KR20230041810A - 항-pvrig 단백질 항체 또는 항체 단편 및 이의 용도 - Google Patents

항-pvrig 단백질 항체 또는 항체 단편 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

항체 또는 항체 단편이 제공된다. 이는 GYTFSSFS, GYTFSTFA 또는 GYSFTAYT로부터 선택되는 HCDR1, ILPGSNST, ILPGINNT, ILPGGNNT 또는 INPYNGGT로부터 선택되는 HCDR2, SSYWFAY, STYWFAY 또는 AREGNYYGSRGDFDY로부터 선택되는 HCDR3; QSLLNSGNQKNY 또는 QTIVTN으로부터 선택되는 LCDR1, GAS 또는 YAS로부터 선택되는 LCDR2; QNAHSYPPT, QNAHSYPPA 또는 QQSHSWPFT로부터 선택되는 LCDR3을 포함한다. 제공된 항체는 암 치료에 사용될 수 있다.

Description

항-PVRIG 단백질 항체 또는 항체 단편 및 이의 용도
관련 출원의 상호 참조
본원 발명은 출원번호가 202110250342.9이고, 출원일자가 2021년 03월 08일인 중국 특허 출원의 우선권을 주장하는 바, 이의 전체 내용은 참조로서 본원 발명에 인용된다.
기술분야
본 발명은 의약 분야에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 항-PVRIG 단백질 항체 또는 항체 단편 및 암 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
종양 세포는 다양한 메커니즘을 통해 면역 시스템의 감시를 회피한다. 면역 체크 포인트 경로는 자가 내성을 유지하고 활성화된 림프구의 이펙터 기능을 제어하는 데 사용되지만, 암세포는 상기 경로를 이용하여 파괴를 피한다. 최근 보도에 따르면, PVRIG는 매우 중요한 면역 체크 포인트이다. PVRIG는 주로 활성화된 T 세포 및 NK 세포에서 발현되며, 관심 세포 또는 DC 세포에서 발현되는 리간드 CD112와 상호 작용하여 T 세포 및 NK 세포의 이펙터 기능을 억제한다. CD112는 다양한 종양 세포 표면에서 고도로 발현되어 PVRIG 신호 경로를 통해 면역 시스템의 기능을 억제하고, 면역 탈출을 구현한다.
연구에 따르면, PVRIG의 결실은 CD8+ T 세포의 이펙터 기능을 향상시킬 수 있다. 이 밖에, PVRIG와 이의 리간드 CD112 결합을 차단하는 항체의 사용은 종양 침윤 CD8+T 세포의 기능을 회복하고 종양 성장을 억제하는 데에도 효과적일 수 있다. 인간 PVRIG를 표적으로 하는 항체는 이미 임상 실험을 진행 중이며 우수한 치료 효과를 보여주고 있다.
PVRIG를 표적으로 하는 항체는 추가 개선이 필요하다.
본 발명의 목적은 항종양 기능을 촉진할 수 있는 항체 또는 항체 단편 및 이의 용도를 제공하는 것이다. 제공된 항체 또는 항체 단편은 PVRIG에 효과적으로 결합할 수 있고, PVRIG와 이의 리간드 CD112의 결합을 차단할 수 있다. 제공된 항체 또는 항체 단편은 인간 PVRIG와 높은 친화도를 갖는 것으로 확인되었다. 또한 인간 PVRIG와 CD112 사이의 상호 작용을 효과적으로 차단할 수 있다.
본 발명의 제1 양태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고;
여기서 HCDR1은 GYTFSSFS, GYTFSTFA 또는 GYSFTAYT로 표시되는 서열로부터 선택되며,
HCDR2는 ILPGSNST, ILPGINNT, ILPGGNNT 또는 INPYNGGT로 표시되는 서열로부터 선택되고,
HCDR3은 SSYWFAY, STYWFAY 또는 AREGNYYGSRGDFDY 로 표시되는 서열로부터 선택되며;
상기 경쇄는 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고;
여기서, LCDR1은 QSLLNSGNQKNY 또는 QTIVTN으로 표시되는 서열로부터 선택되며,
LCDR2는 GAS 또는 YAS로 표시되는 서열로부터 선택되고;
LCDR3은 QNAHSYPPT, QNAHSYPPA 또는 QQSHSWPFT로 표시되는 서열로부터 선택된다.
본 발명의 제2 양태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 각각 하기 중 하나로부터 선택된다:
(1) GYTFSSFS, ILPGSNST 및 SSYWFAY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPT를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
(2) GYTFSTFA, ILPGINNT 및 STYWFAY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPT를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
(3) GYTFSTFA, ILPGGNNT 및 STYWFAY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPA를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편; 및
(4) GYSFTAYT, INPYNGGT 및 AREGNYYGSRGDFDY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QTIVTN, YAS 및 QQSHSWPFT를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
본 발명의 제3 양태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 하기 중 적어도 하나로부터 선택된다:
(1) SEQ ID NO:1로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
(2) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열로부터 선택되거나 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열로부터 선택되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
(3) SEQ ID NO:39로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:39로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
(4) SEQ ID NO:41로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:41로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편; 및
(5) SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:44 로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:44로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
본 발명의 제4 양태에서, 본 발명은 분리 가능한 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 상기 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 단편을 코딩한다.
