal como se usa en Aldevron), seguido de cribado contra proteína PVRIG humana y generación de hibridomas, con purificación y recuperación de los anticuerpos.
V. Formulaciones de anticuerpos anti-PVRIG
Las composiciones terapéuticas usadas en la práctica de los anteriores métodos se pueden formular en composiciones farmacéuticas que comprenden un vehículo adecuado para el método de administración deseado. Los vehículos adecuados incluyen cualquier material que cuando se combina con la composición terapéutica retiene la función antitumoral de la composición terapéutica y de forma general es no-reactivo con el sistema inmunitario del paciente. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, cualquiera de una serie de vehículos farmacéuticos estándares tales como disoluciones de salino tamponado con fosfato, agua bacteriostática, y similares (véase, de forma general, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, A. Osal., Ed., 1980). Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, acetato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio; cloruro de bencetonio; fenol, butil orbenzil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; edulcorantes y otros agentes aromatizantes; rellenos tales como celulosa microcristalina, lactosa, almidones de maíz y otros; complejos metálicos (p.ej., complejos Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilen glicol (PEG).
En una realización preferida, la composición farmacéutica que comprende los anticuerpos de la invención puede estar en una forma soluble en agua, tal como estar presente como sales farmacéuticamente aceptables, que se pretende que incluya tanto sales de adición ácida como básica. “Sal de adición ácida farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellas sales que retienen la eficacia biológica de las bases libres y que no son indeseables biológicamente, o de cualquier otra forma, formadas con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares, y ácidos orgánicos tales como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido ptoluenosulfónico, ácido salicílico y similares. Las “sales de adición básica farmacéuticamente aceptables” incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas tales como sales de sodio, potasio, litio, amonio, calcio, magnesio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio, y similares. Son particularmente preferidas las sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio. Las sales derivadas de bases orgánicas no tóxicas farmacéuticamente aceptables incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas que incluyen aminas sustituidas naturales, aminas cíclicas y resinas de intercambio iónico básicas, tal como isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina y etanolamina. Las formulaciones a usar para la administración in vivo preferiblemente son estériles. Esto se logra fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración estéril o mediante otros métodos.
La administración de la composición farmacéutica que comprende anticuerpos de la presente invención, preferiblemente en la forma de una disolución acuosa estéril, se puede realizar en una variedad de formas, que incluyen, aunque sin limitación, subcutáneamente e intravenosamente. La administración subcutánea puede ser preferible en algunas circunstancias porque el paciente puede auto-administrarse la composición farmacéutica. Muchos agentes terapéuticos proteínicos no son suficientemente potentes para permitir una formulación de una dosis terapéuticamente efectiva en el volumen máximo aceptable para la administración subcutánea. Este problema se puede solventar en parte mediante el uso de formulaciones de proteínas que comprenden arginina-HCl, histidina y polisorbato (ver el documento WO 04091658). Los polipéptidos Fc de la presente invención pueden ser más susceptibles de administración subcutánea debido a, por ejemplo, una mayor potencia, mejor vida media en suero o mayor solubilidad.
Como es sabido en la técnica, los agentes terapéuticos proteínicos a menudo se administran mediante infusión IV o de bolo. Los anticuerpos de la presente invención también se pueden administrar usando dichos métodos. Por ejemplo, la administración puede ser venosa mediante infusión intravenosa con cloruro sódico al 0,9% como vehículo de infusión.
Adicionalmente, se puede usar cualquiera de una serie de sistemas de administración conocidos en la técnica para administrar las variantes Fc de la presente invención. Los ejemplos incluyen, aunque sin limitación, encapsulación en liposomas, micropartículas, microesferas (p.ej., microesferas de PLA/p Ga ), y similares. Alternativamente, se puede usar un implante de un material poroso, no poroso o gelatinoso, que incluye membranas o fibras. Los sistemas de liberación sostenida pueden comprender un material o matriz polimérica tal como poliésteres, hidrogeles, poli(vinil alcohol), polilactidas, copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, acetato de etilen-vinilo, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOt .RTM., y ácido poli-D-(-)-3-hidroxiburírico. Los anticuerpos descritos en la presente memoria también pueden formularse como inmunliposomas. Un liposoma es una vesícula pequeña que comprende varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o tensioactivos que es útil para la administración de un agente terapéutico a un mamífero. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante métodos conocidos en la técnica, tal como se describe en Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sci USA, 82: 3688; Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77: 4030; Patente de EE.UU. n° 4.485.045; Patente de EE.UU. n° 4.544.545; y solicitud internacional de patente PCT WO 97/38731. En la Patente de EE.UU. n° 5.013.556 se describen liposomas con tiempo en circulación mejorado. Los componentes del liposoma se disponen habitualmente en una conformación bicapa, similar a la disposición de lípidos en las membranas biológicas. Los liposomas particularmente útiles pueden ser generados mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para dar lugar a liposomas con el diámetro deseado. Dentro del liposoma se puede contener opcionalmente un agente quimioterapéutico u otro agente terapéuticamente activo (Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81: 1484).
Los anticuerpos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas mediante métodos que incluyen, aunque sin limitación, técnicas de coacervación, polimerización interfacial (por ejemplo, usando hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina, o microcápsulas de poli-(metilmetacilato), sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas), y macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980. Se pueden fabricar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos, matrices que están en la forma de artículos conformados, p.ej., películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), o poli(vinilalcohol)), polilactidas (Patente de EE.UU. n° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico y ácido glicólico degradables tales como LUPRON DEPOT.RTM. (que son microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolide), ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico, y ProLease.RTM. (disponible comercialmente en Alkermes), que es un sistema de administración basado en microesferas compuesto de la molécula bioactiva deseada incorporada a una matriz de poli-DL-lactida-co-glicolide (PLG).
Las cantidades y las frecuencias de las dosis de administración se seleccionan, en una realización preferida, para ser terapéutica o profilácticamente efectivas. Como es sabido en la técnica, puede ser necesario realizar ajustes por la degradación de proteína, administración sistémica en lugar de localizada, y la velocidad de nueva síntesis de proteasa, así como la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la interacción de fármacos y la gravedad de la afección, y los especialistas en la técnica los podrán determinar mediante una experimentación rutinaria.
La concentración del anticuerpo en la formulación puede variar entre aproximadamente 0,1 y 100% en peso. En una realización preferida, la concentración de la variante Fc está en el rango de 0,003 a 1,0 molar. A fin de tratar a un paciente, se puede administrar una dosis terapéuticamente efectiva de la variante Fc de la presente invención. Por “dosis terapéuticamente efectiva” en la presente memoria se pretende indicar una dosis que produce los efectos para los cuales es administrada. La dosis exacta dependerá del propósito del tratamiento, y podrá ser determinada por el especialista en la técnica usando técnicas conocidas. Las dosis pueden oscilar entre 0,0001 y 100 mg/kg de peso corporal o superior, por ejemplo 0,1, 1, 10 o 50 mg/kg de peso corporal, siendo preferible de 1 a 10 mg/kg.
VI. Métodos para usar los anticuerpos anti-PVRIG
Una vez fabricados, los anticuerpos anti-PVRIG de la invención pueden utilizarse en una serie de aplicaciones diferentes.
A. Usos terapéuticos
Los anticuerpos anti-PVRIG de la invención son útiles para tratar pacientes, tales como sujetos humanos, generalmente con una afección asociada a PVRIG. El término “tratamiento” tal como se usa en la presente memoria, se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas, lo que se refiere al tratamiento del cáncer. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen los que ya padecen cáncer, así como los que se quiere prevenir el cáncer. Por lo tanto, el mamífero en tratamiento en la presente memoria ha sido diagnosticado con cáncer o puede estar predispuesto o ser susceptible a padecer el cáncer. Tal como se usa en la presente memoria, “tratar” se refiere a prevenir, retrasar el inicio, curar, revertir, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir, detener los efectos perjudiciales o estabilizar los síntomas discernibles de las enfermedades, trastornos o afecciones cancerosas descritas anteriormente. También incluye la gestión del cáncer como se ha indicado anteriormente. Por “gestión” se pretende indicar reducir la gravedad de la enfermedad, reducir la frecuencia de los episodios de la enfermedad, reducir la duración de dichos episodios, reducir la gravedad de dichos episodios, frenar/reducir el crecimiento o proliferación de células cancerosas, frenar la progresión de al menos un síntoma, aliviar al menos un parámetro físico medible, y similares. Por ejemplo, las moléculas inmunes anti-PVRIG inmunoestimuladoras deberían promover la inmunidad de células T o NK o citoquinas contra células diana, p.ej., de cáncer, y con ello tratar el cáncer agotando las células implicadas en la condición de enfermedad.
Los anticuerpos de PVRIG de la invención se proporcionan en dosis terapéuticamente efectivas. Una “dosis terapéuticamente efectiva” de una molécula inmune anti-PVRIG según al menos algunas realizaciones de la presente invención preferiblemente da como resultado una reducción de la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia y duración de los periodos libres de síntomas de la enfermedad, un aumento de la esperanza de vida, remisión de la enfermedad, o una prevención o reducción del perjuicio o incapacidad debida a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores positivos en PVRIG, una “dosis terapéuticamente efectiva” preferiblemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento del tumor en al menos aproximadamente 20%, más preferiblemente en al menos aproximadamente 40%, incluso más preferiblemente en al menos aproximadamente 60%, y aún más preferiblemente en al menos aproximadamente 80% respecto a sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir, dicha inhibición in vitro mediante ensayos conocidos por el especialista en la técnica. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor, o de otro modo aliviar los síntomas en un sujeto.
Un especialista en la técnica sería capaz de determinar una cantidad terapéuticamente efectiva en base a factores tales como el tamaño del sujeto, la gravedad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o la ruta de administración seleccionadas.
1. Tratamiento de cáncer
Los anticuerpos de PVRIG de la invención tienen utilidad particular en el tratamiento del cáncer. En general, los anticuerpos de la invención son inmunomoduladores, ya que más que atacar directamente a las células cancerosas, los anticuerpos anti-PVRIG de la invención estimulan el sistema inmunitario, generalmente a través de la inhibición de la acción de PVRIG. Por tanto, al contrario que las terapias dirigidas a tumor, que tienen como objetivo la inhibición de rutas moleculares que son cruciales para el crecimiento y el desarrollo del tumor, y/o el agotamiento de células tumorales, la inmunoterapia de cáncer está dirigida a estimular el propio sistema inmunitario del paciente para eliminar las células cancerosas, proporcionando una destrucción tumoral duradera. Se pueden usar varias estrategias en la inmunoterapia de cáncer, entre ellas se encuentran las vacunas contra el cáncer para inducir respuestas de células T específicas de tumor, y los anticuerpos inmunoestimuladores (es decir, antagonistas de los receptores inhibidores = puntos de control inmune) para eliminar rutas inmunosupresoras.
Las respuestas clínicas con terapia dirigida o terapias anti-cáncer convencionales tienden a ser transitorias ya que las células cancerosas desarrollan resistencia, y se produce una recurrencia del tumor. Sin embargo, el uso clínico de la inmunoterapia de cáncer en los últimos años ha demostrado que este tipo de terapia puede dar lugar a respuestas clínicas duraderas, mostrando un impacto drástico sobre la supervivencia a largo plazo. Sin embargo, aunque las respuestas son duraderas, solo un pequeño número de pacientes responden (al contrario que en la terapia convencional o dirigida, donde responde un gran número de paciente, si bien las respuestas son transitorias).
En el momento en que un tumor es detectado clínicamente, ya ha evadido al sistema inmunitario de defensa, adquiriendo propiedades inmunorresistentes e inmunosupresoras y creando un microentorno tumoral inmunosupresor a través de varios mecanismos y de una variedad de células inmunes.
Por consiguiente, los anticuerpos anti-PVRIG de la invención son útiles para tratar el cáncer. Debido a la naturaleza de un mecanismo de acción inmuno-oncológico, la PVRIG no tiene necesidad de sobreexpresarse o correlacionarse con un tipo de cáncer particular; es decir, la meta es hacer que los anticuerpos anti-PVRIG des-supriman la activación de células T y de células NK, de tal modo que el sistema inmunitario persiga a los cánceres.
“Cáncer”, tal como se usa en la presente memoria, se refiere de forma amplia a cualquier enfermedad neoplásica (ya sea invasiva o metastásica) que se caracteriza por una división celular anormal e incontrolada que produce un crecimiento o tumor maligno (p.ej., crecimiento celular desregulado). El término “cáncer” o “canceroso” tal como se usa en la presente memoria debería entenderse que contempla cualquier enfermedad neoplásica (ya sea invasiva, no invasiva o metastásica) que se caracteriza por una división celular anormal e incontrolada que produce un crecimiento o tumor maligno, describiéndose en la presente memoria ejemplos no limitativos de los mismos. Esto incluye cualquier afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular desregulado. Los ejemplos de cáncer se ejemplifican en los ejemplos de trabajo y también se describen en la presente especificación.
Los ejemplos no limitativos de cáncer que puede ser tratado usando anticuerpos anti-PVRIG incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón (que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (que incluye cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de célula B (que incluye linfoma no de Hodgkin (NHL) de bajo grado/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL de grado difuso intermedio; NHL inmunoblástico de grado elevado; NHL linfoblástico de grado elevado; NHL de célula no separada pequeño de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de célula de manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula vellosa; leucemia mieloblástica crónica; mieloma múltiple y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD).
Otros cánceres susceptibles de tratamiento mediante la presente invención incluyen, aunque sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o malignidades linfoideas. Ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer colorrectal, de vejiga, de ovario, melanoma, cáncer de célula escamosa, cáncer de pulmón (que incluye cáncer de pulmón de célula pequeña, cáncer de pulmón de célula no pequeña, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (que incluye cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándula salival, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de célula B (que incluye linfoma no de Hodgkin (NHL) de bajo grado/folicular; NHL linfocítico pequeño (SL); NHL de grado intermedio/folicular; NHL de grado difuso intermedio; NHL inmunoblástico de grado elevado; NHL linfoblástico de grado elevado; NHL de célula no separada pequeño de grado alto; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de célula de manto; linfoma relacionado con SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de célula vellosa; leucemia mieloblástica crónica; mieloma múltiple y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada a facomatosis, edema (tal como los asociados a tumores cerebrales), y síndrome de Meigs. Preferiblemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer colorrectal, cáncer de mama, cáncer rectal, cáncer de pulmón de célula no pequeña, linfoma no de Hodgkin (NHL), cáncer de célula renal, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer pancreático, sarcoma de tejido blando, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, y mieloma múltiple. En un ejemplo de realización, el cáncer es un cáncer temprano o avanzado (que incluye metastásico) de vejiga, ovario o un melanoma. En otra realización, el cáncer es cáncer colorrectal. Las afecciones cancerosas susceptibles de tratamiento de la invención incluyen cánceres que expresan o que no expresan PVRIG y además incluyen cánceres no metastásicos o no invasivo, así como invasivos y metastásicos, donde la expresión de PVRIG por parte de células inmunes, estromales o enfermas suprime las respuestas antitumorales y las respuestas inmunes anti-invasivas. El método de la presente invención es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores vascularizados.
Tal como se muestra en los Ejemplos, la PVRIG es sobreexpresada y/o se correlaciona con la infiltración de linfocitos tumoral (como demuestra la correlación con la expresión de CD3, CD4, CD8 y PD-1) en una serie de tumores diferentes de orígenes diversos, y por tanto es útil en el tratamiento de cualquier cáncer, que incluye, aunque sin limitación, cáncer de próstata, cáncer de hígado (HCC), cáncer colorrectal, cáncer de ovario, cáncer endometrial, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de estómago, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, cáncer tiroideo, cáncer de testículos, cáncer urotelial, cáncer de pulmón, melanoma, cáncer de piel no melanoma (carcinoma de célula escamosa y basal), glioma, cáncer renal (RCC), linfoma (linfoma no de Hodgkin (NHL) y linfoma de Hodgkin (HD)), leucemia mieloide aguda (AML),) leucemia linfoblástica aguda de célula T (T-ALL), linfoma de célula B grande difusa, tumores de célula germinal testicular, mesotelioma y cáncer esofágico.
“Terapia de cáncer” en la presente memoria se refiere a cualquier método que previene o trata un cáncer, o que alivia uno o más de los síntomas del cáncer. Típicamente, dichas terapias comprenderán la administración de anticuerpos anti-PVRIG inmunoestimuladores (que incluyen fragmentos de unión a antígeno) tanto solos como en combinación con quimioterapia o radioterapia u otros agentes biológicos para mejorar su actividad, es decir, en individuos en los que la expresión de PVRIG suprime las respuestas antitumorales y la eficacia de la quimioterapia o la radioterapia o la eficacia biológica.
2. Terapias de combinación en cáncer
Como es sabido en la técnica, las terapias de combinación que comprenden un anticuerpo terapéutico dirigido a una diana de inmunoterapia y un agente terapéutico adicional, específico para la condición de enfermedad, resultan muy prometedoras. Por ejemplo, en el área de la inmunoterapia, existe una serie de terapias de combinación prometedoras que usan un agente quimioterapéutico (tanto un fármaco de molécula pequeña como un anticuerpo anti-tumoral) con anticuerpos inmuno-oncológicos como el anti-PD-1, y como tal, los anticuerpos anti-PVRIG descritos en la presente memoria pueden ser sustituidos del mismo modo. Se puede usar cualquier agente quimioterapéutico que exhiba actividad anti-cáncer de acuerdo a la presente invención; en la especificación se describen varios ejemplos no limitativos.
El fundamento científico subyacente para el aumento drástico de la eficacia de la terapia de combinación reivindica que el bloqueo del punto de control inmune como monoterapia inducirá regresiones tumorales solo cuando existe una respuesta inmune anti-tumoral pre-existente fuerte que pueda ser “liberada” cuando se bloquea la ruta. Sin embargo, en la mayoría de los pacientes y tipos de tumores, las respuestas inmunes anti-tumorales endógenas son débiles, y por tanto se requiere una inducción de inmunidad anti-tumoral para que el bloqueo del punto de control inmune sea efectivo, tal como muestra la Figura 1. Según al menos algunas realizaciones de la presente invención, los anticuerpos específicos de PVRIG, fragmentos de anticuerpo, conjugados y composiciones que los comprenden, se usan para el tratamiento de todos los tipos de cáncer en inmunoterapia de cáncer en terapia de combinación.
Los términos “en combinación con” y “co-administración” no se limitan a la administración de dichos agentes profilácticos o terapéuticos exactamente al mismo tiempo. En su lugar, se pretende que el anticuerpo anti-PVRIG y el otro agente o agentes se administren en una secuencia, y en un intervalo de tiempo, tales que puedan actuar juntos para proporcionar un beneficio que se ve aumentado en comparación con el tratamiento solo con anticuerpo anti-PVRIG de la presente invención o solo con el otro agente o agentes. Se prefiere que el anticuerpo anti-PVRIG y el otro agente o agentes actúen aditivamente, y especialmente se prefiere que actúen sinérgicamente. Dichas moléculas se presentan de forma adecuada en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito pretendido. El médico responsable puede determinar empíricamente, o considerando la farmacocinética y los modos de acción de los agentes, la dosis o dosis apropiadas de cada agente terapéutico, así como el calendario y los métodos de administración apropiados.
Por consiguiente, los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse concomitantemente con uno o más regímenes o agentes terapéuticos adicionales. Los regímenes o agentes terapéuticos adicionales pueden usarse para mejorar la eficacia o la seguridad del anticuerpo anti-PVRIG. Asimismo, los regímenes o agentes terapéuticos adicionales pueden usarse para tratar la misma enfermedad o comorbilidad, más que para alterar la acción del anticuerpo de PVRIG. Por ejemplo, un anticuerpo de PVRIG de la presente invención puede administrarse al paciente junto con quimioterapia, terapia de radiación, o ambas, quimioterapia y terapia de radiación.
Los anticuerpos de PVRIG de la presente invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes profilácticos o terapéuticos, que incluyen, aunque sin limitación, agentes citotóxicos, agentes quimioterapéuticos, citoquinas, agentes inhibidores del crecimiento, agentes anti-hormonales, inhibidores de quinasa, agentes antiangiogénicos, cardioprotectores, agentes inmunoestimuladores, agentes inmunosupresores, agentes que promueven la proliferación de células hematológicas, inhibidores de angiogénesis, inhibidores de proteína tirosina quinasa (PTK), u otros agentes terapéuticos.
Según al menos algunas realizaciones, las moléculas inmunes anti PVRIG podrían usarse en combinación con cualquiera de las conocidas en la técnica estándar de tratamiento de cuidado del cáncer (como puede encontrarse, por ejemplo, en http://www.cancer.gov/cancertopics).
Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti PVRIG combinado con al menos un agente terapéutico o inmuno modulador adicional, otros compuestos o inmunoterapias, o estrategias inmunoestimuladoras como las descritas en la presente memoria, que incluye, aunque sin limitación, vacunas tumorales, terapia de célula T adoptiva, agotamiento de Treg, anticuerpos (p.ej., bevacizumab, Erbitux), péptidos, pepti-cuerpos, moléculas pequeñas, agentes quimioterapéuticos tales como agentes citotóxicos y citostáticos (p.ej., paclitaxel, cisplatino, vinorelbina, docetaxel, gemcitabina, temozolomide, irinotecan, 5FU, carboplatino), modificadores inmunológicos tales como interferones e interleucinas, anticuerpos inmunoestimuladores, hormonas del crecimiento u otras citoquinas, ácido fólico, vitaminas, minerales, inhibidores de aromatasa, ARNi, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de proteasa, doxorrubicina (Adrimicina), cisplatino bleomicina sulfato, carmustina, clorambucilo e ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismas, solo son efectivas en niveles que son tóxicos o subtóxicos para un paciente. El cisplatino se administra intravenosamente a 100 mg/dosis una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra intravenosamente a 60-75 mg/mL una vez cada 21 días.
Según al menos algunas realizaciones de la presente invención, los agentes terapéuticos que se pueden usar en combinación con anticuerpos anti-PVRIG son agentes potenciadores que aumentan las respuestas anti-tumorales, p.ej., otros anticuerpos anti-punto de control inmune u otros agentes potenciadores que se activan principalmente para aumentar respuestas anti-tumorales endógenas, tales como radioterapia, crioterapia, quimioterapia convencional/clásica que potencia respuestas inmunes anti-tumorales, terapia dirigida que potencia respuestas inmunes anti-tumorales, terapia anti-angiogénica, agentes terapéuticos dirigidos a células inmunosupresoras tales como Tregs y MDSCs, anticuerpos inmunoestimuladores, terapia de citoquinas, vacunas de cáncer terapéuticas, transferencia de células adoptivas.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con bisfosfonatos, especialmente aminobisfosfonatos (ABP), que han demostrado presentar actividad anticancerígena. Algunas de las actividades asociadas a los ABPs son sobre células y§T humanas que cubren la interfaz de la inmunidad innata y adaptativa y que presentan una potente actividad antitumoral.
Las terapias dirigidas también pueden estimular la respuesta inmune específica de tumor induciendo la muerte inmunogénica de células tumorales, o alterando mecanismos efectores inmunes (Galluzzi et al, 2012, Nature Reviews -Drug discovery, Volumen 11, páginas 215-233).
Según al menos algunas realizaciones de la invención, en la presente memoria se describen terapias dirigidas usadas como agentes para combinación con moléculas inmunes anti PVRIG para el tratamiento de cáncer.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con agentes terapéuticos dirigidos a células inmunosupresoras reguladoras tales como células T reguladoras (Tregs) y células supresoras derivadas de mieloide (MDSCs). Una serie de agentes quimioterapéuticos usados habitualmente ejercen una acción no específica de Tregs y reducen el número o la capacidad inmunosupresora de las Tregs o las MDSCs (Facciabene A. et al 2012 Cáncer Res; 72(9) 2162-71; Byrne WL. et al 2011, Cáncer Res. 71: 691520; Gabrilovich DI. y Nagaraj S, Nature Reviews 2009 Volumen 9, páginas 162-174). A este respecto, la terapia metronómica con algunos fármacos de quimioterapia da como resultado efectos inmunoestimuladores en lugar de inmunosupresores, a través de la modulación de células reguladoras. Por tanto, según al menos algunas realizaciones de la presente invención, la molécula inmune anti-PVRIG para inmunoterapia de cáncer se usa en combinación con fármacos seleccionados, aunque sin limitación, entre ciclofosfamida, gemcitabina, mitoxantrona, fludarabina, docetaxel, paclitaxel, talidomida y derivados de talidomida.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PVRIG se usan en combinación con nuevos agentes dirigidos específicos de Treg que incluyen: 1) anticuerpos agotadores o asesinos que atacan directamente a Tregs a través del reconocimiento de receptores superficiales de la célula Treg tales como mAbs anti-CD25, daclizumab, basiliximab, o 2) toxinas dirigidas a ligando tales como denileucina diftitox (Ontak), una proteína de fusión de IL-2 humana y toxina de la difteria, o LMB-2, una fusión entre un scFv contra CD25 y exotoxina de Pseudomonas, y 3) anticuerpos dirigidos a receptores superficiales de células Treg tales como CTLA4, PD-1, OX40 y GITR, o 4) anticuerpos, moléculas pequeñas o proteínas de fusión dirigidas a otros receptores NK, como los identificados previamente.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con cualquiera de las opciones descritas más adelante para alterar la inducción y/o la función de Treg, que incluyen agonistas de TLR (receptores tipo peaje); agentes que interfieren con la ruta adenosinérgica, tal como inhibidores de ectonucleotidasa, o inhibidores del receptor de adenosina A2A; inhibidores de TGF-p, tal como fresolimumab, lerdelimumab, metelimumab, trabedersen, LY2157299, LY210976; bloqueo del reclutamiento de Tregs a tejidos tumorales, que incluyen inhibidores de receptor de quimiocina, tal como la ruta CCR4/CCL2/CCL22.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con cualquiera de las opciones descritas más adelante para inhibir el microentorno tumoral inmunosupresor, que incluyen inhibidores de citoquinas y enzimas que ejercen actividades inmunosupresoras, tales como inhibidores de IDO (indolamina-2,3-dioxigenasa); inhibidores de citoquinas anti-inflamatorias que promueven un microentorno inmunosupresor, tales como IL-10, IL-35, IL-4 e IL-13; Bevacizumab® que reduce Tregs y favorece la diferenciación de DCs.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con cualquiera de las opciones descritas más adelante para atacar MDSCs (células supresoras derivadas de mieolide), que incluye promover su diferenciación en células mieloides maduras que no presentan funciones supresoras por metabolitos de vitamina D3, o vitamina A, tales como ácido retinoico, ácido retinoico todo-trans (ATRA); inhibición de la actividad supresora de MDSCs mediante inhibidores de COX2, inhibidores de fosfodiesterasa 5 como sildenafil, inhibidores de ROS tales como nitroaspirina.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PVRIG se usan en combinación con anticuerpo inmunoestimuladores u otros agentes que potencian las respuestas inmunes anti-tumorales (Pardoll J ExpMed. 2012; 209(2): 201-209). Los anticuerpos inmunoestimuladores promueven la inmunidad anti-tumoral modulando directamente las funciones inmunes, es decir, bloqueando otras dianas inhibidoras o potenciando proteínas inmunoestimuladoras. Según al menos algunas realizaciones de la presente invención, las moléculas inmunes anti-PVRIG para inmunoterapia de cáncer se usan en combinación con anticuerpos antagonistas dirigidos contra puntos de control inmunes adicionales que incluyen mAbs anti-CTLA4, tales como ipilimumab, tremelimumab; anti-PD-1 tales como nivolumab BMS-936558/ MDX-1106/ONO-4538, AMP224, CT-011, MK-3475, antagonistas anti-PDL-1 tales como BMS-936559/ MDX-1105, MEDI4736, RG-7446/MPDL3280A; Anti-LAG-3 tal como IMP-321), anti-TIM-3, anti-BTLA, anti-B7-H4, anti-B7-H3, Anti­ VISTA; anticuerpos agonistas dirigidos contra proteínas inmunoestimuladoras, que incluyen mAbs anti-CD40 tales como CP-870.893, lucatumumab, dacetuzumab; mAbs anti-CD137 tales como BMS-663513 urelumab, PF-05082566; mAbs anti-OX40, tales como anti-OX40; mAbs anti-GITR tales como TRX518; mAbs anti-CD27, tales como CDX-1127; y mAbs anti-ICOS.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con citoquinas. Una serie de citoquinas se encuentran en desarrollo preclínico o clínico como agentes que potencian las respuestas inmunes anti-tumorales para inmunoterapia de cáncer, que incluyen, entre otras: IL-2, IL-7, iL-12, IL-15, IL-17, IL-18 e IL-21, IL-23, IL-27, GM-Cs F, IFNa (interferón a), IFNp, e IFNy. Sin embargo, la eficacia terapéutica a menudo se ve impedida por efectos secundarios severos y unas malas propiedades farmacocinéticas. Por tanto, además de la administración sistémica de citoquinas, se puede emplear una variedad de estrategias para la administración de citoquinas terapéuticas y su localización en el sitio del tumor, a fin de mejorar su farmacocinética, así como su eficacia y/o citotoxicidad, que incluyen moléculas de fusión anticuerpo-citoquina (inmunocitoquinas), la conjugación química a polietilen glicol (PEGilación), la expresión transgénica de citoquinas en células tumorales enteras autólogas, la incorporación de genes de citoquina en vacunas de ADN, vectores virales recombinantes para administrar genes de citoquinas, etc. En el caso de las inmunocitoquinas, la fusión de citoquinas a anticuerpos específicos de tumor, o a fragmentos de anticuerpo, permite la administración dirigida y por tanto una mejor eficacia y farmacocinética, y menores efectos secundarios.
En algunas realizaciones, los anticuerpos anti-PVRIG se usan en combinación con vacunas de cáncer. Las vacunas terapéuticas contra el cáncer permiten una mejor imprimación de células T y una mejor presentación de antígenos, y pueden usarse como agentes terapéuticos para potenciar respuestas inmunes anti-tumorales (Mellman I. et al., 2011, Nature, 480: 22-29; Schlom J, 2012, J Natl Cáncer Inst; 104: 599-613).
Varios tipos de vacunas terapéuticas contra el cáncer se encuentra en desarrollo preclínico o clínico. Éstas incluyen, por ejemplo:
1) Vacunas de célula tumoral entera, en las cuales se tratan células cancerosas extraídas mediante cirugía para potenciar su inmunogenicidad, y se inyectan al paciente para inducir respuestas inmunes contra antígenos en las células tumorales. La vacuna de célula tumoral puede ser autóloga, es decir, un tumor del propio paciente, o alogénica, que típicamente contiene dos o tres líneas celulares tumorales humanas establecidas y caracterizadas de un tipo de tumor dado, tal como las plataformas de vacunas GVAX.
2) Vacunas de antígeno tumoral, en las que se administra un antígeno tumoral (o una combinación de unos pocos antígenos tumorales), normalmente proteínas o péptidos, para activar el sistema inmunitario (posiblemente con un adyuvante y/o con moduladores o atractores inmunes de células dendríticas tales como GM-CSF). Los antígenos tumorales pueden ser específicos para un determinado tipo de cáncer, pero no se fabrican para un paciente específico.
3) Vacunas de antígeno tumoral basadas en vectores y vacunas de ADN, pueden usarse como una forma de proporcionar un suministro continuo de antígenos para estimular una respuesta inmune anti-tumoral. Los vectores que codifican antígenos tumorales son inyectados en el paciente (posiblemente con proinflamatorios u otros atractores tales como GM-CSF), son captados por las células in vivo para fabricar los antígenos específicos, que a continuación provocarían la respuesta inmune deseada. Se pueden usar vectores para administrar más de un antígeno tumoral a la vez, para aumentar la respuesta inmune. Adicionalmente, los vectores de virus, bacterias o levaduras recombinantes deberían activar sus propias respuestas inmunes, lo que también puede potenciar la respuesta inmune global.
4) Vacunas de virus oncolíticas, tales como OncoVez/T-VEC, que implica la inyección intratumoral de virus del herpes simple de replicación-condicional que infecta preferentemente células cancerosas. El virus, que también ha sido modificado para expresar GM-CSF, es capaz de replicarse dentro de una célula de cáncer produciendo su lisis, liberando nuevos virus y un conjunto de antígenos tumorales, y secretando GM-CSF en el proceso. De este modo, dichas vacunas víricas oncolíticas potencian la función de las DCs en el microentorno tumoral para estimular respuestas inmunes anti-tumorales.
5) Vacunas de células dendríticas (Palucka y Banchereau, 2102, Nat. Rev. Cáncer, 12(4): 265-277): las células dendríticas (DCs) fagocitan células tumorales y presentan antígenos tumorales a células T específicas de tumor. En esta estrategia, se aíslan DCs del paciente con cáncer y se impriman para presentar células T específicas de tumor. Para ello se pueden usar varios métodos: las DCs son cargadas con células o lisatos tumorales; las DCs son cargadas con proteínas de fusión o péptidos de antígenos tumorales; acoplamiento de antígenos tumorales a mAbs dirigidos a DC. Las DCs son tratadas en presencia de un factor estimulante (tal como GM-CSF), activadas y maduradas ex vivo, y a continuación re-infundidas de vuelta al paciente para provocar una respuesta inmune a otras células cancerosas. Las células dendríticas también pueden imprimarse in vivo mediante inyección de pacientes con células tumorales enteras irradiadas modificadas para secretar citoquinas estimulantes (tal como GM-CSF). Se pueden llevar a cabo estrategias similares con monocitos. Sipuleucel-T (Provenge), una vacuna terapéutica contra el cáncer que ha sido aprobada para el tratamiento del cáncer de próstata avanzado, es un ejemplo de vacuna de células dendríticas.
En algunas realizaciones, se usan anticuerpos anti-PVRIG en combinación con terapia de células T adoptivas o transferencia de células adoptivas (ACT), que implica la identificación y expansión ex vivo de células T específicas de tumor naturales autólogas, que a continuación son transferidas de vuelta adoptivamente al paciente de cáncer (Restifo et al, 2013, CáncerImmunol. Immunother.62(4): 727-36 (2013) Epub Dic.42012). Las células que infundidas de vuelta a un paciente tras expansión ex vivo pueden apuntar al tumor y mediar en su destrucción. Antes de esta transferencia adoptiva, los hospedantes pueden ser inmunoagotados mediante radiación y/o quimioterapia. La combinación de linfoagotamiento, transferencia de células adoptivas, y un factor de crecimiento de célula T (tal como IL-2), puede conducir a una erradicación prolongada del tumor en pacientes tumorales. Una estrategia más novedosa implica la modificación genética ex vivo de células T de sangre periférica normales para conferir especificidad por los antígenos asociados al tumor. Por ejemplo, se pueden insertar clones de TCRs o de células T con respuestas anti-tumorales particularmente buenas en vectores de expresión víricos y usarse para infectar células T autólogas de paciente en tratamiento. Otra opción es el uso de receptores de antígeno quiméricos (CARs) que son esencialmente unas moléculas quiméricas de inmunoglobulina-TCR, también conocidas como T-cuerpos. Los CARs tienen especificidades de tipo anticuerpo y reconocen estructuras no restringidas de MHC sobre la superficie de las células diana (el módulo de unión a diana extracelular), ancladas a los dominios intracelulares TCR capaces de activar células T (Restifo et al Cáncer Immunol. Immunother. 62(4): 727-36 (2013) Epub Dic. 42012; y Shi et al, Nature 493: 111-115, 2013.
Los anticuerpos de PVRIG y uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. La composición puede estar ligada a un agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse de forma separada del agente. En este último caso (administración separada), la composición se puede administrar antes, después o concurrentemente con el agente, o puede co-administrarse con otras terapias conocidas, p.ej., una terapia anti-cáncer, p.ej., radiación.
La co-administración de las moléculas inmunes anti-PVRIG humanizadas, según al menos algunas realizaciones de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporciona dos agentes anti-cáncer que operan a través de mecanismos diferentes que dan lugar a un efecto citotóxico para las células tumorales humanas. Dicha co­ administración puede resolver problemas debidos al desarrollo de resistencia a fármacos o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las haría no reactivas con el anticuerpo. En otras realizaciones, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente que modula, p.ej., potencia o inhibe, la expresión o la actividad de Fcy o de receptores de Fcy, por ejemplo, tratando al sujeto con una citoquina.
También pueden usarse como agentes terapéuticos células efectoras específicas de diana, p.ej., células efectoras ligadas a composiciones (p.ej., anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi-específicas) según al menos algunas realizaciones de la presente invención. Las células efectoras para ataque pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células portadoras de receptor de IgG o IgA. Si se desea, se pueden obtener células efectoras del sujeto en tratamiento. Las células efectoras específicas de diana pueden administrarse como una suspensión de células en una disolución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 10'8 a 10'9 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula diana, p.ej., una célula tumoral que expresa proteínas PVRIG, y para efectuar la muerte celular, p.ej., mediante fagocitosis. Las rutas de administración también pueden variar.
La terapia con células efectoras específicas de diana se puede llevar a cabo en conjunción con otras técnicas para la eliminación de células diana. Por ejemplo, se puede usar terapia anti-tumoral con las composiciones (p.ej., anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi-específicas) según al menos algunas realizaciones de la presente invención y/o células efectoras armadas con dichas composiciones en conjunción con quimioterapia. Adicionalmente, se puede usar inmunoterapia de combinación para dirigir dos poblaciones efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de células tumorales. Por ejemplo, se pueden usar moléculas inmunes anti-PVRIG ligadas a anti-Fc-YRI o anti-CD3 en conjunción con agentes de unión específicos de receptor de IgG o IgA.
También se pueden usar moléculas bi-específicas y multi-específicas según al menos algunas realizaciones de la presente invención para modular FcyR o los niveles de FcyR en células efectoras, tal como tapando y eliminando los receptores de la superficie celular. También se pueden usar mezclas de receptores anti-Fc para este propósito.
Las composiciones terapéuticas (p.ej., anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi-específicas de estructuras alternativas e inmunoconjugados) según al menos algunas realizaciones de la presente invención que tienen sitios de unión de complemento, tal como porciones de IgG1, -2 o -3, o IgM, que se unen a complemento, también pueden usarse en presencia de complemento. En una realización, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprenden células diana con un agente de unión según al menos algunas realizaciones de la presente invención y células efectoras apropiadas puede suplementarse mediante la adición de complemento o complemento que contiene suero. La fagocitosis de células diana recubiertas con un agente de unión según al menos algunas realizaciones de la presente invención puede mejorarse mediante la unión de proteína de complemento. En otra realización, las células diana recubiertas con las composiciones (p.ej., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y bi-específicas) según al menos algunas realizaciones de la presente invención, también pueden ser lisadas por complemento. En otra realización adicional, las composiciones según al menos algunas realizaciones de la presente invención no activan complemento.
Las composiciones terapéuticas (p.ej., anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas y bi-específicas de estructuras alternativas e inmunoconjugados) según al menos algunas realizaciones de la presente invención también pueden ser administradas junto a complemento. Por tanto, según al menos algunas realizaciones de la presente invención existen composiciones, que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas o bi-específicas y suero o complemento. Dichas composiciones son ventajosas en que el complemento está localizado en estrecha proximidad respecto a los anticuerpos humanos, o las moléculas multi-específicas o bi-específicas. Alternativamente, los anticuerpos humanos, moléculas multi-específicas o bi-específicas de al menos algunas realizaciones de la presente invención y el complemento o suero pueden administrarse por separado.
