CN115925917A - 抗pvrig蛋白抗体或抗体片段及其用途 - Google Patents

抗pvrig蛋白抗体或抗体片段及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种抗体或抗体片段。其包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；HCDR1选自GYTFSSFS、GYTFSTFA或GYSFTAYT，HCDR2选自ILPGSNST、ILPGINNT、ILPGGNNT或者INPYNGGT，HCDR3选自SSYWFAY、STYWFAY或AREGNYYGSRGDFDY；LCDR1选自QSLLNSGNQKNY或QTIVTN，LCDR2选自GAS或YAS；LCDR3选自QNAHSYPPT、QNAHSYPPA或QQSHSWPFT。所提供的抗体可以用于治疗癌症。

Description

抗PVRIG蛋白抗体或抗体片段及其用途
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体地，本发明涉及抗PVRIG蛋白抗体或抗体片段以及在癌症治疗方面的用途。
背景技术
肿瘤细胞通过多种机制逃避免疫系统的监视。免疫检查点通路用于自身耐受的维持以及活化的淋巴细胞效应功能的控制，但癌细胞可利用该通路来避免受到破坏。最近报道指出，PVRIG是一个非常重要的免疫检查点。PVRIG主要表达于活化的T细胞和NK细胞上，通过与表达在靶细胞或者DC细胞上的配体CD112相互作用，来抑制T细胞和NK细胞的效应功能。多种肿瘤细胞表面高表达CD112，从而通过PVRIG信号通路来抑制免疫系统的功能，实现免疫逃逸。
已经有研究表明，PVRIG的缺失，可以导致CD8+T细胞的效应功能增强。此外，使用阻断PVRIG与其配体CD112结合的抗体也能够有效恢复肿瘤浸润的CD8+T细胞的功能并抑制肿瘤的生长。已经有一种靶向人PVRIG的抗体正在进行临床实验，表现出了较好的治疗效果。
靶向PVRIG的抗体还需要进一步改进。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够促进抗肿瘤功能的抗体或抗体片段及其用途。所提供的抗体或者抗体片段，能够有效结合PVRIG，并能够阻断PVRIG与其配体CD112的结合。所提供的抗体或者抗体片段经过验证，与人PVRIG具有高的亲和力。且能够有效阻断人PVRIG和CD112的相互作用。
本发明的第一方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中HCDR1选自GYTFSSFS、GYTFSTFA或GYSFTAYT所示序列，
HCDR2选自ILPGSNST、ILPGINNT、ILPGGNNT或者INPYNGGT所示序列，
HCDR3选自SSYWFAY、STYWFAY或AREGNYYGSRGDFDY所示序列；
所述轻链包括轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中，LCDR1选自QSLLNSGNQKNY或QTIVTN所述序列，
LCDR2选自GAS或YAS所示序列；
LCDR3选自QNAHSYPPT、QNAHSYPPA或QQSHSWPFT所示序列。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段分别选自下列中的一种：
(1)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSSFS、ILPGSNST和SSYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPT；
(2)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSTFA、ILPGINNT和STYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPT；
(3)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSTFA、ILPGGNNT和STYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPA；
(4)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYSFTAYT、INPYNGGT和AREGNYYGSRGDFDY；所述轻链互补决定区包括QTIVTN、YAS和QQSHSWPFT。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段选自下列至少之一：
(1)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQID NO:1所示序列或者与SEQ ID NO:1所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ ID NO:2所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(2)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自SEQID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33所示序列或者与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(3)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQID NO:39所示序列或者与SEQ ID NO:39所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:40所示序列或者与SEQ ID NO:40所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(4)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQID NO:41所示序列或者与SEQ ID NO:41所示序列具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:42所示序列或者与SEQ ID NO:42所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(5)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQID NO:43所示序列或者与SEQ ID NO:43所示序列具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:44所示序列或者与SEQ ID NO:44所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在本发明的第四方面，本发明提供了一种可分离的核酸，所述核酸编码上述任一所述的抗体或抗体片段。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体含有上述所述的核酸。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞表达上述任一所述的抗体或抗体片段。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种上述所述抗体或抗体片段或者上述所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
在本发明的第九方面，本发明提供了一种药物联合，包括：(1)上述所述的抗体或抗体片段，或者上述所述的药物组合物；和(2)不同于(1)的用于癌症治疗的抗体。
在本发明的第十方面，本发明提供了一种预防或者治疗癌症的方法，包括给予受试者有效量的上述所述的抗体或抗体片段或者上述所述的药物组合物。
在本发明的第十一方面，本发明提供了一种在体外抑制样本中PVRIG蛋白活性的方法，包括将所述样本和上述任一项所述的抗体或抗体片段，或者上述所述的药物组合物接触。根据本发明的实施例，所述样本可以为细胞样本。
本发明所提供的抗体或抗体片段能够特异性结合PVRIG抗原，且能够大幅提升人PBMC的杀伤效果，并且在小鼠模型中表现出较好的抗肿瘤效果。本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1是本发明一种实施方式中的鼠源抗体结合人PVRIG的ELISA分析结果图；
图2是本发明一种实施方式中的鼠源抗体结合细胞膜表面人PVRIG的分析结果图；
图3是本发明一种实施方式中的鼠源抗体阻断人PVRIG与人CD112结合的分析结果图；
图4是本发明一种实施方式中的鼠源抗体竞争性结合细胞膜表面人PVRIG的分析结果图；
图5是本发明一种实施方式中的鼠源抗体结合细胞膜表面食蟹猕猴PVRIG以及小鼠PVRIG的活性结果图；
图6是本发明一种实施方式中的鼠源抗体结合食蟹猕猴PVRIG的ELISA分析结果图；
图7是本发明一种实施方式中的鼠源抗体检测NKG细胞系膜表面PVRIG的活性结果图；
图8是本发明一种实施方式中的鼠源抗体检测淋巴细胞表面PVRIG的活性结果图；
图9是本发明一种实施方式中人类肿瘤细胞系表面CD112表达的结果图；
图10是本发明一种实施方式中的鼠源抗体促进NK细胞的细胞毒作用的结果图；
图11是本发明一种实施方式中的鼠源抗体促进人PBMC的细胞毒作用的结果图；
图12是本发明一种实施方式中的鼠源抗体促进NK细胞的效应分子表达的结果图；
图13是本发明一种实施方式中的鼠源抗体促进NK细胞分泌IFN-γ的ELISA分析结果图；
图14是本发明一种实施方式中的鼠源抗体抑制肿瘤体内生长的分析结果图；
图15是本发明一种实施方式中的人源化抗体结合人PVRIG的ELISA分析结果图；
图16是本发明一种实施方式中的人源化抗体结合细胞膜表面人PVRIG的分析结果图；
图17是本发明一种实施方式中的人源化抗体结合细胞膜表面食蟹猕猴PVRIG的分析结果图；
图18是本发明一种实施方式中的人源化抗体阻断人PVRIG与人CD112结合的分析结果图；
图19是本发明一种实施方式中的人源化抗体促进人PBMC的细胞毒作用的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，实施例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，对于本文中的一些术语进行了说明和解释，这些说明和解释用于方便本领域技术人员理解，而不应看作是对本发明保护范围的限制。
本文中，术语“抗体”是指能与抗原相互作用的(例如可以通过结合、空间位阻、稳定化空间分布)包括通过二硫键连接的两个重链和两个轻链的蛋白质。每个重链包括重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包括轻链可变区(常缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域CL。重链可变区和轻链可变区分别可以进一步细分成互补决定区(CDR)。每个重链可变区和每个轻链可变区从氨基端到羧基端分别排列有三个CDR区：CDR1、CDR2和CDR3。本文中，为了区别，将重链的三个CDR区称为HCDR1、HCDR2和HCDR3；将轻链的三个CDR区称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
本文中所提到的抗体或抗体片段中的抗体包括但不限于单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化(camelised)抗体和嵌合抗体。抗体可以是任意同种型的，例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY等。
术语“抗体片段”是指抗体保持与抗原特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化空间分布)的能力的一个或多个部分。抗体片段的例子包括但不限于Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包括两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；以及分离的互补决定区(CDR)等。而且，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH通过单独的基因编码，但它们可以使用重组方法通过能够使其成为单个蛋白质链的合成连接部分接合，其中VL和VH区域成对形成单价分子(称作单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人,(1988)Science 242:423-426；和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883)。这些单链抗体也包括在术语“抗体片段”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术得到，筛选与完整抗体以相同方式具有实用性的片段。