본 발명의 제5 양태에서, 본 발명은 발현 담체를 제공한다. 상기 발현 담체는 전술한 핵산을 함유한다.
본 발명의 제6 양태에서, 본 발명은 재조합 세포를 제공한다. 상기 재조합 세포는 상기 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 단편을 발현한다.
본 발명의 제7 양태에서, 본 발명은 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 상기 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
본 발명의 제8 양태에서, 본 발명은 암 치료용 약물의 제조에서 상기 항체 또는 항체 단편 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명의 제9 양태에서, 본 발명은 (1), 전술한 항체 또는 항체 단편, 또는 전술한 약학적 조성물; 및 (2), (1)과 상이한 암 치료용 항체를 포함하는 약물 조성을 제공한다.
본 발명의 제10 양태에서, 본 발명은 전술한 항체 또는 항체 단편 또는 전술한 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제11 양태에 따르면, 본 발명은 상기 샘플을 상기 어느 하나에 따른 항체 또는 항체 단편, 또는 전술한 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 체외에서 샘플 중 PVRIG 단백질의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 샘플은 세포 샘플일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 항체 또는 항체 단편은 PVRIG 항원에 특이적으로 결합할 수 있고, 인간 PBMC의 사멸 효과를 크게 향상시킬 수 있으며, 마우스 모델에서 우수한 항종양 효과를 나타낸다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 아래 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용에서 상세히 설명될 것이다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체가 인간 PVRIG에 결합하는 ELISA 분석 결과 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체가 세포막 표면의 인간 PVRIG에 결합하는 분석 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체가 인간 PVRIG와 인간 CD112 결합을 차단하는 분석 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체가 세포막 표면의 인간 PVRIG에 경쟁적으로 결합하는 분석 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체가 세포막 표면의 필리핀 원숭이 PVRIG 및 마우스 PVRIG에 결합하는 활성 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체가 필리핀 원숭이 PVRIG에 결합하는 ELISA 분석 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의해 NKG 세포 메산지얼 표면의 PVRIG 활성을 검출한 결과 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의해 림프구 표면의 PVRIG 활성을 검출한 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시형태에서 인간 종양 세포계 표면에서 CD112를 발현시킨 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의한 NK 세포의 세포 독성 작용 촉진 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의한 인간 PBMC의 세포 독성 작용 촉진 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의한 NK 세포의 이펙터 분자의 발현 촉진 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의한 NK 세포의 IFN-γ 분비 촉진 ELISA 분석 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실시형태에서 뮤린 항체에 의한 생체 내 종양 성장 억제 분석 결과 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실시형태에서 인간화 항체가 인간 PVRIG에 결합하는 ELISA 분석 결과 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실시형태에서 인간화 항체가 세포막 표면의 인간 PVRIG에 결합하는 분석 결과 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실시형태에서 인간화 항체가 세포막 표면의 필리핀 원숭이 PVRIG에 결합하는 분석 결과 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실시형태에서 인간화 항체가 인간 PVRIG와 인간 CD112 결합을 차단하는 분석 결과 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실시형태에서 인간화 항체에 의한 인간 PBMC의 세포 독성 작용 촉진 결과 그래프이다.
이하에서는 본 발명의 실시예를 상세히 설명한다. 실시예는 본 발명을 해석하기 위한 것으로, 본 발명을 한정하는 것으로 이해해서는 안된다. 또한, 본 명세서에서 일부 용어에 대한 기술 및 해석은 당업자의 이해를 용이하게 하기 위한 것으로, 본 발명의 보호 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 명세서에서, 용어 “항체”는 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항원과 상호 작용(예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화를 통해 입체적으로 분포될 수 있음)할 수 있는 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 CH1, CH2 및 CH3 이 3개의 도메인을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(일반적으로 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL을 포함한다. 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 각각 상보성 결정 영역(CDR)으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 중쇄 가변 영역 및 각각의 경쇄 가변 영역은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 각각 3개의 CDR 영역인 CDR1, CDR2 및 CDR3이 배열되어 있다. 본 명세서에서는 구별을 위해 중쇄의 3개 CDR 영역을 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 지칭하고; 경쇄의 3개 CDR 영역을 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 지칭한다.
본 명세서에 언급된 항체 또는 항체 단편 중의 항체는 단일클론 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타화(camelised) 항체 및 키메라 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체는 IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY 등과 같은 임의의 동형일 수 있다.