Las moléculas inmunes anti-PVRIG, según al menos algunas realizaciones de la presente invención, también pueden usarse como anticuerpos neutralizantes. Un anticuerpo neutralizante (NAbs), es un anticuerpo que es capaz de unirse y neutralizar o inhibir un antígeno específico, inhibiendo con ello su efecto biológico. Los NAbs eliminarán parcial o completamente la acción biológica de un agente a través del bloqueo de una molécula superficial importante necesaria para su actividad, o interfiriendo en la unión del agente con su receptor en una célula diana.
Según un aspecto adicional de la presente invención, se pueden usar agentes terapéuticos para prevenir la inhibición patológica de la actividad de células T, tal como aquella dirigida contra células cancerosas.
Por tanto, según un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para tratar cáncer como el mencionado en la presente memoria, y/o para promover la estimulación inmune a través de la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad efectiva de uno cualquiera de los agentes terapéuticos y/o composiciones farmacéuticas que comprenden cualquiera de los agentes terapéuticos y que además comprenden un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
Según al menos algunas realizaciones, las células inmunes, preferiblemente células T, se pueden poner en contacto in vivo o ex vivo con los agentes terapéuticos para modular las respuestas inmunes. Las células T puestas en contacto con los agentes terapéuticos pueden ser cualquier célula que expresa el receptor de célula T, que incluye receptores de células T a/p y y/6. Las células T incluyen todas las células que expresan CD3, que incluyen subconjuntos de células T que también expresan CD4 y CDS. Las células T incluyen tanto células vírgenes (naive) como de memoria y células efectoras tales como linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTL). Las células T también incluyen células tales como Th1, Tc1, Th2, Tc2, Th3, Th9, Th17, Th22, Treg, células colaboradoras foliculares (Tfh) y células Tr1. Las células T también incluyen células NKT iNKT, NKT a/p y NKT y/6, y clases únicas similares del linaje de células T.
Los anticuerpos de bloqueo de PVRIG pueden usarse en combinación con anticuerpos bi-específicos que dirigen células efectoras que expresan receptor de Fca o Fcy a las células tumorales (véase, p.ej., Patentes de EE.UU. n° 5.922.845 y 5.837.243). Los anticuerpos bi-específicos pueden usarse para atacar dos antígenos separados. Por ejemplo, se han usado anticuerpos bi-específicos anti-receptor Fc/anti-antígeno tumoral (p.ej., Her-2/neu) para dirigir macrófagos a sitios de tumor. Esta dirección puede activar de una forma más efectiva las respuestas específicas de tumor. El brazo de células T de dichas respuestas aumentaría por el uso del bloqueo de PVRIG. Alternativamente, el antígeno se pude administrar directamente a DCs mediante el uso de anticuerpos bi-específicos que se unen a antígeno de tumor y a un marcador de superficie celular específico de célula dendrítica.
Los tumores evaden la vigilancia inmune del hospedante a través de una gran variedad de mecanismos. Muchos de estos mecanismos pueden solventarse mediante la inactivación de proteínas que son expresadas por los tumores y que son inmunosupresoras. Éstas incluyen entre otras TGF-p (Kehrl, J. et al. (1986) J Exp. Med. 163: 1037-1050), IL-10 (Howard, M. & O'Garra, A. (1992) Immunology Today 13: 198-200), y ligando Fas (Hahne, M. et al. (1996) Science 274: 1363-1365). Los anticuerpos de cada una de estas entidades pueden usarse en combinación con anti-PVRIG para contrarrestar los efectos del agente inmunosupresor y favorecer las respuestas inmunes del hospedante.
Pueden usarse en combinación con anti-PVRIG otros anticuerpos que pueden usarse para activar la capacidad de respuesta inmune. Éstos incluyen moléculas de la superficie de células dendríticas que activan la función DC y la presentación de antígenos. Los anticuerpos anti-CD40 son capaces de sustituir de forma efectiva para la actividad colaboradora de célula T (Ridge, J. et al. (1998) Nature 393: 474-478) puede usarse en conjunción con anticuerpos de PVRIG (Ito, N. et al. (2000) Immunobiology 201 (5) 527-40). La activación de anticuerpos de moléculas coestimuladoras de células T tales como OX-40 (Weinberg, A. et al. (2000) Immunol 164: 2160-2169), 4-1BB (Melero, I. et al. (1997) Nature Medicine 3: 682-685 (1997), e ICOS (Hutloff, A. et al. (1999) Nature 397: 262-266) así como anticuerpos que bloquean la actividad de moléculas coestimuladoras negativas tales como CTLA-4 (p.ej., Patente de EE.UU. n° 5.811.097, implimumab) o BTLA (Watanabe, N. et al. (2003) Nat Immunol 4: 670-9), B7-H4 (Sica, G Let al. (2003) Immunity 18: 849-61) PD-1, también pueden proporcionar niveles incrementados de activación de células T. Actualmente se está usando el trasplante de médula ósea para tratar una variedad de tumores de origen hematopoyético. Aunque la enfermedad de injerto contra hospedante es una consecuencia de este tratamiento, el beneficio terapéutico puede obtenerse a partir de respuestas de injerto contra tumor. El bloqueo de PVRIG pueden usarse para aumentar la eficacia de las células T específicas de tumo injertadas en el donante.
También existen varios protocolos de tratamiento experimentales que implican la activación y expansión ex vivo de células T específicas de antígeno y la transferencia adoptiva de dichas células a receptores para activar células T específicas de antígeno contra el tumor (Greenberg, R. & Riddell, S. (1999) Science 285: 546-51). Estos métodos también pueden usarse para activar respuestas de células T frente a agentes infecciosos tales como CMV. Se puede esperar que la activación ex vivo en presencia de moléculas inmunes anti-PVRIG aumente la frecuencia y la actividad de las células T transferidas adoptivamente.
Opcionalmente, los anticuerpos de PVRIG se pueden combinar con un agente inmunogénico, tal como células cancerosas, antígenos tumorales purificados (que incluyen proteínas, péptidos y moléculas de carbohidratos recombinantes), células, y células transfectadas con genes que codifican citoquinas estimuladoras inmunes (He et al (2004) J Immunol. 173: 4919-28). Los ejemplos no limitativos de vacunas tumorales que pueden usarse incluyen péptidos de MUC1 para el tratamiento de cáncer de colon, péptidos de MUC-1/CEA/TRICOM para el tratamiento del cáncer de ovario, o células tumorales para expresar la citoquina GM-CSF (discutido detalladamente más adelante).
En humanos, se ha demostrado que algunos tumores son inmunogénicos, tal como RCC. Se anticipa que elevando el umbral de activación de células T mediante el bloqueo de PVRIG, se puede esperar la activación de respuestas tumorales en el hospedante.
El bloqueo de PVRIG probablemente es más efectivo cuando se combina con un protocolo de vacunación. Se han contemplado muchas estrategias experimentales para la vacunación contra tumores (véase Rosenberg, S., 2000, Development of Cancer Vaccines, ASCO Educational Book Spring: 60-62; Logothetis, C., 2000, ASCO Educational Book Spring: 300-302; Khayat, D. 2000, ASCO Educational Book Spring: 414-428; Foon, K. 2000, ASCO Educational Book Spring: 730-738; véase también Restifo, N. y Sznol, M., Cancer Vaccines, Ch. 61, pp. 3023-3043 en DeVita, V. et al. (eds.), 1997, Cancer: Principies and Practice of Oncology. Fifth Edition). En una de estas estrategias, se prepara una vacuna usando células tumorales autólogas o alogénicas. Se ha demostrado que dichas vacunas celulares son más efectivas cuando las células tumorales son transducidas para expresar GM-CSF. Se ha demostrado que el GM-CSF es un potente activador de la presentación de antígenos para la vacunación tumoral (Dranoff et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA. 90: 3539-43).
El estudio de la expresión génica y de los patrones de expresión génica a gran escala en varios tumores ha conducido a la definición de los conocidos como antígenos específicos de tumor (Rosenberg, S A (1999) Immunity 10: 281-7). En muchos casos, dichos antígenos específicos de tumor son antígenos de diferenciación expresados en los tumores y en la célula a partir de los cuáles surgió el tumor, por ejemplo, antígenos de melanocito gp100, antígenos MAGE, y Trp-2. Más importante, muchos de estos antígenos pueden demostrar ser las dianas de células T específicas de tumor observadas en el hospedante. Se puede usar el bloqueo de PVRIG en conjunción con una colección de proteínas recombinantes y/o péptidos expresados en un tumor a fin de generar una respuesta inmune frente a estas proteínas. Dichas proteínas normalmente son vistas por el sistema inmunitario como auto-antígenos y por lo tanto son tolerantes a las mismas. El antígeno tumoral también puede incluir la proteína telomerasa, que es requerida para la síntesis de telómeros de cromosomas y que se expresa en más del 85% de los cánceres humanos y solo en un número limitado de tejidos somáticos (Kim, N et al. (1994) Science 266: 2011-2013). (Dichos tejidos somáticos pueden protegerse frente al ataque inmune por diversos medios). Los antígenos tumorales también pueden ser “neo-antígenos” expresados en células cancerosas debido a mutaciones somáticas que alteran la secuencia proteínica o crean proteínas de fusión entre dos secuencias no relacionadas (es decir, bcr-ab1 en el cromosoma Philadelphia), o idiotipo de tumores de célula B.
Otras vacunas tumorales pueden incluir las proteínas de virus implicados en cánceres humanos tales como el virus del papiloma humano (HPV), los virus de la hepatitis (HBV y HCV) y el virus de sarcoma de herpes de Kaposi (KHSV). Otra forma de antígeno específico de tumor que puede usarse en conjunción con el bloqueo de PVRIG son las proteínas de choque térmico (HSP) purificadas, aisladas del propio tejido del tumor. Estas proteínas de choque térmico contienen fragmentos de proteínas de las células tumorales, y dichas HSPs son altamente eficientes en la administración a células presentadoras de antígeno para activar una inmunidad tumoral (Suot, R & Srivastava, P (1995) Science 269:1585-1588; Tamura, Y. et al. (1997) Science 278: 117-120).
Las células dendríticas (DC) son células presentadoras de antígenos potentes que pueden usarse para imprimar respuestas específicas de antígeno. Las DCs pueden producirse ex vivo y cargarse en con diversos antígenos de proteína y péptido, así como con extractos de células tumorales (Nestle, F. et al. (1998) Nature Medicine 4: 328-332). Asimismo, las DCs también pueden transducirse por medios genéticos para expresar dichos antígenos tumorales. Las DCs también han sido fusionadas directamente a células tumorales con el fin de inmunización (Kugler, A. et al. (2000) Nature Medicine 6: 332-336). Como método de vacunación, la inmunización de DC puede combinarse de forma efectiva con el bloqueo de PVRIG para activar respuestas anti-tumorales más potentes.
Uso de los agentes terapéuticos según al menos algunas realizaciones de la invención como adyuvante para vacunación de cáncer:
La inmunización contra antígenos asociados a tumor (TAAs) es una estrategia prometedora para la terapia y prevención de cáncer, pero afronta varios retos y limitaciones, tales como los mecanismos de tolerancia asociados a auto-antígenos expresados por las células tumorales. Moléculas coestimuladoras tales como B7.1 (CD80) y B7.2 (CD86) han mejorado la eficacia de las vacunas de base génica y de base celular en modelos animales y se encuentran bajo investigación como adyuvante en ensayos clínicos. Esta actividad de adyuvante puede lograrse potenciando la señal coestimuladora o bloqueando la señal inhibidora que se transmite por coestimuladores negativos expresados por células tumorales (Neighbors et al., 2008 J Immunother.; 31 (7): 644-55).
Según al menos algunas realizaciones de la invención, uno cualquiera de los anticuerpos policlonales o monoclonales y/o de los fragmentos de unión a antígeno y/o de los conjugados que los contienen, y/o de las estructuras alternativas, específicos para una cualquiera de las proteínas PVRIG, puede usarse como adyuvante para vacunación de cáncer. Según al menos algunas realizaciones, la invención proporciona métodos para mejorar la inmunización contra TAAs, que comprende administrar a un paciente una cantidad efectiva de uno cualquiera de los anticuerpos policlonales o monoclonales y/o de los fragmentos de unión a antígeno y/o de los conjugados que los contienen, y/o de las estructuras alternativas, específicos para una cualquiera de las proteínas PVRIG.
En algunas realizaciones, la invención proporciona el uso de anticuerpos de PVRIG para llevar a cabo uno o más acciones de las siguientes en un sujeto que lo necesite: (a) regular al alza las citoquinas pro-inflamatorias; (b) aumentar la proliferación y/o la expansión de células T; (c) aumentar la producción de interferón-Y o de TNF-a por las células T; (d) aumentar la secreción de IL-2; (e) estimular respuestas de anticuerpos; (f) inhibir el crecimiento de células cancerosas; (g) promover la inmunidad de células T específica de antígeno; (h) promover la activación de células T CD4+ y/o CD8+; (i) aliviar la supresión de células T; (j) promover la actividad de células NK; (k) promover la apoptosis o lisis de células cancerosas; y/o (l) el efecto citotóxico o citostático en células cancerosas.
En otras realizaciones, la invención proporciona el uso de un anticuerpo inmunoestimulador, un fragmento de unión a antígeno o conjugado del mismo según al menos algunas realizaciones de la invención (opcionalmente en una composición farmacéutica) para antagonizar al menos un efecto inhibidor inmune de la PVRIG.
Dicho anticuerpo, fragmento de unión a antígeno o conjugado del mismo, opcional y preferiblemente media en al menos uno de los siguientes efectos:
(i) aumento de la respuesta inmune, (ii) aumento de la activación de células T ap y/o y§, (iii) aumento de la actividad de células T citotóxicas, (iv) aumento de la actividad de células NK y/o NKT, (v) alivio de la supresión de células T ap y/o y6, (vi) aumento de la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, (vii) aumento de la secreción de IL-2; (viii) aumento de la producción de interferón-Y, (ix) aumento de la respuesta de Th1, (x) reducción de la respuesta de Th2, (xi) reducción o eliminación del número de células y/o de la actividad de al menos una célula T reguladora (Tregs).
3. Determinación del tratamiento
Generalmente los anticuerpos anti-PVRIG de la invención se administran a pacientes con cáncer, y se determina la eficacia, de varios modos, como se describe en la presente memoria. De esta manera, aunque se pueden llevar a cabo ensayos estándar de eficacia, tal como la carga de cáncer, el tamaño del tumor, la evaluación de la presencia o la extensión de metástasis, etc., los tratamientos inmuno-oncológicos pueden determinarse también en base a las evaluaciones del estatus inmune. Esto puede hacer de varias formas, que incluyen ensayos in vitro e in vivo. Por ejemplo, se puede realizar la evaluación de los cambios en el estatus inmune (p.ej., la presencia de células T ICOS+ CD4+ después de un tratamiento ipi) junto con medidas “a la antigua usanza” tales como la carga tumoral, el tamaño, y el grado de invasión, la implicación de LN, metástasis, etc. Por tanto, se puede evaluar cualquiera de los ítems siguientes, o todos ellos: los efectos inhibidores de PVRIG sobre la activación o la proliferación de células T CD4+, la activación o la proliferación de células T CD8+ (CTL), la actividad citotóxica mediada por células T CD8+ y/o el agotamiento de células mediado por CTL, la actividad de células NK y el agotamiento de células mediado por NK, los efectos potenciadores de la PVRIG sobre la diferenciación y proliferación de células Treg y la inmunosupresión o inmunotolerancia mediada por células supresoras derivadas de mieloide o Treg (MDSC), y/o los efectos de la PVRIG sobre la producción de citoquinas pro-inflamatorias por parte de células inmunes, p.ej., la producción de IL-2, IFN-y o TNF-a por células T u otras células inmunes.
En algunos aspectos de la descripción, la determinación del tratamiento se realiza evaluando la proliferación de células inmunes, usando por ejemplo, el método de dilución CFSE, la tinción Ki67 intracelular de células efectoras inmunes, y el método de incorporación de 3H-timidina.
En algunos aspectos de la descripción, la determinación se realiza evaluando el aumento de la expresión génica o el aumento de los niveles de proteína de marcadores asociados a la activación, que incluyen uno o más de: CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40, y la desgranulación celular medida mediante expresión superficial de CD107A.
En general, los ensayos de expresión génica se llevan a cabo como se conoce en la técnica. Véase, por ejemplo, Goodkind et al., Computers and Chem. Eng. 29(3): 589 (2005), Han et al., Bioinform. Biol. Insights 11/15/159 (Suppl.
1): 29-46, Campo et al., Nod. Pathol. 2013 Jan; 26 suppl. 1: S97-S110, cuyas técnicas de medición de la expresión génica se incorporan específicamente a la presente memoria a modo de referencia.
En general, las medidas de expresión proteínica también se realizan de forma similar como es conocido en la técnica, véase por ejemplo, Wang et al., “Recent Advances in Capillary Electrophoresis-Based Proteomic Techniques for Biomarker Discovery”, Methods. Mol. Biol. 2013: 984: 1-12; Taylor et al, BioMed Res. Volumen 2014, ID de artículo 361590, 8 páginas, Becerk et al., Mutat. Res 2011 Junio 17: 722(2): 171-182, cuyas técnicas de medida se incorporan expresamente a la presente memoria a modo de referencia.
En algunos aspectos de la descripción, la determinación del tratamiento se realiza determinando la actividad citotóxica vía detección de la viabilidad de células diana estimando numerosos parámetros celulares tales como la actividad enzimática (que incluye la actividad de proteasa), la permeabilidad de la membrana celular, la adherencia celular, la producción de ATP, la producción de co-enzima, y la actividad de captación de nucleótidos. Los ejemplos específicos de estos ensayos incluyen, aunque sin limitación, tinción de Azul de tripano o PI, el método de liberación de 51Cr o 35S, la actividad de LDH, los ensayos MTT y/o WST, el ensayo de calceína-AM, el ensayo basado en luminiscencia, y otros.
En algunos aspectos de la descripción, la determinación del ensayo se realiza determinando la actividad de células T medida mediante la producción de citoquinas, medida tanto intracelularmente o en sobrenadante de cultivo usando citoquinas que incluyen, aunque sin limitación, IFNy, TNFa, GM-CSF, IL2, IL6, IL4, IL5, IL10, IL13 usando técnicas bien conocidas.
Por consiguiente, la determinación del tratamiento se puede realizar usando ensayos que evalúan uno o más de los siguiente ítems: (i) aumento de la respuesta inmune, (ii) aumento de la activación de células T ap y/o y§, (iii) aumento de la actividad de células T citotóxicas, (iv) aumento de la actividad de células NK y/o NKT, (v) alivio de la supresión de células T ap y/o y§, (vi) aumento de la secreción de citoquinas pro-inflamatorias, (vii) aumento de la secreción de IL-2; (viii) aumento de la producción de interferón-Y, (ix) aumento de la respuesta de Th1, (x) reducción de la respuesta de Th2, (xi) reducción o eliminación del número de células y/o de la actividad de al menos una célula T reguladora (Tregs.
Ensayos para medir la eficacia
En algunos aspectos de la descripción, la activación de células T se determina usando un ensayo de Reacción de Linfocitos Mixtos (MLR) tal como se describe en el Ejemplo 23. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la respuesta inmune medida para un ejemplo por fosforilación o des-fosforilación de diferentes factores, o midiendo otras modificaciones post-traduccionales. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide aumentos o reducciones de la activación de células T ap y/o y§ medida por ejemplo a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la actividad de células T citotóxicas medida por ejemplo a través de la muerte directa de células diana como por ejemplo células cancerosas, o a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la actividad de células NK y/o NKT medida por ejemplo a través de la muerte directa de células diana como por ejemplo células cancerosas o a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD107a, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la supresión de células T ap y/o y§, medida por ejemplo a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la secreción de citoquinas pro-inflamatorias medidas por ejemplo mediante ELISA o Luminex o métodos basados en perlitas Multiplex o mediante tinción intracelular y análisis FACS o mediante Alispot, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la secreción de IL-2 medidas por ejemplo mediante ELISA o Luminex o métodos basados en perlitas Multiplex o mediante tinción intracelular y análisis FACS o mediante Alispot, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la producción de interferón-Y medidas por ejemplo mediante ELISA o Luminex o métodos basados en perlitas Multiplex o mediante tinción intracelular y análisis FACs o mediante Alispot, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la respuesta de Th1 medida por ejemplo a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la respuesta de Th2 medida por ejemplo a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en el número y/o la actividad de al menos una de las células T reguladoras (Tregs), medida por ejemplo mediante citometría de flujo o mediante IHC. Una reducción en la respuesta indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen reducciones apropiadas, que son iguales que para los aumentos.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en el número de células de macrófagos M2, medido por ejemplo mediante citometría de flujo o mediante IHC. Una reducción en la respuesta indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen reducciones apropiadas, que son iguales que para los aumentos.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la actividad pro-tumorigénica de macrófagos M2, medida por ejemplo a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación. Una reducción en la respuesta indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen reducciones apropiadas, que son iguales que para los aumentos.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de neutrófilos N2, medido por ejemplo mediante citometría de flujo o mediante IHC. Una reducción en la respuesta indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen reducciones apropiadas, que son iguales que para los aumentos.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la actividad pro-tumorigénica de neutrófilos N2, medida por ejemplo a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación. Una reducción en la respuesta indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen reducciones apropiadas, que son iguales que para los aumentos.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la inhibición de la activación de células T, medida por ejemplo a través de la secreción o proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones en la inhibición de la activación de CTL, medida por ejemplo a través de la muerte directa de células diana como por ejemplo células cancerosas o a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de los cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones del agotamiento de células T ap y/o y§ medido por ejemplo a través de los cambios en la expresión de marcadores de activación. Una reducción en la respuesta indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen reducciones apropiadas, que son iguales que para los aumentos.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la respuesta de células T ap y/o y§ medida por ejemplo a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de los cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la estimulación de respuestas de memoria específicas de antígeno medida por ejemplo a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD45RA, CCR7, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la apoptosis o lisis de células cancerosas medida por ejemplo a través de ensayos de citotoxicidad, como por ejemplo MTT, liberación de Cr, Calcina AM, o mediante ensayos basados en citometría de flujo como por ejemplo dilución de CFSE o tinción de yoduro de propidio, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la estimulación del efecto citotóxico o citostático en células cancerosas medida por ejemplo a través de MTT, liberación de Cr, Calcina AM, o mediante ensayos basados en citometría de flujo como por ejemplo dilución de CFSE o tinción de yoduro de propidio, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la muerte directa de células cancerosas medida por ejemplo a través de ensayos de citotoxicidad, como por ejemplo MTT, liberación de Cr, Calcina AM, o mediante ensayos basados en citometría de flujo como por ejemplo dilución de CFSE o tinción de yoduro de propidio, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la actividad de Th17 medida por ejemplo a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, el ensayo de ruta de señalización mide los aumentos o las reducciones de la inducción de citotoxicidad dependiente de complemento y/o la citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo, medida por ejemplo a través de ensayos de citotoxicidad, como por ejemplo MTT, liberación de Cr, Calcina AM, o mediante ensayos basados en citometría de flujo como por ejemplo dilución de CFSE o tinción de yoduro de propidio, etc. Un aumento de la actividad indica actividad inmunoestimuladora. A continuación se describen aumentos apropiados en la actividad.
En un aspecto de la descripción, la activación de células T se mide por ejemplo a través de la muerte directa de células diana como por ejemplo células cancerosas o a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD137, CD107a, PD1, etc. Para las células T, los aumentos en la proliferación, los marcadores de superficie celular de activación (p.ej., CD25, CD69, CD137, PD1), citotoxicidad (capacidad para matar células diana), y producción de citoquinas (p.ej., IL-2, IL-4, IL-6, IFNy, TNF-a, IL-10, IL-17A) serían indicativos de modulación inmune, que sería consistente con un aumento de la muerte de células cancerosas.
En un aspecto de la descripción, la activación de células NK se mide por ejemplo a través de la muerte directa de células diana como por ejemplo células cancerosas o a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación como por ejemplo CD107a, etc. Para las células NK, un aumento de la proliferación, la citotoxicidad (capacidad para matar células diana y aumento de la expresión de CD107a, granzima y perforina), la producción de citoquinas (p.ej., IFNy y TNF), y la expresión de receptor de superficie celular (p.ej., CD25) sería consistente con un aumento de la muerte de células cancerosas.
En un aspecto de la descripción, la activación de células T y§ se mide por ejemplo a través de la secreción o la proliferación de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación.
En un aspecto de la descripción, la activación de células Th1 se mide por ejemplo a través de la secreción de citoquinas o a través de cambios en la expresión de marcadores de activación.
Los aumentos apropiados para la actividad o respuesta (o las reducciones, según sea apropiado como se ha descrito anteriormente), son aumentos del 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98 a 99% sobre la señal de una muestra de referencia o de muestras de control, por ejemplo muestras de ensayo que no contienen un anticuerpo anti-PVRIG de la invención. De forma similar, los aumentos de al menos una, dos, tres, cuatro o cinco veces en comparación con la referencia o las muestras de control se considera que muestran eficacia.
Ejemplos
Se hace referencia a USSN XX, presentada el 19 de febrero de 2016, titulada "PVRIG POLYPEPTIDES AND METHODS OF TREATMENT", que reivindica prioridad a USSN por USSN 62/118.235, presentada el 19 de febrero de 2015, y por USSN 62/141.168, presentada el 31 de marzo de 2015, todas las cuales se incorporan expresamente a la presente memoria en su totalidad a modo de referencia.
Ejemplo 1: Análisis de expresión de proteínas PVRIG
Ejemplo 1A:
Se analizó el conjunto de datos GDS3113 (http://www.ncbi.nlm.n¡h.gov/s¡tes/GDSbrowser?acc=GDS3113) para identificar genes con un patrón específico de órgano linfoide. Se identificó la PVRIG como específica de linfocitos debido a la elevada expresión en órganos linfoides primarios y secundarios, que incluyen sangre periférica, médula ósea, bazo, nodos linfáticos, amígdala y timo (Figura 2). Otros tipos de tejido fueron negativos y mostraron expresión de niveles de ruido de fondo. Con el objetivo de investigar qué tipos celulares específicos de la población total de células inmunes expresan PVRIG, se analizaron conjuntos de datos adicionales del “Gene Expression Omnibus” (www.ncbi.nlm.nih.gov/GEO), como se describe en la sección de “metodología” de la presente memoria. El análisis se llevó a cabo sobre poblaciones de células inmunes derivadas de sangre periférica y médula ósea. La PVRIG se expresó en linfocitos tanto de linaje de células B como de linaje de células T, que incluyen células T CD8 vírgenes, efectoras y de memoria (Figura 3). Adicionalmente, se expresó PVRIG en células NK y presentó la mayor expresión en la población de iNKT (Figura 4). La población iNKT de linfocitos actúan como activadores potentes de la inmunidad antitumoral cuando se estimulan con un agonista sintético en modelos experimentales. Sin embargo, en algunas condiciones, las células iNKT pueden actuar como supresores y reguladores de la inmunidad antitumoral (Clin Dev Immunol. 2012; 2012: 720803). Adicionalmente, en ensayos clínicos tempranos de inmunoterapia basada en células iNKT se ha demostrado que el tratamiento de infusión de células presentadoras de antígeno pulsadas con ligando, y/o células iNKT activadas in vitro, son seguros y bien tolerados en cáncer de pulmón y en cáncer de cabeza y cuello (Clin Immunol. 2011 agosto; 140(2): 167-76).
Una cuestión clave en relación a la expresión de PVRIG era si los linfocitos infiltrantes de tumor (TILs) retienen la expresión de PVRIG en el microentorno tumoral. El análisis de los datos de expresión de TILs de linfoma folicular, cáncer de mama y cáncer de colon mostró una clara expresión de PVRIG en los TILs infiltrantes en el tumor. En el ejemplo del cáncer de colon, la especificidad a las células infiltrantes inmunes fue observada solo cuando la expresión se da en la población positiva de CD45 (marcador específico de leucocitos), y no se da expresión en la población positiva de EPCAM (marcador específico epitelial) o la población negativa de CD45 y negativa de EPCAM (población de células estromales). Aunque el CD45 no es un marcador específico de linfocitos, la otra descripción de expresión infiere que se expresa en la población de linfocitos (Figura 5 A cáncer de colon, Figura 5B cáncer de mama y Figura 5C linfoma folicular).
Los datos de expresión de ARNm mostrados en la presente memoria indican que la PVRIG se expresa en linfocitos y en linfocitos infiltrantes tumorales (TILs). Estos resultados junto con la actividad inhibidora de PVRIG proponen un papel inhibidor de la molécula en células T, lo que sugiere que los anticuerpos inhibidores de PVRIG elevan el papel supresor de la PVRIG sobre los TILs y por tanto permiten a los TILs inducir una respuesta inmune contra el cáncer. Como el mecanismo de acción propuesto está dirigido a los TILs que se infiltran en el tumor, más que al efecto directo sobre las células tumorales, cualquier cáncer con infiltración inmune es candidato para el tratamiento usando anticuerpos inhibidores de PVRIG.
Metodología: Los datos en bruto son descargados del sitio web de GEO en formato SOFT. En los casos en los que los datos en bruto están en formato MAS5, los datos son tratados sin manipulación. Si los datos están en Log MAS5, entonces son convertidos a datos lineales. Si los datos están en ficheros CEL de formato RMA (datos en bruto) se descargan y re-analizan usando MAS5. Si no están disponibles los ficheros CEL, se usa el formato RMA.
A continuación los datos son normalizados por multiplicativo según el percentil 95° de datos Affy. Conjuntos de datos analizados: GSE49910, GSE47855, GSE39397, GSE36765, GSE27928.
Ejemplo 1B
Se generó una referencia de transcriptoma en base a modelos génicos UCSC conocidos (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/database/knownGene.txt.gz). Todas las lecturas de secuenciamiento de ARN fueron alineadas primero con las secuencias de transcriptoma. Este alineamiento permitió un mapeado no único porque las isoformas comparten muchos exones. Entonces se asignó a cada lectura unas coordenadas genómicas y unas uniones de exón en base al emparejamiento de transcriptoma. El resto de lecturas no mapeadas fueron alineadas directamente con el genoma considerando una o más uniones de exón. Finalmente, el recuento de lecturas se normalizó como se describe en Bo et al. (Bioinformatics 2010, 26 (4): 493-500) y se convirtió en valores de expresión génica como se describe en Trapnell et al (Nat Biotechnol. 2010 May;28(5): 511-5).
Tal como se muestra en la Figura 6, en base a los datos de Expresión de Tejido de Genotipo (GTEx) íhttp://www.nature.com/na/ioumal/v45/n6/full/na.2653.html: http://www.gtexportal.org/home/), la PVRIG se expresa principalmente en células sanguíneas y en menor medida en diversos tejidos normales. Se observaron los mismos resultados en tejidos cancerosos de “The Cancer Genome Atlas” (TCGA) (http://cancergenome.nih.gov/) en el que se observa una expresión elevada en cánceres sanguíneos como los linfomas de células B y AML (Figura 7). Se generó una firma de expresión génica para una variedad de cánceres y tejidos normales usando datos GTEx y TCGA identificando genes con un patrón de expresión altamente correlacionado con PVRIG.
El análisis de correlación se llevó a cabo por tipo de tumor y solo se consideraron las correlaciones en las que ambos genes estaban expresados por encima de 0 RPMK con al menos 50 muestras del mismo tipo de tumor. Estas firmas de expresión génica fueron evaluadas para determinar el enriquecimiento de proteínas de interacción, rutas y genes de enfermedad. Los valores-p de enriquecimiento se calcularon para cada tipo de tumor y se usó el -log(valor-p) medio para clasificar las puntuaciones de conjuntos genéticos. Se observó una firma clara de linfocitos y células T en una variedad de cánceres, tal como muestra la Figura 8. Por ejemplo, el gen de puntuación máxima en la interacción de proteína fue IL2, lo que significa que los genes que se sabe que interaccionan con IL2 se correlacionan más con PVRIG de lo esperado en la mayoría de los cánceres. Un análisis adicional mostró que la expresión de PVRIG en tejidos de cáncer es mayor de lo normal. Mientras que en la Figura 5 el nivel de expresión medio de PVRIG está por debajo de 1 en la mayoría de los tejidos sólidos normales, en la Figura 6 es claramente superior a 1 en muchos cánceres. A modo de ejemplo, cuando se comparan lado a lado en la Figura 7, la PVRIG de melanoma se expresó de forma más elevada que en piel normal (Figura 9). Además, se realizó la caracterización de la fuente de la sobre­ expresión en el cáncer. La PVRIG está expresada de forma elevada en células T y se correlaciona de forma elevada con marcadores de células T en el cáncer. En la Figura 10, se muestra a modo de ejemplo la correlación de PVRIG con CD3, CD4 y CD8 en tres tipos de cáncer, a saber, adenocarcinoma de pulmón, adenocarcinoma de colon y melanoma. Adicionalmente, la PVRIG está altamente correlacionada con PD1, una diana validada para inmunoterapia en cáncer, que se sabe que es expresada en células T (Figura 10).
Estas firmas de expresión génica fueron evaluadas para determinar el enriquecimiento de proteínas, rutas y genes de enfermedad. Se observó una firma clara de linfocitos y células T en una variedad de cánceres, tal como se muestra en la Figura 8. Se analizó adicionalmente la correlación de PVRIG y PD1, y mostró una alta correlación entre su expresión en varios tumores que incluyen mama, pulmón, páncreas y riñón (Tabla 2). Tanto PD-1 como PVRIG son expresados de forma elevada en células T activadas. La PVRIG mostró una elevada correlación con marcadores de células T en cáncer, a saber, CD8A, CD4 y CD3G (Figura 13). Considerados en conjunto, estos datos demuestran que la expresión en cáncer de la PVRIG está asociada a linfocitos infiltrantes tumorales.
Métodos: correlación de genes: los valores FPKM fueron transformados a log2 (FPKM+0.1). Se omitieron las muestras con un valor que cumple log2 (FPKM+0.1) < log2(0.1) para al menos uno de los genes. Se calculó el Coeficiente de Correlación de Pearson (PCC) y los Estimadores de Mínimos Cuadrados correspondientes a la línea de regresión para las 2 listas (una lista por gen). Los PCCs con un valor inferior a 0.5 fueron omitidos, así como los PCCs que no consiguieron mostrar un valor significativo cuando se evaluó la correlación lineal entre los niveles de expresión de los 2 genes.
Análisis de enriquecimiento génico: la ruta, la interacción y los datos de enfermedad se obtuvieron de GeneGo Metacore (https://portal.genego.com), Reactome (http://www.reactome.org) y KEGG Pathways (http://www.genome.jp/kegg). Para identificar las rutas y los procesos enriquecidos dentro de una lista génica dada, se implementó un análisis de enriquecimiento basado en hiper-geometría. Se calculó el valor-p hiper-geométrico usando el programa R (http://www.R-project.org) con el siguiente comando: phyper(x - 1, m, n-m, k y lower.tail = FALSE), donde x es el número de genes de la lista de genes que son miembros de la ruta, m es el número de genes en la ruta, n es el número total de genes únicos en todas las rutas, y k es el número de genes de la lista que estaban presentes en al menos una ruta. El valor-p resultante es indicativo de la probabilidad de enriquecimiento para una ruta específica aleatoria dado el tamaño de la lista de genes. Se aplicó el mismo procedimiento analítico para las interacciones génicas, donde todos los genes que interaccionan con un gen dado fueron tratados como una ruta; o los genes asociados con una enfermedad donde todos los genes asociados fueron tratados como una ruta. Véase la Figura 64.
La expresión de PVRIG se asoció a células T agotadas en cáncer. Se eligieron muestras de cáncer de TCGA que presentan una elevada expresión (4a cuartil) de los siguientes 4 marcadores: CD8, PD-1, TIM-3 y TIGIT. A continuación las muestras de cáncer se dividieron en nivel alto, sin cambios y nivel bajo de la expresión combinada de los 4 marcadores. No se detectó PVRIG en ninguno de los marcadores de baja expresión (células T poco o nada agotadas). La gran mayoría de los tumores asociados a niveles elevados de células T agotadas expresaron niveles elevados de PVRIG (Figura 22).
Ejemplo 1C:
Se evaluó la expresión de ARN y proteína de PVRIG humana y de primates no humanos en líneas celulares y en leucocitos primarios.
Protocolos
Análisis FACS de células modificadas sobre-expresadoras: se usaron las siguientes líneas celulares para determinar la especificidad de los anticuerpos anti-PVRIG humana: células HEK progenitoras y células HEK que sobre-expresan hPVRIG. Estas células se cultivaron en DMEM (Gibco) 10% de suero fetal de ternero (Gibco) glutamax (Gibco). Para las células HEK que sobre-expresan hPVRIG, también se añadió 0,5 pg/mL de puromicina (Gibco) al medio para la selección positiva. Para el análisis FACS, se recolectaron todas las líneas celulares en fase de crecimiento log y se sembraron 50.000-100.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-PVRIG humana (IgG1 humana, hIgG1) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como una serie de valoración de 8 puntos comenzando a 30 pg/mL sobre hielo durante 30 minutos-1 hora. La serie de valoraciones se realizó como diluciones en serie 1:3 o 1:3,3. Los datos fueron adquiridos usando un FACS Canto II (BD Biosciences) y se analizaron usando el software FlowJo (Treestar) y Prism (Graphpad).
Análisis FACS de líneas celulares humanas: se usaron las siguientes líneas celulares para determinar la expresión y la especificidad de los anticuerpos anti-PVRIG humana: Jurkat, CA46, NK-92, OV-90, HepG2 y NCI-H441. Las células Jurkat, CA46 y NCI-H441 fueron cultivadas en medio RPMI 10% de suero fetal de ternero, glutamax, aminoácidos no esenciales (Gibco), piruvato sódico (Gibco) y penicilina/estreptomicina (Gibco). Se cultivaron células NK-92 en medio RPMI 25% de suero fetal de ternero, glutamax, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, penicilina/estreptomicina y 500 U/mL de IL-2 (R&D systems). Las células OV-90 fueron cultivadas en una mezcla 1:1 de medio MCDB 105 (Sigma) que contiene una concentración final de 1,5 g/L de bicarbonato sódico (Life Technologies) y Medio 199 (Sigma) que contiene una concentración final de 2,2 g/L de bicarbonato sódico con una concentración final de 15% de suero fetal de ternero. Las células HepG2 fueron cultivadas en DMEM 10% de suero fetal de ternero glutamax. Para el análisis FACS, todas las líneas celulares fueron recolectadas en fase de crecimiento log y se sembraron 50.000-100.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-PVRIG humana (hIgG1) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como una serie de valoración de 8 puntos comenzando a 30 pg/mL sobre hielo durante 30 minutos-1 hora. La serie de valoraciones se realizó como diluciones en serie 1:3 o 1:3,3. Los datos fueron adquiridos usando un FACS Canto II y se analizaron usando el software FlowJo y Prism.
Análisis FACS de leucocitos primarios humanos vírgenes: se obtuvieron leucocitos primarios mediante aislamiento de gradiente Ficoll (GE Healthcare) de sangre periférica (Stanford Blood Bank). Los leucocitos como células mononucleares de sangre periférica aisladas (PBMC) fueron congelados en nitrógeno líquido a una densidad de entre 1x107 y 5x107 células/mL en una mezcla de 10% DMSO (Sigma) y 90% de suero fetal de ternero. Para determinar la expresión proteínica de PVRIG en PBMC, se diseñaron cócteles de anticuerpos para los principales subconjuntos inmunes que incluyeron anticuerpos anti-PVRIG humana. Los anticuerpos anti-PVRIG humana (hIgG1) y sus respectivos controles fueron añadidos en diluciones de punto individual (5 pg/mL), o en algunos casos, como series de valoración de 8 puntos comenzando a 10 o 30 pg/mL sobre hielo durante 30 minutos-1 hora.