“人源化抗体”通过是指：(i)源自非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)，该抗体基于人种系序列，或者(ii)是CDR-接枝的，其中可变结构域的CDR来自非人来源，而可变结构域的一个或多个框架是人来源的，并且如果存在恒定结构域，则是人来源的。
术语“嵌合抗体”是指具有来源于或对应于一物种中发现的序列的恒定抗体区和来源于另一物种的可变抗体区。优选地，恒定抗体区来源于或者对应于在人中例如在人种系细胞或体细胞中发现的序列，可变抗体区(例如，VH、VL、CDR或FR区)来源于非人动物例如小鼠、大鼠、兔或仓鼠中发现的序列。
如本文所用，术语“重组抗体”包括所有通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体，例如，自人免疫球蛋白基因转基因或转染色体动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体，自转化表达抗体的宿主细胞分离的抗体，自重组、组合人抗体文库选择和分离的抗体，和通过任何其他涉及剪接部分或全部人免疫球蛋白基因、序列至其他DNA序列的方式制备、表达、产生或分离的抗体。优选地，这些重组抗体具有可变区，其中框架区和CDR区源自人种系免疫球蛋白序列。
本文中，术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体表现出独特的结合位点，其对于特定表位具有独特的结合特异性和亲和力。
为此，本发明的一个方面，提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，和轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；其中HCDR1选自GYTFSSFS、GYTFSTFA或GYSFTAYT所示序列，HCDR2选自ILPGSNST、ILPGINNT、ILPGGNNT或者INPYNGGT所示序列，HCDR3选自SSYWFAY、STYWFAY或AREGNYYGSRGDFDY所示序列；LCDR1选自QSLLNSGNQKNY或QTIVTN所述序列，LCDR2选自GAS或YAS所示序列；LCDR3选自QNAHSYPPT、QNAHSYPPA或QQSHSWPFT所示序列。本发明提供的抗体或者抗体片段能够以高亲合力结合PVRIG蛋白。
在至少一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSSFS、ILPGSNST和SSYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPT。
在至少一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:1所示序列或者与SEQ IDNO:1所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；所述轻链可变区为SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ ID NO:2所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
其中重链可变区SEQ ID NO:1所示序列如下所示：
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKATGYTFSSFSIEWVKQRPGHGLAWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:1)。
轻链可变区SEQ ID NO:2所示序列如下所示：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAHSYPPTFAAGTKLELK(SEQ ID NO:2)。
根据所提供的抗体或抗体片段序列经过人源化改造，经过人源化改造的抗体或抗体片段如下所示：
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:3所示序列或者与SEQ ID NO:3所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些实施方式中，所述抗体为抗体4-hu1，所述抗体4-hu1的重链可变区为SEQ ID NO:3所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu1的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:4，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；抗体4-hu1的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:6所示序列或者与SEQ ID NO:6所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu2，所述抗体4-hu2的重链可变区为SEQ ID NO:6所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu2的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:7所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；抗体4-hu2的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:9所示序列或者与SEQ ID NO:9所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu3，所述抗体4-hu3的重链可变区为SEQ ID NO:9所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu3的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:10所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示；抗体4-hu3的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:12所示序列或者与SEQ ID NO:12所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu4，所述抗体4-hu4的重链可变区为SEQ ID NO:12所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu4的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:13所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示；抗体4-hu4的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:15所示序列或者与SEQ ID NO:15所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu5，所述抗体4-hu5的重链可变区为SEQ ID NO:15所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu5的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:16所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；抗体4-hu5的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:18所示序列或者与SEQ ID NO:18所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu6，所述抗体4-hu6的重链可变区为SEQ ID NO:18所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu6的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:19所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示；抗体4-hu6的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:21所示序列或者与SEQ ID NO:21所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu7，所述抗体4-hu7的重链可变区为SEQ ID NO:21所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu7的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:22所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:23所示；抗体4-hu7的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:24所示序列或者与SEQ ID NO:24所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体或抗体片段为抗体4-hu8，所述抗体4-hu8的重链可变区为SEQ ID NO:24所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu8的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:25所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:26所示；抗体4-hu8的轻链氨基酸序列为SEQ IDNO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:27所示序列或者与SEQ ID NO:27所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu9，所述抗体4-hu9的重链可变区为SEQ ID NO:27所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu9的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:28所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:29所示；抗体4-hu9的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:30所示序列或者与SEQ ID NO:30所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu10，所述抗体4-hu10的重链可变区为SEQ ID NO:30所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu10的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:31所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:32所示；抗体4-hu10的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
在至少一些实施方式中，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:33所示序列或者与SEQ ID NO:33所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
在至少一些优选实施方式中，所述抗体为抗体4-hu11，所述抗体4-hu11的重链可变区为SEQ ID NO:33所示序列，轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列。在至少一些优选实施方式中，抗体4-hu11的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:34所示，相应地编码该重链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:35所示；抗体4-hu11的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示，相应地编码该轻链氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示。
其中抗体4-hu1重链可变区SEQ ID NO:3所示序列为：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:3)。
抗体4-hu1重链氨基酸序列SEQ ID NO:4所示序列如下(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:4)。S228P突变是发生在铰链区的突变，该突变能够防止半抗体的形成(所谓半抗体即为IgG4抗体中半分子动态交换的现象)。