용어 “항체 단편”은 항원과 특이적으로 상호 작용(예를 들어, 결합, 입체 장애, 안정화를 통해 입체적으로 분포됨)하는 능력을 유지하는 하나 이상의 부분을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab 단편, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 단편; F(ab)2 단편, 힌지 영역에서 이황화 다리에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; 항체 원암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR) 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 또한, Fv 단편의 두 도메인인 VL 및 VH가 별도의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 단일 단백질 사슬로 만들 수 있는 합성 연결 모이어티에 의해 재조합 방법으로 결합될 수 있으며, 여기서 VL 및 VH 영역은 쌍을 이루어 1가 분자(단일 사슬 Fv(scFv)로 지칭됨; 예를 들어, Bird 등, (1988)Science 242:423-426; 및 Huston 등, (1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85:5879-5883 참조)를 형성한다. 이러한 단일 사슬 항체 역시 용어 “항체 단편” 내에 포함된다. 이러한 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 얻어지며, 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성을 갖는 단편이 스크리닝된다.
“인간화 항체”는 (i) 비인간 공급원(예를 들어, 이종 면역 시스템를 보유하는 형질전환 마우스)에서 유래되되, 해당 항체는 인간 생식계 서열을 기반으로 하거나, 또는 (ii) CDR-이식됨을 의미하며, 여기서 가변 도메인의 CDR은 비인간 공급원에서 유래되고, 가변 도메인의 하나 이상의 프레임워크는 인간에서 유래되며, 또한 불변 도메인이 존재하는 경우, 인간에서 유래된다.
용어 “키메라 항체”는 한 종에서 발견되는 서열로부터 유래되거나 이에 대응되는 불변 항체 영역 및 다른 종으로부터 유래된 가변 항체 영역을 지칭한다. 바람직하게는, 불변 항체 영역은 인간 생식계열 세포 또는 체세포와 같은 인간에서 발견되는 서열로부터 유래되거나 이에 대응되고, 가변 항체 영역(예를 들어, VH, VL, CDR 또는 FR 영역)은 마우스, 래트, 토끼 또는 햄스터와 같은 비인간 동물에서 발견되는 서열로부터 유래된다.
본 명세서에 사용된 용어 “재조합 항체”는 재조합 방식에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 모든 항체, 예를 들어, 인간 면역 글로불린 유전자 형질전환 또는 트랜스염색체 동물(예를 들어 마우스) 또는 이로부터 제조된 하이브리도마로부터 분리된 항체, 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터 분리된 항체, 재조합, 조합 인간 항체 라이브러리로부터 선택 및 분리된 항체, 및 인간 면역 글로불린 유전자, 서열의 일부 또는 전부, 서열을 항체의 다른 DNA 서열에 스플라이싱하는 방식에 의해 제조, 발현, 생성 또는 분리된 항체를 포함한다. 바람직하게는, 이들 재조합 항체는 프레임워크 영역 및 CDR 영역이 인간 생식계열 면역 글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는다.
본 명세서에서, 용어 “단일클론 항체”는 단일 분자로 구성된 항체 분자 제제를 의미한다. 단일클론 항체는 특정 에프토프에 대한 독특한 결합 특이성과 친화도를 갖는 독특한 결합 부위를 나타낸다.
이에, 본 발명의 일 양태에서, 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고; 여기서 HCDR1은 GYTFSSFS, GYTFSTFA 또는 GYSFTAYT로 표시되는 서열로부터 선택되며, HCDR2는 ILPGSNST, ILPGINNT, ILPGGNNT 또는 INPYNGGT로 표시되는 서열로부터 선택되고, HCDR3은 SSYWFAY, STYWFAY 또는 AREGNYYGSRGDFDY 로 표시되는 서열로부터 선택되며; LCDR1은 QSLLNSGNQKNY 또는 QTIVTN으로 표시되는 서열로부터 선택되고, LCDR2는 GAS 또는 YAS로 표시되는 서열로부터 선택되며; LCDR3은 QNAHSYPPT, QNAHSYPPA 또는 QQSHSWPFT로 표시되는 서열로부터 선택된다. 본 발명에서 제공하는 항체 또는 항체 단편은 높은 친화도로 PVRIG 단백질에 결합할 수 있다.
적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역은 GYTFSSFS, ILPGSNST 및 SSYWFAY를 포함하며; 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPT를 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이고; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
여기서 중쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열은 다음과 같다.
QVQLQQSGAELVKPGASVKISCKATGYTFSSFSIEWVKQRPGHGLAWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:1).
경쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열은 다음과 같다.
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAHSYPPTFAAGTKLELK (SEQ ID NO:2).