Resumidamente, se añadieron las mezclas de cócteles de anticuerpos a PBMC resucitadas que fueron sembradas a 5x105 - 1x106 células/pocillo tras un bloqueo previo de receptor Fc y tinción vivo/muerto (Aqua Live/Dead, Life Technologies). Los cócteles de anticuerpos fueron incubados con PBMC durante 30 minutos-1 hora en hielo. A continuación las PBMC fueron lavadas y se adquirieron los datos mediante FACS usando un FACS Canto II. Los datos fueron analizados usando software FlowJo y Prism. Los subconjuntos inmunes que fueron analizados incluyeron células CD56 dim NK, células CD56 bright NK, células T CD4+, células T CD8+, células T no convencionales (p.ej., células NKT y células T—), células B y monocitos.
Análisis FACS de linfocitos efectores humanos activados: en algunos casos, se determinó la expresión de PVRIG en subconjuntos de linfocitos efectores activados tanto aislados como de PBMC enteras o en preparaciones de PBMC enteras. Los linfocitos efectores fueron estimulados con combinaciones de citoquinas, combinaciones de anticuerpos y citoquinas, o productos patogénicos. Se llevó a cabo un análisis FACS de la expresión de PVRIG en las células activadas análogo al descrito anteriormente para leucocitos primarios vírgenes.
Para estudiar la expresión de PVRIG en células NK estimuladas, se aislaron células CD56+ y se cultivaron en varios cócteles de citoquinas durante 1-3 días en medio de células NK (RPMI 10% de suero fetal de ternero, glutamax, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico y beta-mercaptoetanol [Gibco]). Las células NK fueron clasificadas usando microperlas CD56+ anti-humana (Miltenyi Biotec) o el kit de aislamiento de células NK humanas (Miltenyi Biotec) según las instrucciones del fabricante. Los cócteles de citoquinas usados para estimular las células NK incluyeron IL-2, IL-12, IL-15, IL-2/IL-12, IL-2/IL-15, IL-12/IL-15 (R&D systems).
Para estudiar la expresión de PVRIG en células T estimuladas, se aislaron células T CD4+ y CD8+ usando microperlas CD4+ o CD8+ (Miltenyi Biotec). Las células aisladas fueron cultivadas durante 3 días en presencia de diversas condiciones activantes en medio de células T (RPMI 10% de suero fetal de ternero, glutamax, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico). Las condiciones usadas para estimular células T aisladas incluyen la estimulación con “dynabeads” humanas (perlas acopladas a anticuerpos CD3/CD28, Life Technologies) con IL-2 o cócteles de citoquinas que dirigen las células T a determinados fenotipos (p.ej., Th1, Th2, Th17 y fenotipos T reguladores). Las citoquinas que dirigen Th1 son IL-12 recombinante (R&D systems) y un anticuerpo neutralizante anti-IL-4 (Biolegend). Las condiciones que dirigen Th2 son IL-4 recombinante (R&D systems) y un anticuerpo neutralizante anti-IFN-gamma (Biolegend). Las condiciones que dirigen Th17 son IL-6 recombinante (R&D systems), TGF-beta (R&D systems), IL-23 (R&D systems) y anticuerpos neutralizantes anti-IL-4 y anti-IFN-Y. Las condiciones que dirigen T reguladoras son TGF-beta e IL-2, y anticuerpos neutralizantes anti-IL-4 y anti-IFNY.
Alternativamente, las células T activadas también fueron analizadas en cultivos de PBMC estimuladas enteras con antígeno de enterotoxina B estafilococal (SEB) (List Biological Laboratories) durante 3 días, o en una reacción de linfocitos mixta (MLR) donde se co-cultivan células T CD4+ con células dendríticas alogénicas durante 2 o 5 días.
Análisis FACS de monocitos polarizados humanos: Se determinó la expresión de PVRIG en células dendríticas derivadas de monocitos polarizados. En este ejemplo, se enriquecieron células CD14+ usando enriquecimiento de monocitos humanos RosetteSep según las instrucciones del fabricante. Después del enriquecimiento de células CD14+, los monocitos fueron polarizados a células dendríticas tras cultivo con GM-CSF (R&D systems) e IL-4 (R&D systems) durante 4 días en RPMI 10% de suero fetal de ternero, glutamax, penicilina/estreptavidina, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico y beta-mercaptoetanol.
Análisis de expresión de ARN de líneas celulares humanas y leucocitos mediante qPCR: las líneas celulares que fueron evaluadas para determinar la expresión de ARN mediante qPCR fueron células Jurkat, CA46, Daudi, Raji y expi 293. Las células Jurkat, CA46, Raji y Daudi fueron cultivadas en medio RPMI 10% de suero fetal de ternero, glutamax, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, y penicilina/estreptomicina. Se cultivaron células expi 293 en DMEM 10% de FCS glutamax. Se analizó el Ar N de OV-90, HepG2 y NCI-H441 mediante un cribado bioinformático del atlas de líneas celulares. Para aquellas líneas celulares que fueron evaluadas en términos de expresión de ARN mediante qPCR, las células fueron recolectadas en fase de crecimiento log y se recolectó 1.000.000 de células, se lavaron con p Bs , y se lisaron en 350 pL de tampón RLT (Qiagen). Las células lisadas en tampón RLT fueron almacenadas a -80°C hasta uso.
Los leucocitos primarios que fueron evaluados para determinar la expresión de ARN fueron células NK CD56+, células T CD4+, células T CD8+ y monocitos CD14+. Las poblaciones celulares fueron aisladas usando kits de selección positivos para CD56+, CD4+, CD8+ y CD14+ humanos, según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). Tras una clasificación, las células fueron lisadas en 350 pL de tampón RLT y almacenadas a -80°C hasta uso. En algunos casos, los subconjuntos de PBMC activadas (condiciones de activación descritas anteriormente) fueron recolectados del cultivo y lisados en 350 pL de tampón RLT y se almacenaron a -80°C hasta uso.
En el día de su utilización, se generó ARN a partir de las células lisadas usando el mini kit de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems. Se llevó a cabo la qPCR usando ADNc con cebadores Taqman (ThermoFisher) y el mastermix avanzado rápido Taqman de Applied Biosystems. El conjunto de cebadores de PVRIG usado fue el número de catálogo Taqman Hs04189293_g1. El conjunto de cebadores domésticos de beta-actina usado fue el número de catálogo Taqman Hs0 1060665 _g1. Se evaluó la expresión de tránscrito cuantificando los valores Ct y la expresión relativa se calculó con el método 2(-AACt). Los datos se adquirieron en un instrumento Step One Plus de Applied Biosystems.
Análisis FACS de células sobre-expresadoras modificadas de PVRIG de cynomolgus: se usaron las siguientes líneas celulares para determinar la reactividad cruzada de anticuerpos anti-PVRIG humana con PVRIG de cynomolgus (cPVRIG): células expi progenitoras y células expi sobre-expresadoras de cPVRIG. Estas células fueron cultivadas en DMEM 10% de suero fetal de ternero glutamax. Se generaron células expi sobre-expresadoras de cPVRIG transitorias electroporando ADN de cPVRIG en células expi progenitoras usando el sistema de transfección Neon. Para el análisis FACS, se usaron células expi cPVRIG entre 1-3 días después de la transfección. Las células expi progenitoras fueron recolectadas de la fase de crecimiento log. Se sembraron 50.000-100.000 células por pocillo de cada tipo en placas de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-PVRIG humana (hIgG1) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como una serie de valoraciones de 8 puntos comenzando en 100 pg/mL en hielo durante 30 minutos-1 hora. La serie de valoraciones se llevó a cabo en diluciones en serie 1:3 o 1:3,3. Los datos fueron adquiridos con un FACS Canto II y analizados usando software FlowJo y Prism.
Análisis FACS de leucocitos de mono cynomolgus primarios vírgenes: se obtuvieron leucocitos de mono cynomolgus (cyno) primarios de sangre fresca extraída no más de 24 horas antes del análisis de expresión. La sangre se tomó de Bioreclamation. Para determinar la expresión proteínica de PVRIG en PBMC de cyno, se diseñaron cócteles de anticuerpos para los principales subconjuntos inmunes, que incluyeron anticuerpos anti-PVRIG humana. Los anticuerpos anti-PVRIG humana (hIgG1) y sus respectivos controles fueron añadidos en diluciones de punto único (5 pg/mL).
Resumidamente, las mezclas de cóctel de anticuerpos se añadieron a PBMC que fueron sembradas a 5x105 - 1x106 células/pocillo tras bloqueo previo de receptor Fc y tinción vivo/muerto. Los cócteles de anticuerpos se incubaron con PBMC durante 30 minutos-1 hora en hielo. A continuación las PBMC fueron lavadas y se adquirieron los datos mediante FACS usando un FACS Canto II. Los datos fueron analizados usando el software Prism. Los subconjuntos inmunes analizados incluyen linfocitos CD16+, monocitos/células mieloides CD14+/CD56+ y células T CD3+.
Análisis de expresión de ARN de leucocitos primarios de mono cynomolgus: los leucocitos primarios que fueron evaluados para determinar la expresión de ARN fueron los subconjuntos CD56+, CD16+ y CD56-/CD16-. Las poblaciones celulares fueron aisladas usando kits de selección CD56 y CD16 positivos de primate no humano según las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec). T ras una clasificación, las células fueron lisadas en 350 pL de tampón RLT y se almacenaron a -80°C hasta uso.
En el día de su utilización, se generó ARN a partir de las células lisadas usando el mini kit de Qiagen según las instrucciones del fabricante. Se generó ADNc usando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad de Applied Biosystems. Se llevó a cabo la qPCR usando ADNc con cebadores Taqman y el mastermix avanzado rápido Taqman de Applied Biosystems. Se diseñaron dos conjuntos de cebadores para detectar PVRIG de cyno por parte de Compugen USA, Inc. y fueron fabricados por Genscript. La secuencia y los códigos de cebador son:
Conjunto de cebadores 1
Directo: CTTGTGTTCACCACCTCTGG
Inverso: T GTTCTCATCGCAGGAGGT C
Conjunto de cebadores 2
Directo: TTGGCTGTGGATACCTCCTT
Inverso: AT AAGGGTCGT GGAGAGCAG
Se usaron cebadores de beta-actina para domésticos y el conjunto de cebadores usado fue el número de catálogo Taqman Mf04354341 _g1. Se evaluó la expresión de los tránscritos cuantificando los valores Ct y la expresión relativa se calculó con el método 2('ññCt). Los productos generados con los cebadores de PVRIG y los cebadores de betaactina también fueron evaluados en tamaño mediante RT-PCR tradicional usando un gel de agarosa al 2,5%. Los datos de qPCR se adquirieron usando un instrumento Step One Plus de Applied Biosystems.
Resultados
Los anticuerpos de PVRIG reconocen PVRIG en células sobre-expresadoras: Para realizar una criba de anticuerpos específicos de PVRIG, se evaluó la capacidad de los anticuerpos generados a partir de una campaña de fagos para unirse a líneas de células HEK que fueron modificadas para sobre-expresar PVRIG. La mayoría de los anticuerpos de esta campaña tras reformatear la IgG1 humana se unieron a células HEK hPVRIG, aunque con afinidad variable. Además, la mayoría de estos anticuerpos también mostró una baja unión de fondo a las líneas celulares HEK progenitoras, lo que indica una elevada especificidad hacia la PVRIG. La Figura 27 muestra un ejemplo de la especificidad de los anticuerpos de PVRIG. En la Figura 31 se muestra un resumen de todas las características de unión de los anticuerpos hacia células HEK hPVRIG respecto al control que fueron generadas en dicha campaña de fagos.
El ARN de PVRIG humana es expresado en un abanico de líneas celulares cancerosas: Para realizar un escrutinio inicial de líneas celulares que podrían usarse para determinar la expresión de PVRIG por parte de anticuerpos, se examinó el atlas de líneas celulares de cáncer para obtener líneas que fueran elevadas para ARN de PVRIG según se determina por medios bioinformáticos. Se encontraron cuatro líneas celulares que eran fácilmente accesibles comercialmente y que eran grandes expresadoras de ARN de PVRIG, y se eligieron para validación mediante análisis de qPCR. Estas líneas celulares fueron Jurkat, CA46, Raji y Daudi.
Cuando se llevó a cabo el análisis de qPCR, se detectó ARN de PVRIG en las cuatro líneas celulares, en consonancia con el análisis bioinformático (Figura 28). Como control negativo se incluyeron células expi que presentaban una expresión de ARN de PVRIG relativamente baja.
El ARN de PVRIG humana es expresado en células T y células NK: Para realizar un cribado inicial de PBMC para obtener subconjuntos con probabilidad de ser positivos en proteína PVRIG según se detecta con nuestros anticuerpos, se realizó una clasificación de los principales subconjuntos de PBMC y se examinó la expresión de ARN de PVRIG mediante qPCR. Se compararon los niveles de ARN de PVRIG en células NK CD56+, células T CD4+, células T CD8+ y monocitos CD14+ con los de las líneas celulares Jurkat, HEK progenitoras y HEK hPVRIG. Tal como se muestra en la Figura 29, se detectó ARN de PVRIG en la mayor cantidad y hasta 50 veces superior en las células T CD4+, las células T CD8+ y las células NK CD56+, normalizadas respecto a células HEK GFP. De forma similar a la Figura 28, las células Jurkat también mostraron una expresión positiva. Por el contrario, los monocitos CD14+ no mostraron una mayor expresión de PVRIG respecto a las células h Ek GFP, lo que indica una muy baja expresión de ARN de PVRIG.
Además de analizar PBMC vírgenes, también se activaron poblaciones seleccionadas (linfocitos efectores) en diversas condiciones de estimulación y se evaluó la expresión de ARN de PVRIG. Más específicamente, se activaron células NK con diversas combinaciones de citoquinas estimuladoras, mientras que se activaron policlonalmente células T con dynabeads activadoras humanas o con enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) con o sin citoquinas de polarización (ver la sección de protocolos para más detalles). Tal como se muestra en la Figura 30A y B, la expresión de ARN de PVRIG aumentó de forma general tanto en células NK como en células T con las diversas condiciones de estimulación, cuya extensión dependió del donante individual. Más específicamente, la Figura 30a muestra la expresión de ARN de PVRIG en células T CD4 y células NK vírgenes y activadas. La Figura 30b muestra la expresión de ARN de PVRIG en células T CD8 vírgenes y activadas.
Los anticuerpos de PVRIG reconocen la proteína PVRIG en células NK de una forma más prominente en subconjuntos inmunes primarios vírgenes y activados: Tras confirmar el patrón de expresión de ARN de la expresión de ARN de PVRIG en subconjuntos de PBMC vírgenes y activados, se usó nuestro panel de anticuerpos de PVRIG para determinar la expresión de proteína. En primer lugar, se determinó la expresión de PVRIG en subconjuntos de PBMC vírgenes. La población que mostró el mayor nivel de PVRIG fue la de células NK. Las células T CD4+ y CD8+ mostraron niveles bajos de PVRIG, mientras que las células B y los monocitos no presentaron ninguna expresión detectable. En la Figura 32 se muestra un resumen de la expresión en células NK y en células T CD8+, según es detectada por nuestros anticuerpos. Otros subconjuntos menores también presentaron expresión de PVRIG e incluyeron células T no convencionales tales como células NKT y células T y§. El patrón de expresión en los subconjuntos de PBMC fue muy similar en todos los donantes evaluados y analizados.
Cuando se evaluó la proteína PVRIG tras diversas condiciones de estimulación (que incluyen estimulación policlonal, estimulación por citoquinas, y MLR), no se observó ninguna regulación al alza robusta de PVRIG en ninguno de los subconjuntos de PBMc , que incluyen células NK y células T CD4+ y CD8+. Además, los monocitos que fueron polarizados in vitro a células dendríticas con GM-c Sf e IL-4 no mostraron ninguna expresión de PVRIG detectable consistente con la observada en monocitos no polarizados.
PVRIG es detectada en líneas celulares por una proporción de los anticuerpos de PVRIG: Además del cribado de PBMC para expresión de proteína PVRIG, también se quiso entender si también era expresada en líneas celulares de cáncer. Usando las líneas celulares positivas identificadas mediante expresión de ARN (Figura 28), se eligió cribar nuestros anticuerpos en células Jurkat y CA46, ya que mostraron los valores Ct absolutos más bajos respecto a nuestro gen doméstico. También se eligió un abanico de líneas celulares negativas para validar adicionalmente la especificidad de nuestros anticuerpos, que incluyó OV-90, NCI-H441 y HepG2. Una proporción de nuestros anticuerpos detectó la expresión de proteína PVRIG en células Jurkat y CA46 (Figura 31), pero no las líneas celulares negativas. En la Figura 33 se muestra un ejemplo de detección de PVRIG en Jurkat y CA46 con un anticuerpo representativo, CPA.7.021. La expresión en Jurkat y CA46 estuvo totalmente en consonancia entre ellas y la intensidad de expresión fue similar en ambas líneas celulares.
Los anticuerpos de PVRIG detectan PVRIG de cynomolgus expresada transitoriamente en células expi: Con el objetivo de determinar la adecuación pre-clínica de nuestros anticuerpos anti-PVRIG humana para estudios farmacológicos en mono cynomolgus, se quiso comprender si nuestros anticuerpos eran capaces de reaccionar de forma cruzada con PVRIG de cynomolgus (cPVRIG). Una proporción de nuestros anticuerpos fueron capaces de detectar cPVRIG que había sido transfectada transitoriamente en células expi (Figura 29). En la Figura 34 se muestra un ejemplo de anticuerpo que dio lugar a tinción negativa (CPA.7.021) y uno que dio lugar a tinción positiva (CPA.7.024).
El ARN de PVRIG es detectado en PBMC de cynomolgus: Antes de la determinación de la proteína PVRIG en PBMC de cyno, en primer lugar se quiso determinar el perfil de expresión de ARN de PVRIG en subconjuntos de PBMC de cyno. Como no existía un conjunto de cebadores de cPVRIG, se diseñaron dos conjuntos que fueron dirigidos a dos sitios distintos del gen de cPVRIG. Un primer conjunto de cebadores era específico de la variante X2 de cPVRIG, mientras que el otro conjunto era capaz de recoger tanto la variante X1 como la X2. Tal como se muestra en la Figura 35, ambos conjuntos de cebadores fueron capaces de detectar ARN de cPVRIG en un nivel similar cuando se compararon el uno con el otro. Adicionalmente, al contrario que las PBMC humanas en las que no se observó una firma de ARN de PVRIG distinta en linfocitos efectores (células NK y T) en comparación con monocitos, el ARN de cPVRIG fue expresado en un nivel similar en todos los subconjuntos de PBMC de todos los donantes evaluados.
La expresión de proteína PVRIG en PBMC de cynomolgus es muy baja o negativa: Habiendo establecido un perfil de ARN de cPVRIG para PBMC de cyno, se realizó un cribado para determinar la presencia de proteína cPVRIG en PBMC de cyno usando un panel seleccionado de anticuerpos anti-PVRIG humana. Los anticuerpos elegidos para cribar PBMC se basaron en su capacidad para unirse a células transitorias de cPVRIG y/o su actividad funcional. Tal como se muestra en la Figura 36, se pudo detectar un nivel bajo de expresión de cPVRIG en el subconjunto de linfocitos CD16+ (células NK) de un abanico de anticuerpos, pero no en el subconjunto de linfocitos CD3+ (células T) ni en el subconjunto mieloide CD14+ CD56+ (monocitos). A pesar de estos datos, los anticuerpos que mostraron una detección positiva respecto al control (tal como denota la línea negra continua) no se correlacionaron con los que fueron capaces de unirse a las células transitorias de cPVRIG. Por ejemplo, el nivel de tinción con CPA.7.021 fue superior al de CPA.7.024 a pesar de que el primero no se une a las células transitorias de cPVRIG (ver la Figura 36).
Resumen y Conclusiones: usando una plataforma de fagos de anticuerpos, se ha podido generar con éxito anticuerpos monoclonales del antígeno PVRIG humano. Usando células modificadas sobre-expresadoras, así como un grupo de líneas celulares de cáncer, se ha demostrado que nuestros anticuerpos son altamente específicos para el antígeno PVRIG, y que son capaces de detectar la expresión de proteína que se correlaciona con la expresión de ARN. Tras análisis de subconjuntos de PBMC humanas, se ha demostrado que la proteína PVRIG se expresa más elevadamente en células NK, con una baja expresión en células T CD3+, y no es detectable en células B y células mieloides. La expresión no cambió de forma robusta tras exponer dichos tipos celulares a varias condiciones de estimulación. También se ha demostrado que un panel de nuestros anticuerpos reacciona de forma cruzada con el antígeno PVRIG de mono cynomolgus (cyno) a través de la evaluación de su unión a células sobre-expresadoras. Sin embargo, la combinación de un nivel bajo de unión a este panel de anticuerpos a PBMC de cyno, la carencia de correlación de proteína con ARN, y la discordancia de su capacidad para unirse a células sobre-expresadoras (en comparación con PBMC) indica que el antígeno PVRIG en PBMC de cyno puede ser muy bajo/negativo, o está expresado en una forma diferente/más compleja en comparación con las células sobre-expresadoras.
Ejemplo 1D:
Expresión de PVRIG en subconjuntos de PBMC de donantes sanos: Se evaluó la expresión de PVRIG en subconjuntos de PBMC de donantes sanos (la estrategia de clasificación se muestra en la Figura 1a). En las muestras evaluadas, se demuestra que la PVRIG es expresada en células T CD8+ (datos no mostrados), células T CD8a+ y§ (datos no mostrados), células T y§ doble negativas (datos no mostrados) y en menor extensión también en células T CD4+ (datos no mostrados) de PBMCs de donantes sanos (n=5).
Ejemplo 1E
Co-expresión de PVRIG con PD1, TIGIT y HLA-DR en ascitis de cáncer de ovario, PBLs de MSS, CRC, y en PBMCs sanas en reposo y alo-activadas: La PVRIG es co-expresada con TIGIT en células T CD8+ en ascitis de cáncer de ovario (datos no mostrados). En esta muestra, se observó un nivel mixto de expresión de PVRIG, que solapaba con el de expresión de PD-1. Un nivel bajo de HLA-DR se correlacionó con un nivel bajo de expresión de PVRIG. Se observó un nivel muy bajo de PVRIG en células T CD4+ en esta muestra específica, que indica que no hay correlación con PD1, TIGIT y HLA-DR.
En PBLs de pacientes de MSS CRC, la PVRIG es co-expresada con TIGIT en células T CD8+ (datos no mostrados). Se observaron niveles bajos de expresión de PVRIG en esta muestra, lo cual estaba en correlación con los niveles bajos de TIGIT y HLA-DR. Los TILs de este paciente presentaron una pequeña población de CD8+ que dio positivo en la tinción para PVRIG superficial, que también fue positivo para PD1 y TIGIT (datos no mostrados). La tinción intracelular reveló una tinción de PVRIG prominente que reprodujo el patrón de expresión de PD-1, mostrando dos poblaciones distintas que son PD1-PVRIG- y PD1+Pv R iG+ (datos no mostrados). Las células T PVRIG+CD8+ intracelulares parecen correlacionarse mejor con las HLA-DR+ y TIGIT+. La PVRIG no fue detectable en la superficie de las células T CD4+ y solo una minoría de las células CD4+ se mostró positiva en la tinción intracelular de PVRIG en la población PD1+. Debido a la muy pequeña población PVRIG+ intracelular, es difícil determinar si la PVRIG es co-expresada con TIGIT y HLA-DR.
En PBMCs sanas, la tinción de PVRIG en células T CD8 reprodujo el patrón de expresión de PD-1 y TIGIT, mostrando distintas poblaciones PD1-PVRIG- y PD1+PVRIG+ y distintas poblaciones TIGIT-PVRIG- y TIGIT+PVRIG+ (datos no mostrados). No se detectó PVRIG en células CD4+. De forma interesante, tras la alo-activación, se observó co­ expresión de PVRIG y PD-1 en CD4+ (pero no en CD8+) (datos no mostrados).
En resumen, se demostró que la PVRIG es co-expresada con TIGIT en células T CD8+ de ascitis de cáncer de ovario, PBLs de paciente de MSS CRC y con PD-1 de PBMCs de donante sano y con PD1 en células T CD4+ de PBMCs alo activadas de donante sano.
Ejemplo 1F
Expresión de PVRIG en poblaciones de linfocitos de PBMCs sanas, cáncer de uraco, cáncer colorrectal, ascitis de cáncer de ovario y cáncer de pulmón: Resultados: Se analizó la expresión de PVRIG en células T CD4+ y CD8+, células NK y en células NKT CD4+ y CD8+ en PBMCs de donante sano y en amígdalas y en TILs de cáncer de uraco, cáncer colorrectal, ascitis de cáncer de ovario, cáncer de pulmón y melanoma.
En PBMCs de donantes sanos (n=5) y en TILs de ascitis de cáncer de ovario (n=1) se detectaron niveles elevados de expresión de PVRIG en células NK (datos no mostrados) y células NKT CD8+ (datos no mostrados) y en menor medida también en células T CD8+ (datos no mostrados) y en NKT CD4+ (datos no mostrados). Las células T CD4+ también dieron positivo en tinción para PVRIG en algunas de las PBMCs, sin embargo el nivel de expresión fue bastante bajo (datos no mostrados).
Adicionalmente, se detectó la expresión sobre células T CD4+ en dos de 6 TILs de cáncer colorrectal evaluados, y en TILs de cáncer de pulmón (n=3) (datos no mostrados) y en células NK de TILs de cáncer de uraco (n=1).
No se detectó expresión de PVRIG en TILs de melanoma debido a la ausencia de TILs en la muestra evaluada.
Ejemplo 1G
Se realizaron evaluaciones adicionales para identificar tejidos de adición que sobre-expresan PVRIG en líneas celulares humanas y de ratón.
Reactivos: sondas TaqMan de PVRIG humana (Life technologies) Hs04189293_g1, N° Cat. 4331182, sonda TaqMan para gen doméstico (HSKG) (Life technologies), RPL19 Mm 01577060_gH humana, HPRT1 Hs02800695_m1 humana, SDHA Hs00417200_m1 humana, PBGD Hs00609296_g1 humana, y TATA Box Hs00375874_g1 humana. Sondas TaqMan de PVRIG de ratón (Life technologies) CC70L8H, sondas TaqMan CC6RN19 Custom. Sondas TaqMan para gen doméstico (HSKG) (Life technologies) RPL19: Mm02601633_g1 de ratón. ABI TaqMan Fast Advanced Master mix, parte n° 4444557, Applied Biosystem. Las líneas de células cancerosas humanas y de ratón comerciales de la “American Type Culture Collection” (ATCC) y el CLS (Cell line service) se detallan en la Tabla 1. La extracción de ARN de las líneas celulares humanas y de ratón se llevó a cabo con el Mini Kit RNAeasy (Qiagen n° cat.
74014). El ADNc fue producido usando el kit “High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit” (Applied Biosystems n° cat. 4368814). Ab anti-PVRIG policlonal de ratón commercial MaxPab (B01), Abnova, n° cat. H00079037-B01, diluido 1:200. IgG1 de ratón, Life Technologies, n° cat. MG 100, diluido 1:200. Ab anti-PVRIG policlonal de ratón comercial, Sigma, n° cat. SAB1407935, 10 jg/mL. IgG de ratón Chrom puro, molécula entera, Jackson, n° cat. 015-000-003, 10 |jg/mL. Anti-PE de ratón de cabra, Jackson, n° cat. 115-116-146, diluido 1:100. Anti-PVRIG de ratón policlonal de cabra a medida, lote n° 20153456C.1, Aldevron, 10 jg/mL. IgG total de rata a medida, lote n° GV20884.1, Aldevron, 10 jg/mL. Anti-PE de rata de cabra, Jackson, n° cat. 112-116-143, diluido 1:100. Anti-PVRIG humana-CPA.7.024 mlgG1 conjugado a AF647, 10 jg/mL. Anti-PVRIG humana-CPA.7.050 mlgG1 conjugado a AF647, 10 jg/mL. Anti-PVRIG humana-CPA.7.005 mlgGl conjugado a AF647, 10 jg/mL. Anti-PVRIG humana-CPA.7.002 mlgG1 conjugado a AF647, 10 jg/mL. IgG1 Synagis conjugado a A647, 10 jg/mL. Anti-PVRIG humana-CPA.7.021 mlgG1 conjugado a AF647, 10 jg/mL. IgG2 Synagis conjugado a A647, 10 jg/mL. Ab anti-PVRIG policlonal de conejo, Sigma, n° cat. HPA047497, diluido 1:300. Anti-HRP de conejo de cabra, Jackson, n° cat. 111-035-003, diluido 1:100. VioBlue, tinción de viabilidad fijable 450, BD Bioscience, n° cat. 562247, diluido 1:1000. Trustaína FcX humana, Biolegend, n° cat. 422302. Bloque Fc anti-CD16/CD32 de ratón de rata, BD, n° cat. 553142. Disolución de electroporación Ingenio, Mirus, n° cat. MIR50114. siARN de PVRIG humana ON-TARGETplus - SMARTpool, Dharmacon, n° cat. L-032703-02. ON TARGET más siARN no dirigido, Dharmacon, n° cat. D-001810-01-05. Las líneas celulares humanas usadas en el estudio se muestran en la Figura 54.
Expresión de tránscrito. RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR): se llevó a cabo una extracción de ARN (1-5 jg ) de líneas celulares humanas y de ratón (detalladas anteriormente en las Tablas 1 y 2) según los protocolos del fabricante. Se preparó el ADNc siguiendo los protocolos del fabricante (1 jg de ARN diluido en 20 jL de mezcla de ADNc). El ADNc, preparado como se ha descrito anteriormente, diluido 1:10 (lo que representa 25 ng de ARN por reacción), se usó como plantilla para las reacciones de qRT-PCR, usando sondas TaqMan específicas de gen (detallado en la sección de materiales y métodos 1.1 1-4). La detección se llevó a cabo usando el dispositivo QuantStudio 12k. Se registró el ciclo en el que las reacciones alcanzaron un nivel umbral de fluorescencia (Ct = Ciclo umbral) y se usó para calcular la cantidad de tránscrito relativa en las reacciones RT. La cantidad absoluta se calculó usando la ecuación Q=2A-Ct. Las cantidades relativas resultantes fueron normalizadas a las cantidades relativas de gen doméstico, mRPL19 o hRPL19.
Detección de la expresión de proteína mediante Transferencia Western (WB): se analizó la expresión de PVRIG humana en líneas celulares humanas mediante WB usando extractos celulares enteros (45 jg para las líneas de cáncer, y 30 jg para la línea celular sobre-expresadora y la línea celular de control negativo). pAb anti-PVRIG humana policlonal de conejo comercial, Sigma, n° cat. HPA047497, diluido 1:300 en 5% de BsA/TBST seguido de un Ab secundario anti-peroxidasa conjugada de conejo de cabra (Jackson, n° cat. 111-035-003), diluido 1:20.000 en 5% de leche TBST.
Análisis de la expresión de proteína mediante Citometría de Flujo (FACS): se analizó la expresión en superficie celular de la proteína PVRIG mediante FACS. Se tiñeron las líneas celulares humanas o de ratón con reactivo VioBlue diluido 1:1000 en PBS. Las células fueron incubadas 15 minutos a R.T. y a continuación se lavaron una vez con PBS. Las líneas celulares para el análisis de proteína endógena fueron pre-incubadas con las disoluciones bloqueantes de receptor Fc enumeradas anteriormente en la sección de materiales (se usó 2,5 jL/reacción de bloqueante humano y 1 jL/reacción de bloqueante de ratón de acuerdo a los procedimientos del fabricante). Para detectar la proteína PVRIG humana, las células fueron teñidas con un anticuerpo policlonal anti-PVRIG humana o con mAbs anti-PVRIG humana monoclonales a medida (Inc. production, detallado anteriormente en la sección de materiales y métodos) diluidos a una concentración de 10 jg/m L o 1:200 (para Sigma Ab y mAb o para Abnova Ab, respectivamente) o control de isotipo IgG1 a la misma concentración seguido de Ab conjugado anti-PE de ratón de cabra.
Para detectar la proteína PVRIG de ratón, las células fueron teñidas con un pAb policlonal anti-PVRIG de ratón de rata a medida (Aldevron), diluido a una concentración de 10 jg/m L o con molécula completa de IgG de rata como control de isotipo a la misma concentración seguido de Ab conjugado anti-PE de rata de burro diluido 1:100.
Bloqueo de PVRIG: el bloqueo de PVRIG humana endógena se llevó a cabo mediante transfección transitoria de siARN. La transfección de 100 pmol de conjunto de siARN de PVRIG o de siARN revuelto se llevó a cabo mediante electroporación usando el dispositivo Amaxa nucleofector y la disolución de electroporación MIRUS Ingenio, tal como se ha descrito anteriormente en la sección de materiales y métodos, y de acuerdo al procedimiento del fabricante. 48 horas después de la transfección, las células fueron recolectadas para un análisis adicional mediante qRT-PCR y FACS.
Resultados: expresión endógena del tránscrito de PVRIG en líneas celulares humanas y de ratón mediante qRT-PCR.
Líneas celulares humanas: a fin de verificar la presencia del tránscrito de PVRIG en las líneas celulares humanas (enumeradas en la Figura 54), se llevó a cabo una qRT-PCR usando una sonda TaqMan específica como se ha descrito en la sección de Materiales y Métodos. Tal como se muestra en la Figura 56, se observó el tránscrito de PVRIG humana usando la sonda TaqMan Hs04189293_g1 con niveles relativamente elevados en las líneas celulares Jurkat (A, B), HUT78 (A, B) y HL60 (B). Se observó un menor nivel de tránscrito en las líneas celulares THP1, RPMI8226 (B). El resto de líneas celulares muestran muy poco o nada de tránscrito.
Expresión endógena del tránscrito de PVRIG en líneas celulares de ratón mediante qRT-PCR: Con el objetivo de verificar la presencia del tránscrito de PVRIG en líneas celulares de ratón (enumeradas en la Figura 55), se llevó a cabo una qRT-PCR usando una sonda TaqMan específica como se ha descrito en la sección de Materiales y Métodos. Tal como se muestra en la Figura 57, se observó tránscrito de PVRIG de ratón usando la sonda TaqMan CC70L8H con niveles relativamente elevados en las líneas celulares NIH/3T3, Renca, SaI/N y J774A.1 (A). Se observó un menor nivel de tránscrito en las líneas celulares CT26 (A) y B-104-1-1(B). El resto de líneas celulares muestran muy poco o nada de tránscrito.
Expresión endógena de las proteínas PVRIG en líneas celulares humanas mediante W B: se llevó a cabo un análisis WB para determinar la expresión endógena de proteína PVRIG en varios lisatos de líneas celulares de cáncer humanas, tal como se detalla en la Figura 54, usando pAb anti-PVRIG humana comercial (Sigma, HPA047497) como se ha descrito anteriormente en la sección de Materiales y Métodos. Como control positivo, se usó extracto celular entero de un conjunto estable de células HEK293 que sobre-expresan PVRIG, mientras que las células transfectadas con un vector vacío sirvieron como control negativo. Tal como se muestra en la Figura 58, se detectó una banda de proteína que corresponde a ~35kD en el control positivo de células sobre-expresadoras HEK293 (calle 2), así como en la línea celular Jurkat (calle 3). No se detectó expresión de PVRIG humana en las células de vector vacío (calle 1) que sirvieron como control negativo, ni en la línea celular humana ZR75-1 (calle 4).
Expresión endógena de las proteínas PVRIG en líneas humanas y de ratón mediante FACS:
Línea celular humana: para verificar la expresión endógena en superficie celular de PVRIG humana, se evaluaron varias líneas celulares humanas (detalladas en la Figura 54) tal como se ha descrito anteriormente en la sección de Materiales y Métodos. Las líneas celulares fueron teñidas con el Ab comercial (Abnova) o con control de isotipo seguido de un Ab secundario anti-PE de ratón de cabra. El análisis se llevó a cabo mediante FACS. Se observó la unión de anticuerpo Abnova en la línea celular humana de cáncer Jurkat, en comparación con la unión del control de isotipo. No se observó unión de Ab Abnova en las otras líneas celulares evaluadas: para Capan2 y ZR75-1, en comparación con la unión de control de isotipo, se realizó un análisis FACS adicional usando Ab comercial de Sigma en varias líneas celulares humanas (Jurkat, HUT78, Karpas299 y NK-YTS), se observó unión solo en células Jurkat, pero no se observó unión en el resto de líneas celulares (datos no mostrados).
Se realizó un análisis adicional para confirmación endógena de PVRIG humana en la línea celular Jurkat a través de la evaluación de la unión de varios anticuerpos monoclonales de la invención. La línea celular Jurkat se tiñó con cinco mAbs anti-PVRIG humana a medida (CPA.7.024, CPA.7.050, CPA.7.005, CPA.7.002 y CPA.7.021) conjugados con AF647 o con Ab de control de isotipo relativo conjugado a AF647. El análisis se llevó a cabo mediante FACS. Se observó la expresión de PVRIG humana en la línea celular humana Jurkat solo con CPA.7.021 y CPA.7.050, en comparación con la expresión del control de isotipo. No se observó unión a PVRIG humana en la línea celular Jurkat usando ninguno de los otros tres mAbs.
Línea celular de ratón: para verificar la expresión endógena en superficie celular de PVRIG de ratón, se evaluaron varias líneas celulares de ratón: J774A.1, NIH/3T3, SaI/N y Renca (detalladas en la Figura 55), tal como se ha descrito anteriormente en la sección de Materiales y Métodos. Las líneas celulares fueron teñidas con el Ab anti-PVRIG de ratón de rata policlonal a medida (Aldevron), o con el control de isotipo (Aldevron) seguido de un Ab secundario anti­ PE de rata de cabra. El análisis se llevó a cabo mediante FACS. No se observó unión a proteína PVRIG de ratón en ninguna de las líneas celulares de ratón evaluadas con el Ab policlonal de Aldevron (datos no mostrados).
Bloqueo de PVRIG humana en líneas celulares humanas: a fin de confirmar adicionalmente la expresión endógena de la proteína PVRIG en la línea celular Jurkat, se usó un conjunto de siARN de PVRIG humana para bloqueo, tal como se describe en la sección de Materiales y Métodos. 48 horas después de la transfección de siARN, las células fueron recolectadas para un análisis adicional mediante qRT-PCR y FACS.
Bloqueo de PVRIG humana en líneas celulares humanas evaluado mediante qPCR: tal como se muestra en la Figura 59, el nivel de tránscrito de PVRIG humana en células Jurkat transfectadas con conjunto de siARN de PVRIG humana se ve reducido significativamente (barra de histograma derecha) en comparación con las células transfectadas con siARN mezclado (barra de histograma izquierda), analizado mediante qRT-PCR como se describe en la sección de Materiales y Métodos.
Bloqueo de PVRIG humana en líneas celulares humanas evaluado mediante FACS: se llevó a cabo un análisis FACS adicional de la expresión en membrana de PVRIG humana en las mismas células transfectadas con siARN. Tal como se muestra en la Figura 60, las expresiones en membrana de proteína PVRIG humana se ve reducida en las células transfectadas con siARN de PVRIG (verde para mAb CPA.7.021 o rojo para mAb de Sigma) en comparación con las células transfectadas con siARN mezclado (naranja). La tasa de cambio (anti-PVRIG frente a control de ¡sotipo) en la línea celular Jurkat se redujo desde 8 a 3,3 veces usando el Ab de Sigma, o desde 15,3 veces a 2,8 veces usando el mAb CPA.7.021.