抗体4-hu1重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:5所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCGGCACCTTTTCCAGCTTCTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCTCCAACAGCACCAACTACAATGAGAAGTTTAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCTGACGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGTCCGAGGATACCGCTGTGTACTATTGTGCCAGGTATTGGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCTCCCTGTAGCCGGTCCACCAGCGAGTCCACCGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTATAGCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAATGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCTTGCCCCGCTCCAGAGTTCCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTATACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTATCCTAGCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATAGCGACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGATAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTCGGCAAG(SEQ ID NO:5)
抗体4-hu2重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:6)抗体4-hu2重链氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:7)
抗体4-hu2重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:8所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCGGCACCTTCTCCAGCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATTCCACCAACTATAATGAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCTGACGAGAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGTAGCTCCTATTGGTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCCCTGGCTCCCTGCAGCCGGAGCACCTCTGAGTCCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTACTTTCCTGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGTAATGTGGATCACAAGCCTAGCAATACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCCCCCTGCCCTCCCTGCCCAGCTCCTGAATTTCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTTTATACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAACAATTATAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATTCCGACGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG(SEQ ID NO:8)
抗体4-hu3重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:9)
抗体4-hu3重链氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:10)
抗体4-hu3重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:11所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCTCCTCCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCCGGCAGCAATTCCACCAATTATAATGAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCTTTACCGCCGACGAGTCCACCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCAGCTCCTATTGGTTTGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCCCTGGCTCCCTGTAGCCGGAGCACCAGCGAGTCCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAATAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCAGCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCCCCCTGCCCCCCTTGTCCTGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATTCCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTTTATACCCTGCCCCCCTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAATAACTATAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAG(SEQ ID NO:11)
抗体4-hu4重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:12)
抗体4-hu4重链氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:13)
抗体4-hu4重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:14所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCTCCTCCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCAATAGCACCAATTACAACGAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCTTTACCGCCGACGAGTCCACCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTTCCTCCTACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTTCCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTGGCTCCTTGCAGCCGGAGCACCTCCGAGTCCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTATTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTATAGCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCTTCCAATACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTATGGCCCCCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCCAGCGTCTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCTCGGCAAG(SEQ ID NO:14)
抗体4-hu5重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:15)
抗体4-hu5重链氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:16)
抗体4-hu5重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:17所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCGGCACCTTTTCCAGCTTTAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCTCCAACAGCACCAACTACAATGAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCTTCACCGCTGACACCTCCACCAACACCGCTTATATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGAGCGAGGATACCGCTGTGTACTATTGCAGCAGCTATTGGTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTTAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGAGCAACAAGGGCCTGCCTTCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCTCCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTCGGCAAG(SE Q ID NO:17)
抗体4-hu6重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:18)
抗体4-hu6重链氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示(IgG4 S228P突变)：
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抗体4-hu6重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:20所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCCGGCGGCACCTTCTCCTCCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAACTCCACCAATTATAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCTACCTTCACCGCTGACACCAGCACCAATACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTAGCAGCTATTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTTCCTCTGGCTCCTTGTTCCAGGTCCACCAGCGAGAGCACCGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCCGCTGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTATTCCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCCTGTCCTGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTTCCCCCTAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTTAATTGGTATGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCCCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTATCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAATAATTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGATTCCGATGGCAGCTTTTTCCTGTATTCCCGGCTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG(SEQ ID NO:20)