제공된 인간화 형질전환 후 항체 또는 항체 단편 서열에 따르면, 인간화 형질전환된 항체 또는 항체 단편은 다음과 같다:
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:3으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu1이고, 상기 항체 4-hu1의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:3으로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu1의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4이고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:5로 표시되며; 항체 4-hu1의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:6으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:6으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu2이고, 상기 항체 4-hu2의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:6으로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu2의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:7이고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:8로 표시되며; 항체 4-hu2의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:9로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:9로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu3이고, 상기 항체 4-hu3의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:9로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu3의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:11로 표시되며; 항체 4-hu3의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:12로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:12로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu4이고, 상기 항체 4-hu4의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:12로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu4의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:13으로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:14로 표시되며; 항체 4-hu4의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:15로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:15로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu5이고, 상기 항체 4-hu5의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:15로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu5의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16으로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:17로 표시되며; 항체 4-hu5의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:18로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:18로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu6이고, 상기 항체 4-hu6의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:18로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu6의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:19로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:20으로 표시되며; 항체 4-hu6의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:21로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:21로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu7이고, 상기 항체 4-hu7의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:21로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu7의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:23으로 표시되며; 항체 4-hu7의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:24로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:24로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 항체 4-hu8이고, 상기 항체 4-hu8의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:24로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu8의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:25로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:26으로 표시되며; 항체 4-hu8의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:27로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:27로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu9이고, 상기 항체 4-hu9의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:27로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu9의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:28로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:29로 표시되며; 항체 4-hu9의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:30으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:30으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu10이고, 상기 항체 4-hu10의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:30으로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu10의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:31로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:32로 표시되며; 항체 4-hu10의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
적어도 일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 상기 항체는 항체 4-hu11이고, 상기 항체 4-hu11의 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열이며, 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이다. 적어도 일부 바람직한 실시형태에서, 항체 4-hu11의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:34로 표시되고, 상응하게 상기 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:35로 표시되며; 항체 4-hu11의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되고, 상응하게 상기 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
여기서 항체 4-hu1의 중쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:3으로 표시되는 서열은 다음과 같다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:3).
항체 4-hu1의 중쇄 아미노산 서열 SEQ ID NO:4로 표시되는 서열은 다음과 같다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:4). S228P 돌연변이는 힌지 영역에서 발생하는 돌연변이로, 상기 돌연변이는 반항체의 형성을 방지할 수 있다(소위 반항체는 IgG4 항체에서 반분자의 동적 교환 현상임).
항체 4-hu1의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:5로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCGGCACCTTTTCCAGCTTCTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCTCCAACAGCACCAACTACAATGAGAAGTTTAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCTGACGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGTCCGAGGATACCGCTGTGTACTATTGTGCCAGGTATTGGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCTCCCTGTAGCCGGTCCACCAGCGAGTCCACCGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTATTTCCCCGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTATAGCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAATGTGGACCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCTTGCCCCGCTCCAGAGTTCCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGGGAGCCTCAGGTGTATACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTATCCTAGCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATAGCGACGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGATAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTCGGCAAG (SEQ ID NO:5)
항체 4-hu2의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:6으로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:6)
항체 4-hu2의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:7로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:7)
항체 4-hu2의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:8로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCTCCGGCGGCACCTTCTCCAGCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATTCCACCAACTATAATGAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCATCACCGCTGACGAGAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGTCCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGTAGCTCCTATTGGTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTCCCCCTGGCTCCCTGCAGCCGGAGCACCTCTGAGTCCACCGCCGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTACTTTCCTGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAATAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCTGCCGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTACAGCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGTAATGTGGATCACAAGCCTAGCAATACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCCCCCTGCCCTCCCTGCCCAGCTCCTGAATTTCTGGGCGGCCCCAGCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCAGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAATGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTTTATACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTATCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAACAATTATAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATTCCGACGGCAGCTTTTTCCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG (SEQ ID NO:8)