Este informe incluye datos preliminares de la expresión endógena de PVRIG en líneas celulares, tanto a nivel de ARN como a nivel de proteína, en líneas celulares humanas y de ratón.
Se evaluaron varias líneas celulares de cáncer humanas mediante qRT-PCR, WB y FACS en términos de expresión endógena de PVRIG.
Se observó la expresión en superficie celular de PVRIG humana en la línea celular Jurkat usando los Abs policlonales comerciales (Sigma y Abnova) y los Abs monoclonales de ratón (Inc), tal como se muestra en la Figura 4A y 4B, respectivamente. Estas observaciones están en correlación con los niveles de tránscrito de ARN mostrados en la Figura 1A y 1B, y con los resultados WB mostrados en la Figura 3.
Se realizó una confirmación adicional de PVRIG humana endógena en líneas celulares Jurkat mediante un experimento de bloqueo que confirma una clara reducción del tránscrito de ARN después de la transfección de siARN de PVRIG, tal como se muestra en la Figura 5, y también se observó una reducción en la expresión de proteína en superficie celular en las líneas celulares Jurkat, como se muestra en la Figura 6, con el Ab comercial y el Ab monoclonal.
Se evaluaron varias líneas celulares de ratón mediante qRT-PCR y FACS para determinar la expresión endógena de PVRIG. A nivel de tránscrito, se observó la presencia de PVRIG en las líneas celulares J774A.1, NIH/3T3, SaI/N y Renca, tal como se muestra en la Figura 2A y 2B. Aunque no se observó expresión en membrana de PVRIG de ratón en estas líneas celulares evaluadas detectada por Ab policlonal (Aldevron) (datos no mostrados). La Figura 61 y la Figura 62 indican el resumen de los descubrimientos descritos en este informe, destacando las líneas celulares que muestran una correlación entre qPCR y FACS, confirmada mediante bloqueo.
Ejemplo 1H
El objetivo de este experimento es evaluar la expresión de proteína PVRIG en TILs (linfocitos infiltrantes tumorales) humanos en reposo o activados, aislados de muestras de melanoma humano y propagados en presencia de antígenos específicos de melanoma e IL2. Se produjo mAb humano dirigido contra el dominio extracelular (ECD) de PVRIG humana. Estos Abs fueron marcados directamente con Alexa flour 647 a fin de examinar la expresión de PVRIG en células mediante análisis FACS.
Materiales y Métodos
TILs: En esta serie de experimentos se usaron tres linfocitos infiltrantes tumorales (TIL) diferentes de metástasis extirpadas de tres pacientes de melanoma: 1) TIL-412-HLA-A2-Mart1 específico; 2) TIL-F4-HLA-A2-gp100 específico, y 3) TIL-209-HLA-A2-gp100 específico. Los TILs humanos (>90% CD8+) fueron descongelados 24h antes de comenzar el experimento. Las células fueron descongeladas en 12 mL de medio de TIL (IMDM 10% de suero humano 1% de Glutamax 1% de Na-Piruvato 1% de aminoácidos no esenciales 1% de Pen-Strep) suplementado con 300 U/mL de rhIL2 (Biolegend 509129). Las células se dejaron recuperar de la congelación durante 24 horas.
Condiciones de ensayo: tras la recuperación, los TILs fueron evaluados en cuatro condiciones diferentes: 1) Reposo - con 300 U/mL de IL2 (Biolegend cat-589106), 2) Con activación policlonal de células T, usando 1 pg/mL de anticuerpo anti-CD3 ligado a placa (eBioscience clon OKT3, cat-16-0037-85) 2 pg/mL de ab anti-CD28 (eBioscience clon CD28.2 cat-16-0289-85) 300 U/mL de IL2. 3) Co-cultivados (1:1) con células de melanoma (HLA-A2 negativas) Mel888 (LIMS ID: CL-216), y 4) Co-cultivados (1:1) con células de melanoma (HLA-A2 Mart1/gp100 positivas) Mel624 (LIMS ID CL-218).
Después de 12 horas de reposo / activación / co-cultivo, las células fueron evaluadas mediante FACS para determinar la expresión de PVRIG, así como la expresión de otros miembros de la ruta PVRIG y otros marcadores superficiales.
Tinción de células: las células fueron recolectadas después de 12 horas y lavadas dos veces con PBS. Las células fueron teñidas a temperatura ambiente durante 20 minutos con PBS suplementado con 1/1000 de tinte de viabilidad fijable efluor 450 (BD horizon cat-562247). Después de la tinción, las células fueron lavadas dos veces con PBS y teñidas durante 15 minutos en hielo con tampón de FACS (PBS 0,5% de BSA EDTA 2 mM 0,05% de Azide) suplementado con 1/25 de Truestain FC-Block humano (Biolegend, 422302). Tras bloqueo de Fc, las células fueron teñidas en hielo durante 30 minutos con los Abs y las concentraciones que se indican en la Tabla 1.
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Tras tinción, las células fueron lavadas una vez y re-suspendidas en tampón FACS para análisis. Se realizó un calibrado de compensación usando perlas de compensación (BD, 552843). Una gota de perlas fue teñida durante 30 minutos con los anticuerpos anteriores. La tinción de perlas se realizó en las mismas concentraciones que la tinción de células. Después de la tinción de perlas, se llevó a cabo la compensación en una máquina MacsQuant FACS según el procedimiento estándar. Todas las muestras fueron adquiridas en un analizador MACSQuant (Miltenyi) y los datos fueron analizados usando el software Tree Star FlowJo (v10.0.8).
La PVRIG es expresada en TILs humanos en reposo: Se tiñeron TILs en reposo, cultivados durante 12 horas con 300 U/mL de IL2 solo, para expresión de PVRIG y se analizó mediante FACS. La estrategia de clasificación para TILs: los linfocitos fueron clasificados en primer lugar en función del tamaño y la granularidad en el gráfico FCS:SSC, a continuación se clasificaron células individuales según FSC-H y FSC-A, a continuación las células fueron clasificadas según la tinción de Colorante de viabilidad en el gráfico Vioblue:FSC, a continuación las células CD8+ fueron clasificadas según la tinción CD8 en el gráfico CD8:FSC. Los niveles de expresión de PVRIG fueron representados entonces según la tinción de PVRIG en histogramas.
La expresión de PVRIG en TILs humanos se ve regulada a la baja tras activación con abs anti-CD3 anti-CD28: Se tiñeron TILs humanos, cultivados durante 12 horas con abs anti-CD3 anti-CD28 IL2, para expresión de PVRIG y se analizaron mediante FACS. La expresión de PVRIG en la superficie de los tres TILs examinados se ve regulada a la baja tras activación, en comparación con los TILs en reposo (datos no mostrados).
La expresión de PVRIG en TILs humanos se ve regulada ligeramente a la baja tras co-cultivo con Mel888: Se tiñeron TILs humanos, cultivados durante 12 horas con células Mel888 para expresión de PVRIG y se analizaron mediante FACS. La expresión de PVRIG en la superficie de los tres TILs examinados se ve regulada ligeramente a la baja tras co-cultivo con Mel888, en comparación con los TILs en reposo.
La expresión de PVRIG en TILs humanos se ve regulada a la baja tras co-cultivo con Mel624: Se tiñeron TILs humanos, cultivados durante 12 horas con células Mel624 para expresión de PVRIG y se analizaron mediante FACS. La expresión de PVRIG en la superficie de los tres TILs examinados se ve regulada ligeramente a la baja tras co-cultivo con Mel624, en comparación con los TILs en reposo.
Expresión de otros miembros de la ruta en TILs en reposo: Se tiñeron TILs humanos, co-cultivados durante 12 horas con IL2 solo para la expresión de CD96, PVR, PVRL2, TIGIT y DNAM1, y se analizaron mediante FACS. CD96, TIGIT y DNAM1 son expresados en los tres TILs examinados. PVR es expresado sobre la superficie de los tres TILs también, pero en niveles relativamente bajos. No se detecta PVRL2 en ninguno de los TILs.
Expresión de otros miembros de la ruta en TILs activados con abs anti-CD3 y anti-CD28: Se tiñeron TILs humanos, co-cultivados durante 12 horas con abs anti-CD3 y anti-CD28 para la expresión de CD96, PVR, PVRL2, TIGIT y DNAM1, y se analizaron mediante FACS. Tras activación con abs anti-CD3 anti-CD28, CD96 se ve regulado a la baja, PVR se ve regulado ligeramente al alza, TIGIT se ve regulado ligeramente al alza y DNAM1 se ve regulado ligeramente al alza también.
Expresión de otros miembros de la ruta en TILs co-cultivados con Mel888: Se tiñeron TILs humanos, co-cultivados durante 12 horas con células Mel888 para la expresión de CD96, PVR, PVRL2, TIGIT y DNAM1, y se analizaron mediante FACS. Tras co-cultivo con Mel888, CD96 se ve regulado al alza, PVR se ve regulado ligeramente al alza, TIGIT y DNAM1 se ven regulados a la baja, PVRL2 también se ve inducido ligeramente.
Expresión de otros miembros de la ruta en TILs co-cultivados con Mel624: Se tiñeron TILs humanos, co-cultivados durante 12 horas con células Mel624 para la expresión de CD96, PVR, PVRL2, TIGIT y DNAM1, y se analizaron mediante FACS. Se aplicó una estrategia de clasificación de acuerdo a la Figura 1. Tras co-cultivo con Mel624, CD96 se ve regulado a la baja, PVR se ve regulado muy al alza, TIGIT es estable o se ve regulado ligeramente al alza, DNAM1 se ve regulado a la baja y PVRL2 se ve inducido ligeramente.
Expresión de PD1 en TILs: Se tiñeron TILs humanos, cultivados durante 12 horas con IL2 solo o activados con abs anti-CD3 anti-CD28 o co-cultivados con células Mel888 o con células Mel624, para la expresión de PD1 y se analizaron con FACS. Como puede observarse en la Figura 16 y las Figuras 17, PD1 es expresado solo en TIL412 en reposo. No se observó ningún cambio en la expresión de PD1 tras co-cultivo con Mel888, pero PD1 se ve regulado al alza en los tres TILs tras co-cultivo con Mel624 o tras activación con abs anti-CD3 anti-CD28.
Resumen y conclusiones: Para todos los TILs evaluados:
• Ab anti-PVRIG CPA.7.021 tiñe TILs (hasta 2,6 veces).
• La expresión de PVRIG se ve regulada a la baja tras activación de 12 horas con abs anti-CD3 anti-CD28 o tras co-cultivo con Mel624 (casi al nivel de fondo).
• Los TILs en reposo expresan CD96, TIGIT y DNAM1 (hasta 35, 12 y 79 veces, respectivamente).
• La expresión de CD96 se ve regulada a la baja tras activación (desde 35 hasta ~11 veces) o co-cultivo con melanoma irrelevante (HLA-A2-).
• La expresión de DNAM1 se ve regulada al alza tras activación con abs aCD3/CD28 (desde 79 a 102 veces) pero se ve regulada fuertemente a la baja tras co-cultivo de TILs con Mels (hasta 8 veces).
• La expresión de TIGIT se ve regulada a la baja ligeramente tras co-cultivo de TILs con la línea celular mel888, y permaneció estable con una ligera regulación al alza tras co-cultivo con Mel624 o tras activación con abs anti-CD3 anti-CD28.
• La expresión de PD1 se ve regulada al alza tras activación (desde 0 hasta 18 veces).
• Se detectaron niveles elevados de PVR tras el co-cultivo de TILs con melanomas (desde <2 hasta 18 veces). El TIL-412 en reposo muestra tinción positiva para PD1. El TIL-F4 también es ligeramente positivo para PD1, mientras que el TIL-209 es negativo. En la Tabla 2 se puede ver un resumen de los cambios en los niveles de expresión de todos los parámetros evaluados, en las diferentes condiciones.
Tabla 2:
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Ejemplo 11: Expresión de PVRIG en células T y TILs humanos en reposo y activados
El objetivo de este ejemplo fue evaluar la expresión de la proteína PVRIG en células T CD4+ y CD8+ primarias aisladas humanas activadas, así como en TILs (linfocitos infiltrantes tumorales) aislados de muestras de melanoma humano y propagados en presencia de antígenos específicos de melanoma e IL2. Se produjeron mAbs humanos contra el dominio extracelular (ECD) de PVRIG humana. Estos Abs fueron marcados directamente con Alexa flour 647 a fin de examinar la expresión de PVRIG sobre las células mediante análisis FACS.
Materiales y Métodos
TILs: en esta serie de experimentos, se usaron dos TILs diferentes, de metástasis extirpadas de tres pacientes de melanoma:
TIL-Mart1-HLA-A2-Mart1 específico
TIL-209-HLA-A2-gp100 específico
TILs humanos (>95% CD8+), fueron descongelados 24h antes de comenzar el experimento. Las células fueron descongeladas en 12 mL de medio de TIL (IMDM 10% de suero humano 1% de Glutamax 1% de Na-Piruvato 1% de aminoácidos no esenciales 1% de Pen-Strep) suplementado con 300 U/mL de rhIL2 (Biolegend 509129). Las células se dejaron recuperar de la congelación durante 24 horas.
Células T primarias: en esta serie de experimentos se usaron dos donantes diferentes:
CD4+ y CD8+ del donante n°147
CD4+ y CD8+ del donante n°186
Células primarias humanas (>95% de pureza), fueron descongelados 24h antes de comenzar el experimento. Las células fueron descongeladas en medio completo RPMI (RPMI 10% de FBS 1 % de Glutamax 1 % de Na-Piruvato 1% de Pen-Strep) suplementado con 300 U/mL de rhIL2 (Biolegend 509129). Las células se dejaron recuperar durante 24 horas.
Condiciones de ensayo: tras la recuperación, las células fueron activadas usando una activación policlonal de células T, usando 1 pg/mL de anticuerpo anti-CD3 ligado a placa (BD-pharmingen clon Ucht-1, cat-555329), 2 pg/mL de ab anti-CD28 (eBioscience clon c D28.2 cat-16-0289-85) y 300 U/mL de IL2.
La activación se llevó a cabo durante 24h, 48h, 72h y 144h.
Tinción de células: las células fueron recolectadas y lavadas con PBS. Las células fueron teñidas a temperatura ambiente durante 10 minutos con PBS suplementado con 1/1000 de tinte de viabilidad fijable efluor 450 (BD horizon cat-562247). Después de la tinción, las células fueron lavadas dos veces con PBS y teñidas con los Abs a la concentración indicada en la Figura 65 durante 30 minutos en hielo con tampón de FACS (PBS 0,5% de BSA EDTA 2 mM 0,05% de Azide) y las concentraciones fueron las indicadas en la Figura 65. Tras la tinción, las células fueron lavadas una vez y re-suspendidas en tampón FACS para análisis.
Resultados: se dejaron células T humanas de dos donantes diferentes y TlLs sin tratar (en reposo) o fueron estimuladas policlonalmente a varios tiempos tal como se ha descrito en la sección de Materiales y Métodos. Se evaluó el estado de activación celular mediante la detección de la expresión superficial de CD137 y p D-1 para cada tiempo en comparación con el control de isotipo (FMO), tal como se muestra para las células T CD8+, CD4+ y TlLs activados (Figura 70A, B y C, respectivamente). Como era de esperar, tras la activación se detectó y se elevó la expresión de PD-1 y CD137 (Figura 70A, B y C).
La expresión de PVRIG se observó tanto en células T CD4+ como CD8+, con una mayor expresión en células CD8+ (de 6-8 veces) en comparación con las células CD4+ (de 3 veces), y disminuyó tras activación (Figura 71A, B y C). En la activación de 3-6 días, la expresión de PVRIG aumentó en las células T CD8+ (4-5 veces) y CD4+ (2-3 veces), como puede observarse en la Figura 71.
Adicionalmente, también se observó expresión de PVRIG en TlLs Mart1 y 209 en reposo, y la expresión disminuyó tras la activación (Figura 72A, B y C). En la activación de 3-6 días, la expresión de PVRlG aumentó, como puede observarse en la Figura 72, en comparación con la activación de 1-2 días.
Ejemplo 2: Generación y caracterización de conjuntos celulares transfectantes estables que expresan PVRIG Se generaron conjuntos celulares recombinantes de líneas celulares que sobre-expresan PVRlG humana y proteína de ratón, para uso en la determinación de los efectos de la PVRlG sobre la inmunidad, para caracterización de la PVRlG y para identificar agentes terapéuticos inmunoreguladores basados en PVRlG.
Materiales y Métodos:
Reactivos: Construcciones de ADN:
PVRlG humana flag pUC57
PVRlG humana flag pCDNA3.1
PVRlG humana flag pMSCV
Células recombinantes:
HEK293 pCDNA3.1 Humanas PVRlG flag
HEK293 pMSCV Humanas PVRlG flag
Anticuerpos comerciales:
Anti-PVRlG, Sigma cat. HPA047497 - Policlonal de conejo
Anti-PVRlG, Abnova cat. H00079037-B01 - Policlonal de ratón
La validación de longitud completa de PVRlG de ratón se realizó usando reacciones PCR y secuenciando los productos de PCR.
Se usaron tres parejas de cebadores (Tabla 3).
Tabla 3: Secuencias de cebadores usados para la validación de longitud completa de ratón.
Nombre de cebador Secuencia
200-554 mPVRIG -F CCACCAACCTCTCGTCTTTC
200-553 mPVRIG -R TCATGCCAGAGCATACAG
200-571 mPVRIG -F CAGTGCCTCTAACTGCTGAC
200-572 mPVRIG -R TCACTGTTACCAGGGAGATGAG
200-549 mPVRIG -F CACAGGCT GCCCAT GCAAC
200-551 mPVRIG -R T GCCTGGGT GCTAGT GAGAG
200-554 mPVRIG -F CCACCAACCT CTCGT CTTTC
200-546 mPVRIG -R GACCCT GTT ACCT GT CATT G
Como plantilla para la reacción PCR, se usó ADNc de la línea celular NIH 3T3 o una mezcla de tres paneles de ADNc comerciales:
1. Panel de ADNc I, Ratón, Biochain, Cat n°. C8334501 (Corazón, Cerebro, Riñón, Hígado).
2. Panel de ADNc II, Ratón, Biochain, Cat n° C8334502 (Pulmón, Páncreas, Bajo, Músculo esquelético). 3. ADNc, Clontech, Cat n° 637301 (Cerebro, Corazón, Embrión de 7 días, Testículos, Bajo).
Construcciones de expresión
Se llevó a cabo la clonación de longitud completa y PVRIG-flag humana y de ratón mediante síntesis génica (GenScript) usando una secuencia optimizada con codón en vector pUC57 para tránscrito humano y no optimizada para tránscrito de ratón y subclonada en un vector de expresión de mamífero, pcDNA3.1 o pMSCV, para crear el plásmido de expresión.
La secuencia de PVRIG humana que fue subclonada en pcDNA3.1 se inicia en la segunda metionina de la proteína PVRIG humana, mientras que la secuencia de PVRIG humana que fue subclonada en pMSCV se inicia a partir de la primera metionina de la proteína PVRIG humana.
Construcción que codifica la PVRIG-flag humana.
El gen de PVRIG humana de longitud completa, síntesis mediante GenScript, fue subclonado usando pcDNA3.1 con enzimas de restricción BamI y NheI.
Construcciones que codifican las proteínas PVRIG de ratón:
Se sintetizaron cuatro construcciones que codifican la secuencia de ratón mediante GenScript como:
1. Primera metionina sin etiqueta
2. Primera metionina con etiqueta
3. Segunda metionina sin etiqueta
4. Segunda metionina con etiqueta
El gen sintetizado fue subclonado en pCDNA3.1.
Generación de transfectantes estables que sobre-expresan proteínas PVRIG
La construcción de expresión resultante fue verificada por secuencia y se usó posteriormente para Transfecciones y generación de conjunto estable, como se describe a continuación. Las secuencias de proteína codificadas por las construcciones de expresión son las establecidas en la Figura 103.
Generación de conjuntos transfectantes estables que expresan proteína PVRIG-flag humana.
Las células HEK293 (ATCC, número de catálogo: CRL-1573) fueron transfectadas con plásmido pCDNA3.1+ PVRIG-flag humano o con vector vacío (pCDNA3.1+ como control negativo), usando reactivo FUGENE 6 (Roch, número de catálogo 11-988-387). Se seleccionaron las colonias resistentes a genticina, G418 (Gibco, número de catálogo: 11811­ 031) para generación de conjuntos estables.
La línea celular de empaquetamiento GP2-293 (Clontech cat. n° 631458) fue transfectada con pMSCV-PVRIG humana o con vector pMSCV vacío usando reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen, número de catálogo 11668019). 48 horas después de la transfección se recolectaron los sobrenadantes que contenían virio nes, y se usaron directamente para infección de la línea celular humana como se indica a continuación:
Las células HEK-293 (ATCC, CRL-CRL-1573) fueron infectadas con viriones que expresan PVRIG humana con viriones de vector vacío de pMSCV como control negativo, para la generación de conjuntos estables se seleccionaron colonias resistentes a puromicina (Invivogen, número de catálogo: 58-58-2).
Validación de expresión.
Validación de expresión mediante ensayo de transferencia Western
Se analizaron extractos celulares enteros de conjuntos celulares (30 pg de proteína total) mediante ensayo de transferencia Western. Como control negativo, se usaron extractos celulares enteros de conjuntos celulares estables transfectados con el vector vacío. Para la detección de PVRIG-flag humana, se usaron anticuerpos anti-flag y anti-PVRIG como se indica a continuación:
• M2-peroxidasa anti-Flag de ratón, Sigma, cat. A8592 diluido 1:1000 en TTBS/5% BSA;
• Anti-PVRIG, Sigma cat. HPA047497 - policlonal de conejo, diluido 1:200 en TTBS/5% BSA. Seguido de anti-HRP de conejo de cabra, Jackson, Cat: 111-035-003 diluido 1:20.000 en disolución de 5% leche/TTBS.
Validación de expresión mediante citometría de flujo (FACS)
Con el objetivo de validad la expresión en superficie celular de la proteína PVRIG humana en los conjuntos estables recombinantes, se tiñeron 1x105 células con tinte de viabilidad fijable 450 (BD, 562247) diluido 1:1000 en PBS, durante 10 minutos a R.T. A continuación se añadió a las células anti-PVRIG policlonal de ratón, (Abnova, Cat. H00079037-B01) diluido 1:200 o con control de isotipo de IgG1 de ratón (Life Technologies), seguido de tinción con anti-PE de ratón de cabra (Jackson, cat.115-116-146).
Validación de los resultados de expresión de células de conjunto estable HEK293 que sobre-expresan la proteína PVRIG-Flag humana.
Para verificar la expresión de la proteína PVRIG en los conjuntos celulares HEK293 transfectados de forma estable, se analizaron los extractos celulares enteros mediante transferencia Western usando anticuerpo anti-flag o anticuerpos anti-PVRIG (Abnova), tal como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados, mostrados en la Figura 24, demuestran una banda que corresponde al tamaño de proteína esperado de ~33 kDa en los extractos de conjuntos celulares HEK293 que expresan PVRIG humana, pero no en las células transfectadas con el vector vacío.
A fin de verificar la expresión en superficie celular de la proteína PVRIG humana, se analizaron células HEK293 transfectadas de forma estable que sobre-expresan el vector PVRIG- flag pCDNA3.1 mediante FACS usando pAb anti-PVRIG de ratón (Abnova) como se describe en Materiales y Métodos. Los resultados presentados en la Figura 25 muestran que la unión de pAb anti-PVRIG de ratón a células que expresan de forma estable PVRIG-flag humana (gris) es mayor que la observada con células transfectadas con el vector vacío (gris claro).
Ejemplo 3: Producción de proteína de fusión PVRIG-ECD Ig
La proteína de fusión PVRIG mECD-mIg (ver la Figura 103), compuesta por el ECD de PVRIG de ratón fusionado con el Fc de IgG2a de ratón, fue producida por ProBioGen (Alemania) en células CHO-DG44 cultivando conjuntos celulares estables durante 12 días, seguido de purificación de proteína A de la cosecha celular y purificación mediante SEC preparativa para eliminación de agregados. El producto final se formuló en Na citrato 5 mM, Na/K fosfato 5 mM, NaCl 140 mM, 0,01% de Tween pH 5,5.
El vector de expresión usado fue el PBG-GPEX6 de ProBioGen. El gen de PVRIG está dirigido por el promotor híbrido CMV/EF1 seguido de la señal de poliadenilación pA-1. El vector contiene gel de N-acetil-transferasa de puromicina que permite la selección de células transfectadas usando puromicina, así como el gen de deshidrofolato reductasa que permite la selección de células transfectadas usando metotrexato (MTX).
La proteína de fusión PVRIG hECD-hIg (ver la Figura 103), compuesta del ECD de PVRIG humana fusionado al Fc de IgG1 humana que porta las mutaciones C220, C226 y C229 a S en la bisagra, fue producido por GenScript (China) mediante transfección transitoria en células CHO-3E7 que fueron cultivadas durante 6 días, seguido de purificación de proteína A de la cosecha celular. El producto final se formuló en PBS, pH 7,2.
El vector de expresión usado fue el vector de expresión de mamífero pTT5, en el que el gen PVRIG está dirigido por el promotor de CMV.
Ejemplo 4: Expresión de PVRIG en PBLs humanas y unión de PVRIG-Fc a líneas celulares de melanoma
PVRIG es una nueva proteína de punto de control inmune, que sin pretender limitarse a una única teoría actúa como receptor de tipo CD28 en las células T. En este estudio, se evaluó la expresión de PVRIG en linfocitos de sangre periférica humana y la unión de PVRIG-ECD-Ig (compuesta por el domino extra-celular de PVRIG humana fusionado a IgG1 humana) a líneas celulares de melanoma.
Materiales y Métodos
Se usaron tres líneas celulares de melanoma humano que presentan el antígeno MART-1 en contexto HLA-A2 (SK-MEL-23, Mel-624 y Mel-624.38) como dianas para CTLs. La Mel-888, que no expresa HLA-A2, sirvió como control negativo.
Se obtuvieron capas leuco-plaquetarias de donantes sanos humanos del “Te1Hashomer Blood Bank”. Las células mononucleares de sangre periférica fueron estimuladas con PHA y cultivadas durante 3 días, y posteriormente fueron transducidas con un vector retroviral basado en MSCV (pMSGV1). Después de la transducción, las células fueron crecidas adicionalmente en medio de linfocitos (medio Bio target, suero bovino fetal (10%), L-glutamina Penicilina/Estreptomicina (100 unidades/mL), IL-2300 IU) durante otros 5 días más.
Para evaluar la expresión de PVRIG en PBLs, las células fueron teñidas con un anticuerpo específico para PVRIG (policlonal de ratón) a 5 pg/mL durante 30 minutos a 4 grados. Después del lavado, las células fueron teñidas con mAb anti-ratón de cabra conjugado a FITC (1:250) (Invitrogen, cat. n° A10667) en tampón FACS a oscuras durante 30 minutos a 4 grados. Después de dos lavados en tampón FACS, las muestras fueron leídas en un BD Bioscience FACS Calibur con un Cytek HTS.
Para evaluar la unión de PVRIG-Ig a las líneas celulares de melanoma, se co-cultivaron células SK-MEL-23, Mel-624, Mel-624.38 y mel-888 con PBLs transducidas con F4 o no transducidas (designadas w/o) y posteriormente se tiñeron con 20 pg/mL de la proteína de fusión PVRIG-Ig HH, lote n°125. Después de dos lavados en tampón de FACS, las muestras fueron teñidas con un anticuerpo secundario anti-PE humano de cabra (Jackson, cat n° 109-116-098).
Resultados
Para evaluar la expresión endógena de PVRIG en leucocitos humanos primarios, se estimularon PBLs con PHA y posteriormente se transdujeron con un vector vacío y se tiñeron con un anticuerpo anti-PVRIG específico. Tal como se muestra en la Figura 11, en dos donantes diferentes se observó la tinción con anti-PVRIG respecto a un control de isotipo igualado.
Para evaluar la expresión endógena de PVRIG en líneas celulares de melanoma y para determinar si la expresión endógena se ve afectada por el co-cultivo con células T específicas de antígeno, se co-cultivaron 4 líneas celulares de melanoma diferentes (SK-MEL-23, Mel-624, Mel-624.38 y mel-888) con PBLs que expresan o que no expresan la F4 (TCR específica de gp100). Las células fueron teñidas a continuación con la proteína de fusión compuesta por el dominio extracelular de PVRIG humana fusionado a la porción Fc de la IgG1 humana. Tal como se muestra en la Figura 12, las 4 líneas celulares de melanoma humano exhiben unión a PVRIG-Ig. La intensidad de unión no se ve afectada por la activación dependiente de células T que sigue al co-cultivo con células T modificadas reactivas a melanoma.
Resumen: Los resultados presentados en la presente memoria sugieren que la PVRIG es expresada en leucocitos de sangre periférica (PBLs) primarios humanos activados con PHA. Adicionalmente, las 4 líneas celulares de melanoma que fueron evaluadas en este estudio se unen a la proteína de fusión compuesta por el dominio extracelular de PVRIG humana fusionado a la porción Fc de la IgG1 humana, lo que sugieren que dichas líneas celulares expresan la contrapartida para PVRIG.
Ejemplo 5: identificación y validación de receptor ligando.
Se llevó a cabo un primer estudio de validación usando una tecnología de microsistema celular usada para cribar por interacciones de PVRIG a 3559 proteínas de membrana de plasma humano de longitud completa, que fueron expresadas individualmente en células HEK293 humanas.
Se crecieron células HEK293 en porta-objetos impregnados con vectores de expresión que codifican 3559 proteínas de membrana humanas de longitud completa. Se impregnó un vector de expresión (pIRES-hEGFR-IRES-ZsGreen1) por cuadruplicado en cada porta-objetos, y se usó para asegurar que se había alcanzado o excedido un umbral mínimo de eficacia de transfección en cada porta-objetos. Las células HEK293 humanas fueron usadas para transfección inversa/expresión. Se añadió una proteína de fusión compuesta por el ECD de PVRIG fusionado a una IgG1 humana a 20 pg/mL a cada porta-objetos después de la fijación celular. Se cribaron dos conjuntos de portas replicados. Las imágenes fluorescentes fueron analizadas y cuantificadas (para determinar la eficacia de transfección) usando el software ImageQuant (GE).
Un “acierto” de proteína se definió como un punto duplicado que muestra un aumento de señal en comparación con los niveles de fondo. Esto se realizó mediante inspección visual usando las imágenes en rejilla con el software ImageQuant. Los aciertos se clasificaron como “fuerte, medio, débil o muy débil”, dependiendo de la intensidad de los puntos duplicados. Para confirmar los aciertos, todos los vectores que codifican los aciertos identificados en el cribado primario fueron dispuestos en nuevos porta-objetos. Se llevó a cabo un cribado de confirmación/especificidad y análisis como en el cribado primario (n=2 portas replicados por muestra), excepto que porta-objetos idénticos también fueron evaluados con los controles negativos apropiados. Adicionalmente, todos los vectores que codifican los aciertos fueron secuenciados. Los vectores que codifican cada acierto primario fueron secuencias confirmando su identidad.
El cribado de fondo mostró una unión desdeñable a células HEK293 no transfectadas a 2, 5 y 20 pg/mL (Figura 13). En base a los datos de fondo, se eligió 20 pg/mL para obtener el perfil completo. El cribado primario dio como resultado múltiples aciertos duplicados (clones), siendo la mayoría de intensidad débil o muy débil. Todos los aciertos primarios identificados, y un vector de control EGFR-ZsGreen1, fueron impregnados y re-expresados por duplicado y sondeados con PVRIG a 20 pg/mL para el cribado de confirmación/especificidad.
Se identificó un acierto específico único, PVRL2, con intensidad fuerte (Figura 14). Otro acierto débil, MAG, se demostró más tarde que se unía también a otras proteínas de fusión evaluadas (datos no mostrados), sugiriendo de este modo que no es específico. Estos resultados son consistentes con el resumen publicado recientemente https://www.yumpu.com/en/document/view/7263720/sunday-december-4-late-abstracts-1-molecular-biology-of-the-/133 de G. Quiñones en “New Technologies & Frontiers”. Se conoce que el PVRL2 desempeña un papel como ligando para TIGIT y DNAM1, que son ambos moduladores de la activación de células T y células NK. Recientemente, se ha publicado que TIGIT es un actor clave en la inhibición de la respuesta inmune dirigida contra células tumorales (Noa Stanietsky, Joumal of Immunology, vol. 106 n° 42, 17858-17863; Robert J Johnston, Cáncercell, Volumen 26, Número 6, p. 923-937, 8 de diciembre de 2014). Los resultados presentados en el Ejemplo 5, que muestran la interacción de la PVRIG con la misma contrapartida que TIGIT, sugieren una implicación de la PVRIG en una importante ruta reguladora que regula la vigilancia inmunitaria del cáncer, y posicionan por tanto a la PVRIG como diana potencial para el tratamiento del cáncer.
Estudio de validación adicional 2
Materiales y Métodos
Materiales
Proteínas de fusión Fc, proteínas marcadas con His y control de Ig: Se usó la proteína de fusión de Fc PVRIG-Fc M:M para los estudios de unión. Se usó IgG2a de ratón como control de isotipo. Otras proteínas de ratón comerciales usadas en el estudio fueron PVRL2-his (R&D, 3869-N2), y PVRL2-his (Sino Biological, 50318-M08H).
Células: se generaron HEK293 que sobre-expresan (OX) PVRIG de ratón y PVRIG-FLAG (RC-287 y RC-286, respectivamente) y se comparó la unión de PVRL2 a estas células con células HEK293 que expresan vector vacío (EV (RC-83). Se generaron las variantes de división 1 y 2 (sv1 y sv2) de HEK293 OX PVRL2 de ratón (RC-334 y RC-335, respectivamente) y se comparó la unión de PVRIG a estas células con células HEK293 que expresan EV. También se usaron células B16-F10 (CL-161, células de melanoma de piel de ratón que expresan endógenamente mPVRL2) para estudiar la interacción entre PVRIG y PVRL2.
Anticuerpos: se usó Ab anti-PVRL2-PE de ratón (R&D, FAB3869P, 25 pg/mL, 1:100) para la detección de PVRL2. Se usó IgG2A-PE de rata (R&D, IC006P, 25 pg/mL, 1:100) como control de isotipo. Se usó anti-PE de ratón (Jackson Immunoresearch, 115-115-206, 0,5 mg/mL, 1:200) y Ab anti-his (Abcam, ab72467, 0,1 mg/mL, 1:300) para detectar la unión proteínas recombinantes. Se usó Ab anti-DYKDDDDK Tag (anti-FLAG) (BioLegend, 637302, 0,5 mg/mL, 1:300) para la detección de la expresión de PVRIG en HEK293 OX PVRIG-FLAG de ratón. Para el etiquetado de PVRIG, se usó el kit “Alexa Fluor® 647 Antibody Labeling Kit” (Molecular Probes, A-20186) según el protocolo del fabricante. Para la biotinilación de PVRIG, se usó el kit “DSB-X™ Biotin Protein Labeling Kit” (Molecular Probes, D-20655) según el protocolo del fabricante. La PVRIG biotinilada fue detectada mediante estreptavidina-PE (SA-PE) (Jackson Immunoresearch, 016-110-084, 0,5 mg/mL, 1:300).
Métodos
Análisis FACS de la unión de PVRIG-Fc de ratón a células HEK293 estables que sobre-expresan (OX) PVRL2 de ratón o a células B16-F10: se suspendieron células HEK293 OX PVRL2 (sv1 o sv2) o células B16-F10 en una concentración de 106 células/mL en PBS. Por cada 1 mL de células, se añadió 1 pL de disolución de reserva de tinción de viabilidad (BD Horizon Fixable Viability Stain 450, cat. 562247, BD Bioscience). Las células se incubaron durante 10 min protegidas de la luz a temperatura ambiente. A continuación las células fueron lavadas dos veces con PBS y suspendidas a una concentración de 3x106 células/mL en presencia de 1:50 TruStain FcXTM humano (BioLegend 422302) en tampón de FACS (PBS suplementado con un 2% FBS y EDTA 0,5 mM) a temperatura ambiente durante 15 minutos para bloqueo de receptores de Fcy. Sin lavar, se llevaron a placa a continuación 1x105 células/pocillo en placas de 96 pocillos en forma de V (Costar n°3357). Se examinó la expresión de PVRL2 mediante anticuerpo anti-PVRL2 (ver anterior). Se examinó la unión de PVRIG-Fc a células con diversos lotes (ver anterior), generalmente a 60 pg/mL o con varias concentraciones. Las células fueron incubadas con anticuerpos o PVRIG-Fc durante 40 minutos a temperatura ambiente, a continuación se lavaron una vez. Se añadió anticuerpo secundario (anti-PE de ratón) durante 15 minutos a temperatura ambiente, las células se lavaron dos veces y se tomaron para análisis en analizadores MACSQuant® FACs (Miltenyi Biotec), seguido de análisis de datos usando el software Flow-Jo 10.
Análisis FACS de la unión de PVRL2-his de ratón a células HEK293 estables que sobre-expresan OX PVRIG de ratón: Se examinaron los niveles de PVRIG con anticuerpo anti-FLAG. Se monitorizó la unión de PVRL2-his a anticuerpo anti-his. El análisis FACS se llevó a cabo como se ha indicado anteriormente.
Análisis SPR biofísico de la interacción PVRIG / PVRL2 mediante Biacore: La interacción entre PVRIG de ratón y PVRL2 se analizó en un analizador de interacción biomolecular Biacore T100 SPR en la Universidad de Bar-Ilan. Las proteínas fueron diluidas a 100 nM en tampón de acetato pH 4,0, y se acoplaron covalentemente a una celda de flujo única de un chip Biacore CM5 Serie S usando química de acoplamiento de aminas estándar. Las superficies fueron activadas con EDC-NHS, y posteriormente se bloquearon mediante inyección de etanolamina 1M (pH 8,5). El tampón de elución fue Hepes 10 mM, pH 7,3, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y Tween-20 al 0,05% (HBS-EP+). Los niveles de inmovilización finales fueron de ~1000RU. Las proteínas usadas como analitos fueron diluidas a 2500 nM, 500 nM y 100 nM. En cada experimento un tubo contenía solo tampón de elución a modo de referencia. Después de cada experimento, se llevó a cabo una etapa de regeneración con MgCh 4M durante 30 s a 20 pL/s.