抗体4-hu7重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:21)
抗体4-hu7重链氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示(IgG4 S228P突变)：
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抗体4-hu7重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:23所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTTCCAGCTTCAGCATCGAGTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAACTCCACCAATTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCTGACGAGAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGCAGCAGCTATTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTGGCTCCTTGCAGCAGGTCCACCAGCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAATAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAATGTGGATCACAAGCCTAGCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCCCCTTGCCCTCCTTGCCCCGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTATACCCTGCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAATAATTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGATAGCGACGGCAGCTTTTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAG(SEQ ID NO:23)
抗体4-hu8重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示：
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抗体4-hu8重链氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示(IgG4 S228P突变)：
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抗体4-hu8重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:26所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTCTCCAGCTTTAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATTCCACCAACTATAACGAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCTTCACCGCCGATGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCAGCAGCTATTGGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCTTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCTCCGAATCCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTATAGCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCTAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAATGTGGATCACAAGCCCAGCAATACCAAGGTGGATAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCCCCTTGTCCTCCTTGTCCCGCCCCAGAGTTCCTGGGCGGCCCATCTGTGTTTCTGTTTCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGATGGCTCCTTTTTCCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAG(SEQ ID NO:26)
抗体4-hu9重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示：
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抗体4-hu9重链氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示(IgG4 S228P突变)：
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抗体4-hu9重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:29所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTCTCCAGCTTCAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATAGCACCAACTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCTTCACCGCCGATGAGAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCTGTGTATTATTGTAGCAGCTATTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGTTCCCGGTCCACCTCCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGATCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTATGGCCCTCCCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATTTCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTATAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATTCCGACGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG(SEQ ID NO:29)
抗体4-hu10重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEK FKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:30)
抗体4-hu10重链氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:31)
抗体4-hu10重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:32所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTTCCAGCTTCAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATAGCACCAATTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCTTCACCGCCGACACCAGCACCAATACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGTCCGAGGACACCGCTGTGTATTATTGCTCCAGCTATTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCAGCAGGTCCACCAGCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTTCCTGCTGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAATGTGGATCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTATACCCTGCCTCCCTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAATAATTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTCGGCAAG(SEQ ID NO:32)
抗体4-hu11重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEK FKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:33)
抗体4-hu11重链氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示(IgG4 S228P突变)：
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO:34)
抗体4-hu11重链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:35所示：
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTCAGCTCCTTCAGCATCGAGTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCAGCAATTCCACCAACTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCTACCTTCACCGCCGACACCTCCACCAATACCGCCTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCTCCAGCTACTGGTTTGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTGTAGCAGGAGCACCTCCGAGTCCACCGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCCTGTCCCCCTTGCCCCGCTCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCCCAGGTTTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATAGCGACGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTCGGCAAG(SEQ ID NO:35)
抗体4人源化抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAHSYPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:36)
抗体4人源化抗体轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示：
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAHSYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:37)
抗体4人源化抗体轻链氨基酸序列编码核酸序列如SEQ ID NO:38所示：