항체 4-hu3의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:9로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:9)
항체 4-hu3의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:10으로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:10)
항체 4-hu3의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:11로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCAGCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCTCCTCCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCCGGCAGCAATTCCACCAATTATAATGAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCTTTACCGCCGACGAGTCCACCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGCAGCTCCTATTGGTTTGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTTCCCCTGGCTCCCTGTAGCCGGAGCACCAGCGAGTCCACCGCTGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTACTTTCCCGAGCCCGTGACCGTGTCTTGGAATAGCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCTTCCAGCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCCCCCTGCCCCCCTTGTCCTGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATTCCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTTTATACCCTGCCCCCCTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACCTGTCTGGTGAAAGGCTTCTACCCCAGCGATATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCCGAGAATAACTATAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGATAGCGATGGCAGCTTCTTCCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCTCCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAG (SEQ ID NO:11)
항체 4-hu4의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:12로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:12)
항체 4-hu4의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:13으로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:13)
항체 4-hu4의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:14로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCTCCGTGAAGGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCGGCACCTTCTCCTCCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCTCCAATAGCACCAATTACAACGAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCTTTACCGCCGACGAGTCCACCTCCACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTATTACTGTTCCTCCTACTGGTTTGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTTCCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTGGCTCCTTGCAGCCGGAGCACCTCCGAGTCCACCGCTGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTATTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGAGCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTATAGCCTGTCCTCCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCTTCCAATACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTATGGCCCCCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCCAGCGTCTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTTAACTGGTATGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACCACCCCCCCCGTGCTGGACTCCGATGGCAGCTTTTTCCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGAGCCTCGGCAAG (SEQ ID NO:14)
항체 4-hu5의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:15로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:15)
항체 4-hu5의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:16으로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:16)
항체 4-hu5의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:17로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCTCCTCCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCGGCACCTTTTCCAGCTTTAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCTCCAACAGCACCAACTACAATGAGAAGTTTAAGGGCCGGGTGACCTTCACCGCTGACACCTCCACCAACACCGCTTATATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGAGCGAGGATACCGCTGTGTACTATTGCAGCAGCTATTGGTTCGCTTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCCCTGGCCCCTTGTAGCCGGTCCACCTCCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGATTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACTCCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTCCCTGCTGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAATGTGGACCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCCTGTCCTCCTTGCCCTGCCCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTTAACTCCACCTACAGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGTAAGGTGAGCAACAAGGGCCTGCCTTCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTATCCCTCCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTATAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGACAGCGATGGCTCCTTCTTTCTGTACTCCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCTCCTGTAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGTCCCTCGGCAAG (SEQ ID NO:17)
항체 4-hu6의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:18로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:18)
항체 4-hu6의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:19로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:19)
항체 4-hu6의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:20으로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCTCCGTGAAGGTGTCCTGTAAGGCTTCCGGCGGCACCTTCTCCTCCTTTTCCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAACTCCACCAATTATAATGAGAAGTTTAAGGGCAAGGCTACCTTCACCGCTGACACCAGCACCAATACCGCCTATATGGAGCTGTCCTCCCTGCGGAGCGAGGACACCGCCGTGTATTATTGTAGCAGCTATTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTAGCACCAAGGGCCCTAGCGTGTTTCCTCTGGCTCCTTGTTCCAGGTCCACCAGCGAGAGCACCGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTTCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCCGCTGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTATTCCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCTTGCCCTCCCTGTCCTGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTTCCCCCTAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTTAATTGGTATGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCTAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTAGCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCCCAGGTGTATACCCTGCCCCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTATCCTAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAATAATTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGATTCCGATGGCAGCTTTTTCCTGTATTCCCGGCTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG (SEQ ID NO:20)
항체 4-hu7의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:21)
항체 4-hu7의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:22로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:22)
항체 4-hu7의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:23으로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTTCCAGCTTCAGCATCGAGTGGGTGCGGCAGGCTCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAACTCCACCAATTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCATCACCGCTGACGAGAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGTCCGAGGATACCGCCGTGTATTACTGCAGCAGCTATTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCCCTGGCTCCTTGCAGCAGGTCCACCAGCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGTCTGGTGAAGGACTACTTCCCCGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAATAGCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCTGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCTCCTCCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAATGTGGATCACAAGCCTAGCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCCCCTTGCCCTCCTTGCCCCGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTTCCCCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCTCAGGTGTATACCCTGCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTTTACCCTTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGCCAGCCTGAGAATAATTACAAGACCACCCCTCCTGTGCTGGATAGCGACGGCAGCTTTTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGATAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTATACCCAGAAGAGCCTGTCCCTGAGCCTGGGCAAG (SEQ ID NO:23)
항체 4-hu8의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:24로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:24)