Resultados
Unión de PVRIG de ratón a células HEK293 OX PVRL2 sv1: con el objetivo de validar la interacción entre PVRIG de ratón y PVRL2 de ratón, en primer lugar se evaluó la unión de PVRIG-Fc a células que sobre-expresan (OX) PVRL2. El nivel de expresión de PVRL2 en HEK293 OX PVRL2 sv1 se determinó usando anticuerpos anti-PVRL2 de ratón. La expresión de PVRL2 de ratón fue 10 veces superior a la de células HEK293 que expresan vector vacío (datos no mostrados). Se examinaron cuatro lotes de PVRIG-Fc para determinar la unión a células que sobre-expresan PVRL2. Todos los lotes de PVRIG-Fc mostraron una unión de 6-11 veces a células OX PVRL2 en comparación a la de células de vector vacío (datos no mostrados). También se examinó la unión de PVRIG-Fc a células OX PVRL2 usando proteínas PVRIG biotiniladas y marcadas fluorescentemente (Alexa Fluor 647). Mientras que las proteínas biotiniladas mostraron una unión ligeramente más fuerte a células OX PVRL2 en comparación con la PVRIG-Fc no marcada (datos no mostrados), la PVRIG marcada fluorescentemente demostró una unión mucho menor (datos no mostrados). Estos resultados demuestran que se detecta PVLR2 sobre la membrana de células HEK293 OX PVRL2; la unión de PVRIG-Fc de ratón a células OX PVLR2 es detectada por anticuerpos anti-IgG2A de ratón; la unión de PVRIG-Fc de ratón biotinilada a células OX PVLR2 es detectada por estreptavidina-PE, y la unión de PVRIG-Fc marcada con Alexa Fluor 647 a células OX PVLR2.
Unión de PVRL2 de ratón a células HEK293 OX PVRIG: para validar adicionalmente la interacción entre PVRIG de ratón y PVRL2 de ratón, se realizó una evaluación de la unión de PVRL2 a células OX PVRIG con o sin una etiqueta FLAG. La expresión en membrana de PVRIG de ratón en células HEK293 OX PVRIG con una etiqueta FLAG se confirmó usando un anticuerpo anti-FLAG (datos no mostrados). Como era de esperar, las células HEK293 OX PVRIG sin una etiqueta FLAG no mostraron expresión usando un anticuerpo anti-FLAG. Usando sobrenadantes anti-PVRIG (Aldeveron), estas células demostraron una menor expresión de PVRIG que las células OX PVRIG con una etiqueta FLAG. La proteína recombinante PVRL2 de ratón comercial solo se encontraba disponible como proteína con etiqueta His. Por lo tanto, fue necesario realizar calibraciones completas para obtener un anticuerpo anti-His apropiado y unas condiciones de detección apropiadas. La PVRL2 marcada con His, de dos fuentes diferentes, fue evaluada en términos de unión a células OX PVRIG a 60 pg/mL, y demostró una unión 2 veces (datos no mostrados) y 3-4 veces (datos no mostrados) superior a la de células HEK293 que expresan vector vacío. Es decir, la PVLR2 de ratón marcada con his se une a HEK293 OX PVRIG de ratón, y la PVRiG de ratón es expresada en membranas de células HEK293 OX PVRIG.
Estudio de la interacción de PVRIG de ratón y PVLR2 de ratón usando SPR-Biacore: Con el objetivo de determinar la interacción entre PVRIG-Fc de ratón y PVRL2 marcada con His de ratón, ambas proteínas fueron inmovilizadas en un chip Biacore. Después de la inmovilización, ambas proteínas, así como PVRIG-Fc (datos no mostrados), fueron sometidas a elución como analitos a tres concentraciones: 2500, 500 y 100 nM (PVRIG lote n° 480 y PVRL2 fueron eluídas dos veces como analitos). Se detectó interacción entre las dos proteínas en ambas direcciones, y con ambos lotes de PVRIG (datos no mostrados). Debido a la cinética compleja, no se pudo determinar una KD exacta a partir de los resultados de Biacore.
Unión de respuesta a dosis de PVRIG de ratón a células HEK293 OX PVRL2 sv2 y a célula B16-F10: Como se ha mostrado anteriormente, la unión de PVRL2 de ratón a células OX PVRIG de ratón fue relativamente baja. A fin de establecer un método para cribar anticuerpos anti-PVRIG de ratón capaces de bloquear la interacción entre PVRIG de ratón y PVRL2 de ratón, se seleccionó la unión de PVRIG-Fc a células OX PVRL2. En primer lugar, se generó una curva de unión de respuesta a dosis de IgG2A de ratón y PVRIG-Fc de ratón a células OX PVRL2 de ratón y se comparó con las células que expresan vector vacío (EV). La respuesta a dosis se realizó con diluciones en serie a la mitad (1:2) desde 50 pg/mL a 0,1 pg/mL. Aunque no se observó diferencia en la unión de IgG2A de ratón (datos no mostrados), la PVRIG-Fc demostró una saturación de la unión a 12,5 pg/mL y una unión reducida en correlación con la disminución de la concentración de proteína (datos no mostrados). Se obtuvieron resultados similares también con PVRIG-Fc (datos no mostrados). Estos resultados sugieren que el ensayo de unión puede considerarse para cribar anticuerpos bloqueantes.
Con el objetivo de considerar también un sistema endógeno para cribar anticuerpos anti-PVRIG de ratón, se determinó la expresión de PVRL2 en células B16-F10 usando un anticuerpo anti-PVRL2. Los resultados demuestran que PVRL2 se expresa de forma elevada en células B16-F10 (datos no mostrados). Por lo tanto, se produjo una curva dosis respuesta de unión similar también para la unión de IgG2A de ratón y PVRIG-Fc de ratón a células B16-F10. De forma similar a los resultados obtenidos con células HEK293 OX PVRL2, la PVRIG-Fc de ratón demostró una dosis respuesta de unión a células B16-F10 que alcanzaba saturación a 12,5 pg/mL, aunque no se detectaron cambios en la unión de IgG2A de ratón (datos no mostrados).
Discusión y conclusiones: se identificó la interacción de PVRIG humana con PVRL2 humana usando Tecnología de Microsistemas Celulares en Retrogenix. Para validar esta interacción también en ratón, se adoptaron varias estrategias. Entre ellas, el uso de células OX PVRIG o PVRL2, y medidas biofísicas usando SPR-Biacore. Todas las estrategias indicaron que la PVRIG de ratón interacciona con PVRL2 de ratón. Sin embargo, la unión de PVRL2 de ratón a células OX PVRIG fue relativamente baja en comparación con la unión de PVRIG a células OX PVRL2. La razón para ello podría ser el hecho de que la PVRL2 comercial solo está disponible como monómero de proteína marcada con His y no como proteína fusionada a Fc (como en el caso de la PVRIG). Para este fin, se produjo una PVRL2 de ratón fusionada a Fc en GenScript. Sin embargo, a partir de datos preliminares, solo se observó un pequeño aumento en la unión con esta proteína (de ~5 veces comparado con 2-3 veces para la PVRL2-his). Por lo tanto, algunos otros factores podrían influir en dicha unión relativamente baja.
Debido a la baja unión de PVRL2 a células OX PVRIG, se decidió establecer un ensayo de bloqueo de anticuerpos anti-PVRIG usando la unión de PVRIG-Fc a células OX PVRL2. Según las curas de dosis respuesta observadas, se sugirieron tres concentraciones de trabajo: 0,1,0,2 y 0,4 pg/mL. Siguiendo resultados similares obtenidos con la unión de PVRIG a células B16-F10 que expresan endógenamente PVRL2, se sugirió llevar a cabo el ensayo de bloqueo de anticuerpos también con estas células a las siguientes concentraciones: 0,2, 0,4, 0,8 pg/mL.
Se presume que PVRIG es un receptor, por tanto, preferiblemente el ensayo de bloqueo de anticuerpos debería llevarse a cabo con PVRL2 como proteína soluble y PVRIG expresada en las células. Por tanto, debería considerarse examinar anticuerpos anti-PVIRG de ratón que demuestran actividad de bloqueo en el presente formato también en este sistema.
Estudio de validación adicional 3
El objetivo de este estudio es confirmar las parejas de unión de PVRIG, una nueva diana inmuno-oncológica. Los estudios preliminares indican que uno de estos ligandos es la PVRL2. En este estudio, se ha investigado la unión de la proteína recombinante PVRIG a varios ligandos potenciales del eje de PVRIG mediante ELISA.
Protocolos
Lista de reactivos: la bibliografía actual sobre proteínas PVRIG sugiere que existen tres ligandos potenciales: PVR (CD155), PVRL2 (CD112), y PVRL3 (CD113). Para investigar su capacidad para unirse al receptor de PVRIG, se buscaron estos tres ligandos comercialmente, como se indica a continuación: PVR y PVRL3 de Sino Biologicals Inc. y PVRL2 de R&D Systems y Sino Biologicals Inc. La proteína recombinante PVRIG humana fue generada en Compugen como el dominio extra-celular (ECD) de PVRIG fusionado a dominio Fc de IgG1 humana (PVRIGHH).
ELISA para determinar la interacción receptor-ligando: Los ligandos obtenidos comercialmente marcados con His, PVR, PVRL2 y PVRL3, fueron recubiertos sobre los pocillos de una placa de alta unión EIA/RIA (Costar 9018) durante una noche a 4°C. Se incluyó una proteína marcada con His irrelevante como control negativo. Los pocillos de placa recubiertos fueron lavados dos veces con PBS y se incubaron con 300 pL de tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en polvo en PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. Se retiró el tampón de bloqueo y las placas fueron lavadas dos veces más con PBS. Los ligandos unidos a placa fueron incubados con concentraciones variables de PVRIGHH en disolución (rango lineal de 0,1 pg/mL a 4 pg/mL en un volumen de pocillo de 50 pL) a RT durante 1 h. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T (PBS 7,4, 0,05% de Tween20), a continuación tres veces con PBS y se añadieron 50 pL/pocillo de un anticuerpo secundario conjugado a HRP (dominio específico Fc de IgG humana, Jackson ImmunoResearch). Se incubó a r T durante 1 h y las placas se volvieron a lavar. Se desarrollaron las señales ELISA en todos los pocilios añadiendo 50 pL de sustrato Sureblue TMB (KPL Inc) e incubando durante 5­ 20 minutos. La reacción de h Rp de detuvo añadiendo 50 pL de H2SO4 2N (VWR) y se leyeron las señales de absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro SpectraMax (Molecular Devices) o EnVision (PerkinElmer). Los datos fueron exportados a Excel (Microsoft) y se representaron en GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).
Resultados: la PVRIG se une preferiblemente a PVRL2: la proteína de fusión PVRIG Fc humana fue evaluada para determinar la unión a PVR, PVRL2 y PVRL3, que fueron inmovilizados en una placa EIA/RIA. Se incubaron concentraciones variables de PVRIG receptor en fase de disolución con el ligando inmovilizado. Los datos muestran claramente una unión dependiente de dosis de PVRIGHH a PVRL2, pero no unión a los ligandos PVR, PVRL3 o la proteína de control negativo (datos no mostrados). La señal ELISA A450 se representó en función de la concentración de receptor usando una ecuación de unión a un sitio, revelando una constante de equilibrio de unión (KD) de 13 ± 1 nM.
Resumen y Conclusiones: La PVRIG es una nueva diana inmuno-oncológica de la cual aún no se entiende completamente la biología. En un esfuerzo para arrojar luz sobre dicha biología, se ha examinado la unión a varios ligandos potenciales. PVRL2 ha sido identificada claramente como la pareja de unión de PVRIG. El análisis cuantitativo sugiere que dicha interacción es muy fuerte, con una KD de 13 ± 1 nM. Nuestros resultados también sugieren que la PVRIG humana no se une a PVR y PVRL3 humanas, o la unión es demasiado débil para ser detectada mediante ELISA.
Estudio de validación adicional 4:
En este ejemplo, se evaluó la expresión de PVRIG en subconjuntos de células PBMC pre y post alo-activación. Después de la alo-activación, la expresión de PVRIG se vio regulada al alza en células T CD4+ y en células T CD8+ y en células T gamma delta negativas. Dicha regulación al alza se observó en PBMCs de uno de los dos donantes evaluados (véase la Figura 52).
E je m p lo 6: E s tu d io s d e R e so n a n c ia d e P las m ó n S u p e rfic ia l d e la un ión d e P V R , P V R L 2 y P V R L 3 a P V R IG , D N A M y T IG IT
Materiales y Métodos
Todos los experimentos se llevaron a cabo usando un instrumento ProteOn XPR 36 a 22°C.
E tap a 1: Se preparó una superficie de anticuerpo policlonal anti-Fc humano de cabra de alta densidad (Invitrogen H10500) en las seis calles de un chip GLC usando un biosensor ProteOn XPR 36. La etapa de activación para la superficie de anti-Fc humano se produjo en la dirección de flujo horizontal, mientras que la etapa de inmovilización para el pAb de alta densidad se produjo en la dirección de flujo vertical. La etapa de bloqueo se produjo tanto en la posición vertical como en la horizontal, de tal modo que las “inter-señales” podía usarse como superficies de referencia. Se inmovilizó un promedio de ~4400 RU de pAb anti-humano de cabra en cada calle.
E tap a 2: Para cada ciclo, tres lotes diferentes de proteína de fusión de PVRIG (fc humana, GenScript lotes 451, 448, 125), proteína de fusión de DNAM-1 humana (fc human, R&D Systems), proteína de fusión de TIGIT humana (fc humana, R&D Systems), y una IgG humana de control (Synagis) fueron capturados sobre una calle vertical diferente durante dos minutos a una concentración de 2 pg/mL. PVR, dos lotes de PVRL2 y PVRL3 fueron inyectados en la dirección de flujo horizontal a seis concentraciones diferentes para los seis ligandos capturados a diferentes ciclos de captura de ligando. Las inyecciones fueron de dos minutos seguidas de 10 minutos de disociación con un caudal de 50 pL/min. El rango de concentración de PVR fue de 1,4 nM-332 nM en una serie de dilución 3 veces, ambos lotes de PVRL2 fueron inyectados en un rango de concentración de 1,3 nM-322 nM en una serie de dilución 1:3, y la PVRL3 fue inyectada en un rango de concentración de 1,4 nM-334 nM en una serie de dilución 1:3. Todos los reactivos de proteína fueron preparados en tampón de elución, que fue tampón de PBS desgasificado con 0,05% de Tween 20 y 0,01 % de BSA añadido. Las superficies de captura anti-fc humana fueron regeneradas con dos pulsos de 30 segundos de ácido fosfórico 146 mM después de cada ciclo.
E tap a 3: Los datos de sensograma de la unión de analitos a cada ligando capturado fueron procesados y referenciados doblemente usando ProteOn Manager versión 3.1.0.6, haciendo uso de referencia inter-señal y una inyección pre­ blanco idéntica a las inyecciones de analito.
Resultados
a) PV R : Se une débilmente a DNAM-1 y TIGIT capturados y no muestra unión a los tres lotes de PVRIG y la IgG de control. No se generó suficiente información para estimar la Kd de las interacciones de PVR con DNAM-1 y TIGIT (datos no mostrados).
b) P V R L R 2: Ambos lotes de PVRL2 mostraron unión a los tres lotes de PVRIG y DNAM-1 pero una unión mínima o nula a TIGIT, y ninguna unión al control de IgG. Los sensogramas mostraron cinéticas complejas, por tanto no se pudo estimar las constantes de unión (datos no mostrados).
c) P V R L 3: Mostró unión mínima a TIGIT y no se unió a las otras proteínas (datos no mostradas).
E je m p lo 7: A c tiv id a d e s in vitro in m u n o m o d u la d o ra s d e P V R IG E C D -Ig en c é lu la s T d e ra tón
En estos experimentos se investigaron las actividades inmunomoduladoras de la proteína fusionada recombinante PVRIG-ECD-Ig en la activación de células T de ratón. Se investigó el efecto de PVRIG-ECD-Ig en la activación de células T CD4 de ratón usando una serie de lecturas de activación de células T in vitro: marcadores de activación celular, secreción y proliferación de citoquinas.
Para evaluar la actividad de la proteína PVRIG en la activación de células T, se produjo proteína recombinante que comprende el dominio extracelular (ecd) de ratón de la PVRIG de ratón fusionada a fc de igg2a de ratón (designada PVRIG-ECD Ig M:M) (SEQ ID NO: 29). Se investigó el efecto de la proteína fusionada a fc co-inmovilizada con anticd3 sobre las funciones de las células t cd4 de ratón, manifestado a través de marcadores de activación y secreción de citoquinas.
Materiales y Métodos
Se evaluó la proteína de fusión de Fc y la proteína de fusión de control Ig : Fc, PVRIG-ECD-Ig (lote n° 198). Como control de isotipo se usó IgG2a de ratón (clon MOPC-173; Biolegend o C1.18.4; BioXcell).
Aislamiento de células T CD4 de ratón: Se aislaron células T CD4+CD25- intactas de conjuntos de bazos de ratones BALB/C usando un kit de aislamiento de células T (Miltenyi Cat n° 130-093-227) según las instrucciones del fabricante. La pureza obtenida fue de >90%.
Activación de células T CD4 de ratón: mAb anti-CD3-s de ratón (clon 145-2C11; BD Biosciencies) a 2 pg/mL junto con proteína PVRIG-ECD-Ig o Ig de control a diversas concentraciones (1, 3, o 10 pg/mL), se co-inmovilizaron durante 3 h a 37°C en placas de cultivo de fondo plano de 96 pocillos (Sigma, cat n° Z707910). Se añadió Ig de control a cada pocillo para completar una concentración total de proteína de 12 pg/mL por pocillo. Los pocillos fueron lavados 3 veces con PBS y llevados a placa con 1x105 células T CD4+CD25- purificadas por pocillo, y se mantuvieron en un incubador humidificado, con un 5% de CO2 , a 37°C. En algunos experimentos, se añadió anti-CD28 soluble (clon: 37.51; eBioscience; 1 pg/mL). Los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados a los tiempos indicados post-estimulación y analizados para secreción de IFNy o IL-2 de ratón mediante kits ELISA (R&D Systems). Se analizó el efecto de la proteína PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103) sobre la expresión del marcador de activación CD69 en células T CD4+ de ratón mediante citometría de flujo. Las células fueron teñidas 48h post estimulación con un cóctel de anticuerpos que incluye PerCP-anti-CD4 (clon G41.5; Biolegend), FITC o PE-anti-CD69 (clon H1.2F3; Biolegend), en presencia de anti-CD16/32 (clon 2.4g2; BD Biosciences) para bloqueo de receptores Fcy. Las células fueron evaluadas usando el analizador 9 de MACSQuant (Miltenyi) y los datos se analizaron usando el software BD CellQuest o MACSQuantify TM. Los datos se analizaron usando Excel o el software Prism4.
Resultados y Resumen
Efecto de PVRIG-ECD Ig M:M (ver Figura 103) en la función de células T CD4+: la Figura 15 muestra las actividades inmunomoduladoras in vitro de PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103) en células T esplénicas de ratón aisladas (CD4+, >95% de pureza) estimuladas con microplacas co-inmovilizadas con anti-CD3 (2 pg/mL) solo o co-inmovilizado con Ig de control (mIgG2a) o PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103)) (10 pg/mL) en presencia de anti-CD28 soluble (1 pg/mL). La PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103) suprimió la activación de células T CD4 de ratón de un modo dependiente de la dosis, como manifiesta la reducción de la regulación al alza de CD69 (Figura 15A, D), y la reducción de la secreción de citoquinas inducidas por TCR (IL-2 e IFNy) (Figura 15B-C, E). La magnitud del efecto inhibidor de la PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103) estuvo en el rango de 30-100%. El efecto inhibidor de la PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103) sobre la secreción de IFNy se observó en concentraciones tan bajas como 3 pg/mL (~60% de inhibición frente al control de Ig).
La PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103) inhibe la activación de células T de un modo dependiente de la concentración cuando la proteína de fusión Fc es co-inmovilizada con anti-CD3 en placas. El efecto inhibidor máximo se observó a 10 pg/mL de PVRIG-ECD-Ig (ver la Figura 103).
Los resultados demuestran el efecto inhibidor de PVRIG-ECD-Ig en la activación de células T de ratón, manifestado a través de una reducción de la secreción de citoquinas, y de la supresión de la regulación al alza del marcador de activación CD69. Esta inhibición de la activación de células T apoya el potencial terapéutico de las proteínas PVRIG inmunomoduladoras (polipéptidos de PVRIG y proteínas de fusión) según la presente invención en el tratamiento de enfermedades autoinmunes dirigidas por células T, tales como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, soriasis y enfermedad inflamatoria del intestino, así como otras enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y/o para reducir la activación no deseada del sistema inmune tras una terapia génica. Adicionalmente, estos resultados también apoyan el potencial terapéutico de las proteínas PVRIG inmunoestimuladoras (polipéptidos de PVRIG y proteínas de fusión) que reducen la actividad inhibidora de PVRIG para tratar afecciones que se beneficiarían de unas mayores respuestas inmunes, en particular una mayor inmunidad de CTL y de citoquinas pro-inflamatorias tales como cáncer, enfermedades infecciosas, particularmente infecciones crónicas y sepsis, donde el agotamiento mediado por células T de las células enfermas sea terapéuticamente ventajoso.
Ejemplo 8: Actividades inmunomoduladoras in vitro de PVRIG en células T citotóxicas (CTLs) humanas
Los experimentos descritos en este ejemplo evaluaron el efecto de la expresión ectópica de PVRIG humana en diferentes líneas celulares de melanoma sobre su capacidad para activar CTLs (linfocitos T citotóxicos) y actuar como dianas para ser matadas por dichas células.
Materiales y Métodos:
Se usaron tres líneas celulares de melanoma humano que presenta el antígeno MART-1 en el contexto de HLA-A2 (SK-MEL-23, Mel-624 y Mel-624.38) como dianas para CTLs. Mel-888, que no expresa HLA-A2, sirvió como control negativo.
Expresión ectópica de PVRIG humana en linfocitos T citotóxicos (CTLs): Para expresar PVRIG humana en cultivos de leucocitos de sangre periférica (PBL), se amplificó el ADNc que codifica para PVRIG usando cebadores específicos y se clonó en un vector retroviral basado en MSCV (pMSGV1) o en vectores tripartitos: las cadenas □- y □- de TCR F4 dependiente de CD8 fueron ligadas con una secuencia P2A y clonadas en el vector pMSGVI, tanto seguidas por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) como por PVRIG. El vector retroviral que codifica para NGFR1, como control negativo o en vectores triplicados: las cadenas □- y □ - de TCR F4 dependiente de CD8 fueron ligadas con una secuencia P2A y clonadas en el vector pMSGV1, tanto seguidas por un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES) como por NGFR. La verificación de la clonación se realizó primero usando digestión de enzima de restricción y posteriormente mediante secuenciamiento. Tras confirmación de secuencia, se produjeron grandes cantidades del vector retroviral (Maxi-prep) para el uso posterior.
Se transdujeron leucocitos de sangre periférica de donantes humanos sanos con las construcciones retrovirales que codifican PVRIG o con los vectores retrovirales que codifican para NGFR1 o un vector vacío, como control negativo. La transducción se llevó a cabo usando un protocolo basado en retronectina; resumidamente, se produjo sobrenadante retroviral en células 293GP (una línea celular de empaquetamiento retroviral) después de transfección con el vector retroviral y un gen de envoltura anfotrópico (VSV-G). El sobrenadante retroviral se llevó a placa sobre placas recubiertas de retronectina antes de la transducción para permitir la unión de viriones a la placa, y los PBLs se añadieron a la placa durante 6 horas. Después de eso, las células fueron restauradas en un nuevo recipiente de cultivo Se determinó la eficacia de transducción y la expresión de la proteína mediante tinción de los PBLs transducidos con anticuerpo policlonal de conejo específico de PVRIG o con anti-NGFR comercial (cat n° 345108; BioLegend). Como control de isotipo se usó IgG de conejo (Sigma cat n° I5006), y como anticuerpo secundario se usó IgG anti-conejo conjugada a a Pc (Jackson, cat n° 711-136-152).
Expresión ectópica del receptor de células T F4 en linfocitos T citotóxicos (CTLs): Para obtener linfocitos efectores que expresan el TCR F4 específico de MART-1, que reconoce específicamente el complejo MART-126-35-/HLA-A2 péptido-MHC, PBLs humanas recién aisladas transducidas previamente para expresar con PVRIG, NGFR o un vector vacío, fueron estimuladas con PHA y cultivadas durante 5-10 días, y posteriormente fueron transducidas con ARNm transcrito in vitro que codifica cadenas a y p de TCR de F4 específico de MART-1. Los linfocitos transducidos fueron cultivados en medio de linfocitos (medio diana Bio, suero fetal bovino (10%), L-glutamina penicilina/ Estreptomicina (100 unidades/mL), IL-2 300 IU), regenerado cada 2-3 días. Se verificaron los niveles de expresión de TCR de F4 mediante tinción FACS usando un anticuerpo monoclonal específico que reconoce el dominio extra-celular de la cadena beta del TCR específico transducido. (TCR-Vb12-PE, (Cat. N° IM2291; Beckman Coulter).
Secreción de citoquinas de linfocitos transducidos con PVRIG, NGFR o un vector vacío y F4-TCR tras co-cultivo con células de melanoma: Se co-cultivaron PBLs que expresan PVRIG o NGFR junto con F4-TCR con células de melanoma no manipuladas. Se co-cultivaron 105 PBLs transducidos con 105 células diana de melanoma durante 16 horas. A fin de determinar la respuesta de las células T CD8 efectoras a las diferentes líneas celulares tumorales, se midió la secreción de citoquinas (IFNy, IL-2 y TNF-a) mediante ELISA en sobrenadantes de cultivo (IFNy (Cat. n° DY285E), IL-2 (Cat. N° DY202E), TNF-a (Cat. N° DY210E) R&D SYSTEMS), diluidos para entrar en el rango lineal del ensayo ELISA.
Ensayo de citotoxicidad mediado por células: Este ensayo se llevó a cabo para determinar la muerte de células diana en co-cultivo. Se expresaron PVRIG y F4 en PBLs usando un vector bi-cistrónico y se co-cultivaron con células diana de melanoma marcadas con CFSE (marcadas con CFSE 2 mM (eBioscience) durante 6 minutos), a 37°C durante 18h, a una relación E:T de 3:1. Las células fueron recolectadas después de 18h y se añadió yoduro de propidio 1 mM (Sigma-Aldrich) para asignar la ratio de muerte celular. Las muestras fueron eluídas en un citómetro de flujo CyAn-ADP (Beckman Coulter).
Resultados:
Diseño general del sistema experimental: En el sistema experimental descrito en la presente memoria, se sobre­ expresa PVRIG en PBLs humanas que a continuación son manipuladas para expresar el F4-TCR específico de MART1 y restringido por HLA-A2. A continuación las células sobre-expresadoras son co-cultivadas con líneas celulares de melanoma (referencia) HLA-A2 positivas (nombrarlas) y HLA-A2 negativas (nombres). El F4-TCR ha sido usado recientemente en ensayos clínicos en pacientes de melanoma terminales para conferir específicamente reconocimiento tumoral por linfocitos autólogos de sangre periférica usando un retrovirus que codifica el TCR (Morgan et al, 2006 Science, 314:126-129). Se determinó el efecto de la expresión de PVRIG en la activación específica de antígeno de células T CD8 mediante co-cultivo con células de melanoma cognadas a través de la secreción de citoquinas.
Sobre expresión de PVRIG en PBLs humanos - experimento 1: Se transdujeron PBLs humanos con un vector retroviral que codifica la PVRIG o un vector vacío como control negativo, tal como se describe en Materiales y Métodos. Se determinaron los niveles de PVRIG mediante citometría de flujo 48 h después de la transducción, y se compararon con las células transducidas con un vector vacío. El porcentaje de células que expresan transgén fue del 62,4%, como se muestra en la Figura 16.
Sobre expresión de PVRIG en PBLs humanos - experimento 2: Se transdujeron PBLs humanos con un vector retroviral que codifica PVRIG o NGFR o un vector vacío como controles negativos, tal como se describe en Materiales y Métodos. Se determinaron los niveles de PVRIG mediante citometría de flujo 48 h después de la transducción, y se compararon con células transducidas con un vector vacío. El porcentaje de células que expresan PVRIG estaba en el rango del 20%. La expresión de NGFR fue del 63%, tal como se muestra en la Figura 17. Algunos intentos adicionales de sobre expresar PVRIG en PBLs no tuvieron éxito. Una posibilidad es que la dificultad para expresar PVRIG en PBLs primarios surge de un nivel de expresión endógena basal en estas células.
Sobre expresión de F4 TCR en PBLs humanos: Para llevar a cabo ensayos funcionales con CTLs humanos, usamos PBLs modificados para expresar el F4 TCR, que reconoce células de melanoma HLA-A2+/MART1+, como se describe en Materiales y Métodos. La Figura 18A muestra los niveles de expresión de F4 TCR obtenidos tras transducción de TCR de los leucocitos usados en el experimento 1, la Figura 18B muestra los niveles de expresión de F4 TCR obtenidos tras transducción de TCR de los leucocitos usados en el experimento 2.
Efecto de la expresión de PVRIG sobre la secreción de IFNv - experimento 1: Se co-cultivaron PVRIG o vector vacío y PBLs transducidas con F4 con líneas celulares de melanoma. Se midieron los niveles de secreción de IFNy a las 16 h de co-cultivo. Tal como se muestra en la Figura 19, la magnitud de la inhibición de la secreción de IFNy debida a sobre-expresión de PVRIG fue superior al 90%. El co-cultivo con la línea celular HLA-A2 negativa Mel-888 que sirvió como control negativo, produjo solo una secreción menor de IFNy dependiente de activación a partir de linfocitos transducidos con F4. Los PBLs que no expresan el F4 TCR (designados W/O) sirven como control negativo adicional.
Efecto de la expresión de PVRIG sobre la secreción de IFNv - experimento 2: PVRIG, NGFR o vector vacío y F4 fueron transducidos en PBLs en co-transducción (Figura 20A) o usando un vector bi-cistrónico (Figura 20B). Los PBLs transducidos fueron co-cultivados con líneas celulares de melanoma. Se midieron los niveles de secreción de IFNy a las 16 h de co-cultivo. Tal como se muestra en la Figura 20A, la magnitud de la inhibición de la secreción de citoquinas debida a sobre-expresión de PVRIG estuvo en el rango del 30%. El co-cultivo con la línea celular HLA-A2 negativa Mel-888 que sirvió como control negativo, produjo solo una secreción menor de IFNy dependiente de activación a partir de linfocitos transducidos con F4. Los PBLs que no expresan el F4 TCR (designados W/O) sirven como control negativo adicional. Tal como se muestra en la Figura 20B, cuando se co-transduce PVRIG con el F4 TCR, no se observó inhibición de IFNy.
Efecto de PVRIG en la actividad mortal mediada por CTL - experimento 2 : PVRIG o NGFR y F4 fueron transducidos a PBLs usando un vector bi-cistrónico y se co-cultivaron con líneas celulares de melanoma marcadas con CFSE. Tal como se muestra en la Figura 21, el porcentaje de eventos positivos en yoduro de propidio (que refleja la intensidad de la actividad mortal) disminuyó en ~50% por la expresión de PVRIG con respecto a las células transducidas con NGFR del control negativo. La actividad mortal de las células que expresan PVRIG es similar a la del co-cultivo entre melanoma y PBLs que no expresan el F4 TCR (designados W/O).
Resumen: sin pretender estar limitados por una única hipótesis, los resultados presentados en la presente memoria indican que la sobre-expresión en linfocitos primarios da como resultado una reducción de la secreción de citoquinas por parte de CTLs, lo que sugiere que la PVRIG tiene un efecto inhibidor sobre los CTLs.
Ejemplo 9: Anticuerpos anti-PVRIG humana
El objetivo de este estudio fue aislar anticuerpos humanos que se unen a la diana inmuno-oncológica PVRIG con alta afinidad y especificidad, y bloquear la interacción de PVRIG con su pareja de unión, PVRL2. Esto se logró preparando una biblioteca de presentación de fagos de fragmento fab contra una proteína recombinante que comprende el dominio extracelular (ECD) de PVRIG humana fusionado a la región Fc de IgG1 humana, y cribando los anticuerpos resultantes en función de su capacidad para bloquear la interacción de PVRIG con PVRL2.
Protocolos
QC funcional de reactivos: La pureza del agente de preparación, ECD de PVRIG fusionado a dominio Fc de IgG1 humana (PVRIGHH), fue determinada mediante Electroforesis Capilar de Microfluidos usando un Sistema LabChip (PerkinElmer). La actividad del reactivo de preparación fue validada por su capacidad para unirse a su ligando PVRL2.
ELISA para detectar la interacción proteína-proteína: Se diluyó proteína recombinante PVRL2 marcada con His a 2 pg/mL en salino tamponado con fosfato (PBS) y se recubrieron alícuotas de 50 pL sobre los pocillos de una placa de alta unión EIA/RIA (Costar) durante una noche a 4°C. Los pocillos de la placa recubierta fueron lavados dos veces con PBS e incubados con 300 pL de tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en polvo en PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. Se eliminó el tampón de bloqueo y las placas fueron lavadas dos veces más con PBS. Se incubó PVRL2 ligada a placa con concentraciones variables de PVRIGHH en disolución (rango lineal de 0,1 pg/mL a 4 pg/mL en un volumen de 50 pL/pocillo) a RT durante 1 h. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-T (PBS 7,4, 0,05% de Tween20), a continuación tres veces con PBS y se añadieron 50 pL/pocillo de un anticuerpo secundario conjugado a HRP (específico de dominio Fc de IgG humana). Se incubó a RT durante 1 h y se volvió a lavar las placas. Se desarrollaron las señales ELISA en todos los pocillos añadiendo 50 pL de sustrato Sureblue TMB (KPL Inc) e incubando durante 5-20 minutos. La reacción de HRP se detuvo añadiendo 50 pL de H2SO42N (VWR) y se midieron las señales de absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro SpectraMax (Molecular Devices) o EnVision (PerkinElmer).
Preparación de PVRIG biotinilada: Para facilitar la preparación de fagos en disolución usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina, PVRIGHH y un control de isotipo Fc de IgG1 humana irrelevante fueron biotinilados usando el kit “Lightning-Link® Biotin Kit” (Innova Biosciences). Las reacciones de biotinilación se llevaron a cabo siguiendo el protocolo del fabricante y los reactivos biotinilados se almacenaron a 4°C para QC adicional y preparación. La pureza y la actividad de las proteínas marcadas con biotina se determinó mediante LabChip y ELISA funcional, como se describe en la Sección 2.1. Adicionalmente, se determinó el grado de biotinilación mediante ELISA usando dos estrategias: 1) los reactivos biotinilados fueron adsorbidos en una placa de EIA/RIA de alta unión y las proteínas fueron detectadas usando estreptavidina conjugada a HRP, y 2) las proteínas biotiniladas fueron incubadas en placa EIA/RIA pre-recubierta con estreptavidina y la unión se detectó usando un anticuerpo secundario específico de dominio Fc de IgG humana conjugada a HRP.
Preparación de fagos de biblioteca de anticuerpos humanos: Las reacciones de preparación se llevaron a cabo en disolución usando perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina para captura los antígenos biotinilados. Cabe destacar que todas las etapas de lavado y elución se llevaron a cabo usando un sistema magnético para capturar las perlas (Promega). Todas las etapas de incubación se llevaron a cabo a temperatura ambiente con mezcla suave en un rotador de tubos (BioExpress). Se llevaron a cabo cuatro sub-campañas de preparación, cada una con una combinación diferente de concentraciones de antígeno, lavados y etapas de agotamiento de ligando de Fc (Tabla 1).
Todas las sub-campañas de preparación se llevaron a cabo usando el antígeno PVRIGHH biotinilado. Para cada ronda de preparación, las bibliotecas de fagos fueron agotadas contra 100 pmol de proteína Fc de IgG1 humana irrelevante en dos etapas sucesivas. Tras el agotamiento, las sub-campañas A y B implicaron la preparación contra 50 nM del antígeno en cada ronda, en condiciones de lavado de baja y alta severidad, respectivamente. Las sub-campañas C y D fueron idénticas a la sub-campaña B, excepto que en la campaña C la biblioteca fue bloqueada con un exceso 10 a 1 de la proteína Fc de IgG1 irrelevante en las rondas de preparación 2 y 3. La sub-campaña D difirió en que se usó 5 nM de antígeno en la ronda 3.
Tabla 1: Antígeno y condiciones de lavado usados para la preparación de fagos contra PVRIGHH.
Sub-campaña Ronda Conc. de antígeno Lavados Agotamiento Fc
A 1 50 nM 3x PBS-T 3x PBS 2X 100 pmol
2 50 nM 3x PBS-T 3x PBS 2X 100 pmol
3 50 nM 3x PBS-T 3x PBS 2X 100 pmol
B 1 50 nM 3x PBS-T 3x PBS 2X 100 pmol
2 50 nM 6x PBS-T 6x PBS 2X 100 pmol
3 50 nM 6x PBS-T 6x PBS 2X 100 pmol
C 1 50 nM 3x PBS-T 3x PBS 2X 100 pmol
2 50 nM 6x PBS-T 6x PBS 2X 100 pmol bloqueo con 1 nmol 3 50 nM 6x PBS-T 6x PBS 2X 100 pmol bloqueo con 1 nmol D 1 50 nM 3x PBS-T 3x PBS 2X 100 pmol
2 50 nM 6x PBS-T 6x PBS 2X 100 pmol
3 5 nM 6x PBS-T 6x PBS 2X 100 pmol
2.4 Preparación de biblioteca de fagos para preparación: todos los experimentos de preparación de fagos usaron la biblioteca de presentación de fagos de anticuerpo fab humano XOMA031 (XOMA Corporation, Berkeley, CA). Se bloqueó suficiente fago para una sobre-representación de 50 a 1 de la biblioteca mezclando 1:1 con 10% de leche desnatada en polvo en PBS (concentración final de leche desnatada 5%) e incubando durante 1 h.
2.4.1 Acoplamiento de antígeno a perlas de estreptavidina: para cada sub-campaña, se bloquearon tres alícuotas de 100 pL de perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina Dynal (Life Technologies) mediante suspensión de 1 mL de tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en polvo en PBS) y se incubó durante 30 minutos. Una alícuota de perlas bloqueada se mezcló con 100 pmoles de PVRIGHH biotinilada. Las otras dos alícuotas se mezclaron con 100 pmoles del antígeno irrelevante para agotamiento de ligando solo de Fc. Los antígenos marcados con biotina fueron acoplados a las perlas durante 30 minutos a RT. Las suspensiones de perlas fueron lavadas dos veces con PBS para eliminar el antígeno libre y se re-suspendieron en 100 pL de tampón de bloqueo.
2.4.2. Agotamiento de Fc de IgG1 humana y ligandos de perlas de estreptavidina de la biblioteca de fagos: fue necesario eliminar los ligandos no deseados de perlas de estreptavidina y de la región Fc de PVRIGHH antes de que pudiera comenzar la preparación de fagos. Para lograr esto, el fago bloqueado se mezcló con una alícuota de 100 pL de perlas de estreptavidina no acopladas y se incubó durante 45 minutos. Las perlas (y presumiblemente las perlas no deseadas y los ligandos de Fc de IgG1 humana) fueron desechados. Esta etapa se repitió una vez y los sobrenadantes de la biblioteca de fagos agotados se reservaron para la preparación.
2.5 Preparación de fagos ronda 1: la biblioteca de fagos bloqueada y agotada se mezcló con PVRIGHH biotinilada acoplada a perlas magnéticas como se ha descrito anteriormente. Esta suspensión se incubó durante 1 h a RT con una rotación suave para permitir la unión de fago específico de PVRIGHH. Los ligandos no específicos fueron eliminados mediante lavado según el protocolo de la Tabla 1. Tras lavar, los fagos ligados fueron eluídos mediante incubación con 500 pL de trietilamina (TEA) 100 mM (EMD) durante 15 minutos a RT. El eluato se neutralizó añadiendo 500 pL de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 (Teknova).