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCTACCATCAATTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAATAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCACCCGGGAGAGCGGCGTTCCTGACAGGTTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTATTATTGCCAGAATGCCCACTCCTATCCCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCTTCCGTGTTTATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAG
GTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATAGGGGCGAGTGC(SEQ ID NO:38)
在至少又一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSTFA、ILPGINNT和STYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPT。
在至少一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:39所示序列或者与SEQ IDNO:39所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:40所示序列或者与SEQ ID NO:40所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
其中重链可变区SEQ ID NO:39所示序列如下所示：
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTFAIDWIKQRPGPGLAWIGEILPGINNTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSTYWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:39)。
轻链可变区SEQ ID NO:40所示序列如下所示：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMTCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLMYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAHSYPPTFGAGTKLELK(SEQ ID NO:40)。
在至少另一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSTFA、ILPGGNNT和STYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPA。
在至少一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:41所示序列或者与SEQ IDNO:41所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:42所示序列或者与SEQ ID NO:42所示序列相比至少具有一个氨基酸取代的序列。
其中，重链可变区SEQ ID NO:41所示序列如下所示：
QVQLQQSGAELTKPGASVKISCKATGYTFSTFAIDWIKQRPGHGLAWIGEILPGGNNTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSTYWFAYWGQGTLVTVSA(SEQ ID NO:41)；
轻链可变区SEQ ID NO:42所示序列如下所示：
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLMYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAHSYPPAFGAGTKLELK(SEQ ID NO:42)。
在至少一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYSFTAYT、INPYNGGT和AREGNYYGSRGDFDY；所述轻链互补决定区包括QTIVTN、YAS和QQSHSWPFT。
在至少一些实施方式中，本发明提供了一种抗体或抗体片段，所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ ID NO:43所示序列或者与SEQ IDNO:43所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:44所示序列或者与SEQ ID NO:44所示序列相比至少具有一个氨基酸取代的序列。
其中重链可变区SEQ ID NO:43所示序列如下所示：
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTAYTMNWVKQSHGKNLEWIGLINPYNGGTSYNQKFKGKATLTGDKSSSTAYMELLSVTSEDSAVYFCAREGNYYGSRGDFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:43)
轻链可变区SEQ ID NO:44所示序列如下所示：
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQTIVTNILWYQQRTNGSPRLLIRYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIAHYYCQQSHSWPFTFGSGTKLEIK(SEQ ID NO:44)
上述所提到的抗体或者抗体片段是可分离的。术语“可分离的”是指除了所提供的抗体，基本上不含有其他具有不同抗原特异性的抗体或者抗体片段。而且，可分离的抗体或者抗体片段可以基本上不含其它的细胞材料和/或化学物质。因此，在一些方面，提供的抗体是分离的抗体，其已经与具有不同特异性的抗体分离。分离的抗体可以是单克隆抗体。分离的抗体可以是重组的单克隆抗体。但是，与目标表位、同种型或变体特异性结合的分离的抗体可以与其他相关抗原例如来自其他物种者(例如物种同源物)具有交叉反应性。
本文中，所提到的至少一个氨基酸取代可以为一个氨基酸取代、两个氨基酸取代、三个氨基酸取代、四个氨基酸取代或者五个氨基酸取代，甚至是更多。根据本发明的优选实施，所述氨基酸取代优选为保守氨基酸取代。本文中，保守氨基酸取代即不会损害抗体与PVRIG抗原的结合的氨基酸取代。
保守氨基酸取代包括一种类别中的氨基酸被相同类别的氨基酸取代，其中所述类别由共同的氨基酸侧链物理化学性质和自然中发现的同源蛋白质中的高取代频率来定义，如例如通过标准Dayhoff频率交换基质或BLOSUM基质确定的。已经将氨基酸侧链分类为六个大类，并且包括：I类(Cys)；II类(Ser、Thr、Pro、Ala、Gly)；III类(Asn、Asp、Gln、Glu)；IV类(His、Arg、Lys)；V类(Ile、Leu、Val、Met)以及VI类(Phe、Tyr、Trp)。举例来说，用另一III类残基如Asn、Gln或Glu取代Asp是保守取代。因此，抗EGFR抗体中预计的非必需氨基酸残基优选地用来自同一类别的另一种氨基酸残基置换。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域中熟知的。
本发明还提供了一种可分离的核酸，所述核酸编码上述提到的抗体或抗体片段。所提到的可分离的核酸是指核酸基本上可以与其他物质进行分离，而基本上不含有材料或者化学物质。核酸可存在于完整细胞中、细胞裂解产物中，或以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过包括碱性/SDS处理、CsCl显带、柱层析、琼脂糖凝胶电泳以及其它本领域中熟知的技术在内的标准技术来从其它细胞组分或其它杂质，例如其它细胞核酸或蛋白质中纯化出来时，核酸是“分离的”或“基本上纯的”。
本发明还提供了一种表达载体，所述表达载体含有所述的核酸。可以使用许多种表达载体来表达编码本文所提到的抗体或结合片段的多核苷酸。可以使用基于病毒的和非病毒的表达载体在哺乳动物宿主细胞中产生抗体。非病毒载体和系统包括质粒，附加型载体，通常具有用于表达蛋白质或RNA的表达组件，和人的人工染色体(参见，例如，Harrington等人,(1997)Nat Genet 15:345)。例如，可用于在哺乳动物(例如人)细胞中表达多核苷酸和多肽的非病毒载体包括pThioHis A,B&C、pcDNA3.1/His、pEBVHis A,B&C(Invitrogen,San Diego,CA)、MPSV载体和大量本领域已知的用于表达其他蛋白质的其他载体。可用的病毒载体包括基于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒的载体，基于SV40、乳头瘤病毒、HBP Epstein Barr病毒、牛痘病毒载体和塞姆利基森林病毒(SFV)的载体。参见，Brent等人,(1995)Annu.Rev.Microbiol.49:807；和Rosenfeld等人,(1992)Cell68:143。
表达载体含有与编码抗体或抗体片段的多核苷酸可操作连接的启动子和其他调节序列(例如增强子)。在一些实施方式中，可以使用诱导型启动子，以防止在诱导条件以外表达插入的序列。诱导型启动子包括但不限于阿拉伯糖、lacZ、金属硫蛋白启动子或热休克启动子。除启动子以外，还可以要求或需要其他的调节元件，用以高效表达抗体或抗体片段。这些元件通常包括ATG起始密码子和相邻的核糖体结合位点或其他序列。此外，通过包括适合于所用细胞系统的增强子，例如使用SV40增强子或CMV增强子，以增加哺乳动物宿主细胞中的表达。
本发明还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞表达上述所述的抗体或抗体片段。根据本发明的实施例，所述宿主细胞含有上述所述的表达载体，能够用来表达本申请提到的抗体。其中表达载体可以整合在宿主细胞的基因组上。所述宿主细胞可以为哺乳动物细胞，包括但不限于CHO或HEK293细胞。
用于带有并表达抗体或抗体片段的宿主细胞可以是原核细胞或真核细胞。例如原核宿主细胞大肠杆菌(E.coli)。其他适合使用的微生物宿主包括芽孢杆菌，例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，和其他肠杆菌科，例如沙门氏菌(Salmonella)、沙雷氏菌(Serratia)和各种假单胞菌(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以产生表达载体，其通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列。此外，这些宿主细胞中还含有启动子，例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常任选地与操作子序列一起控制表达，并具有核糖体结合位点序列等，用于引发和完成转录和翻译。也可以使用其他的微生物例如酵母来表达本公开内容的多肽。也可以与杆状病毒载体结合使用昆虫细胞。
在一些优选实施方式中，使用哺乳动物宿主细胞表达和产生本公开内容的抗PVRIG抗体或抗体片段。例如，它们可以是表达内源性免疫球蛋白基因的杂交瘤细胞系。优选地，使用带有外源性表达载体的哺乳动物细胞系，包括任何正常的致死或者正常或异常的永生动物或人细胞，例如，SP2/0骨髓瘤细胞、CHO细胞、HeLa细胞、PER.C6细胞、COS细胞、HKB11细胞、NS0细胞。例如，已经开发出多种能够分泌完整免疫球蛋白的适当宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、转化的B-细胞和杂交瘤。宿主细胞中含有的合适的启动子可以是组成型、细胞类型特异性、阶段特异性和/或可调控或可调节的。可用的启动子包括但不限于，金属硫蛋白启动子、组成型腺病毒主要晚期启动子、地塞米松诱导型MMTV启动子、SV40启动子、MRP pollll启动子、组成型MPSV启动子、组成型CMV启动子和本领域已知的启动子-增强子组合。
可以通过熟知的方法将含有目标多核苷酸序列(例如，编码抗体多肽的核酸以及表达控制序列)的载体转入至宿主细胞中，其根据细胞宿主的类型而变化。例如，对于原核细胞常使用氯化钙转染，而对于其他细胞宿主可以使用磷酸钙处理或电穿孔。其他方法例如可以为电穿孔、磷酸钙处理、脂质体介导的转化、注射和微注射、病毒体、免疫脂质体、聚阳离子核酸缀合物、裸DNA、人工病毒体等。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括上述所述的抗体和药学上可接受的载体。
药学上可接受的载体包括任何和所有生理相容的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，该载体适于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮施用(例如，通过注射或输注施用)。根据不同的施用途径，可以将活性化合物，即抗体包裹在某种材料中，以保护该化合物免受酸作用和其它可能使该化合物失活的自然条件的影响。
所提供的药物组合物可以通过本领域已知的多种方法施用。抗体可以与合适的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物、透皮贴片和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。许多用于制备此类制剂的方法已经获得专利或是本领域技术人员普遍已知的。