항체 4-hu8의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:25로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:25)
항체 4-hu8의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:26으로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTCTCCAGCTTTAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCTCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATGGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATTCCACCAACTATAACGAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCTTCACCGCCGATGAGTCCACCTCCACCGCCTACATGGAGCTGAGCTCCCTGCGGTCCGAGGATACCGCCGTGTACTATTGCAGCAGCTATTGGTTCGCTTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGCTTCCACCAAGGGCCCTTCCGTGTTTCCCCTGGCCCCCTGCTCCCGGTCCACCTCCGAATCCACCGCCGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTACTTCCCTGAGCCCGTGACCGTGTCCTGGAACTCCGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTATAGCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCTAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGTAATGTGGATCACAAGCCCAGCAATACCAAGGTGGATAAGAGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCCCCTTGTCCTCCTTGTCCCGCCCCAGAGTTCCTGGGCGGCCCATCTGTGTTTCTGTTTCCCCCCAAGCCTAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCTGAGGTGCAGTTCAATTGGTATGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCAGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCAGCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCTCCCAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGTCTGGTGAAGGGCTTTTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAACGGCCAGCCTGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGACTCCGATGGCTCCTTTTTCCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTATACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGAGCCTGGGCAAG (SEQ ID NO:26)
항체 4-hu9의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:27로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:50)
항체 4-hu9의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:28로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:28)
항체 4-hu9의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:29로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCTCCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTCTCCAGCTTCAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGATTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATAGCACCAACTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAGGGTGACCTTCACCGCCGATGAGAGCACCTCCACCGCTTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGGAGCGAGGATACCGCTGTGTATTATTGTAGCAGCTATTGGTTTGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCAGCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTCCCTCTGGCCCCTTGTTCCCGGTCCACCTCCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAGCCCGTGACCGTGAGCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCTGCCGTGCTGCAGTCCAGCGGCCTGTACTCCCTGTCCAGCGTGGTGACCGTGCCCAGCTCCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAACGTGGATCACAAGCCCTCCAATACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGAGCAAGTATGGCCCTCCCTGTCCCCCCTGCCCTGCCCCTGAATTTCTGGGCGGCCCCTCCGTGTTTCTGTTTCCTCCTAAGCCTAAGGATACCCTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGATGTGAGCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTTAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCTAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTATAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCTCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTACCCCTCCGATATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATTCCGACGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAG (SEQ ID NO:29)
항체 4-hu10의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:30으로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:30)
항체 4-hu10의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:31로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGRVTFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:31)
항체 4-hu10의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:32로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTACACCTTTTCCAGCTTCAGCATCGAGTGGGTGAGGCAGGCCCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCTGGCAGCAATAGCACCAATTACAACGAGAAGTTCAAGGGCCGGGTGACCTTCACCGCCGACACCAGCACCAATACCGCCTATATGGAGCTGAGCTCCCTGAGGTCCGAGGACACCGCTGTGTATTATTGCTCCAGCTATTGGTTCGCCTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCCAGCACCAAGGGCCCCAGCGTGTTTCCTCTGGCCCCTTGCAGCAGGTCCACCAGCGAGAGCACCGCCGCTCTGGGCTGCCTGGTGAAGGATTACTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCTTGGAACAGCGGCGCCCTGACCTCCGGCGTGCACACATTTCCTGCTGTGCTGCAGAGCAGCGGCCTGTATAGCCTGAGCAGCGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTACACCTGCAATGTGGATCACAAGCCCTCCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCCTGTCCTGCTCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCTAGCGTGTTCCTGTTCCCTCCTAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCAGGACCCCTGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGATCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTAGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATAGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCTTCCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCTAAGGGCCAGCCTAGGGAGCCTCAGGTGTATACCCTGCCTCCCTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTTTACCCCAGCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAATAATTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGATTCCGACGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGTCCAGGTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGCAGCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTCGGCAAG (SEQ ID NO:32)
항체 4-hu11의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:33으로 표시된다.
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:33)
항체 4-hu11의 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:34로 표시된다(IgG4 S228P 돌연변이).
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFSSFSIEWVRQAPGQGLEWIGEILPGSNSTNYNEKFKGKATFTADTSTNTAYMELSSLRSEDTAVYYCSSYWFAYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK (SEQ ID NO:34)
항체 4-hu11의 중쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:35로 표시된다.
GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGCCGAGGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCTTCCGGCTATACCTTCAGCTCCTTCAGCATCGAGTGGGTGCGGCAGGCTCCTGGCCAGGGACTGGAGTGGATCGGCGAGATCCTGCCCGGCAGCAATTCCACCAACTATAATGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCTACCTTCACCGCCGACACCTCCACCAATACCGCCTATATGGAGCTGTCCAGCCTGAGGAGCGAGGACACCGCTGTGTACTACTGCTCCAGCTACTGGTTTGCCTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCAGCGCTTCCACCAAGGGCCCCTCCGTGTTCCCTCTGGCCCCCTGTAGCAGGAGCACCTCCGAGTCCACCGCTGCCCTGGGCTGCCTGGTGAAGGACTATTTCCCTGAGCCTGTGACCGTGTCCTGGAACAGCGGCGCTCTGACCTCCGGCGTGCACACCTTCCCCGCTGTGCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACAGCCTGAGCTCCGTGGTGACCGTGCCTAGCAGCAGCCTGGGCACCAAGACCTATACCTGCAACGTGGATCACAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAGCGGGTGGAGTCCAAGTACGGCCCTCCCTGTCCCCCTTGCCCCGCTCCTGAGTTTCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTTCTGTTCCCCCCTAAGCCCAAGGATACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGCGTGGTGGTGGATGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACAGCACCTATCGGGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGTCCAATAAGGGCCTGCCTAGCAGCATCGAGAAGACCATCAGCAAGGCTAAGGGCCAGCCCCGGGAGCCCCAGGTTTACACCCTGCCCCCTAGCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCTCCGACATCGCTGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCTCCCGTGCTGGATAGCGACGGCAGCTTCTTTCTGTACTCCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAATGTGTTCTCCTGTTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAATCACTACACCCAGAAGTCCCTGTCCCTGAGCCTCGGCAAG (SEQ ID NO:35)
항체 4 인간화 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:36으로 표시된다.