2.5.1. Determinación del título de fagos: 10 pL de la biblioteca de fagos inicial (título de entrada) o de eluato de preparación (título de salida) fueron diluidos en serie (10 veces) en PBS. Se mezcló una alícuota de 90 pL de cada dilución de fago con 500 pL de células E. coli TG1 crecidas hasta una densidad óptica de ~0,5 a 600 nm (Do 600nm). Se dejó que los fagos infectaran las células mediante incubación estacionaria durante 30 minutos, después con incubación en agitación (250 rpm) durante 30 minutos, todo a 37°C. Se impregnó una alícuota de 10 pL de cada cultivo celular infectado en una placa de agar 2YT suplementada con un 2% de glucosa y 100 pg/mL de carbenicilina (2YTCG, Teknova). Las placas fueron incubadas durante una noche a 30°C. Se contabilizaron las colonias que crecieron de cada impregnación de 10 pL y se usaron para calcular los títulos de entrada y de salida.
2.5.2. Rescate de fagos: El eluato de fagos remanente (~1 mL) se mezcló con 10 mL de células E. coli TG1 crecidas hasta una DO 600 nm de 0,5. Los fagos fueron infectados en células como se detalla en la sección 2.5.1. Las células infectadas fueron peletizadas mediante centrifugación a 2500xG, resuspendidas en 750 pL de medio 2YT (Teknova) y extendidas en placas de agar 2YTCG. Éstas fueron incubadas durante una noche a 37°C y las colonias de E. coli resultantes fueron rascadas y resuspendidas en ~20 mL de 2YTCG líquido (Teknova). Se inoculó una pequeña alícuota de células re-suspendidas en 50 mL de 2YTCG para alcanzar una DO 600nm de 0,05, y a continuación se crecieron a 37°C con agitación a 250 rpm hasta que la DO alcanzó un valor de 0,5. El cultivo resultante se infectó con fago colaborador M13K07 (New England Biolabs) y se incubó durante una noche a 25°C con agitación para permitir el empaquetamiento de fagos. El sobrenadante de cultivo que contenía partículas de fago rescatadas se aclaró mediante centrifugación a 2500xG y se trasladó 1 mL para a) una ronda posterior de preparación o b) cribados de unión a fab.
Preparación de fagos rondas 2-3: la segunda y tercera rondas de preparación se llevaron a cabo como en las etapas anteriores, excepto que se usó el sobrenadante de fagos rescatado de la ronda previa en lugar de la biblioteca de fagos. Las condiciones de lavado, agotamiento y las concentraciones de antígeno usadas son las presentadas en la Tabla 1.
2.6. Cribados de unión usando fabs preparados a partir de extractos periplásmicos
2.6.1. Vectores de expresión de Fab: la biblioteca XOMA031 se basa en construcciones fagémidas que también actúan como vectores de expresión de fab. Dichos vectores contienen casetes de expresión de cadena pesada y cadena ligera de fab, un promotor lac para conducir la expresión de los genes de anticuerpo, y un gen de resistencia a ampicilina. Las cadenas de anticuerpo tienen como apéndices péptidos señal N-terminales para conducir su secreción al espacio periplásmico. El extremo C de la cadena pesada también porta etiquetas de afinidad de hexa-histidina, cmyc y V5. La transformación de estos vectores en E. coli y la inducción con isopropil p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) da como resultado la expresión periplásmica de moléculas fab solubles.
2.6.2. Producción de Fab PPE: Los conjuntos de fagos eluídos de la ronda de preparación 3 fueron diluidos e infectados en células de E. coli TG1 (Lucigen) de tal modo que se generaron colonias individuales cuando se extendieron en una placa de agar 2YTCG. Esto dio como resultado que cada colonia portara un único clon de fab. Los clones individuales fueron inoculados en 1 mL de cultivos de inicio 2YTCG en bloques de pocillos profundos de 96 pocillos (VWR) usando un instrumento Qpix2 (Molecular Devices). Estos cultivos de inicio fueron crecidos durante una noche en un incubador Multitron de 3 mm (Infors) a 37°C con una agitación de 700 rpm. Para la expresión de fab, se transfirieron 20 pL de cultivos de inicio de 1 mL a un segundo conjunto de placas de pocillos profundos que contenían 1 mL de 2YT con 0,1% de glucosa y 100 pg/mL de ampicilina. Los cultivos fueron crecidos hasta una DO 600nm promedio de 0,5-1,0 y se indujo la expresión de proteína añadiendo IPTG (Teknova) hasta una concentración final de 1 mM. Los cultivos de expresión fueron incubados durante una noche en el instrumento Multitron a 25°C con una agitación de 700 rpm.
Las proteínas Fab secretadas en el periplasmo de E. coli fueron extraídas para análisis. Las células fueron recolectadas mediante centrifugación a 2500xG, los sobrenadantes fueron desechados y los pelets resuspendidos en 75 pL de tampón PPB (Teknova) enfriado en hielo. Los extractos fueron incubados durante 10 minutos a 4°C con una agitación de 1000 rpm, y se añadieron 225 pL de ddH2O enfriada en hielo y se incubó durante 1 h adicional. El extracto periplásmico resultante (PPE) se aclaró mediante centrifugación a 2500xG y se transfirió a placas o tubos separados para análisis ELISA y FACS. Todos los tampones de extracción contenían Inhibidores de Proteasa Completos libres de EDTA (Roche).
Cada placa de muestras también incluye pocilios “PPE blancos” duplicados que sirvieron como controles negativos. Éstos fueron creados dejando intencionadamente dos cultivos de 1 mL sin inocular y a continuación procesándolos del mismo modo que los fab PPEs, creando con ello una muestra sin crecimiento bacteriano y por tanto sin expresión de fab.
2.6.3. Cribado primario mediante ELISA: Dos placas de 96 pocilios de extractos PPE por subcampaña fueron evaluadas en términos de unión a PVRIGHH mediante ELISA. Cabe destacar que se usó una versión no biotinilada de la proteína para el cribado ELISA para evitar la selección de biotina o ligandos de estreptavidina. La proteína recombinante PVRIGHH se diluyó a 2 pg/mL en salino tamponado con fosfato (PBS) y se recubrieron alícuotas de 50 pL sobre los pocillos de una placa EIA/RIA de alta unión (Costar) durante una noche a 4°C. Los pocillos de placa recubierta fueron lavados dos veces con PBS e incubados con 300 pL de tampón de bloqueo (5% de leche desnatada en polvo en PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. El tampón de bloqueo se eliminó y las placas fueron lavadas dos veces más con PBS. La PVRIG ligada a placa se incubó con los PPEs, se pre-bloqueó con 3% de leche desnatada, a RT durante 1 h. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-T (PBS 7,4, 0,05% de Tween20), después tres veces con PBS y se añadieron 50 pL/pocillo de anticuerpo secundario anti-Fab humano conjugado a HRP (Jackson ImmunoResearch) en una dilución 1:2000 en leche al 5% en PBS. Se incubó a RT durante 1 h y las placas se volvieron a lavar. Las señales ELISA fueron desarrolladas en todos los pocillos añadiendo 50 pL de sustrato Sureblue TMB (KPL Inc) y se incubó durante 5-20 minutos. La reacción HRP se detuvo añadiendo 50 pL de H2SO4 2N (VWR) y se leyeron las señales de absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro SpectraMax (Molecular Devices) o EnVision (PerkinElmer). Los pocillos que mostraron señal sobre el fondo (PPE blanco) con una ratio >3 fueron seleccionados como aciertos positivos.
2.6.4. Análisis de secuencia de fabs positivos en ELISA: los aciertos positivos del cribado ELISA fueron seleccionados y re-organizados en una nueva placa de 96 pocillos. Los clones fueron crecidos durante una noche a 37°C y el ADN plásmido fue secuenciado usando cebadores específicos de cadena pesada y cadena ligera. Las secuencias fueron ensambladas y analizadas usando el software Xabtracker (XOMA). Se juzgó que los clones presentaban secuencia única si había más de una diferencia no conservativa en la CDR3 de cadena pesada. Los clones con la misma, o similar, cadena pesada, pero con cadenas ligeras significativamente diferentes fueron marcadas como hermanas del clon original.
2.6.5. Cribado FACS de fabs como PPEs: Los clones fab positivos en ELISA de secuencia única fueron seleccionados y analizados para determinar su capacidad de unirse a células sobre-expresadoras de PVRIG mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los análisis se llevaron a cabo usando células HEK293 que sobre-expresan el antígeno de PVRIG humana. En un experimento paralelo, se usaron células HEK293 no transfectadas como control negativo para cada muestra de fab.
Se generaron los PPEs correspondientes a los clones fab positivos en ELISA de secuencia única como se ha descrito anteriormente. Todos los ensayos fueron llevados a cabo usando tampón FACS (1% de BSA y 0,1% de azida sódica en PBS). La PVRIG humana y las células HEK293 no transfectadas fueron recolectadas, lavadas dos veces y re­ suspendidas a una densidad de 2x106 células/mL. Se mezcló una alícuota de 25 pL de cada muestra de PPE y se incubó durante 1 h a 4°C con agitación suave. También se incluyeron dos controles de PPE blanco en el análisis. Las placas fueron lavadas una vez en 200 pL de tampón FACS y se añadieron a cada pocillo 50 pL de una dilución de 2 pg/mL de un anticuerpo anti-C-myc de ratón (Roche). T ras incubación durante 30 minutos a 4°C, las células se lavaron nuevamente y se añadieron 25 pL de una dilución de 5 pg/mL de fab-AF647 anti-ratón de cabra (Jackson Immunoresearch) a cada pocillo de PPE y de control negativo. Todos los anticuerpos secundarios fueron incubados durante 30 minutos a 4°C. Después de dos lavados, las células fueron re-suspendidas en un volumen final de 50 pL de tampón de fijación (2% de paraformaldehído en tampón FACS). Las muestras fueron leídas en un sistema de cribado Intellicyt HTFC, registrando aproximadamente 5000 eventos por pocillo en una puerta viva designada. Los datos se analizaron usando FlowJo (De Novo Software, CA, EE.UU.) y se exportaron a Excel. Se calculó la ratio de Intensidad Media de Fluorescencia (MFI) para las células HEK sobre-expresadoras de PVRIG humana y las células 293 no transfectadas usando software Xabtracker (XOMA). Los eventos positivos de cada placa fueron identificados como aquellos que proporcionan una ratio de MFI superior en 5 veces a la señal de control de PPE blanco media.
Re-formateo de aciertos fab y producción como moléculas IgG humanas: Los fabs de unión de PVRIG potenciales fueron convertidos a IgGs humanas de longitud completa para caracterización adicional. Las construcciones de expresión de proteína fueron derivadas mediante amplificación de PCR de genes de dominio variable pesado, lambda y kappa, que fueron sub-clonados en vectores pFUSE-CHig-hG1 (cadena pesada de IgG1 humana), pFUSE2-CLighK (cadena ligera kappa humana) o pFUSE2-CLig-hL2 (cadena ligera lambda 2 humana), respectivamente (todos los vectores de expresión fueron obtenidos en Invivogen).
Se sembraron células Expi293 (Life Technologies) a 6x105 células/mL en medio Expi293 (Life Technologies) y se incubaron durante 72 horas a 37°C en una atmósfera humidificada con un 8% de CO2 y agitando a 125 rpm. Esta reserva celular se usó para sembrar cultivos de expresión a 2,0x106 células/mL en medio Expi293. Estos cultivos se incubaron como antes, durante 24 horas con agitación a 135 rpm.
Para la transfección, las células fueron diluidas nuevamente a 2,5x106 células/mL en medio Expi293. Las construcciones de expresión de proteína para cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo se mezclaron con una ratio de 1:2. Para cada 30 mL de volumen de cultivo de expresión, se diluyeron por separado 30 pg de ADN y 81 pL de Expifectamina (Life Technologies) hasta 1,5 mL con Opti-MEM (Life Technologies) y se incubaron durante cinco minutos. El ADN y la Expifectamina diluidos fueron mezclados entonces e incubados a RT durante 20 minutos. Se añadió a continuación al cultivo de expresión en un matraz agitador y se incubó como se ha descrito anteriormente, con agitación a 125 rpm.
Aproximadamente 20 h después de la transfección, se añadieron a cada matraz 150 pL de Potenciador 1 de transfección ExpiFectamina 293 y 1,5 mL de Potenciador 2 de transfección de ExpiFectamina 293. Los cultivos fueron incubados durante otros cinco días (seis días desde la transfección en total) y los sobrenadantes fueron recolectados mediante centrifugación. Las IgGs fueron purificadas de los sobrenadantes usando un FPLC AKTA Pure (GE Healthcare Bio-Sciences) y columnas de afinidad HiTrap MabSelect Sure (GE Healthcare Bio-Sciences) según las instrucciones del fabricante.
Cribado FACS de anticuerpos IgG1 reformateados: El cribado FACS de los anticuerpos reformateados se realizó de forma similar al cribado basado en PPE descrito en la presente memoria, excepto que se realizó una valoración dependiente de dosis de los anticuerpos purificados. Las células HEK293 que sobre-expresan PVRIG humana, o las células HEK293 no transfectadas, fueron incubadas con concentraciones variables (0 - 10 pg/mL) de los anticuerpos de PVRIG o de los controles de isotipo en tampón FACS a 4°C durante 60 minutos. Las células fueron lavadas una vez en tampón FACS, re-suspendidas en 50 pL de IgG anti-humana conjugada a Alexa Fluor 647 (específico de fragmento Fab) diluido 1:200 e incubado durante 30 minutos a 4°C en la oscuridad. Las células fueron lavadas dos veces y re-suspendidas en un volumen final de 80 pL de tampón FACS y yoduro de propidio (Biolegend cat n° 421301) diluido 1:1000. Las muestras fueron analizadas usando un sistema de cribado Intellicyt HTFC (Intellicyt). Los datos fueron analizados usando FlowJo (DeNovo), exportados a Excel (Microsoft) y representados en GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).
Resultados
QC funcional de la proteína recombinante PVRIGHH: La pureza de la proteína PVRIGHH se determinó mediante electroforesis capilar de microfluidos usando un sistema LabChip. En condiciones reductoras, la proteína recombinante migró a 80 kDa, en consistencia con su peso molecular calculado de 80,4 kDa, y mostró una pureza del 99% (datos no mostrados). En condiciones no reductoras, se observó un pico adicional que probablemente fuera consecuencia de la presencia de una forma dimérica de la proteína debida a la interacción Fc-Fc.
La integridad funcional de la proteína recombinante se determinó evaluando su unión a PVRL2 (un ligando conocido de PVRIG) en ELISA. Se observó una respuesta dependiente de dosis para la unión de PVRIGHH a PVRL2 (datos no mostrados). En comparación, no se observó unión para un control de Fc de IgG1 humana irrelevante. Considerado en conjunto, esto indica que la proteína recombinante PVRIGHH presenta una pureza elevada y es funcionalmente activa, y por tanto es adecuada para biopreparación.
QC de la proteína recombinante PVRIGHH biotinilada: La pureza de la proteína PVRIGHH biotinilada se determinó mediante electroforesis capilar de microfluidos usando un sistema LabChip. No se observaron diferencias significativas entre las proteínas no biotiniladas y biotiniladas (datos no mostrados). Cabe destacar que se observó un pico adicional de 44,3 kDa en la muestra de proteína biotinilada. Este pico puede ser resultado de la forma monomérica de la proteína PVRIGHH o quizá sea un artefacto de la reacción de parada del kit de biotinilación.
El éxito de la biotinilación se confirmó incubando la proteína biotinilada en una placa EIA recubierta de estreptavidina y detectando la proteína ligada usando un anticuerpo secundario anti-Fc de IgG1 human conjugado a HRP. La unión de la PVRIGHH biotinilada a la placa EIA recubierta de estreptavidina fue comparable a una proteína biotinilada irrelevante disponible comercialmente (datos no mostrados).
Preparación de fagos: La proteína PVRIGHH biotinilada se usó para preparación de fagos contra la biblioteca de presentación de fagos de anticuerpos fab humanos XOMA031 (XOMA Corporation, Berkeley, CA). Se llevaron a cabo tres rondas de biopreparación, en 4 combinaciones diferentes de severidad de lavado, concentración de antígeno y agotamiento de ligandos de Fc (sub-campañas A - D). El éxito de cada ronda se estimó usando los títulos de salida de fagos. Se usaron guías cualitativas para definir el éxito de las sub-campañas de preparación, tales como una reducción significativa de los títulos de fagos después de la ronda 1, un aumento o mantenimiento de los títulos de fagos después de las rondas 2 y 3, y una reducción de los títulos de fagos tras aumentar la severidad de lavado o disminuir la concentración de antígeno. Las 4 sub-campañas dieron como resultado títulos de fagos en el rango esperado, que fueron consistentes entre las sub-campañas (datos no mostrados).
Cribado de producción de fagos como fab PPEs: Se cribaron dos placas de 96 pocillos de clones fab (como PPEs) para cada una de las cuatro sub-campañas para evaluar el éxito de la biopreparación. Los resultados se resumen en la Tabla 3 y se discuten con más detalle a continuación. En general, las 4 sub-campañas dieron lugar a un número significativo de fabs específicos de PVRIGHH. Se identificaron un total de 49 fabs únicos específicos de diana. Las sub-campañas B y D mostraron las mayores tasas de aciertos en ELISAS y de correlación en FACS, y fueron seleccionadas para un cribado extendido.
Tabla 3: Resumen de cribado pilado de fab PPEs. Para cada sub-campañas, se presenta el número total de clones cribados, aciertos ELISA, aciertos FACS y unicidad de secuencia. Los marcos de lectura abiertos (ORFs) representan clones que fueron secuenciados con éxito como fab de longitud completa. La especificidad se basa en la falta de unión no específica a proteínas irrelevantes en ELISA. La correlación de FACS representa el porcentaje de aciertos ELISA que también fueron positivos en FACS (específicamente unidos a células HEK293 que sobre-expresan PVRIG).
Sub A Sub B Sub C Sub D Global Clones cribados 182 182 182 182 728 Positivos ELISA (>3 S/N) 48 51 44 68 211
Tasa aciertos ELISA 26% 28% 24% 37% 29% ORFs 36 (75%) 45 (88%) 35 (80%) 63 (93%) 179 (85%) Secuencias únicas 25 21 17 31 73 Diversidad 69% 47% 49% 49% 41% Especificidad por ELISA* 100% 100% 100% 100% 100% Ligandos FACS (>5 S/N) 14 17 14 24 49** Correlación FACS 56% 81% 82% 77% 67%
*No unión no específica a conjugados Fc irrelevantes o PVRL2; **35 HCs únicos, 14 hermanos.
Cribado de fab primario (ELISA): se cribaron dos placas de 96 pocillos (182 clones fab) de PPEs para cada sub­ campaña mediante ELISA contra la proteína recombinante PVRIGHH. Cabe destacar que, aunque se usó proteína biotinilada para la preparación, la versión no biotinilada se usó para el cribado ELISA, que evitó la detección de ligandos específicos de biotina o estreptavidina. Las 4 sub-campañas dieron como resultado tasas de acierto ELISA que oscilan entre 24 - 37% cuando el umbral para una señal “positiva” se fijó en una ratio de 3 para la unión específica a diana respecto a la señal de control de PPE blanco.
Fabs de cribado secundario (análisis de secuencia de ADN, ELISA y FACS): los clones positivos en ELISA fueron secuenciados para seleccionar fabs no redundantes. Se identificaron setenta y tres clones fab de secuencia única. 19 clones fueron únicos para la sub-campaña A, 13 clones fueron únicos para la sub-campaña B, 10 clones fueron únicos para la sub-campaña C, 18 clones fueron únicos para la sub-campaña D, mientras que los 23 clones restantes fueron compartidos entre las campañas. Los clones fab positivos en ELISA de secuencia única fueron re-expresados como PPEs y cribados en función de unión específica mediante FACS. Se identificó un total de 49 de 73 clones únicos como ligandos de ELISA y FACS específicos de PVRIG (siguiendo los criterios establecidos en 2.6.5). Los 49 ligandos FACS correspondieron a 35 anticuerpos con cadenas pesadas únicas y 14 hermanos que presentaban cadenas ligeras únicas, pero compartían la cadena pesada con uno de los clones únicos. En la Tabla 4 se presenta un resumen de datos de unión de FACS.
Los fabs de secuencia única también fueron evaluados para unión no específica. Todos los fab PPEs analizados se unieron a la proteína recombinantes PVRIGHH con una señal de ensayo mayor a 3 veces la del control de PPE blanco. En un ensayo paralelo, los fab PPEs fueron evaluados para determinar la unión a dos proteínas irrelevantes con la misma región Fc de IgG1, así como con la proteína recombinante PVRL2. Ninguno de los clones mostró una unión no específica significativa a los controles, lo que sugiere que los fabs seleccionados son específicos de PVRIG.
Tabla 4: resumen de unión de FACS correspondiente a PVRIG fabs. Todos los fabs positivos en ELISA únicos fueron analizados mediante FACS. Se midió la intensidad de fluorescencia media (MFI) para las células HEK293 que sobre­ expresan PVRIG, así como las células HEK293 no transfectadas. Se calculó la ratio de MFI correspondiente a unión específica de diana respecto a unión no a diana. Los clones con una ratio de MFI > 5 fueron seleccionados como aciertos y se presentan a continuación.
Clon fab Ratio de MFI Clon fab Ratio de MFI CPA.7.001 11 CPA.7.026 5,3
CPA.7.002 8,9 CPA.7.027 9,2
CPA.7.003 9,5 CPA.7.028 17
CPA.7.004 9,3 CPA.7.029 6,7
CPA.7.005 6,5 CPA.7.030 15
CPA.7.006 9,6 CPA.7.031 8,5
CPA.7.007 14 CPA.7.032 7,6
CPA.7.008 14 CPA.7.033 22
CPA.7.009 10 CPA.7.034 7,7
CPA.7.010 7,6 CPA.7.035 14
CPA.7.011 10 CPA.7.036 5
CPA.7.012 19 CPA.7.037 5,3
CPA.7.013 12 CPA.7.038 6,3
CPA.7.014 14 CPA.7.039 12
CPA.7.015 15 CPA.7.040 12
CPA.7.016 7,6 CPA.7.041 7,6
CPA.7.017 13 CPA.7.042 5,4
CPA.7.018 7,8 CPA.7.043 13
CPA.7.019 16 CPA.7.044 7,9
CPA.7.020 6,9 CPA.7.045 7,8
CPA.7.021 15 CPA.7.046 10
CPA.7.022 7,5 CPA.7.047 8,4
CPA.7.023 12 CPA.7.049 10
CPA.7.024 9,8 CPA.7.050 22
CPA.7.025 6
Reformateo de los fabs positivos de ELISA y FACS en hIgG1: Todos los ligandos ELISA y FACS únicos fueron reformateados para expresión como moléculas IgG1 humana en células Expi293. De los 49 anticuerpos originales, 44 fueron expresados con éxito como anticuerpos de longitud completa. Dichos anticuerpos reformateados fueron evaluados para determinar la retención de unión a células HEK293 que sobre-expresan PVRIG junto con control de isotipo de IgG1 humana irrelevante. Asimismo, todos los anticuerpos también fueron evaluados contra células HEK293 no transfectadas. Los resultados de unión resultantes fueron usados para demostrar la especificidad de los anticuerpos y también se representaron para calcular la constante de equilibrio de unión (KD). Nueve de los restantes 44 anticuerpos mostraron una unión débil o una unión no específica significativa. Los restantes 35 anticuerpos fueron seleccionados para un análisis adicional en ensayos funcionales basados en células. Las KD basadas en FACS de dichos anticuerpos se presentan en la Tabla 6. Los valores de KD oscilan entre 0,30 nM y 96 nM, con una media de 9,4 nM, lo que sugiere que la mayoría de los anticuerpos de la campaña de preparación son muy específicos y se unen a PVRIG con alta afinidad.
Tabla 5: Resumen de expresión y unión de anticuerpos reformateados. Todos los fabs positivos en ELISA y FACS únicos fueron reformateados en la cadena principal de IgG1 humana. Los valores KD de FACS se determinaron mediante valoración de dosis contra las células HEK293 que sobre-expresan PVRIG. La unión no a diana se determinó mediante valoración de dosis contra las células HEK293 no transfectadas.
Anticuerpo KD de FACS (nM) Anticuerpo KD de FACS (nM) CPA.7.001 No expresión CPA.7.026 No ligando CPA.7.002 44,35 CPA.7.027 No ligando CPA.7.003 Unión no específica CPA.7.028 7,14
CPA.7.004 21,71 CPA.7.029 Unión débil CPA.7.005 95,56 CPA.7.030 No expresión CPA.7.006 No expresión CPA.7.031 No ligando
CPA.7.007 0,73 CPA.7.032 8,78
CPA.7.008 No expresión CPA.7.033 12,8
CPA.7.009 33,00 CPA.7.034 14,2
CPA.7.010 21,89 CPA.7.035 No ligando CPA.7.011 66,02 CPA.7.036 6,0
CPA.7.012 0,30 CPA.7.037 Unión no específica CPA.7.013 No expresión CPA.7.038 20,26
CPA.7.014 2,04 CPA.7.039 3,76
CPA.7.015 1,34 CPA.7.040 0,79
CPA.7.016 22,02 CPA.7.041 52,2
CPA.7.017 1,82 CPA.7.042 24,26
CPA.7.018 9,29 CPA.7.043 13,2
CPA.7.019 0,45 CPA.7.044 9,4
CPA.7.020 86,97 CPA.7.045 3,73
CPA.7.021 11,22 CPA.7.046 Unión no específica
CPA.7.022 4,17 CPA.7.047 5,36
CPA.7.023 4,08 CPA.7.049 19,9
CPA.7.024 9,08 CPA.7.050 68,3
CPA.7.025 No ligando
Resumen y conclusiones
Se llevó a cabo una campaña de descubrimiento de anticuerpos de presentación de fagos para aislar ligandos contra la diana inmuno-oncológica PVRIG usando una versión marcada con Fc recombinante del antígeno. El análisis de control de calidad mostró que la preparación de antígenos fue pura y funcionalmente activa. El esfuerzo de preparación dio como resultado 49 clones fab únicos que se unieron específicamente a la diana PVRIG, tanto en forma de proteína recombinante como sobre la superficie celular. De éstos, 35 fueron producidos con éxito como anticuerpos IgG1 humanos y se demostró que retenían la unión específica a PVRIG. Este conjunto de anticuerpos mostró mayores afinidades en un ensayo de FACS, mostrando 18 de los 35 anticuerpos una unión con una KD < 10 nM.
Ejemplo 10. Demostración de la capacidad de los fabs anti-PVRIG humana para bloquear la interacción entre PVRIG y PVRL2 mediante ELISA.
Método: Se recubrió la PVRL2-His humana (Catálogo n° 2229-N2-050/CF, R&D Systems), sobre la placa ELISA. Se preincubaron extractos periplásmisos de Fab (PPEs), diluidos 1:1 en 5% de leche desnatada, con 1 pg/mL (concentración final) de la PVRIG-Fc humana, durante 15 minutos a RT. La mezcla fab-receptor se dejó unir a la PVRL2-His recubierta sobre la placa ELISA. Se evaluó la interacción PVRIG-Fc/PVRL2-His usando un anticuerpo anti-Fc humano, conjugado a HRP (Jackson Immuno Research catálogo n° 709-035-098). En ausencia de PPE (células negativas), era de esperar una fuerte señal positiva. Para los fabs bloqueantes, la señal se vería reducida significativamente. Los clones fab con una señal >5 veces inferior a la de los pocillos negativos (>80% de bloqueo) se podrían seleccionar como fabs bloqueantes.
Protocolo:
Se recubrieron placas ELISA (Costar 9018) con 50 pL de 2 pg/mL de antígeno y se almacenaron a 4°C durante una noche. Las placas recubiertas de antígeno fueron lavadas 3 veces con 1X PBS. La placa fue bloqueada con 200 pL de leche desnatada al 5% en PBS y se incubó 1 h a RT (temperatura ambiente). A continuación, la placa se lavó con 1X PB.
Tras añadir 50 pL/pocillo de PPEs de Fab (diluidos en leche desnatada al 5%), la placa fue preincubada con 1 pg/mL de PVRIG-Fc humana que se añadió a los respectivos pocilios. El control de “no fab” se llevó a cabo con 2 pocilios.
La placa se incubó 1 h a RT.
Las placas se lavaron 3 veces con 1X PBST y 3 veces con 1X PBS.
Tras añadir 50 pL/pocillo del anticuerpo secundario conjugado a HRP (Jackson Immuno Research, 709-035-098), diluido en leche al 5% en PBS, la placa se incubó 1 h a RT.
Las placas se lavaron 3 veces con 1X PBST y 3 veces con 1X PBS.
Tras añadir 50 pL/pocillo del sustrato de TMB y esperar hasta que el color se desarrollase, se detuvo la reacción añadiendo 50 pL/pocillo de H2SO42N. Se midió la absorbancia a 450 nm.
Resultados
La Figura 52 muestra los resultados de la evaluación de los anticuerpos anti-PVRIG para determinar su capacidad de bloquear al menos el 80% de la unión de PVRL2 a PVRIG. Como se muestra, un gran número de dichos anticuerpos fue capaz de bloquear con éxito al menos el 80% de la unión. Específicamente, los anticuerpos que bloquearon con éxito se designan como se indica a continuación:
CPA.7.001, CPA.7.003, CPA.7.004, CPA.7.006, CPA.7.008, CPA.7.009, CPA.7.010, CPA.7.011, CPA.7.012, CPA.7.013, CPA.7.014, CPA.7.015, CPA.7.017, CPA.7.018, CPA.7.019, CPA.7.021, CPA.7.022, CPA.7.023, CPA.7.024, CPA.7.033, CPA.7.034, CPA.7.036, CPA.7.040, CPA.7.046, CPA.7.047, CPA.7.049, CPA.7.050.
Ejemplo 11: Estudio de Resonancia de Plasmón Superficial del Contenedor de Epítopos de 37 anticuerpos IgG anti-PVRIG que se unen a la proteína de fusión PVRIG humana
Materiales y Métodos
Los experimentos se llevaron a cabo usando un instrumento ProteOn XPR 36 a 22°C con todas las muestras mantenidas a 4°C durante el experimento.
Etapa 1: Los siguientes mAbs anti-PVRIG fueron diluidos a ~10 pg/mL en acetato sódico 10 mM, pH 5,0, e inmovilizados covalentemente en puntos independientes de un chip biosensor ProteOn GLC usando acoplamiento de aminas estándar:
CPA.7.002 CPA.7.017 CPA.7.033
CPA.7.003 CPA.7.018 CPA.7.034
CPA.7.004 CPA.7.019 CPA.7.036
CPA.7.005 CPA.7.020 CPA.7.037
CPA.7.007 CPA.7.021 CPA.7.038
CPA.7.009 CPA.7.022 CPA.7.039
CPA.7.010 CPA.7.023 CPA.7.040
CPA.7.011 CPA.7.024 CPA.7.043
CPA.7.012 CPA.7.026 CPA.7.045
CPA.7.014 CPA.7.028 CPA.7.046
CPA.7.015 CPA.7.029 CPA.7.047
CPA.7.016 CPA.7.032 CPA.7.050
La etapa de activación se produjo en la dirección de flujo horizontal durante cinco minutos, mientras que la etapa de inmovilización se produjo en la dirección de flujo vertical. Los mAbs fueron inyectados durante cuatro minutos después de la activación de la superficie. La etapa de bloqueo tuvo lugar tanto en la posición vertical como en la horizontal, cinco minutos en cada, de tal modo que los “interpuntos” horizontales pudieran usarse como superficies de referencia. Los mAbs fueron inmovilizados en un rango de ~450RU-5000RU. También se agrupó un mAb adicional CPA.7.041 en este estudio, pero solo como analito en disolución. Ver más adelante.
Etapa 2: Experimentos preliminares implicaron varios ciclos de inyección de antígeno PVRIG ~20 nM (PVRIGHH-2-1-1 n°448, GenScript) sobre todos los mAbs inmovilizados durante tres minutos con un caudal de 25 pL/min seguido de regeneración con un pulso de 30 segundos de glicina-HCl 10 mM, a pH 2,0 o pH 2,5, dependiendo de la fila horizontal de mAbs en el sistema de chip GLC. Las muestras de antígeno fueron preparadas en tampón de elución PBST desgasificado (PBS con un 0,05% de Tween 20) con 100 pg/mL de BSA. Estos experimentos preliminares demostraron que los clones CPA.7.026 y CPA.7.029 no se unieron al antígeno y por lo tanto no se incluyeron en el contenedor. Los mAbs restantes del sistema ProteOn mostraron una unión reproducible al antígeno.
Etapa 3: Se llevó a cabo un protocolo de agolpamiento de epítopos de “pre-mezcla” debido a la bivalencia del antígeno de PVRIG de fusión-fc. En dicho protocolo, cada mAb enumerado en la Etapa 1, más el mAb CPA.7.041, fue pre­ mezclado con antígeno PVRIG y a continuación inyectado durante tres minutos sobre todos los mAbs inmovilizados. La concentración molar en el sitio de unión de cada mAb estaba en exceso respecto a la concentración molar de antígeno en el sitio de unión. La concentración final en el sitio de unión de cada mAb fue ~400 nM y la concentración final de antígeno en el sitio de unión fue ~20 nM. Se llevó a cabo un ciclo de control de solo antígeno después de cada ocho ciclos de inyección de mAb para monitorizar la actividad de los mAbs inmovilizados a lo largo del experimento. También se llevaron a cabo inyección de blanco con tampón después de aproximadamente cada ocho ciclos de inyección de mAb para una doble referencia. Los controles adicionales incluyeron cada mAb inyectado solo sobre todos los mAbs inmovilizados en concentraciones idénticas a las de los ciclos de inyección de pre-mezcla. Todas las superficies fueron regeneradas con un pulso de 30 s de glicina-HCl 10 mM a pH 2,0 o pH 2,5, dependiendo de qué fila de mAbs del sistema se estuviera regenerando, y todos los ciclos fueron eluídos con un caudal de 25 pL/min. Las muestras de mAb y antígeno se prepararon en tampón de elución PBST desgasificado con 100 pg/mL de BSA.
Etapa 4: Los datos de sensograma fueron procesados y referenciados usando ProteOn Manager Versión 3.1.0.6 usando interpuntos y blancos de tampón para doble referencia. Las inyecciones de control solo de mAb fueron usadas como referencias de inyección, donde se observó una unión significativa con las inyecciones de solo mAb. Un par de anticuerpo era clasificado como que tenía un epítopo de unión de antígeno compartido (designado como un “0” rojo en la matriz de la Figura 43) si no se observaba unión de la inyección de mAb y antígeno mixtos sobre el mAb inmovilizado, o si la unión se veía reducida significativamente en comparación con la inyección de control de solo antígeno sobre el mismo mAb inmovilizado. Un par de anticuerpo era clasificado como unión a diferentes epítopos de antígeno, o “que forma un sándwich” con el antígeno (designado como “1” verde en la matriz de la Figura 43) si la inyección de mAb y antígeno mixtos mostraba una unión al mAb inmovilizado similar o mayor a la del control de solo antígeno sobre el mismo mAb inmovilizado.
Etapa 5: El patrón de bloqueo para el mAb CPA.7.041 (n°37) se estudió solo como un analito porque el sistema de chip GLC solo tiene 36 posiciones. Por tanto, por consistencia, el agrupamiento jerárquico de los patrones de unión de la matriz binaria para cada mAb pre-mezclado con antígeno (patrones verticales de la Figura 42) se llevó a cabo usando el software JMP versión 11.0.0. Los patrones de bloqueo de los mAbs inmovilizados (patrones horizontales de la Figura 42) también fueron agrupados a modo de comparación con los patrones de bloqueo de los mAbs pre­ mezclados en disolución (datos no mostrados, ver el apartado de Resultados para una discusión).
Resultados: La Figura 42 muestra la matriz binaria de bloqueo (“0”) o formación de sándwich (“1”) entre cada par de mAb, donde los mAbs se presentan en idéntico orden tanto verticalmente (mAbs sobre la superficie - “ ligandos”) como horizontalmente (mAbs en disolución - “analitos”). Los “contenedores” idénticos de patrones de bloqueo para todos los mAbs como analitos están destacados en la Figura 42 con un recuadro negro alrededor de cada grupo de patrones verticales similares. La Figura 43 muestra el dendograma de los patrones de bloqueo verticales (analito) de la matriz de la Figura 42. Para la definición más estricta de “contenedor” de epítopos, donde solo técnicamente se incluyen juntos los mAbs que muestran patrones de bloqueo idénticos, existen un total de 4 contenedores discretos. Específicamente, 33 de los 35 mAbs que fueron agrupados comprenden dos contenedores donde la única diferencia entre dichos dos contenedores es si un mAb forma un sándwich (Contenedor 2, ver Figura 42 y Figura 43) o bloquea (Contenedor 1, ver Figura 42 y Figura 43) la unión a CPA.7.039. Esto significa que la CPA.7.039 está en su propio contenedor separado. El cuarto contenedor consiste solo en el mAb CPA.7.050 que es incapaz de bloquear la unión a antígeno de ninguno de los otros 34 mAbs. La agrupación jerárquica de los patrones de bloqueo de los mAbs como ligandos (patrones horizontales de la Figura 42) mostró el mAb CPA.7.016 que forma un sándwich con el antígeno y mAb CPA.7.039, mientras que como analito bloquea la unión a antígeno al CPA.7.039 inmovilizado. Por tanto, el clon CPA.7.016 se ubicaría en el contenedor 2 más que en el contenedor 1. Los mAbs de cada contenedor se enumeran en la Figura 43. Los datos de sensograma procesados representativos de cada contenedor se muestran en la Figura 44 a la Figura 47.
Resumen: 35 mAbs IgG anti-PVRIG fueron agrupados en contenedores usando SPR según sus patrones de bloqueo por pares con PVRIG humana de fusión fc. Según la definición más estricta de contenedor de epítopos, hay un total de cuatro contenedores discretos. 33 de los 35 mAbs comprenden dos contenedores que difieren solo en si sus respectivos componentes mAbs bloquean o forma un sándwich de antígeno con el clon c Pa .7.039.
Ejemplo 12. Cribado cinético de Resonancia de Plasmón Superficial de 50 fabs anti-PVRIG humana preparados en extractos periplásmicos
Materiales y Métodos
Todos los experimentos fueron llevados a cabo usando un instrumento Biacore 3000 y un instrumento ProteOn XPR 36 a 22°C.
Etapa 1: La concentración molar de los 52 fabs del sobrenadante de extracto periplásmico fueron cuantificados usando un instrumento Biacore 3000 a 22°C. Cada fab fue diluido 20 veces y a continuación se inyectó durante 2 minutos a 5 pL/min en superficies de fab anti-humano de alta densidad (GE Healthcare 28-9583-25) preparadas usando acoplamiento de aminas estándar con un chip Biacore CM5 (GE Healthcare). A continuación, se inyectó un fab humano a una concentración conocida (Bethyl P80-115) sobre la superficie anti-fab con las mismas condiciones que los sobrenadantes de fab. Las muestras se prepararon en el tampón de elución que fue HBSP desgasificado (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, 0,005% de P20, pH 7,4) añadiendo BSA al 0,01%. Se ajustaron las pendientes de asociación de cada sensograma SPR de cada sobrenadante de fab contra la pendiente de asociación SPR del fab humano estándar de concentración conocida usando el software CLAMP 3.40 para estimar las concentraciones molares de cada fab en el sobrenadante.