根据本发明的实施例，所提供的抗体可用某种材料包裹或与某种材料共同施用该组合物以防止其失活。例如，可以将组合物在适当的载体，例如脂质体或稀释剂中施用给受试者。可接受的稀释剂包括盐水和水性缓冲液。脂质体包括水包油包水CGF乳液以及常规脂质体。
根据本发明的实施例，药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散体等制备为无菌注射溶液或无菌粉末。本文所提供的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的常规方法配制成为药学上可接受的剂型。
本发明还提供了上述所述的抗体或者上述所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中用途。
本发明还提供了一种预防或者治疗癌症的方法，包括给予受试者有效量的上述所述的抗体或者上述所述的药物组合物。
“治疗有效量”或“有效量”是指引起期望生物响应所需的PVRIG抗体的量。根据本发明，治疗有效量是治疗和/或预防疾病所需的PVRIG抗体的量。
本文提供的抗体的治疗有效量取决于抗体和组合的相对活性(例如，抑制细胞生长的活性)，并且取决于接受治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重性、施用方式等而变化，本领域普通技术人员可以很容易地确定治疗有效量。用于施用的剂量可以在以下范围内：例如，约1ng至约6000mg、约5ng至约5500mg、约10ng至约5000mg、约20ng至约4500mg、约30ng至约5000mg、约300ng至约4,500mg、约500ng至约4,000mg、约1μg至约3,500mg、约5μg至约3,000mg、约10μg至约2,600mg、约20μg至约2,575mg、约30μg至约2,550mg、约40μg至约2,500mg、约50μg至约2,475mg、约100μg至约2,450mg、约200μg至约2,425mg、约300μg至约2,000、约400μg至约1,175mg、约500μg至约1,150mg、约0.5mg至约1,125mg、约1mg至约1,100mg、约1.25mg至约1,075mg、约1.5mg至约1,050mg、约2.0mg至约1,025mg、约2.5mg至约1,000mg、约3.0mg至约975mg、约3.5mg至约950mg、约4.0mg至约925mg、约4.5mg至约900mg、约5mg至约875mg、约10mg至约850mg、约20mg至约825mg、约30mg至约800mg、约40mg至约775mg、约50mg至约750mg、约100mg至约725mg、约200mg至约700mg、约300mg至约675mg、约400mg至约650mg、约500mg或约525mg至约625mg的抗体。
本文中，“受试者”是指任何动物，包括啮齿类动物，例如小鼠或大鼠，灵长类动物，例如食蟹猴(Macaca fascicularis)、恒河猴(Macaca mulatta)或人(Homo sapiens)。优选地，受试者是灵长类动物，更优选人。本文中，“预防”是指致力于防止疾病发作或延缓疾病发作的方法。
本文中，癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及白血病。更具体的示例包括：鳞状上皮细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃癌、胰腺癌、胶质细胞肿瘤如成胶质细胞瘤和神经纤维瘤病、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、黑色素瘤、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾脏癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌以及各种类型的头颈癌。在具体的实施方案中，使用本文公开的方法治疗或诊断的癌症选自黑色素瘤、乳癌、卵巢癌、肾癌、肠胃/结肠癌、肺癌以及前列腺癌。根据本发明的优选实施例，所述癌症包括但不限于黑色素瘤、肺癌、头颈癌、结直肠癌、胰腺癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌或肝癌。
本发明还提供了一种药物联合，其除了上述提到的抗体或抗体片段之外，还可以含有其他用于治疗癌症的药物。组合物可以单独施用或以联合治疗施用，即，与其它药剂联合施用。例如，联合治疗可以包括本文提供的组合物以及至少一种或多种另外的治疗剂如本文描述的抗癌剂。该组合物还可以与放射治疗和/或手术联合施用。抗EGFR抗体的特定组合也可以与或不与另外的治疗剂分开施用或顺序施用。
例如，所提供的其他治疗癌症的药物可以为抗体，例如可以为抗CTLA-4抗体、抗PD-L1抗体、抗LAG-3抗体、抗TIM-3抗体、抗BTLA抗体或者其他抗肿瘤抗体组合应用。
本发明所提供的示例性抗体，无论是鼠源抗体还是人源化抗体均能够以高亲和力结合人PVRIG蛋白，并且能够促进人PBMC对肿瘤细胞的杀伤。此外，所提供的抗体还表现出了在体内抑制肿瘤生长的活性。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
(I)抗人PVRIG单克隆抗体的制备
参照常规杂交瘤细胞融合技术稍作调整后制备抗PVRIG的单克隆抗体，具体如下：
(1)重组融合蛋白的制备
人工合成编码人PVRIG蛋白(如SEQ ID NO:45所示)的全长基因，并使用PCR扩增如SEQ ID NO:46所示的蛋白片段，并在目的序列的C端引入人IgG1恒定区(如SEQ ID NO:47所示)的蛋白片段，并克隆入pLVX-IRES-zsGreen载体中，通过包装慢病毒，感染HEK293T细胞系，得到过表达人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白，随后通过常规细胞培养，收集细胞培养上清，并通过Protein G亲和层析方法(GE Healthcare)纯化得到纯度大于90％的重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白。质谱鉴定显示，目的蛋白的肽段和PVRIG序列匹配，证明该重组蛋白即为重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白。
人PVRIG全长氨基酸序列：
MRTEAQVPALQPPEPGLEGAMGHRTLVLPWVLLTLCVTAGTPEVWVQVRMEATELSSFTIRCGFLGSGSISLVTVSWGGPNGAGGTTLAVLHPERGIRQWAPARQARWETQSSISLILEGSGASSPCANTTFCCKFASFPEGSWEACGSLPPSSDPGLSAPPTPAPILRADLAGILGVSGVLLFGCVYLLHLLRRHKHRPAPRLQPSRTSPQAPRARAWAPSQASQAALHVPYATINTSCRPATLDTAHPHGGPSWWASLPTHAAHRPQGPAAWASTPIPARGSFVSVENGLYAQAGERPPHTGPGLTLFPDPRGPRAMEGPLGVR(SEQ ID NO:45)
人PVRIG胞外段氨基酸序列：(41-172)
TPEVWVQVRMEATELSSFTIRCGFLGSGSISLVTVSWGGPNGAGGTTLAVLHPERGIRQWAPARQARWETQSSISLILEGSGASSPCANTTFCCKFASFPEGSWEACGSLPPSSDPGLSAPPTPAPILRADL(SEQ ID NO:46)
人IgG1恒定区氨基酸序列：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:47)
采用类似地的方法，我们制备得到了重组人CD112-人IgG1 Fc融合蛋白。其中人CD112全长氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示，人CD112胞外段氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示。
人CD112全长氨基酸序列：
MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGGIIGGIIAAIIATAVAATGILICRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV(SEQ ID NO:48)
人CD112胞外段氨基酸序列：(32-360)
QDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGG(SEQ ID NO:49)
采用类似地的方法，制备获得了食蟹猕猴PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白。其中食蟹猕猴PVRIG氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，食蟹猕猴PVRIG胞外段序列如SEQ ID NO:51所示。
食蟹猕猴PVRIG氨基酸序列：
MRTEAQVLALQSPEPGLEGAMGRRTLALPWVLLTLCVTAGTPEVWVQVQMEATELSSFTVHCGFLGPGSISLVTVSWGGPDGAGGTKLAVLHPELGTRQWAPARQARWETQSSISLALEDSGASSPFANTTFCCKFASFPEGSWESCGSLPPSSDPGLSAPPTPVPILRADLAGILGLSGVLLFGCGYLLHLLRRQKHRPTPRLQPSHTNSQALTAQAWAPSQASQAALHDPYATINTSFCPATLDTAHPNGWASLPTHAAHQPQGPAASASTPILARGSFVSVENGLYTQAGERPPHTGPGLTLFPDCRGPRALEGRFGVR(SEQ ID NO:50)
食蟹猕猴PVRIG胞外段序列：(39-171)
AGTPEVWVQVQMEATELSSFTVHCGFLGPGSISLVTVSWGGPDGAGGTKLAVLHPELGTRQWAPARQARWETQSSISLALEDSGASSPFANTTFCCKFASFPEGSWESCGSLPPSSDPGLSAPPTPVPILRAD(SEQ ID NO:51)
(2)动物免疫、杂交瘤细胞融合及克隆筛选
将上述获得的重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白与等体积完全弗氏佐剂(CFA)充分混合，初次免疫8-10周龄的BALB/c雌鼠(购自上海莱斯克，体重20g左右)，每只小鼠腹腔注射40-60μg的重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白；以后每2周免疫一次，相同剂量的重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白与等体积不完全弗氏佐剂混合，总共免疫5次后，ELISA检测小鼠血清效价不低于1:105时，最后注射40-60μg的重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白进行强化。在强化后的第三天，使用标准技术分离脾细胞，并和鼠骨髓瘤细胞SP2/0细胞(ATCC编号CRL-1581)融合。
在ELISA和流式细胞术两者鉴定都显示阳性信号的杂交瘤细胞进行亚克隆筛选，得到四株杂交瘤细胞。
(3)单克隆抗体的表达及纯化
单克隆抗体的制备采用小鼠腹腔接种法，首先500μl无菌的液体石蜡通过腹腔免疫8-10周龄的BALB/c雌鼠，一周之后腹腔注射1×106杂交瘤细胞，7-10天左右收集腹水，高速离心收集上清。通过上述方法获得的上清，用Protein G亲和层析方法纯化得到纯度高于95％的单克隆抗体。
(II)抗PVRIG单克隆抗体的可变区序列
将候选杂交瘤细胞总数量培养到106，800rpm离心10分钟收集细胞，并以Trizol试剂盒(Invitrogen)提取总RNA，以总RNA为模板，逆转录合成cDNA文库(Invitrogen)，又以cDNA为模板PCR扩增杂交瘤细胞的所对应的可变区核酸序列。随后通过测序得到杂交瘤细胞的重链和轻链可变区氨基酸序列(包括CDR序列)。
其中，将氨基酸序列鉴定，各抗体序列分别如下：
编号为抗体4的重链可变区序列如SEQ ID NO:1所示，轻链可变区序列如SEQ IDNO:2所示；编号为抗体1的重链可变区序列如SEQ ID NO:39所示，轻链可变区序列如SEQ IDNO:40所示；编号为抗体2的重链可变区序列如SEQ ID NO:41所示，轻链可变区序列如SEQID NO:42所示；编号为抗体3的重链可变区序列如SEQ ID NO:43所示，轻链可变区序列如SEQ ID NO:44所示。
上述编号为抗体1，抗体2，抗体3和抗体4的抗体均为鼠源抗体。
(III)人源化抗体的表达和纯化：
对上述不同的抗体可以进行人源化，其中以抗体4为例，进行了人源化，所获得的人源化抗体包括但不限于抗体4-hu1至抗体4-hu11，可大致通过如下方法进行制备和纯化。通过人工基因合成，得到含有编码人源化抗体的HC和LC核酸序列的载体，取合适的宿主细胞，例如HEK293或CHO，采用最佳预设HC：LC载体比例(比如1:1或1:2)作为可分泌抗体的的表达系统进行瞬时或稳定转染。随后，可收集细胞培养上清并通过Protein A亲和层析纯化得到纯度大于95％的人源化抗体。