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAHSYPPTFGQGTKLEIK (SEQ ID NO:36)
항체 4 인간화 항체의 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시된다.
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLIYGASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNAHSYPPTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:37)
항체 4 인간화 항체의 경쇄 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열은 SEQ ID NO:38로 표시된다.
GACATCGTGATGACCCAGAGCCCCGATTCCCTGGCCGTGTCCCTGGGCGAGAGGGCTACCATCAATTGCAAGTCCTCCCAGAGCCTGCTGAATAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCTCCTAAGCTGCTGATCTACGGCGCCTCCACCCGGGAGAGCGGCGTTCCTGACAGGTTTAGCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTCACCCTGACCATCTCCAGCCTGCAGGCCGAGGACGTGGCCGTGTATTATTGCCAGAATGCCCACTCCTATCCCCCCACCTTTGGCCAGGGCACCAAGCTGGAGATCAAGCGGACCGTGGCCGCCCCTTCCGTGTTTATCTTCCCCCCCTCCGACGAGCAGCTGAAGTCCGGCACCGCCAGCGTGGTGTGTCTGCTGAACAACTTCTACCCCAGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTGCAGTCCGGCAACAGCCAGGAGAGCGTGACCGAGCAGGACTCCAAGGACTCCACCTACTCCCTGTCCTCCACCCTGACCCTGTCCAAGGCCGATTATGAGAAGCACAAGGTGTACGCCTGCGAGGTGACCCACCAGGGCCTGAGCTCCCCCGTGACCAAGTCCTTCAATAGGGGCGAGTGC (SEQ ID NO:38)
적어도 일부 다른 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역은 GYTFSTFA, ILPGINNT 및 STYWFAY를 포함하며; 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPT를 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:39로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:39로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
여기서 중쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:39로 표시되는 서열은 다음과 같다.
QVQLQQSGAELMKPGASVKISCKATGYTFSTFAIDWIKQRPGPGLAWIGEILPGINNTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSTYWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:39).
경쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열은 다음과 같다.
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMTCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLMYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAHSYPPTFGAGTKLELK (SEQ ID NO:40).
적어도 일부 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역은 GYTFSTFA, ILPGGNNT 및 STYWFAY를 포함하며; 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPA를 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:41로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:41로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
여기서, 중쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:41로 표시되는 서열은 다음과 같다.
QVQLQQSGAELTKPGASVKISCKATGYTFSTFAIDWIKQRPGHGLAWIGEILPGGNNTNYNEKFKGKATFTADTSSNTAYMHLSSLTSEDSAVYYCSTYWFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO:41);
경쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열은 다음과 같다.
DIVMTQSPSSLSVSAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLAWYQQKPGQPPKLLMYGASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNAHSYPPAFGAGTKLELK (SEQ ID NO:42).
적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 및 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하고, 상기 중쇄 상보성 결정 영역은 GYSFTAYT, INPYNGGT 및 AREGNYYGSRGDFDY를 포함하며; 상기 경쇄 상보성 결정 영역은 QTIVTN, YAS 및 QQSHSWPFT를 포함한다.
적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 항체 또는 항체 단편을 제공한다. 상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며; 상기 경쇄 가변 영역은 SEQ ID NO:44로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:44로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이다.
여기서 중쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열은 다음과 같다.
Figure pct00001
(SEQ ID NO:43)
경쇄 가변 영역의 SEQ ID NO:44로 표시되는 서열은 다음과 같다.
DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQTIVTNILWYQQRTNGSPRLLIRYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIAHYYCQQSHSWPFTFGSGTKLEIK (SEQ ID NO:44)
상기에 언급된 항체 또는 항체 단편은 분리 가능하다. 용어 “분리 가능한”은 제공된 항체 이외에 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체 또는 항체 단편을 실질적으로 함유하지 않는 것을 의미한다. 또한, 분리 가능한 항체 또는 항체 단편은 다른 세포 재료 및/또는 화학 물질을 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 제공된 항체는 상이한 특이성을 갖는 항체로부터 분리된, 분리된 항체일 수 있다. 분리된 항체는 단일클론 항체일 수 있다. 분리된 항체는 재조합된 단일클론 항체일 수 있다. 그러나, 관심 에피토프, 동형 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 관련 항원, 예를 들어 다른 종으로부터 유래(예를 들어, 종 상동체)된 항원과 교차 반응성을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 언급된 적어도 하나의 아미노산 치환은 하나의 아미노산 치환, 2개의 아미노산 치환, 3개의 아미노산 치환, 4개의 아미노산 치환 또는 5개의 아미노산 치환, 또는 그 이상의 치환일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현에 따르면, 상기 아미노산 치환은 바람직하게는 보존적 아미노산 치환이다. 본 명세서에서, 보존적 아미노산 치환은 항체와 PVRIG 항원의 결합을 손상시키지 않는 아미노산 치환이다.