Etapa 2: Se preparó una superficie de anticuerpo policlonal fc anti-humano de cabra de alta densidad (Invitrogen H10500) usando acoplamiento de aminas estándar en dos calles de un chip GLC usando un biosensor ProteOn XPR 36. Se preparó una superficie de anticuerpo policlonal fc anti-ratón de alta densidad (GE Healthcare BR-1008-38) usando acoplamiento de aminas estándar sobre dos calles diferentes del mismo chip GLC. Las etapas de activación y bloqueo para las cuatro superficies de captura se produjeron en la dirección de flujo vertical. Cada fab del sobrenadante fue inyectado entonces a tres concentraciones sobre PVRIG human de fusión fc (PVRIG-HH-2-1-1 n° 448, GenScript) y la PVRIG de ratón de fusión fc (PVRIG-MM-2-1-1 n° 198, GenScript) que fueron capturados en una superficie de fc anti-humana de alta densidad y una superficie de fc anti-ratón (respectivamente) con una media de ~200RU y ~290RU por ciclo, respectivamente. Cada serie de concentración de fab se inyectó durante dos minutos seguido de 10 minutos de disociación a un caudal de 50 pL/min. El rango de concentraciones de partida (como se determina en la Etapa 1) fue de ~20nM - ~400nM con dos diluciones de tres veces de la mayor concentración para cada fab. Los fabs fueron diluidos en el tampón de elución que fue PBS desgasificado con un 0,05% de Tween 20 y un 0,01% de BSA añadidos. Las superficies de captura de fc anti-humanas fueron regeneradas con dos pulsos de 30 segundos de ácido fosfórico 146 mM después de cada ciclo y las superficies de fc anti-ratón fueron regeneradas con dos pulsos de 30 segundos de glicina 10 mM, pH 1,7, después de cada ciclo.
Etapa 3: Los datos de sensograma de fabs den la unión de sobrenadante a PVRIG capturada fueron procesados y doblemente referenciados usando el ProteOn Manager versión 3.1.0.6. Los sensogramas fueron doblemente referenciados usando las correspondientes superficies de captura anti-especies sin PVRIG capturada como valores de referencia y una inyección de blanco sobre la PVRIG capturada en condiciones idénticas a las inyecciones de los fabs. Cuando fue posible, los sensogramas de las tres concentraciones diferentes de cada fab fueron ajustados entonces globalmente a un modelo cinético 1:1 (con un término para el transporte de materia) para estimar las constantes de velocidad de asociación y disociación. Los sensogramas que no mostraron una unión 1:1 sencilla no fueron ajustados al modelo cinético y por lo tanto no se les asignaron estimaciones de ka y kd.
Resultados
Ninguno de los fabs incluidos en este estudio mostró actividad de unión a PVRIG de ratón (datos no mostrados). Los sensogramas de 17 de los 50 fabs cribados contra PVRIG humana pudieron ser ajustados para obtener estimaciones fiables de sus constantes cinéticas. Veintiocho clones mostraron cinéticas complejas, cinco de los fabs no mostraron ninguna unión a la proteína de fusión de PVRIG humana capturada (CPA.7.025, CpA.7.026, CPA.7.027, CPA.7.029, CPA.7.035) y un clon (CPA.7.035) no mostró título cuando se realizó la determinación de concentración de la Etapa 1. Las constantes cinéticas y sus correspondientes sensogramas se muestran más adelante en la Figura 49 y la Figura 50. Los clones enumerados a continuación mostraron cinéticas complejas. La Figura 51 muestra algunos ejemplos de estos datos.
CPA.7.001 CPA.7.006 CPA.7.013 CPA.7.045
CPA.7.030 CPA.7.036 CPA.7.014 CPA.7.046
CPA.7.031 CPA.7.037 CPA.7.041 CPA.7.017
CPA.7.032 CPA.7.009 CPA.7.042 CPA.7.018
CPA.7.033 CPA.7.038 CPA.7.043 CPA.7.047
CPA.7.034 CPA.7.039 CPA.7.016 CPA.7.023
CPA.7.003 CPA.7.011 CPA.7.044 CPA.7.024
Ejemplo 13: Medida de la afinidad de unión del clon de IgG CPA.7.021 a PVRIG expresada en células HEK usando citometría de flujo
Materiales y Métodos
Se usó citometría de flujo para medir la afinidad de la unión de IgG CPA.7.021 a PVRIG humana expresada sobre células HEK 293. Se añadió CPA.7.021 conjugado con Alexa 647 por duplicado en un rango de concentración de sitio de unión de 3 pM - 101 nM en una dilución en serie 2 a 1, a un número constante de células (100.000 células/pocillo) en 17 pocillos de una placa de 96 pocillos. Un pocillo contenía células sin ninguna IgG añadida, para servir como pocillo de blanco. Las células fueron equilibradas durante 4 horas con IgG a 4°C. Las células fueron lavadas dos veces y a continuación se registró la Intensidad de Fluorescencia Media (MFI) de aproximadamente 10.000 “eventos” usando un citómetro de flujo Intellicyte. Los valores MFI resultantes en función de la concentración en el sitio de unión de IgG CPA.7.021 se muestran a continuación. La KD de la unión de CPA.7.021 a células HEK 293 que expresan PVRIG human se estimó mediante un ajuste de la curva de MFI frente a concentración de sitio de unión de IgG con un modelo de equilibrio 1:1, como se detalla en Drake y Klakamp, Journal of lmmunol Methods, 318 (2007) 147-152.
Resultados: La IgG CPA.7.021 marcada con Alexa 647 fue valorada con células HEK 293 que expresan PVRIG humana y se midió la señal de unión usando citometría de flujo. La isoterma de unión resultante, que muestra el MFI por duplicado frente a la concentración en el sitio de unión del CPA.7.021, se presenta a continuación. La línea roja es un ajuste de equilibrio 1:1 de la curva que permite una estimación de KD de 2,5 nM ± 0,5 nM (intervalo de confianza al 95% del ajuste, N=1).
Ejemplo 14: Efecto del bloqueo (KD) de PVRIG y anticuerpo anti-PVRIG sobre la función de TILs específicos de melanoma humano
El objetivo de estos ensayos es evaluar la capacidad funcional de la PVRIG en TILs derivados de humano, medida a través de marcadores de activación y de la secreción de citoquinas, tras co-cultivo con células diana de melanoma. Se usó PD1 como punto de control inmune de comparación para los estudios de bloqueo (siARN). Se evaluó el efecto del anticuerpo anti-PVRIG (CPA.7.21), que se ha demostrado que bloquea la interacción de PVRIG y PVRL2, solo o en combinación con otros anticuerpos (p.ej., un TIGIT, DNAM1).
Materiales y Métodos
TILs
Linfocitos infiltrantes tumorales (TILs) de tres pacientes de melanoma:
• TIL-412- HLA-A2-Mart1 específico
• TIL-F4- HLA-A2-gp100 específico
• TIL-209- HLA-A2-gp100 específico
Los TILs fueron descongelados en medio IMDM completo (BI, 01-058-1A) suplementado con un 10% de suero humano (Sigma, H3667) 1% de glutamax (Life technologies, 35050-038) 1% de Na-Piruvato (Biological Industries, 03-042-1B) 1% de aminoácidos no esenciales (Biological Industries, 01-340-1B) 1% de Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B) 300 U/mL de rhIL2 (Biolegend, 509129).
Líneas celulares tumorales: Células de melanoma humano Mel-624 que expresan los antígenos MART-1 y gp-100 en el contexto de haplotipo de MHC-I HLA-A2. Las células fueron cultivadas en medio DMEM completo (Biological Industries, 01-055-1A) suplementado con 10% de FBS (BI, 04-127-1A), tampón HEPES 25 mM (BI, 03-025-1B), 1% de glutamax (Life technologies, 35050-038), y 1% de Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B).
Bloqueo en TILs: El bloqueo (KD) de PVRIG humana y PD1 humana en TILs se realizó usando 100 pmol de Dharmacon ON-TARGETplus siARN de PVRIG humana - SMARTpool (L-032703-02) o siARN de PD1 humana -SMARTpool (L-004435) o siARN no diana (D-001810-01-05). El siARN fue electroporado a TILs (AMAXA, programa X-005). La electroporación se realizó en TILs en reposo cultivadas en IMDM completo suplementado con IL-2 24 h después de la descongelación. Tras la electroporación, las TILs fueron sembradas en placas TC de 96 pocillos para recuperar durante 24 h. Después de 24 h, las células fueron recolectada y teñidas con colorante de viabilidad (BD Horizon; Cat n° 562247, BD biosciences), se lavaron con PBS y se tiñeron con CPA.7.021 anti-PVRIG humana (CPA.7.021 IgG2 A647, 7,5 pg/mL) con anti-PD-1 humana (Biolegend, n° 329910 AF647, 5 pg/mL) a temperatura ambiente durante 30 minutos. Los controles de isotipo usados son synagis (IgG2 A647, 7,5 pg/mL) e IgG1 de ratón (Biolegend n° 400130 A647, 5 pg/mL), respectivamente. Todas las muestras fueron analizadas en un analizador MACSQuant (Miltenyi) y los datos fueron analizados usando el software FlowJo (v. 10.0.8).
Co-cultivo de TILs con células de melanoma 624: TILs electroporados con siARN fueron recolectados y sembrados en una placa TC 96 5x104/pocillo. Las células Mel-624 también fueron recolectadas y sembradas en co-cultivo con ratios E:T de 1:1 / 1:3. La placa se incubó durante una noche (18h) a 37°C con un 5% de CO2.
Para determinar el efecto del anticuerpo anti-PVRIG (CPA.7.021), anti-TIGIT (clon 10A7) y anti-DNAM1 (clon DX11) sobre la actividad de TIL específica de melanoma, se pre-incubaron TILs (1x105 células/pocillo) con anticuerpos evaluados o controles de isotipo relevantes en mono-tratamiento (10 pg/mL) o en tratamiento de combinación (final 10 pg/mL para cada uno) antes de la adición de células diana de melanoma 624 con una ratio efector:diana (E:T) de 1:1. La placa se incubó durante una noche (18h) a 37°C con un 5% de CO2.
Determinación de la activación de TILs: 16 h post co-cultivo, las células fueron teñidas con colorante de viabilidad (BD Horizon; Cat n° 562247, BD biosciences), lavadas con BPS y expuestas a disolución bloqueante de Fc (cat n° 309804, Biolegend), seguido de tinción superficial con anti-CD8a (Cat n° 301048, Biolegend) y anti-CD137 (Cat n° 309804, Biolegend) a 4°C durante 30 min. Todas las muestras fueron analizadas en un analizador MACSQuant (Miltenyi) y los datos se analizaron usando el software FlowJo (v10.0.8). Los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados y analizados para determinar la secreción de citoquinas mediante el kit CBA (cat n° 560484, BD).
Resultados
Bloqueo de PVRIG en TILs: se cultivaron TIL MART-1 y TIL F4 24 h con IL-2. Se electroporaron a TILs (AMAXA, programa X-005) 100 pmol de ON-TARGETplus siARN de PVRIG humana - SMARTpool (L-032703-02) o siARN de PD1 humana - SMARTpool (L-004435) o siARN no diana (D-001810-01-05). La detección de PVRIG o de PD-1 se llevó a cabo 24 h después de la electroporación (y antes del co-cultivo). Las células fueron teñidas con colorante de viabilidad seguido de 30 min de incubación RT con anti-PVRIG y anti-PD-1. El porcentaje de población KD se indica en la Figura 82.
Ensayos funcionales con TILs bloqueados: Los TILs humanos, cultivados durante 24 horas con IL2 fueron electroporados con siARN que codifica para PVRIG o PD-1 humanas o con secuencia mezclada como control. Los TILs fueron evaluados para expresión de PVRIG o PD-1 24 horas después de la electroporación. Se observó ~80% de bloqueo de PVRIG y ~50% de bloqueo de PD-1 en comparación con los TILs electroporados con mezcla (Figura 82).
Los TILs KD fueron cultivados con células Mel-624 con una ratio E:T de 1:1 o 1:3 durante 18 h y se tiñeron para la expresión de CD137. Se observaron niveles elevados de marcador de activación CD137 en TIL MART-1 electroporados con siARN de PVRIG, de forma similar a TILs que fueron electroporados con siARN de PD-1, en comparación con siARN mezclado de control (Figura 83A). Se recolectó el sobrenadante de co-cultivo y se evaluó para determinar la presencia de citoquinas secretadas. Los TILs que fueron electroporados con siARN de PVRIG muestran un aumento significativo de los niveles de IFNy y TNF en comparación con el siARN SCR de control. Se observó un efecto similar en los TILs que fueron electroporados con siARN de PD-1 (Figura 83B-C).
Se observó la misma tendencia de aumento de los niveles de activación en TIL F4. El co-cultivo de TIL F4 electroporado con siARN de PVRIG con células Mel-624 a una E:T de 1:3 dio lugar a un aumento de los niveles de expresión superficial de CD137 (Figura 84A), así como a un aumento de la secreción de IFNy en el sobrenadante del co-cultivo (Figura 84B). Se observó una tendencia similar con los TlLs que fueron electroporados con siARN de PD-1.
Ensayo funcional usando Abs de bloqueo:
Monoterapia y terapia de combinación in vitro de anti-PVRIG y anti-TIGIT: Se cultivaron TILs 209 con células Mel-624 a una E:T de 1:1 durante 18h. Se recolectó el sobrenadante de co-cultivo y se evaluó para determinar la presencia de citoquinas secretadas. El tratamiento con anti-TIGIT no afectó a los niveles de secreción de IFNy o TNF. Sin embargo, se observó un aumento de los niveles de IFNy y TNF cuando se añadió anti-TIGIT y anti-PVRIG al co-cultivo en combinación (Figura 85A-B).
Monoterapia y terapia de combinación in vitro de anti-PVRIG y anti-TIGIT: Se cultivaron TILs 209 con células Mel-624 a una E:T de 1:1 durante 18h. Los TILs fueron teñidos para expresión superficial de marcador de activación CD137 y mostraron un nivel reducido de expresión tras tratamiento con anti-DNAM1. Se recolectó el sobrenadante de co-cultivo y se evaluó para determinar la presencia de citoquinas secretadas. El tratamiento con anti-DNAM-1 medió una tendencia de aumento de las citoquinas secretadas IFNy y TNF. El tratamiento con la combinación de anti-DNAM-1 y anti-PVRIG revertió parcialmente el efecto sobre la expresión de CD137 (Figura 86C) y potenció el efecto sobre la secreción de citoquinas IFNy y TNF (Figura 5A-B). Se cultivó TILs MAr T-1 con células Mel-624 a una E:T de 1:1 durante 18h. Se recolectó el sobrenadante de co-cultivo y se evaluó para determinar la presencia de citoquinas secretadas. El tratamiento con anti-DNAM-1 redujo la expresión superficial de CD137 en TILs y también redujo las citoquinas secretadas IFNy y TNF. El tratamiento con la combinación de anti-DNAM-1 y anti-PVRIG revertió parcialmente estos efectos (Figura 86D-F).
Resumen y conclusiones
El bloqueo KD de PD1 mejoró la actividad de TIL, medida a través de la secreción de IFNy y TNF en TILs F4 y MART-1. Se observó un aumento (~20%) de la secreción de IFNy y TNF tras el KD de PVRIG en TILs MART-1 en comparación con el siARN de control. Se observó la misma tendencia en la expresión de CD137 tras co-cultivo con células de melanoma 624 en TILs F4.
El tratamiento de anti-TIGIT no afectó a los niveles de secreción de IFNy o TNF de TILs co-cultivados con Mels 624, sin embargo, se observó un aumento de los niveles de IFNy y TNF cuando se añadió anti-TIGIT y anti-PVRIG (CPA.7.021) al co-cultivo en combinación.
El tratamiento con anti-DNAM-1 redujo la activación de TIL-MART-1, manifestado a través de la reducción de la secreción de CD137 y citoquinas, y el anti-PVRIG (CPA.7.21) pudo revertir parcialmente este efecto en el tratamiento de combinación con Ab DNAM-1. En TIL 209, los niveles de secreción de IFNy y TNF se elevaron ligeramente (~10%) con anti-DNAM-1, y se observó un aumento de los niveles de IFNy y TNF (~40% y 30%, respectivamente) cuando se añadieron anti-DNAM1 y anti-PVRIG (CPA.7.021) al co-cultivo en combinación. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la PVRIG es un nuevo receptor co-inhibidor para PVRL2.
Ejemplo 15: Efecto del anticuerpo anti-PVRIG en la función de TILs específicos de melanoma humano en combinación con anticuerpos anti-TIGIT y anti-PD1
Materiales y Métodos
TILs: Linfocitos infiltrantes tumorales (TILs) de tres pacientes de melanoma:
• TIL-412- HLA-A2-Mart1 específico
• TIL-F4- HLA-A2-gp100 específico
• TIL-209- HLA-A2-gp100 específico
Los TILs fueron descongelados en medio IMDM completo (BI, 01-058-1A) suplementado con un 10% de suero humano (Sigma, H3667) 1% de glutamax (Life technologies, 35050-038) 1% de Na-Piruvato (Biological Industries, 03-042-1B) 1% de aminoácidos no esenciales (Biological Industries, 01-340-1B) 1% de Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B) 300 U/mL de rhIL2 (Biolegend, 509129).
Líneas celulares tumorales: Células de melanoma humano Mel-624 que expresan los antígenos MART-1 y gp-100 en el contexto de haplotipo de MHC-I HLA-A2. Las células fueron cultivadas en medio DMEM completo (Biological Industries, 01-055-1A) suplementado con 10% de FBS (BI, 04-127-1A), tampón HEPES 25 mM (BI, 03-025-1B), 1% de glutamax (Life technologies, 35050-038), y 1% de Pen-Strep (Biological Industries, 03-031-1B).
Co-cultivo de TILs con células de melanoma 624 en presencia de anticuerpos bloqueantes anti-PVRIG, anti-TIGIT y PD1: Para determinar el efecto del anticuerpo anti-PVRIG (CPA.7.021), anti-TIGIT (clon 10A7) y anti-PD1 (mAb 1B8, Merck) sobre la actividad de TIL específica de melanoma, se pre-incubaron TILs (3x104 células/pocillo) con anticuerpos evaluados o controles de isotipo relevantes en mono-tratamiento (10 pg/mL) o en tratamiento de combinación (final 10 |jg/ml_ para cada uno) antes de la adición de células diana de melanoma 624 con una ratio efector:diana (E:T) de 1:3. La placa se incubó durante una noche (18h) a 37°C con un 5% de CO2.
Determinación de la activación de TILs: Los sobrenadantes de cultivo fueron recolectados y analizados para determinar la secreción de citoquinas mediante el kit CBA (cat n° 560484, BD).
Monoterapia in vitro de anti-PVRIG y terapia de combinación de anticuerpos anti-TIGIT y anti-PD1: Se cultivaron TILs F4 (específicos de gp100) con células Mel-624 a una E:T de 1:3 durante 18h. Se recolectó el sobrenadante de co­ cultivo y se evaluó para determinar la presencia de citoquinas secretadas. El tratamiento con anti-TIGIT o anti-PD1 no afectó a los niveles de secreción de IFNy o TNF. Sin embargo, se observó un aumento de los niveles de IFNy y TNF cuando se añadió anti-TIGIT o anti-PD1 en combinación con anti-PVRIG al co-cultivo en combinación (Figura 87A-B).
El tratamiento de anti-PVRIG, anti-TIGIT y PD1 solo no afectaron a los niveles de secreción de IFNy o TNF del co­ cultivo de TILs con Mels 624, sin embargo, se observó un aumento de los niveles de IFNy y TNF cuando los anticuerpos anti-TIGIT y anti-PD1 fueron añadidos en combinación con anti-PVRIG (CPA.7.021). Los datos presentados sugieren que existe un efecto sinérgico para la terapia de combinación con anticuerpos anti-TIGIT o anti-PD1.
Ejemplo 16: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG sobre la señalización TCR usando un ensayo génico informador
Se usa un sistema de ensayo informador para señalización de TCR, tal como la línea celular Jurkat-NFAT-Luc, para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la señalización mediada por TCR. Esta línea celular Jurkat derivada expresa el gen indicador de luciferasa bajo el control del elemento de respuesta NFAT. Estas células son transfectadas con un vector que codifica PVRIG humana de longitud completa. Como control negativo, se usan células transfectadas con vector vacío. Los transfectantes con vectores que codifican para moléculas de referencia coestimuladoras o coinhibidoras, tal como CD28 y PD-1, sirven como control positivo. Los transfectantes son estimulados mediante la adición de anti-CD3 humano (p.ej., OKT3) en ausencia o en presencia de anticuerpos anti-PVRIG. El control de isotipo sirve como control negativo. Los anticuerpos funcionales conocidos contra las moléculas de referencia sirven como controles positivos. Es de esperar que un anticuerpo reticulante agonístico funcional muestre un efecto inhibidor sobre la actividad de luciferasa.
Ejemplo 17: Efecto de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T usando PVRL2-Fc
Se usó un ensayo ligado a placa para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T, la proliferación y la secreción de citoquinas. Se estimularon células T en bruto humanas purificadas usando 1 jg/mL de anti-CD3 humano ligado a placa (p.ej., OKT3) y 5 jg/m L de PVRL2-Fc (proteína fusionada recombinante compuesta del ECD de PVRL2, la contrapartida de PVRIG) o control negativo. La activación de células T se evalúa a través de la expresión de marcadores de activación, p.ej., CD137, o mediante división celular evaluada a través de la dilución de colorante CFSE (las células T son marcadas con CFSE antes de su estimulación). También se determina la producción de citoquinas (p.ej., IFNg, IL-2) como lectura adicional de la activación de células T. Se usan los marcadores de subtipo de células T para distinguir los efectos específicos sobre las células T CD4 o CD8. La PVRL2-Fc co-inmovilizada podría presentar un efecto estimulador basal sobre la activación de células T, mediado a través de DNAM1 endógena - un receptor de contrapartida coestimulador conocido de PVRL2 en células T. En presencia de Abs anti-PVRIG, este efecto basal estimulador de PVRL2-Fc es de esperar que se vea potenciado adicionalmente, debido a su bloqueo de la influencia inhibidora de la PVRIG endógena sobre la activación de células T. Por consiguiente, es de esperar que los Abs anti-PVRIG muestren inhibición de la activación de células T.
Ejemplo 18: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T usando células ectópicas que expresan PVRL2.
Se usa un ensayo basado en células para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T, la proliferación y la secreción de citoquinas. Se estimulan células T CD4 o CD8 en bruto humanas purificadas mediante co-cultivo con células estimuladoras CHO (células CHO que expresan anti-CD3 ligado a membrana) que expresan ectópicamente PVRL2 o vector vacío. Se evalúa la activación de células T mediante la expresión de marcadores de activación, p.ej., CD137, o mediante división celular evaluada a través de la dilución de colorante CFSE (las células T son marcadas con CFSE antes de su estimulación). También se determina la producción de citoquinas (p.ej., IFNy, IL-2) como lectura adicional de la activación de células T. Se usan los marcadores de subtipo de células T para distinguir los efectos específicos sobre las células T CD4 o CD8. Es de esperar que los estimuladores CHO que expresan PVRL2 presenten un efecto estimulador ejemplo 19 basal sobre la activación de células T, mediado a través de DNAM1 endógena - un receptor de contrapartida coestimulador conocido de PVRL2 en células T. En presencia de Abs antagonísticos anti-PVRIG, este efecto basal estimulador de PVRL2 expresada superficialmente es de esperar que se vea potenciado adicionalmente, debido a su bloqueo de la influencia inhibidora de la PVRIG endógena sobre la activación de células T. Por consiguiente, es de esperar que los Abs anti-PVRIG agonísticos muestren inhibición de la activación de células T.
Ejemplo 20: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T usando el ensayo SEB Los anticuerpos anti-PVRIG son evaluados para determinar su efecto sobre la actividad de células T usando células sanguíneas de voluntarios sanos y el superantígeno SEB (enterotoxina B de Staphylococcus) para enfrentar y activar todas las células T que expresan la cadena de receptor de células T Vp3 y Vp8. Se cultivan PBMCs humanas en placas de fondo redondo de 96 pocillos y se pre-incuban durante 30-60 minutos con los anticuerpos evaluados. A continuación se añade SEB en diferentes concentraciones, que oscilan entre 10 ng/mL y 10 pg/mL. Se recogen los sobrenadantes después de 2 a 4 días de cultivo y la cantidad de citoquinas producidas (p.ej., IL-2, IFNy) se cuantifica mediante ELISA o usando un kit CBA estándar. La SEB estimula la producción de citoquinas por parte de las células sanguíneas enteras de un modo dependiente de la dosis. El efecto de los mAbs anti-PVRIG sobre la producción de citoquinas es evaluados para varias dosis de Ab. Es de esperar que los mAbs anti-PVRIG bloqueantes potencien la producción de IL-2 sobre el control de IgG. Además de IL-2, en este ensayo se puede evaluar el efecto de los Abs sobre los niveles de otras citoquinas, tal como TNFa, IL-17, IL-7, IL-6 e IFNy, usando un kit CBA.
Ejemplo 21: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG en ensayos específicos de Ag
Un ensayo usado para obtener el perfil del efecto funcional de los anticuerpos anti-PVRIG humana sobre la estimulación específica de Ag de células T de memoria pre-existentes en sangre de donante sano es el ensayo de toxoide del tétanos (TT). Para este fin, se llevan a placa PBMC recién preparadas (2 x 105 células) en placas de fondo redondo de 96 pocillos en medio RPMI 1640 completo (que contiene un 5% de suero humano inactivado térmicamente), se pre-incuban con los anticuerpos evaluados a concentración variable y se estimulan con TT (Astarte Biologics) en una concentración de 100 ng/mL. Las células son incubadas durante 3-7 días a 37°C, tras lo cual se recolectan los sobrenadantes. Se determinan las concentraciones de citoquinas (p.ej., IL-2, IFN-y) mediante ELISA y/o kit CBA. Es de esperar que los Abs anti-PVRIG bloqueantes potencien la proliferación de células T y la producción de citoquinas en comparación con los resultados obtenidos solo con el antígeno TT.
De forma similar al método descrito anteriormente, que usa TT para estimular células T de memoria humanas, podemos evaluar el efecto de Abs anti-PVRIG sobre la activación de células T tras respuestas de recuerdo a antígenos adicionales, tal como CMV, EBV, gripe, VIH, paperas y TB, usando un experimento similar al descrito anteriormente. Esto también puede usarse para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la estimulación de células vírgenes usando neo-antígenos tales como KLH.
Adicionalmente, se evalúa el efecto de los Abs anti-PVRIG sobre las respuestas específicas de antígeno de células T CD8 específicas de Ag clasificadas por tetrámero de sangre periférica de pacientes que padecen infecciones víricas tales como HCV y VIH. Las células T CD8 clasificadas por tetrámero son co-cultivadas con PBMCs autólogas cargadas de péptidos durante 5 días. Se evalúa la proliferación de células T específicas de Ag CD8 y la secreción de citoquinas (p.ej., IFNy, IL2, TNF-a). Esperamos que los anticuerpos anti-PVRIG potencien la proliferación y la producción de citoquinas, en comparación con el antígeno solo.
Ejemplo 22: Análisis de unión y funcional de anticuerpos derivados de hibridoma contra PVRIG
Este ejemplo muestra la caracterización de la unión de anticuerpos derivados de hibridoma (los anticuerpos CHA) a proteína PVRIG humana y de cynomolgus en líneas celulares y leucocitos primarios, así como la caracterización de la capacidad de los anticuerpos derivados de hibridoma para bloquear la interacción entre PVRIG y PVRL2.
Protocolos
Análisis FACS de células que sobre-expresan hPVRIG: Se usaron las siguientes líneas celulares para determinar la especificidad de los anticuerpos anti-PVRIG humana: HEK progenitoras y células HEK que sobre-expresan hPVRIG. Estas células fueron cultivadas en DMEM (Gibco) 10% de suero fetal de ternero (Gibco) glutamax (Gibco). Para las células HEK sobre-expresadoras de hPVRIG, también se añadió 0,5 pg/mL de puromicina (Gibco) al medio para selección positiva. Para el análisis FACS, se recolectaron todas las líneas celulares en fase de crecimiento logarítmico y se sembraron 50.000 - 100.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron anticuerpos anti-PVRIG humana (mIgG1 o mIgG2a) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como una serie de valoración de 8 puntos comenzando a 10 pg/mL en hielo durante 30 min - 1 h. La serie de valoración se llevó a cabo como diluciones en serie 1:3 o 1:3,3. Los datos fueron adquiridos usando un FACS Canto II (BD Biosciences) o IntelliCyt (IntelliCyt Corporation) y se analizaron usando software FlowJo (Treestar) y Prism (Graphpad).
Análisis FACS de líneas celulares humanas para hPVRIG: se usaron las siguientes líneas celulares para determinar la expresión y la especificidad de los anticuerpos anti-PVRIG humana: Jurkat y HepG2. Las células Jurkat fueron cultivadas en medio RPMI 10% de suero fetal de ternero, glutamax, aminoácidos no esenciales (Gibco), piruvato sódico (Gibco) y penicilina/estreptomicina (Gibco). Las células HepG2 fueron cultivadas en DMEM 10% de suero fetal de ternero glutamax. Para el análisis FACS todas las líneas celulares fueron recolectadas en fase de crecimiento logarítmico y se sembraron 50.000 - 100.000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se añadieron los anticuerpos anti-PVRIG humana (mIgG1 o mIgG2a) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como series de valoración de 8 puntos comenzando a 10 pg/mL en hielo durante 30 minutos - 1 hora. Las series de valoración se llevaron a cabo como diluciones en serie 1:3 o 1:3,3. Los datos fueron adquiridos usando un FACS Canto II o IntelliCyte y se analizaron usando software FlowJo y Prism.
Análisis FACS de leucocitos primarios humanos vírgenes para hPVRIG: Se obtuvieron leucocitos primarios mediante aislamiento de gradiente Ficoll (GE Healthcare) de sangre periférica (Standford Blood Bank). Los leucocitos aislados como células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron congelados en nitrógeno líquido con una densidad de entre 1 x 107 y 5 x 107 células/mL en una mezcla de 10% de DMSO (Sigma) y 90% de suero fetal de ternero. Para determinar la expresión de proteína de PVRIG en PBMC, se diseñaron cócteles de anticuerpos para los subconjuntos inmunes principales que incluyeron los anticuerpos anti-PVRIG. Se añadieron los anticuerpos anti-PVRIG humana (mIgG1 o mIgG2a) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o en algunos casos, como series de valoración de 4 puntos comenzando a 10 pg/mL en hielo durante 30 minutos - 1 hora.
Resumidamente, se añadieron mezclas de cóctel de anticuerpos a PBMC resucitados que fueron sembrados a 5x105 - 1x106 células/pocillo tras un bloqueo previo de receptor de Fc y tinción vivo/muerto (Aqua Live/Dead, Life Technologies). Los cócteles de anticuerpos fueron incubados con PBMC durante 30 minutos - 1 hora en hielo. A continuación las PBMC fueron lavadas y se adquirieron los datos mediante FACS usando un FACS Canto II. Los datos se analizaron usando software FlowJo y Prism. Los subconjuntos inmunes que fueron analizados incluyeron células NK CD56 dim, células NK CD56 bright, células T CD4+, células T CD8+, células T no convencionales (p.ej., células NKT y células T y§), células B y monocitos.
Análisis FACS de células modificadas sobre-expresadoras de PVRIG de cynomolgus: Se usaron las siguientes líneas celulares para determinar la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-PVRIG humana con PVRIG de cynomolgus (cPVRIG): células expi progenitoras y células expi sobre-expresadoras de cPVRIG. Estas células fueron cultivadas en DMEM 10% de suero fetal de ternero glutamax. Se generaron células expi sobre-expresadoras de cPVRIG transitorias electroporando ADN de cPVRIG en células expi progenitoras usando el sistema de transfección Neon. Para el análisis FACS, se usaron células expi cPVRIG entre 1-3 días después de la transfección. Las células expi progenitoras fueron recolectadas en la fase de crecimiento logarítmico. Se sembraron 50.000 - 100.000 células por pocillo de cada tipo en placas de 96 pocillos. Se añadieron los anticuerpos anti-PVRIG humana (mIgG1 o mIgG2a) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como una serie de valoraciones de 8 puntos comenzando en 10 pg/mL en hielo durante 30 minutos - 1 hora. La serie de valoraciones se llevó a cabo con diluciones en serie de 1:3 o 1:3,3. Los datos fueron adquiridos usando un FACS Canto II o IntelliCyte y se analizaron usando software FlowJo y Prism.
Análisis FACS de leucocitos de mono cynomolgus primarios vírgenes: Se obtuvieron leucocitos de mono cynomolgus (cyno) primarios a partir de sangre fresca, extraída no más de 24 horas antes del análisis de expresión. La sangre se obtuvo de Bioreclamation. Para determinar la expresión de proteína de PVRIG en PBMC cyno, se diseñaron cócteles de anticuerpos para los principales subconjuntos inmunes, que incluyeron los anticuerpos anti-PVRIG humana. Se añadieron los anticuerpos anti-PVRIG humana (mIgG1 o mIgG2a) y sus respectivos controles en diluciones de punto único (5 pg/mL), o como una serie de valoraciones de 8 puntos comenzando en 10 pg/mL en hielo durante 30 minutos - 1 hora.
Resumidamente, se añadieron mezclas de cóctel de anticuerpos a PBMC que fueron sembrados a 5x105 - 1x106 células/pocillo tras un bloqueo previo de receptor de Fc y tinción vivo/muerto. Los cócteles de anticuerpos fueron incubados con PBMC durante 30 minutos - 1 hora en hielo. A continuación las PBMC fueron lavadas y se adquirieron los datos mediante FACS usando un FACS Canto II. Los datos se analizaron usando software Prism. Los subconjuntos inmunes que fueron analizados incluyen linfocitos CD16+, monocitos/células mieloides CD14+/CD56+, y células T CD3+.
Ensayos de competición basados en células: Se evaluó la capacidad de los anticuerpos de PVRIG para inhibir la interacción de PVRIG con su ligando PVRL2 en un ensayo de competición celular. En este ensayo, el ligando PVRL2 es expresado endógenamente en células HEK no manipuladas y se añade PVRIG marcada con Fc soluble (fabricada a demanda por GenScript). En este caso, se determinó la capacidad de los anticuerpos de PVRIG para bloquear la unión de PVRIG soluble a células HEK a través de la adición concomitante de proteína PVRIG soluble 33 nM y anticuerpos de PVRIG (0,066-66 nM) a 100.000 células HEK y se incubó durante 1 hora en hielo. Se detectó el grado de unión de PVRIG Fc mediante la adición de anti-Fc humano Alexa 647 (Jackson Laboratories) durante 20-30 minutos en hielo. Las células se lavaron dos veces en PBS para adquisición usando un FACS Canto II. Los datos fueron analizados usando FlowJob (Treestar), Excel (Microsoft) y Prism (GraphPad).
Resultados
Los anticuerpos de PVRIG de hibridoma reconocen PVRIG en células sobre-expresadoras: Para realizar un cribado de anticuerpos que fueran específicos para PVRIG, se determinó la capacidad de los anticuerpos generados a partir de dos campañas de hibridomas para unirse a líneas de células HEK modificadas para sobre-expresar PVRIG humana. La mayoría de los anticuerpos de dichas campañas se unieron a las células HEK hPVRIG, aunque con afinidad variable. Además, la mayoría de estos anticuerpos también mostró una baja unión de fondo a las líneas de células HEK progenitoras, lo que indica una alta especificidad hacia la PVRIG. La Figura 77 muestra un ejemplo de la especificidad de los anticuerpos de PVRIG. En la Figura 79 se muestra un resumen de todas las características de unión de los anticuerpos hacia células HEK hPVRIG respecto al control que fueron generados en las campañas de hibridomas.
Los anticuerpos de PVRIG reconocen la proteína PVRIG en células NK y T vírgenes: Las poblaciones que mostraron el mayor nivel de PVRIG en subconjuntos de PBMC vírgenes fueron las células NK y T CD8, y el nivel absoluto de expresión entre estos dos subconjuntos de células fue similar (gMFI). Las células T CD4 mostraron niveles menores de PVRIG, mientras que las células B y los monocitos presentaron una expresión muy baja/no detectable. En la Figura 91 se muestra un resumen de la expresión en células NK y en células T CD8 vírgenes, detectada por los anticuerpos. Otros subconjuntos menores también mostraron expresión de PVRIG e incluyeron células T no convencionales tales como células NKT y células T y§. El patrón de expresión en subconjuntos de PBMC fue muy similar en todos los donantes analizados.
La PVRIG es detectada en líneas celulares Jurkat mediante anticuerpos de PVRIG derivados de hibridoma: Además del cribado de PBMC en función de la expresión de proteína PVRIG, quisimos comprender si también era expresada en líneas de células de cáncer. Elegimos para el cribado de nuestros anticuerpos células Jurkat, dada su elevada expresión de ARN de PVRIG. También elegimos HepG2 como línea celular de control negativo para validar adicionalmente la especificidad de nuestros anticuerpos. La mayoría de los anticuerpos derivados de hibridoma detectaron la expresión de proteína PVRIG en células Jurkat (Figura 79). Características de unión de anticuerpo de hibridoma de PVRIG a PBMc humanas primarias, células sobre-expresadoras cyno, y PBMC cyno primarias. Expi cyno OE denota células expi transfectadas transitoriamente con cPVRIG, expi par denota células expi progenitoras. gMFIr indica la tasa de diferencia en MFI geométrica de la tinción de anticuerpos de PVRIG respecto a sus controles. Las concentraciones indican aquella a la que se calculó la gMFIr. No evaluado indica anticuerpos que no fueron evaluados debido a una ausencia de unión a HEK hPVRIG, células expi cPVRIG, o no que cumplen los requisitos de subconjuntos PBMC. Los anticuerpos destacados son cuatro anticuerpos para los cuales se realizó la humanización (Ver Figura 90).
Figura 92), pero no las células HepG2 (datos no mostrados). Un ejemplo de detección de PVRIG en Jurkat se muestra en la Figura 78 con un anticuerpo representativo, el CHA.7.518.
Ensayos bioquímicos basados en células: tras realizar el cribado de nuestros 29 anticuerpos de hibridoma en los ensayos bioquímicos celulares, descubrimos que había 20 bloqueantes claros y 9 no bloqueantes de la interacción PVRIG-PVRL2. Todos los anticuerpos bloqueantes fueron capaces de inhibir la interacción de PVRIG Fc con células HEK en al menos un 50%, eliminando por completo la mayoría de dichos anticuerpos la unión a PVRIG Fc. Los valores IC50 asociados a dichos anticuerpos que mostraron capacidad de bloqueo se presentan en la Figura 92. La mayoría de los valores de IC50 estaban entre 20-60 nM.
Resumen y conclusiones
Mediante el uso de una plataforma de hibridomas, hemos sido capaces de generar con éxito anticuerpos monoclonales para el antígeno PVRIG humano. Mediante el uso de células modificadas sobre-expresadoras como representantes de líneas celulares de cáncer, demostramos que nuestros anticuerpos son altamente específicos para el antígeno PVRIG, y son capaces de detectar la expresión de proteína que se correlaciona con la expresión de ARN. T ras análisis de subconjuntos de PBMC humanas, demostramos que la proteína PVRIG se expresa en su mayor nivel en células NK y T, con una expresión baja/negativa en células B y células mieloides. También demostramos que una proporción de dichos anticuerpos reaccionan de forma cruzada con el antígeno de PVRIG de mono cynomolgus (cyno) a través de la determinación de su unión a células sobre-expresadoras. Además, el patrón de expresión en PBMC de cyno es similar al de PBMC humanas. Finalmente, fuimos capaces de demostrar a través de un ensayo competitivo basado en FACS que una proporción de nuestros anticuerpos de hibridoma son capaces de inhibir la interacción de PVRIG con su ligando, PVRL2. Los anticuerpos que mostraron las mejores características respecto a todos los datos mencionados anteriormente fueron ChA-7-518, CHA-7-524, CHA-7-530 y CHA-7-538.