实施例2
实施例2评价了上述实施例1制备的不同的抗体的活性以及抗原结合的特异性。其中所用到的同型对照为小鼠IgG1,κ(购自Biolegend)。
采用ELISA评价了不同克隆的鼠源抗体结合人PVRIG-Fc融合蛋白的活性。实验过程如下：
用1×PBS(磷酸盐缓冲液)稀释重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白至1.0μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％的Tween20-PBS)清洗3遍，1％的BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，分别加入经过倍比稀释的鼠源抗体(抗体1，抗体2，抗体3或抗体4)，设置8个浓度，用小鼠IgG1(购自Biolegend)作为阴性对照，100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(购自博士德生物，1∶10000稀释)，37℃孵育1小时。清洗后每孔加入100μl的TMB底物液，避光显色10-15分钟，加入终止液(2M的H2SO4)100μl/孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD450)，结果见图1。
从图1可以看出，不同克隆的鼠源抗体均能够特异性结合人PVRIG-Fc融合蛋白。
采用流式细胞术评价了不同克隆的鼠源抗体结合细胞膜表面人PVRIG蛋白的活性。实验过程如下：
收集293T-人PVRIG细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，分别加入不同浓度的各鼠源抗体(抗体1，抗体2，抗体3或者抗体4)，4℃孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的山羊抗小鼠IgG抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测。
从图2给出的结果可以看出，不同克隆的鼠源抗体均能够特异性结合细胞膜表面的人PVRIG蛋白。
采用流式细胞术评价了不同克隆的鼠源抗体阻断人PVRIG与其配体CD112结合的活性。实验过程如下：
收集293T-人CD112细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，分别加入不同浓度的各鼠源抗体(抗体1，抗体2，抗体3或者抗体4)以及10μg/ml的人CD112-人IgG1 Fc融合蛋白，4℃孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的小鼠抗人IgG-Fc抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSRII)进行检测。
从图3的结果来看，不同克隆的鼠源抗体均能够有效阻断人PVRIG与其配体CD112的结合。
采用流式细胞术评价了不同克隆的鼠源抗体竞争性结合人PVRIG蛋白的活性。实验过程如下：
收集293T-human PVRIG细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，分别加入10μg/ml的对照抗体小鼠IgG1以及不同克隆的各鼠源抗体(抗体1，抗体2，抗体3或者抗体4)，4℃孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的抗体4抗体，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，分析统计结果如图4所示。
从图4可以看出，抗体1，抗体2和抗体4具有竞争性结合人PVRIG的关系，而抗体3与抗体4结合不同的人PVRIG表位。
采用流式细胞术评价了鼠源抗体结合食蟹猕猴以及小鼠PVRIG的活性。实验过程如下：
收集293T-食蟹猕猴PVRIG以及293T-小鼠PVRIG细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，并加入AF647标记的抗体4鼠源抗体，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，分析统计结果如图5所示。
从图5可以看出，抗体4鼠源抗体能够结合食蟹猕猴的PVRIG蛋白而不能够结合小鼠的PVRIG蛋白。
采用ELISA的方法评价了鼠源抗体的食蟹猕猴PVRIG结合活性。实验过程如下：
用1×PBS(磷酸盐缓冲液)稀释重组食蟹猕猴PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白至1.0μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％的Tween20-PBS)清洗3遍，1％的BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，分别加入经过倍比稀释的鼠源抗体(抗体4)，设置11个浓度，用小鼠IgG1作为阴性对照，100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体(购自博士德生物，1∶10000稀释)，37℃孵育1小时。清洗后每孔加入100μl的TMB底物液，避光显色10-15分钟，加入终止液(2M的H2SO4)100μl/孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD450)，结果见图6。可以看出，抗体4鼠源抗体能够结合食蟹猕猴的PVRIG蛋白。
采用流式细胞术评价了鼠源抗体结合NKG细胞系膜表面PVRIG的活性。实验过程如下：
收集NKG细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，并加入10μl小鼠血清，4℃封闭30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的抗体4，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，检测结果如图7所示。
从图7可以看出，鼠源抗体4能够结合NKG细胞系表面的人PVRIG蛋白。
采用流式细胞术评价了鼠源抗体结合淋巴细胞膜表面PVRIG的活性。实验过程如下：
通过使用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，GE Healthcare)离心分离法，400g，30分钟，从正常人外周血中分离淋巴细胞，用1×PBS重悬，进行细胞计数。随后在每个1.5mlEp管中放入1×106个细胞，并加入10μl小鼠血清，4℃封闭30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的抗体4，PercP-Cy5.5标记的小鼠抗人CD3抗体(购自Biolegend)，PE-Cy7标记的小鼠抗人CD8抗体(购自BD)，BV421标记的小鼠抗人CD4抗体(购自BD)和BV605标记的小鼠抗人CD56抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，检测结果如图8所示。
从图8可以看出，鼠源抗体4可以结合人淋巴细胞膜表面的PVRIG蛋白。
采用流式细胞术对肿瘤细胞系表面CD112的表达进行了评价。实验过程如下：
收集SW620结肠癌细胞系(中科院上海细胞库)，A375黑色素瘤细胞系(中科院上海细胞库)和SK-OV-3卵巢癌细胞系(中科院上海细胞库)，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，并加入10μl小鼠血清，4℃封闭30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入APC标记的小鼠抗人CD112抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，检测结果如图9所示。
从图9可以看出，在多种肿瘤细胞系表面都高表达PVRIG的配体CD112。
实验继续评价了鼠源抗体促进NK细胞的细胞毒作用。实验过程如下：
通过使用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，GE Healthcare)离心分离法，400g，30分钟，从正常人外周血中分离淋巴细胞，用1×PBS重悬；随后应用NK细胞分选试剂盒(美天妮，Human NK Cell Isolation Kit)纯化出NK细胞。随后以纯化的NK细胞为效应细胞，CFSE(购自Thermo Scientific)标记的SW620结肠癌细胞系作为靶细胞，按照1.25：1，2.5：1和5：1的效靶比，放入96孔圆底板中，在培养体系中分别加入10μg/ml的小鼠IgG1作为对照抗体以及鼠源抗体(抗体4)，250g，离心4分钟，随后于37℃孵育4小时。采用7AAD标记被杀伤的肿瘤细胞，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，分析统计结果如图10所示。
从图10可以看出，在不同的效靶比条件下，鼠源抗体(抗体4)都能够大幅促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。
实验进一步评价了鼠源抗体促进人PBMC的细胞毒作用。实验过程如下：
通过使用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，GE Healthcare)离心分离法，400g，30分钟，从正常人外周血中分离淋巴细胞，用1×PBS重悬；随后以人PBMC细胞为效应细胞，CFSE(购自Thermo Scientific)标记的SW620结肠癌细胞系或者A375黑色素瘤细胞或者SK-OV-3卵巢癌细胞作为靶细胞，按照12.5：1，25：1和50：1的效靶比，放入96孔圆底板中，在培养体系中分别加入10μg/ml的小鼠IgG1作为对照抗体以及鼠源抗体(抗体4)，250g，离心4分钟，随后于37℃孵育4小时。采用7AAD标记被杀伤的肿瘤细胞，并使用流式细胞仪(BD LSRII)进行检测，分析统计结果如图11所示。
从图11可以看出，在不同的效靶比条件下，鼠源抗体Antibody 4都能够大幅促进人PBMC细胞对多种肿瘤细胞的杀伤。
实验进一步采用流式细胞术评价了鼠源抗体促进NK细胞的效应分子表达效果。实验过程如下：
通过使用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，GE Healthcare)离心分离法，400g，30分钟，从正常人外周血中分离淋巴细胞，用1×PBS重悬；随后以人PBMC细胞为效应细胞，SW620结肠癌细胞系作为靶细胞，按照25：1的效靶比，放入96孔圆底板中，在培养体系中分别加入10μg/ml的小鼠IgG1作为对照抗体以及鼠源抗体(抗体4)，250g，离心4分钟，随后于37℃孵育24小时。在最后4小时孵育时加入2.5μg/ml的莫能霉素(购自Sigma)和BV510标记的小鼠抗人CD107a抗体(购自Biolegend)。孵育结束后，收集细胞，并用1×PBS洗涤，以100μl的1×PBS重悬细胞，加入10μl的小鼠血清，4℃封闭30分钟。以1×PBS洗涤，以100μl的1×PBS重悬细胞，分别加入PercP-Cy5.5标记的小鼠抗人CD3抗体(购自Biolegend)，PE-Cy7标记的小鼠抗人CD8抗体(购自BD)，BV421标记的小鼠抗人CD4抗体(购自BD)和BV605标记的小鼠抗人CD56抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，350g离心5分钟收集细胞。以Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer(购自eBioscience)重悬细胞，并加入FITC标记的小鼠抗人IFN-γ(购自Biolegend)和PE标记的小鼠抗人TNF-α(购自Biolegend)，4℃孵育1小时。后加入1×PBS洗涤两遍，500g离心5分钟收集细胞。以200μl的1×PBS重悬细胞，并使用流式细胞仪(BD FACS Celesta)进行检测，分析统计结果如图12所示。
从图12可以看出，鼠源抗体(抗体4)能够增强NK细胞的脱颗粒能力并促进细胞因子的分泌。
实验通过ELISA的方法评价了鼠源抗体促进NK细胞细胞因子的分泌的效果。实验过程如下：通过使用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，GE Healthcare)离心分离法，400g，30分钟，从正常人外周血中分离淋巴细胞，用1×PBS重悬；随后应用NK细胞分选试剂盒(美天妮，Human NK Cell Isolation Kit)纯化出NK细胞。随后以纯化的NK细胞为效应细胞，SW620结肠癌细胞系作为靶细胞，按照2.5：1的效靶比，放入96孔圆底板中，在培养体系中分别加入10μg/ml的小鼠IgG1作为对照抗体以及鼠源抗体(抗体4)，250g，离心4分钟，随后于37℃孵育18小时。随后收集细胞培养上清，通过ELISA试剂盒(购自达科为)来检测培养上清中IFN-γ的含量。ELISA分析统计结果如图13所示。可以看出，鼠源抗体(抗体4)能够促进NK细胞分泌IFN-γ。
实验评价了鼠源抗体抑制肿瘤生长的活性。实验过程如下：
体外扩增SW620结肠癌细胞(中科院上海细胞库)，收集细胞，并用1×PBS洗涤两遍，800rpm离心5分钟收集细胞，并用无菌生理盐水重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为1×107个/ml，接种100μl细胞于6-8周龄的B-NDG小鼠右侧腋窝皮下，在第7天时，将荷瘤小鼠进行随机分组，并进行尾静脉转输经过Ficoll分离得到的人PBMC细胞，1×107个细胞每只小鼠。于次日开始进行PBS或者小鼠IgG对照抗体或者鼠源抗体Antibody 4(250μg/只)的腹腔注射，每3天给药1次，共治疗5次。每3天测量一次小鼠皮下肿瘤的长边和短边，并对小鼠进行称重。按照经验公式(肿瘤大小＝长边×短边×短边/2)可以计算得到肿瘤大小，结果见图14，结果说明鼠源抗体(抗体4)能够在体内抑制皮下肿瘤的生长。
实验进一步通过ELISA的方法评价了人源化抗体结合人PVRIG的活性。实验过程如下：
用1×PBS(磷酸盐缓冲液)稀释重组人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白至1.0μg/ml，100μl/孔，包被96孔ELISA板，4℃过夜，用PBST(0.05％的Tween20-PBS)清洗3遍，1％的BSA封闭，37℃孵育2小时。PBST清洗3遍，分别加入经过倍比稀释的人源化抗体，设置8个浓度，用人IgG4(购自Biolegend)作为阴性对照，100μl/孔，37℃孵育1小时。PBST清洗3遍，每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗人IgG4-Fc抗体(购自Southern Biotech，1∶5000稀释)，37℃孵育1小时。清洗后每孔加入100μl的TMB底物液，避光显色10-15分钟，加入终止液(2M的H2SO4)100μl/孔，终止后立即用酶标仪进行检测，读取波长450nm的吸光值(OD450)，结果见图15。
从图15可以看出，人源化抗体都能够特异性结合人PVRIG蛋白。
实验通过流式细胞术评价了人源化抗体结合人PVRIG的活性。
收集293T-human PVRIG细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，分别加入不同浓度的各人源化抗体，4℃孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的小鼠抗人IgG-Fc抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，分析统计结果如图16所示。可以看出，各人源化抗体均能够特异性结合细胞膜表面的人PVRIG蛋白。
实验通过流式细胞术评价了人源化抗体结合食蟹猕猴PVRIG的活性。实验过程如下：
收集293T-食蟹猕猴PVRIG细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，分别加入不同浓度的各人源化抗体，4℃孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的小鼠抗人IgG-Fc抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，分析统计结果如图17所示。
从图17可以看出，各人源化抗体均能够特异性结合细胞膜表面的食蟹猕猴PVRIG蛋白。
实验采用流式细胞术评价了人源化抗体阻断人PVRIG与配体结合的活性。实验过程如下：
收集293T-人CD112细胞系，用1×PBS洗涤重悬之后，进行细胞计数。随后在每个1.5ml Ep管中放入2×105个细胞，分别加入人源化抗体以及10μg/ml的人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白，4℃孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤，3500rpm离心5分钟收集细胞。用100μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并加入AF647标记的小鼠抗人IgG-Fc抗体(购自Biolegend)，4℃避光孵育30分钟，随后加入1×PBS洗涤两遍，3500rpm离心5分钟收集细胞。用200μl的1×PBS重悬细胞沉淀，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测。分析统计结果如图18所示，人源化抗体均能够有效阻断人PVRIG与其配体CD112的结合。
实验进一步评价了人源化抗体促进人PBMC的细胞毒作用。实验过程如下：
通过使用Ficoll(外周血淋巴细胞分离液，GE Healthcare)离心分离法，400g，30分钟，从正常人外周血中分离淋巴细胞，用1×PBS重悬；随后以人PBMC细胞为效应细胞，CFSE(购自Thermo Scientific)标记的SW620结肠癌细胞系作为靶细胞，按照25：1的效靶比，放入96孔圆底板中，在培养体系中分别加入10μg/ml的人IgG4作为对照抗体，鼠源抗体(抗体4)及人源化抗体，250g，离心4分钟，随后于37℃孵育4小时。采用7AAD标记被杀伤的肿瘤细胞，并使用流式细胞仪(BD LSR II)进行检测，分析统计结果如图19所示。可以看出，人源化抗体均能够大幅促进人PBMC细胞对肿瘤细胞的杀伤。
表面等离子体共振(SPR)测定亲和力常数：
采用表面等离子体共振(Biacore)测定方法对本发明抗体对人PVRIG的结合动力学以及解离平衡常数(KD)进行测定。简而言之，在CM5芯片上包被人PVRIG-人IgG1 Fc融合蛋白，进行封闭之后，将不同浓度的抗体溶液以固定流速通过CM5芯片，并与抗原结合2分钟，随后转移至解离缓冲液中6分钟进行解离率的测定。用1:1结合模型分析其动力学。
在大致如上所述的实验中，测定得到鼠源抗体的亲和力如表1所示，以及各人源化抗体的亲和力如表2所示。
表1鼠源抗体亲和力大小
Figure BDA0002965773080000281
表2人源化抗体亲和力大小
Figure BDA0002965773080000282
从上述内容可以看出，所获得的抗体1～4以及对应的抗体4的人源化抗体均表现出优异的PVRIG的亲和力，且能够表现出良好的抗肿瘤效果。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (11)

1.一种抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及轻链互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3；
其中HCDR1选自GYTFSSFS、GYTFSTFA或GYSFTAYT所示序列，
HCDR2选自ILPGSNST、ILPGINNT、ILPGGNNT或者INPYNGGT所示序列，
HCDR3选自SSYWFAY、STYWFAY或AREGNYYGSRGDFDY所示序列；
其中，LCDR1选自QSLLNSGNQKNY或QTIVTN所述序列，
LCDR2选自GAS或YAS所示序列；
LCDR3选自QNAHSYPPT、QNAHSYPPA或QQSHSWPFT所示序列。
2.一种抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段分别选自下列中的一种：
(1)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSSFS、ILPGSNST和SSYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPT；
(2)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSTFA、ILPGINNT和STYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPT；
(3)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYTFSTFA、ILPGGNNT和STYWFAY；所述轻链互补决定区包括QSLLNSGNQKNY、GAS和QNAHSYPPA；
(4)所述抗体或抗体片段包括重链互补决定区和轻链互补决定区，所述重链互补决定区包括GYSFTAYT、INPYNGGT和AREGNYYGSRGDFDY；所述轻链互补决定区包括QTIVTN、YAS和QQSHSWPFT。
3.一种抗体或抗体片段，其特征在于，所述抗体或抗体片段选自下列至少之一：
(1)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ IDNO:1所示序列或者与SEQ ID NO:1所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:2所示序列或者与SEQ ID NO:2所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(2)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区选自SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33所示序列或者与SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:33所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:36所示序列或者与SEQ ID NO:36所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(3)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ IDNO:39所示序列或者与SEQ ID NO:39所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:40所示序列或者与SEQ ID NO:40所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(4)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ IDNO:41所示序列或者与SEQ ID NO:41所示序列具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:42所示序列或者与SEQ ID NO:42所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
(5)所述抗体或抗体片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区为SEQ IDNO:43所示序列或者与SEQ ID NO:43所示序列具有至少一个氨基酸取代的序列，所述轻链可变区为SEQ ID NO:44所示序列或者与SEQ ID NO:44所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列。
4.根据权利要求3所述的抗体或抗体片段，其特征在于，包括重链和轻链，所述重链氨基酸序列为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34所示序列，或者与SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:34所示序列相比具有至少一个氨基酸取代的序列；
所述轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:37所示序列或者与SEQ ID NO:37所示序列相比至少具有一个氨基酸取代的序列。
5.一种可分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗体片段。
6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求5所述的核酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞表达权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗体片段；
任选地，所述宿主细胞中含有权利要求6所述的表达载体。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗体片段和药学上可接受的载体。
9.权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗体片段或者权利要求8所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途。
10.一种药物联合，其特征在于，包括：
(1)权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗体片段，或者权利要求8所述的药物组合物；和
(2)不同与(1)的用于癌症治疗的抗体。
11.一种在体外抑制样本中PVRIG蛋白活性的方法，其特征在于，包括将所述样本和权利要求1～4中任一项所述的抗体或抗体片段，或者权利要求8所述的药物组合物接触。
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