Ejemplo 23: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG CHA en el ensayo MLR
Un ensayo usado para obtener el perfil del efecto funcional de los anticuerpos anti-PVRIG humana sobre las respuestas de alo-antígeno es la proliferación de células T CD8+ humanas en un ensayo de Reacción de Linfocitos Mixtos (MLR). Como es sabido en la técnica, MLR es un ensayo inmune celular ex vivo que proporciona una correlación in vitro de la función de células T.
Es de esperar que los anticuerpos anti-PVRIG potencien la proliferación de células T CD4 y CD8 en respuesta a las células de un donante de MHC no coincidente. Las células T humanas son enriquecidas a partir de sangre entera de un donante (p.ej., donante A) usando un “Human T cell RosetteSep RTM” (StemCell Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras la separación, las células son marcadas fluorescentemente con colorante CFSE (Molecular Probes). Para actuar como células presentadoras de antígeno alogénicas (APCs), en primer lugar se aíslan células mononucleares a partir de sangre entera de un donante de MHC no coincidente (p.ej., donante B) y a continuación se agotan de células T CD3+. A continuación se irradian las APCs con 2500 rads en un irradiador de cesio.
En general, un ensayo MLR se lleva a cabo de la siguiente forma. Se co-cultivan células T humanas y 150.000 APCs alogénicas en una placa de 96 pocillos de fondo plano con 150.000 células T CD8+ y APCs durante 5 días con anticuerpos anti-PVRIG a diferentes concentraciones. En el día 5, las células son recolectadas, lavadas y teñidas con anti-CD8-biotina seguido de estreptavidina-PerCp. Las muestras son analizadas mediante FACS para determinar el grado de proliferación representado por la dilución de CFSE. Es de esperar que los anticuerpos anti-PVRIG bloqueantes funcionales potencien la proliferación de células T y la secreción de citoquinas en respuesta a las células de un donante de MHC no coincidente.
El ensayo MLR se usa para caracterizar el efecto bioquímico de los anticuerpos CHA de la invención en células T humanas en reposo y activadas, y para caracterizar la capacidad de los anticuerpos derivados de hibridoma para modular la proliferación de células T en un experimento MLR.
Protocolos
Reacción de Linfocitos Mixtos (MLR): Se estableció una reacción de linfocitos mixtos co-cultivando células dendríticas (DCs) y células T derivadas de donantes distintos en un experimento alogénico. Las DCs fueron generadas cultivando monocitos purificados con 100 ng/mL de GM-CSF (R&D systems) y 100 ng/mL de IL-4 (R&D systems) durante 7 días. Después de 7 días, las células T CD3 marcadas con CFSE fueron combinadas con DCs en una proporción de 10:1 y se cultivaron en medio libre de suero X vivo-20 (Lonza) durante 5 días. En algunas condiciones, se añadieron anticuerpos anti-PVRIG no conjugados o anticuerpos de control de isotipo a las placas a 10 pg/mL. Se establecieron tres permutaciones de ensayo MLR, donde las DCs de un donante fueron co-cultivadas con células T CD3 de 3 donantes alogénicos separados. Todos los productos sanguíneos fueron adquiridos en el “Stanford Blood Bank”.
Análisis de expresión y funcional: Después del día 5 de cultivo MLR, se determinó el nivel y el grado de activación y proliferación de células T mediante dilución CFSE y expresión de marcadores de activación tales como CD25 y PD-1. Se usaron anticuerpos anti-PVRIG caseros de campañas de fagos y de hibridomas para determinar la expresión de PVRIG. También se evaluó la expresión del ligando de PVRIG, PVRL2, de un modo cinético sobre DC. Todos los datos fueron adquiridos usando citometría de flujo y el análisis de datos se llevó a cabo usando software FlowJo (Treestar) y Prism (Graphpad).
Análisis de epítopo basado en FACS: Como evaluamos un conjunto de anticuerpos en la MLR, nos interesó determinar si dichos anticuerpos podrían agruparse en “contenedores” de epítopos en base a la unión basada en FACS, y si dichos “contenedores” se correlacionarían con cambios en la activación y proliferación de células T en el ensayo. Para hacer esto, se pre-incubaron células T recolectadas del ensayo con anticuerpos de PVRIG no conjugados, y a continuación se contra-tiñeron con un anticuerpo de PVRIG conjugado de un clon diferente. El grado en el que el anticuerpo de PVRIG conjugado proporcionó una señal en las células T indicó el grado en el que dicho anticuerpo tenía que competir para la unión de PVRIG en células T con el anticuerpo no conjugado. Una señal negativa o baja indicaría que existe una fuerte competencia, lo que indica que los dos anticuerpos están en el mismo “contenedor” de epítopo. Una señal elevada indicaría una competencia baja o nula, y por tanto los anticuerpos serían considerados en diferentes “contenedores”.
Resultados
Expresión de PVRL2 en DC derivadas de monocitos: Para determinar si PVRL2 sería expresada en DC del ensayo MLR, se generaron DC a partir de monocitos, y se determinó la expresión de PVRL2 de un modo cinético a intervalos diarios tras la adición de GM-CSF e IL-4. Tal como se indica en la Figura 72, la expresión de PVRL2 aumentó desde el Día 0 hasta el Día 5, cuando alcanzó un máximo. En el Día 6, la expresión disminuyó ligeramente en comparación con el Día 5. En el Día 7, la expresión fue similar al Día 6, lo que indica una estabilización de la expresión de PVRL2 para esos tiempos. Por tanto, las DC expresaron PVRL2 en el tiempo apropiado para su uso en el ensayo MLR.
Expresión de PVRIG en células T después de cultivo de MLR: Muchos receptores de células T que modulan la función en el MLR se expresan en células T en proliferación. Por tanto, quisimos determinar si también se expresa PVRIG. Analizamos células T en proliferación en el Día 5 después del inicio del co-cultivo de MLR y se caracterización mediante su dilución de CFSE (es decir, CFSE bajo). Tal como se muestra en la Figura 73 y la Figura 74, respecto al control de isotipo (mIgG1), se expresó PVRIG en células de bajo CFSE, determinado a través de múltiples anticuerpos de PVRIG tanto en células T CD4 como células T CD8 a lo largo de los tres donantes analizados. En la Figura 73 se muestran representaciones de FACS para indicar la PVRIG en células de CFSE bajo, y los gráficos de barras de la Figura 74 indican el nivel de expresión de PVRIG respecto a mIgG1.
Los anticuerpos de PVRIG potencian la proliferación de células T : habiendo demostrado que la expresión de PVRIG se expresa en células T en proliferación en la MLR, quisimos determinar si el tratamiento con anticuerpos de PVRIG podría afectar a los niveles de proliferación de células T. Tal como se muestra en la Figura 4, la adición de anticuerpos de PVRIG podría afectar a los niveles de proliferación de células T. Tal como se muestra en la Figura 4, la adición de anticuerpos de PVRIG en el ensayo de MLR fue capaz de aumentar el porcentaje de células de CFSE bajo con todos los anticuerpos de hibridoma evaluados en comparación con el control. Esto se observó para todos los donantes analizados.
Los anticuerpos de PVRIG se unen a epítopos múltiples de la PVRIG: Para comparar los anticuerpos de PVRIG en términos de capacidad de unión a diferentes epítopos de la PVRIG, llevamos a cabo un experimento competitivo donde se cultivaron células T del MLR con anticuerpos anti-PVRIG no marcados derivados de nuestras campañas de hibridomas durante 5 días. A continuación se recolectaron las células T en el día 5 y se contra-tiñeron con un anticuerpo anti-PVRIG conjugado que se derivó de nuestra campaña de fagos (CPA.7.021). Tal como se muestra en la Figura 76, se observó una reducción completa, o casi completa, de la unión de CPA.7.021 en las condiciones que contenían CHA.7.516-M1, CHA.7.518-M1, CHA.7.524-M1, CHA.7.530-M1 y CHA.7.538-M1 en comparación con los niveles de fluorescencia de fondo, lo que sugiere que dichos anticuerpos pueden solaparse en el reconocimiento de epítopos. Se observó una reducción parcial en la unión de CPA.7.021 con CHA.7.537-M1, CHA.7.528-M1 y CHA.7.548-M1, lo que sugiere un solapamiento parcial en el reconocimiento de epítopos. No se observó una reducción en la unión a CPA.7.021 en células pre-cultivadas con CHA.7.543-M1 lo que sugiere una ausencia de reconocimiento de epítopos. Colectivamente, estos datos indican que los anticuerpos de PVRIG de nuestras campañas, cuando se evalúan respecto a CPA.7.021, pudieron reconocer al menos 3 epítopos diferentes en la PVRIG.
Conclusiones: Caracterizamos nuestros anticuerpos de PVRIG en función de su capacidad para unirse a células T en proliferación y en reposo, así como en función de su actividad funcional en una MLR. Se detectó la unión de múltiples anticuerpos de PVRIG en células T en proliferación y fue mayor en células T en proliferación en comparación con las de reposo, especialmente el subconjunto CD8+. Estos datos demuestran que la expresión de PVRIG aumenta con la activación de células T. Además, varios anticuerpos de PVRIG aumentaron la proliferación de células T en comparación con el isotipo mIgG1 lo que indica que también pueden modular la función de células T. Como antes, dichos anticuerpos presentan todos la capacidad de bloquear la unión de PVRIG con su ligando, PVRL2. En base a esto, concluimos que mediante el bloqueo de la interacción PVRIG-PVRL2, estos anticuerpos conducen a un aumento de la activación y proliferación de células T, que es un indicio clave de un efecto deseado para un inhibidor de punto de control inmune que se usaría para tratar el cáncer. Finalmente, llevamos a cabo experimentos competitivos que comparan la unión de múltiples anticuerpos de PVRIG derivados de hibridomas a células T activadas, respecto a un anticuerpo derivado de fago. De esta serie de experimentos, proporcionamos evidencias de una diversidad de epítopos de nuestros anticuerpos derivados de fagos y de hibridomas.
Ejemplo 24: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T tras combinación con bloqueo de punto de control inmune
Es de esperar que la combinación de bloqueo de PVRIG con Abs bloqueantes de un punto de control inmune conocido (p.ej., PD1, PDL-1 o TIGIT) aumente el efecto estimulador sobre la activación de células T en los ensayos indicados anteriormente.
Ejemplo 25. Análisis funcional de anticuerpos de PVRIG
Los anticuerpos de PVRIG de la invención fueron caracterizados en términos de su capacidad para inhibir la interacción de PVRIG con su ligando PVRL2, y de su capacidad para modular la función efectora de linfocitos en ensayos basados en células primarias.
Protocolos
Ensayos bioquímicos basados en células
Se determina la capacidad de los anticuerpos anti-PVRIG para inhibir la interacción de PVRIG con su ligando PVRL2 en un formato de ensayo bioquímico celular en dos orientaciones.
En la primera orientación, se expresa endógenamente el ligando PVRL2 en células HEK no manipuladas y se añade PVRIG marcada con Fc biotinilada soluble (fabricada bajo demanda por Genscript). En este caso, se determinó la capacidad de los anticuerpos de PVRIG para bloquear la unión de PVRIG soluble a células HEK a través de dos permutaciones. En la primera permutación, se pre-incubaron varias concentraciones de anticuerpos de PVRI (rango 0,066-66 nM) con 33 nM de PVRIG soluble en salino tamponado con fosfato (PBS, Gibco) durante 30 minutos en hielo. Este complejo se añadió posteriormente a 100.000 células HEK y se incubó durante otra hora adicional en hielo. Después de 1 hora, las células HEK fueron lavadas dos veces en PBS y se detectó el grado de PVRIG soluble unida a células HEK mediante la adición de estreptavidina conjugada a Alexa 647 (Jackson Laboratories) durante 30 minutos en hielo. Las células HEK fueron lavadas dos veces en PBS, y resuspendidas en 100 pL de PBS para adquisición en el FACS Canto II (BD Biosciences). Los datos fueron analizados usando software FlowJo (Treestar) y Prism (Graphpad). En la segunda permutación, se añadió 33 nM de proteína PVRIG soluble y anticuerpos de PVRIG (0,066­ 66 nM) concomitantemente con 100.000 células HEK y se incubó durante 1 hora en hielo. Las siguientes etapas para el análisis de esta permutación son equivalentes a la primera permutación.
En la segunda orientación, se modificó las células HEK para sobre-expresar PVRIG y se añadió PVRL2 marcada con Fc biotinilada soluble (CD Biosciences). En este caso, se añadieron varias concentraciones de anticuerpos de PVRIG (rango 0-200 nM) con PVRL2 soluble 160 nM concomitantemente a 100.000 células HEK hPVRIG o células HEK progenitoras, y se incubó en PBS 1% de BSA 0,1 % de azida sódica (tampón de FACS) durante 1 h en hielo. La unión de PVRL2 soluble se detectó mediante la adición de estreptavidina Alexa 647 en tampón de FACS durante 30 minutos en hielo. Las células fueron lavadas dos veces en tampón de FACS, y re-suspendidas en 50 pL de PBS para adquisición en el HTFC Intellicyt (Intellicyt). Los datos se analizaron usando FlowJo (Treestar), Excel (Microsoft) y Prism (GraphPad).
Ensayo de células NK primarias
El subconjunto de PBMCs con el perfil de expresión más robusto para PVRIG fue sobre células NK. Como tal, diseñamos un ensayo de co-cultivo basado en células NK con células tumorales que expresan PVRL2 para determinar si nuestros anticuerpos podían modular la citotoxicidad mediada por células Nk hacia dichas dianas. Las dianas elegidas fueron la línea celular de leucemia linfocítica de células B, Reh (banco de células ATCC), y la línea celular de leucemia mieloide aguda, MOLM-13 (banco celular DSMZ). Las células Reh y MOLM-13 fueron crecidas en medio RPMI (Gibco) 20% de suero fetal de ternero (Gibco), glutamax (Gibco), penicilina/estreptomicina (Gibco), aminoácidos no esenciales (Gibco), piruvato sódico (Gibco), HEPES (Gibco) y beta-mercaptoetanol (Gibco).
Dos días antes del ensayo de co-cultivo, las células NK primarias fueron aisladas usando el kit de aislamiento de células NK humanas (Miltenyi Biotec) y se cultivaron en medio RPMI 20% de suero fetal de ternero, glutamax, penicilina/estreptomicina, aminoácidos no esenciales, piruvato sódico, HEPES, beta-mercaptoetanol y 250 U/mL de IL-2 (R&D systems). El día del ensayo, las células NK fueron recolectadas, enumeradas y pre-incubadas con anticuerpos de PVRIG durante 15-30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación, las células diana fueron recolectadas del cultivo, etiquetadas con Calcein AM (Life Technologies) durante 30 min a 37°C, se lavaron en el medio y se enumeraron para el ensayo. Se establecieron los ensayos de toxicidad mediados por células NK, donde se co-cultivó un número constante de células diana (50.000) con concentraciones crecientes de células NK pre­ incubadas con 5 pg/mL de anticuerpos de PVRIG (alterando así la ratio de células NK a diana). Alternativamente, se usó una ratio de células NK a diana fija en el ensayo, pero las células NK fueron pre-incubadas con concentraciones variables de anticuerpo de PVRIG (rango de 3,9 ng/mL - 5 ng/mL) en una valoración de dosis. Tras adición de las células NK y las dianas, las placas fueron sometidas a giros pulsados a 1.400 rpm durante 1 minuto y colocadas a 37°C en una atmósfera con un 5% de CO2 durante 4 horas. Después de 4 horas, las placas se giraron a 1.400 rpm durante 4 minutos, y se recolectaron 80 pL de sobrenadante para cuantificar la liberación de Calceína AM desde las células diana. La cantidad de Calceína AM liberada de las dianas se determinó mediante un fluorómetro Spectramax Gemini XS (Molecular Devices). Como controles para la liberación de Calceína AM, se determinó la liberación total y espontánea exponiendo a las células diana a etanol al 70% o a medio solo por toda la duración del ensayo. Los niveles de muerte (en porcentaje) por acción de las células NK se calcularon usando la siguiente fórmula:
(liberación de muestra - liberación espontánea) / (liberación total - liberación espontánea) * 100
Además de los anticuerpos de PVRIG, en algunos casos, también se añadieron como comparadores otros anticuerpos de receptores de células NK tales como TIGIT (Genentech, clon 10A7, número de patente: WO 2009126688 a 2) y DNAM-1 (Biolegend, clon 11A8).
Resultados
Ensayos bioquímicos basados en células: Tras realizar el cribad de un panel de nuestros anticuerpos de PVRIG en los ensayos bioquímicos celulares, descubrimos que había niveles variables de inhibición en los anticuerpos evaluados, y que el nivel de inhibición era dependiente de la permutación y la orientación del ensayo (Figura 98). Para ilustrar este punto, se muestran específicamente cuatro anticuerpos en la Figura 93. La orientación y permutación del ensayo que proporcionó el efecto inhibidor más robusto respecto al control, fue cuando se añadió PVRIG soluble pre­ incubada con anticuerpos de PVRIG a células HEK (Figura 93a). En esta permutación, el CPA.7.021 mostró la mejor capacidad de bloqueo absoluta en comparación con los otros tres anticuerpos (CPA.7.002, CPA.7.005 y CPA.7.050). A pesar de las diferencias en el nivel de bloqueo, todos los anticuerpos de esta permutación mostraron valores de IC50 similares, que estuvieron en el rango nanomolar bajo, y la capacidad de bloqueo alcanzó un valor estable a mayores concentraciones.
Cuando el nivel absoluto de inhibición invocado por los cuatro anticuerpos de PVRIG fue medido entonces, cuando la PVRIG soluble y los anticuerpos de PVRIG fueron añadidos concomitantemente a células HEK, más viabilidad del bloqueo se observó en el ensayo (Figura 93b). CPA.7.021 siguió siendo el mejor anticuerpo bloqueante. Sin embargo, CPA.7.002 y CPA.7.005 mostraron una capacidad marcadamente menor para inhibir la unión de PVRIG soluble a células HEK con respecto al anticuerpo de control. CPA.7.050 mostró un nivel intermedio de bloqueo en comparación con CPA.7.021, CPA.7.002 y CPA.7.005. Esta diferencia en el nivel absoluto de inhibición también correspondió a diferencias en los valores IC50 de cada anticuerpo. CPA.7.021 y CPA.7.050 mostraron nuevamente valores de IC50 nanomolares bajos, aunque fueron ambos mayores que en la primera permutación del ensayo. Por el contrario, los valores de IC50 de CPA.7.002 y CPA.7.005 aumentaron sustancialmente, CPA.7.002 en aproximadamente 20 veces, y CPA.7.005 en aproximadamente 30 veces. Estos datos indican cómo debe competir el anticuerpo por la unión a PVRIG con su ligando cognado, indicará la potencia con la que el anticuerpo puede bloquear dicha interacción.
Cuando se invirtió la orientación del ensayo bioquímico (es decir, se determina la unión de PVRL2Fc a células HEK hPVRIG), la capacidad de los cuatro anticuerpos de PVRIG para bloquear la interacción con PVRL2 Fc fue variable (Figura 93c). En consistencia con los ensayos bioquímicos que usaron células HEK como dianas (Figura 93a-b), CPA.7.021 y CPA.7.050 inhibieron la unión de PVRL2 Fc a células HEK PVRIG, y su capacidad para bloquear la unión fue similar. Sin embargo, sorprendentemente, observamos un aumento de la unión de PVRL2 Fc en presencia de los anticuerpos CPA.7.002 y CPA.7.005, que no observamos cuando se usaron células HEK como dianas.
Ensayo de citotoxicidad de células NK con células Reh: La primera diana que investigamos en el ensayo de citotoxicidad de células NK fue la línea Reh. Reh fue seleccionada inicialmente porque muestra niveles robustos de PVRL2 mediante citometría de flujo, pero una baja frecuencia de otros ligandos activantes tales como ligandos NKG2D, y una baja expresión de PVR (Figura 94). No se usaron las dianas de células NK tradicionales, tal como K562, debido a su expresión de una frecuencia elevada de ligandos NKG2D, y una alta expresión de PVR, que puede enmascarar un efecto funcional de los anticuerpos de PVRIG. Cabe destacar que las células Reh no expresaron ningún receptor de célula NK conocido por interaccionar con PVRL2 y PVR, tal como TIGIT, DNAM-1 y PVRIG.
Tras realizar un escrutinio de nuestro panel de anticuerpos de PVRIG en este ensayo, observamos cuatro anticuerpos que fueron capaces de modular la citotoxicidad mediada por células NK (Figura 99). Estos cuatro anticuerpos fueron los discutidos en la sección de resultados del ensayo bioquímico, CPA.7.002, CPA.7.005, CPA.7.021 y CPA.7.050. En todos los casos, la adición de estos anticuerpos potenció la citotoxicidad mediada por células NK contra células Reh (Figura 95a-c). La adición de CPA.7.002 y c Pa .7.005 potenció la citotoxicidad de una forma más robusta (Figura 95ab), seguidos de CPA.7.021 y CPA.7.050, que mostraron niveles similares de potenciamiento (Figura 95c). La Figura 95d muestra un análisis dependiente de la concentración del potenciamiento de la citotoxicidad mediada por células NK por parte de CPA.7.002 y CPA.7.021. Los anticuerpos de bloqueo para receptores que se ha publicado que también se unen a PVRL2, tal como TIGIT y DNAM-1, fueron añadidos al ensayo con células Reh como comparadores. Tal como se muestra en la Figura 95e-f, la adición de anticuerpos de TIGIT y DNAM-1 no mostró efectos funcionales en este ensayo.
Ensayo de células NK con células MOLM-13: para determinar si los anticuerpos de PVRIG eran capaces de modular la citotoxicidad mediada por células NK contra una segunda diana, se utilizaron células MOLM-13. Las MOLM-13 también expresan PVRL2 de forma análoga a las células Reh, pero también presentan una expresión robusta de PVR (Figura 94). Como las células Reh, las MOLM-13 no expresaron ningún receptor de células NK. La utilización de esta línea celular, además de las células Reh, indicaría si los anticuerpos de PVRIG pueden modular la citotoxicidad mediada por células NK en el contexto de diferentes interacciones receptor-ligando, particularmente cuando se expresa PVR.
Tras cribar nuestros anticuerpos de PVRIG en este ensayo, encontramos que el efecto funcional de CPA.7.021 estaba disminuido y no mostró ningún cambio significativo de la citotoxicidad mediada por células NK por encima de los niveles de control (Figura 97a). Por el contrario, CPA.7.002 y CPA.7.005 fueron capaces de potenciar la citotoxicidad mediada por células NK en este ensayo (Figura 97a). Usando un anticuerpo comparador, el bloqueo de TIGIT no mostró efectos funcionales en este ensayo en comparación con el control (Figura 97b).
Resumen y conclusiones
Usando nuestra plataforma de fagos de anticuerpos, generamos un panel de anticuerpos contra el antígeno PVRIG humano que mostró la capacidad de bloquear la interacción de PVRIG con su ligando PVRL2, y de potenciar la citotoxicidad mediada por células NK contra dos líneas celulares hematológicas. La capacidad de los anticuerpos de PVRIG para inhibir la interacción entre PVRIG y PVRL2 se vio influida por la orientación del ensayo, así como por las etapas de pre-incubación, representativas de la dinámica potencial de anticuerpos con PVRIG en experimentos fisiológicos tales como el cáncer. Cuatro anticuerpos mostraron la capacidad de potenciar la citotoxicidad mediada por células NK contra la línea celular Reh, pero solo dos anticuerpos mostraron la capacidad de potenciar la citotoxicidad contra las células MOLM-13. Esta diferencia puede atribuirse a las interacciones receptor-ligando alternativas implicadas en el reconocimiento mediado por células NK de cada línea celular, y/o a propiedades diferenciales de los anticuerpos y su potencia para modular la función de PVRIG.
Ejemplo 26: Efecto de anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T GD usando células que expresan PVRL2 ectópicamente o de forma natural
Se usó un ensayo basado en células para evaluar el efecto de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T gamma delta, la proliferación y la secreción de citoquinas. Las células T gamma delta humanas purificadas son activadas con HMBPP o IPP y co-cultivadas con células diana (p.ej., REH, MOLM-13), que expresan de forma natural PVRL2, o con células diana que expresan ectópicamente PVRL2 o vector vacío (p.ej., CHO, Raji, 721.221). Se determina la función de células T gamma delta examinando la producción de citoquinas (p.ej., IFN-y, IL-17), en sobrenadantes cultivados, o la actividad citotóxica sobre las células diana. Es de esperar que la expresión de PVLR2 tenga un efecto estimulador basal sobre la activación de células T gamma delta, mediada a través de DNAM1 endógena, un receptor de contrapartida coestimuladora conocido de la PVRL2 en células T gamma delta. En presencia de Abs anti-PVRIG antagonistas, es de esperar que la producción de citoquinas o la actividad de citoquinas se vea potenciada adicionalmente, debido a su bloqueo de la función inhibidora de la PVRIG endógena sobre la activación de células T gamma delta. Por consiguiente, es de esperar que los Abs anti-PVRIG agonistas muestren inhibición de la activación de células T gamma delta.
Ejemplo 27: Efecto de proteínas en células T humanas activadas usando anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de PBMCs autólogas
Materiales y Métodos
En estos experimentos se evalúan los efectos de la PVRIG en células T humanas que fueron activadas usando anti-CD3 y anti-CD28 en presencia de PBMCs autólogas. Y a la inversa, este ensayo también puede usarse para evaluar los efectos de los anticuerpos anti-PVRIG sobre la activación de células T.
La proteína de fusión PVRIG hECD-hIg (Figura 92BA), compuesta del ECD de PVRIG humana fusionado al Fc de la IgG1 humana que porta las mutaciones C220, C226 y C229 a S en la bisagra, fue producida en GenScript (China) mediante transfección transitoria en células CHO-3E7 que fueron cultivadas durante 6 días, seguido de purificación de proteína A de la cosecha celular. El producto final se formuló en PBS, pH 7,2. Se usó el vector de expresión Vector de Expresión de Mamífero pTT5, en el que el gen de PVRIG está gobernado por el promotor CMV.
El kit de aislamiento de células T humanas CD4+ se adquirió de Miltenyi (cat n° 130-094-131). El control de hIgGI (Synagis®) se obtuvo de Medimmune Inc. El Ab anti-CD3 humano (OKt 3, cat n° 16-0037) y el Ab anti-CD28 humano (clon CD28. 2; cat n° 16-0289) se compraron a eBioscience. Las Dynabeads M-450 Epoxy (cat n° 140. 11) se compraron a Invitrogen. Las capas leuco-plaquetarias de sangre humana se obtuvieron de LifeSource. Ficoll-Paque Plus (cat n° 17-1440-02) se compró a GE HealthCare.
Aislamiento de PBMCs a partir de capas leuco-plaquetarias usando separación Ficoll: Las PBMCs totales se suspenden en medio ExVivo 20, y se irradian a 3000 rad. Se aíslan células T CD4+ vírgenes a partir de las capas leuco-plaquetarias de sangre de tres donantes sanos usando el kit II de aislamiento de células T humanas CD4+ (Miltenyi) según las instrucciones del fabricante y se co-cultivan con PBMCs autólogas irradiadas en una ratio de 1:1 (1,5 x 105 células T con 1,5 x 105 PBMCs irradiadas por pocillo). Los cultivos se activan con anticuerpos anti-CD3 (0,5 pg/mL) y anti-CD28 (0,5 pg/mL). Se añade anticuerpo anti-PVRIG o una proteína de ECD de PVRIG al cultivo en las concentraciones indicadas. Después de 24h de cultivo, las células son pulsadas con H3-timidina. Las células se recolectan después de 72 horas en cultivo.
Para el experimento de ECD, es de esperar que los resultados produzcan una inhibición dependiente de la dosis de la proliferación y/o la activación de células T, apoyando el potencial terapéutico de los agentes terapéuticos basados en PVRIG inmunoinhibidores (p.ej., polipéptidos de PVRIG o proteínas de fusión de PVRIG según al menos algunas realizaciones de la invención) para tratar enfermedades autoinmunes gobernadas por células T, tal como artritis reumatoide, esclerosis múltiple, soriasis y enfermedad inflamatoria del intestino, así como para tratar otras enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario y/o para reducir la activación inmune no deseada que sigue a una terapia génica o celular. Esencialmente, las proteínas de PVRIG inmunoinhibidoras que agonizan PVRIG deberían prevenir o reducir la activación de células T y la producción de citoquinas proinflamatorias implicadas en la patología de enfermedad de dichas afecciones.
Adicionalmente, también es de esperar que estos resultados apoyen un potencial terapéutico de los anticuerpos anti-PVRIG inmunoestimuladores que reduzca la actividad inhibidora de la PVRIG para tratar afecciones que se beneficien de un aumento de las respuestas inmunes, tal como inmunoterapia de cáncer, enfermedades infecciosas, particularmente infecciones crónicas y sepsis. Esencialmente, los anticuerpos anti-PVRIG inmunoestimuladores promoverán la activación de células T y provocarán la producción de citoquinas pro-inflamatorias, promoviendo de este modo el agotamiento de células cancerosas o infectadas o de agentes infecciosos.
Ejemplo 28: Ensayo de inhibición de la activación de células T.
En estos experimentos, se evalúan los efectos de ECDs de PVRIG o de anticuerpos anti-PVRIG en la activación de células T en un ensayo de perlas.
Materiales y Métodos
Aislamiento de células T humanas: Se obtuvieron capas leuco-plaquetarias del “Stanford Blood Bank” de donantes humanos sanos. Se aislaron las células T CD3+ de las capas leuco-plaquetarias usando el kit RosetteSep (StemCell Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se analizan con anti-CD45 y anti-CD3 mediante citometría de flujo para evaluar el % de células CD3+ obtenidas. La viabilidad se evalúa después de descongelar antes del ensayo.
Recubrimiento de perlas y QC: Se recubren perlas activadas con tosilo (Invitrogen, cat n° 14013) a 500x106/mL con mAb anti-CD3 y con proteínas ECD de PVRIG o anticuerpos anti-PVRIG en un protocolo de dos etapas: con 50 pg/mL de clon UTCH1 anti-CD3 humano (R&D systems, cat n° mab 100) en tampón de fosfato sódico a 37°C durante una noche, seguido de 0-320 pg/mL de proteínas ECD de PVRIG o de anticuerpos anti-PVRIG durante otra noche de incubación a 37°C.
Se analiza la cantidad de proteína PVRIG (ya sea ECD o anticuerpo) unida a las perlas.
Experimento de ensayo de perlas: se cultivan 100k células T CD3+ humanas con 100k o 200k perlas recubiertas con diversas concentraciones de la proteína PVRIG durante 5 días en IMDM completo (Gibco, cat n° 12440-053) suplementado con un 2% de suero humano AB (Gibco, cat n° 34005-100), Glutamax (Gibco, cat n° 35050-061), piruvato sódico (Gibco, cat n° 11360-070), disolución MEM de aminoácidos no esenciales (Gibco, cat n° 11140-050) y 2-mercaptoetanol (Gibco, cat n° 21985). Al final del día 5 de cultivo, las células son teñidas con anti-CD25, anti-CD4, anti-CD8 y colorante vivo-muerto fijable para determinar los niveles de expresión de CD25 en cada subconjunto de células. Los sobrenadantes son recolectados y evaluados en términos de secreción de IFNy mediante ELISA (Human IFNy duoset, R&D systems, DY285).
En estos experimentos, las células T CD3 humanas co-cultivadas con perlas recubiertas de concentraciones variables de proteína PVRIG son analizadas para determinar su nivel de expresión de CD25. Se anticipa que tanto las células CD4+ como las CD8+ muestren una inhibición dependiente de la dosis por parte de la proteína de fusión PVRIG-ECD, o, a la inversa, se anticipa que las células CD4+ y CD8+ muestren una activación dependiente de la dosis por parte del anticuerpo de PVRIG.
Ejemplo 29: Mapeado de epítopos de anticuerpos anti-PVRIG humana basado en reactividad cruzada con cynomolgus
Fundamentos y Objetivos
El objetivo de este estudio es identificar los epítopos de la proteína PVRIG que determinan la reactividad cruzada de los anticuerpos anti-PVRIG humana con el ortólogo de mono cynomolgus (cyno). Muchos de los anticuerpos líderes contra la diana PVRIG humana muestran un grado variable de reactividad cruzada con cyno a pesar del hecho que muchos de estos anticuerpos pertenecen al mismo contenedor de epítopos. Para arrojar luz sobre el fundamento molecular de la reactividad cruzada humano/cyno (o de su ausencia), se diseñaron varias mutaciones cyno-a-humano de las proteínas recombinantes de PVRIG, se expresaron y se purificaron, y se evaluaron en términos de unión a un panel de anticuerpos anti-PVRIG humana en ELISA.
Métodos
Diseño de variantes cyno-a-humano: el alineamiento de secuencia de dominios extracelulares (ECDs) de PVRIG humana y de cyno muestra un 90% de identidad de secuencia y un 93% de homología de secuencia entre los ortólogos humano y de cyno (Figura 100). En base a la naturaleza de las mutaciones (conservadas frente a no conservadas) y a la predicción de estructura secundaria (enrollada frente a extendida) de la región de mutación, se diseñaron tres mutantes sito-dirigidos de la PVRIG de cyno para testar el mapeado de epítopos enfocado a reactividad cruzada de cyno. Dichos mutantes incluyen H61R, P67S y L95R/T97I PVRIG de cyno. También se generó PVRIG natural humana y de cyno.
Expresión y purificación de PVRIG humana, de cyno, y de variantes híbridas: Todas las variantes de PVRIG fueron expresadas como fusiones ECD con una etiqueta C-terminal 6XHis en células de mamífero. Las proteínas fueron purificadas mediante purificación de afinidad, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión de tamaño. Las proteínas purificadas fueron cambiadas de tampón a tampón de PBS (pH 7,4) y almacenadas a 4°C.
ELISA para determinar la interacción PVRIG-anticuerpo: se llevó a cabo un ELISA funcional como se indica a continuación: proteínas recombinantes de cyno, humanas e híbridas cyno/humano (marcadas con His) fueron adsorbidas sobre una placa IA durante una noche a 4°C. Los pocillos de placa recubiertos fueron lavados dos veces con PBS e incubados con 300 pL de tampón de bloqueo (leche desnatada en polvo al 5% en PBS, pH 7,4) a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. Se retiró el tampón de bloqueo y las placas fueron lavadas dos veces más con PBS. Las variantes de PVRIG ligadas a placa fueron incubadas con mAbs anti-PVRIG humana (isotipo IgG1 humano) en disolución (rango lineal de 0,1 pg/mL a 8 pg/mL en un volumen de 50 pL/pocillo) a RT durante 1 h. Las placas fueron lavadas tres veces con PBS-T (PBS 7,4, 0,05% de Tween 20), después tres veces con PBS y se añadió 50 pL/pocillo de un anticuerpo secundario conjugado a HRP (específico de dominio Fc de IgG humana, Jackson ImmunoResearch). Se incubó a RT durante 1 h y se volvió a lavar las placas. Se desarrollaron las señales ELISA en todos los pocillos añadiendo 50 pL de sustrato Sureblue TMB (KPL Inc) e incubando durante 5-20 minutos. La reacción HRP se detuvo añadiendo 50 pL de H2SO4 2N (VWR) y se leyeron las señales de absorbancia a 450 nm en un espectrofotómetro SpectraMax (Molecular Devices) o EnVision (PerkinElmer). Los datos se exportaron a Excel (Microsoft) y se representaron en GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.).
Resultados
Los residuos S67, R95 e I97 como determinantes de la reactividad cruzada de cyno: Los datos de unión mostrados en la Figura 101 claramente muestran que los residuos S67, R95 e I97 afectan a la reactividad cruzada de cyno de varios anticuerpos. Aunque la mutación de cyno-a-humano P67S impacta negativamente en la unión de CPA.7.002 y CPA.7.041, la mutación L95R/T97I cyno-a-humano mejora significativamente la unión de CPA.7.002, CPA.7.021, CPA.7.028 y CPA.7.041. Por otro lado, la mutación cyno-a-humano H61R no afecta a la unión de ninguno de los anticuerpos evaluados.
La unión relativa de las variantes cyno-a-humano sugiere tres grupos de epítopos: La unión relativa de los anticuerpos a las variantes cyno, humana e híbridas de PVRIG sugiere 3 grupos distintos de epítopos: el Grupo 1 se une a los residuos R95/I97 (CPA.7.021 y CPA.7.028). El Grupo 2 se une a los residuos S67 y R95/I97 (CPA.7.002 y CPA.7.041). El Grupo 3 no se une a los residuos S67 o R95/I97 (CPA.7.024 y CPA.7.050). Los grupos de epítopos muestran una fuerte correlación con el grado de reactividad cruzada de dichos anticuerpos (Figura 102).
Resumen y Conclusiones
El mapeado de epítopos restringido basado en variaciones cyno-a-humano identificó los residuos de ECD de PVRIG S67, R95 e I97, como determinantes de la reactividad cruzada de cyno en anticuerpos anti-PVRIG humana. La restauración completa de la unión a PVRIG cyno L95R/T97I para los anticuerpos CPA.7.021 y CPA.7.028 y la unión mejorada de CPA.7.002 a este mutante sugiere rotundamente que los residuos R95 e I97 son epítopos críticos de PVRIG humana para dichos anticuerpos. Estos descubrimientos también sugieren una posible vía para predecir la reactividad cruzada con ortólogos de PVRIG de primates no humanos en base a su secuencia de aminoácidos primaria.

Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo anti-PVRIG (Proteína que Contiene Dominio de Inmunoglobulina Relacionada con Receptor de Virus de la Polio) para uso en el tratamiento de cáncer, donde el anticuerpo activa células T y/o células NK.
2. Un anticuerpo anti-PVRIG para uso según la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo anti-PVRIG comprende: las secuencias vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3, vlCDR1, vlCDR2 y vlCDR3 seleccionadas del grupo que consiste en:
• la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 877, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 878, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 879, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 881, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 882 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 883, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 885, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 886, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 887, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 889, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 890 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 891, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 917, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 918, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 919, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 921, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 922 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 923, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 941, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 942, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 943, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 945, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 946 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 947, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 949, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 950, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 951, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 953, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 954 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 955, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 973, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 974, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 975, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 977, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 978 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 979, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 997, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 998, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 999, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1001, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1002 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1003, • la vhCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1037, vhCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1038, vhCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1039, vlCDR1 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1041, vlCDR2 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1042 y vlCDR3 tal como se establece en la SEQ ID NO: 1043.
3. Un anticuerpo anti-PVRIG para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, donde dicho anticuerpo comprende el dominio pesado variable tal como se establece en la SEQ ID NO: 884 y el dominio ligero variable tal como se establece en la SEQ ID NO: 888.
4. Un anticuerpo anti-PVRIG para uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho anticuerpo comprende el dominio pesado variable tal como se establece en la SEQ ID NO: 980 y el dominio variable ligero tal como se establece en la SEQ ID NO: 984.
5. Un anticuerpo anti-PVRIG para uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el anticuerpo anti-PVRIG es para uso en combinación con un anticuerpo inmunoestimulador, una terapia de citoquinas o un fármaco inmunomodulador.
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