보존적 아미노산 치환은 동일한 클래스의 아미노산에 의한 한 클래스 중의 아미노산 치환을 포함하고, 여기서 상기 클래스는 공통 아미노산 측쇄의 물리 화학적 성질 및 자연에서 발견되는 상동 단백질 중의 높은 치환 주파수에 의해 정의되는 바, 예를 들어 표준 Dayhoff 주파수 교환 매트릭스 또는 BLOSUM 매트릭스에 의해 결정된다. 아미노산 측쇄는 이미 6개의 큰 클래스로 분류되어 있으며, 또한 클래스 I(Cys); 클래스 II(Ser, Thr, Pro, Ala, Gly); 클래스 III(Asn, Asp, Gln, Glu); 클래스 IV(His, Arg, Lys); 클래스 V(Ile, Leu, Val, Met) 및 클래스 VI(Phe, Tyr, Trp)를 포함한다. 예를 들어, Asn, Gln 또는 Glu와 같은 다른 클래스 III 잔기로 Asp를 치환하는 것은 보존적 치환이다. 따라서, 항-EGFR항체에서 예상된 비필수 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 클래스로부터의 다른 아미노산 잔기로 치환된다. 항원 결합을 제거하지 않는 뉴클레오티드 및 아미노산의 보존적 치환을 확인하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 또한 분리 가능한 핵산을 제공한다. 상기 핵산은 상기에 언급된 항체 또는 항체 단편을 코딩한다. 언급된 분리 가능한 핵산은 핵산이 다른 물질과 실질적으로 분리 가능하고 재료 또는 화학 물질을 실질적으로 함유하지 않음을 의미한다. 핵산은 온전한 세포, 세포 용해물에 존재하거나, 부분적으로 정제되거나 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다. 알칼리성/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 공지된 기타 기술을 포함한 표준 기술을 통해 기타 세포성 핵산 또는 단백질과 같은 기타 세포 성분 또는 기타 불순물로부터 정제될 때, 핵산은 “분리”되거나 “실질적으로 순수”하다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 발현 담체를 제공한다. 매우 다양한 발현 담체를 사용하여 본 명세서에 언급된 항체 또는 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있다. 항체는 바이러스 기반 및 비-바이러스 발현 담체를 사용하여 포유동물 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 비-바이러스 담체 및 시스템은 플라스미드, 일반적으로 단백질 또는 RNA를 발현하기 위한 발현 성분을 갖는 에피솜 담체, 및 인간의 인공 염색체(예를 들어, Harrington 등, (1997)Nat Genet 15:345 참조)를 포함한다. 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 세포에서 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 발현하는 데 사용될 수 있는 비-바이러스 담체는 pThioHis A,B&C, pcDNA3.1/His, pEBVHis A,B&C(Invitrogen,San Diego,CA), MPSV 담체 및 다른 단백질을 발현하기 위한 당업계에 공지된 대량의 다른 담체를 포함한다. 사용 가능한 바이러스 담체는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 기반 담체, SV40, 유두종 바이러스, HBP Epstein Barr바이러스, 백시니아 바이러스 담체 및 Semliki Forest 바이러스(SFV) 기반 담체를 포함한다(Brent 등, (1995)Annu.Rev.Microbiol.49:807; 및 Rosenfeld 등, (1992)Cell 68:143 참조).
발현 담체는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 포로모터 및 기타 조절 서열(예를 들어, 인핸서)를 함유한다. 일부 실시형태에서, 유도성 포로모터를 사용하여 유도 조건 이외에 삽입된 서열의 발현을 방지할 수 있다. 유도성 포로모터는 아라비노스, lacZ, 메탈로티오네인 포로모터 또는 열 충격 포로모터를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체 또는 항체 단편의 고효율적인 발현을 위해서는 포로모터 이외에 다른 조절 요소가 요구되거나 필요할 수 있다. 이러한 요소는 일반적으로 ATG 개시 코돈 및 인접한 리보솜 결합 부위 또는 기타 서열을 포함한다. 이 밖에, 예를 들어 SV40인핸서 또는 CMV인핸서를 사용하는 것과 같이 사용된 세포 시스템에 적절한 인핸서를 포함함으로써 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시킨다.
본 발명은 또한 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 전술한 항체 또는 항체 단편을 발현한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 숙주 세포는 전술한 발현 담체를 함유하여 본 출원에 언급된 항체를 발현하는 데 사용될 수 있다. 여기서 발현 담체는 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 상기 숙주 세포는 CHO 또는 HEK293 세포를 포함하나 이에 한정되지 않는 포유동물 세포일 수 있다.
항체 또는 항체 단편을 휴대 및 발현하기 위한 숙주 세포는 원핵숙주 세포 대장균(E.coli)과 같은 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 사용에 적합한 다른 미생물 숙주는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)와 같은 바실러스, 및 살모넬라(Salmonella), 세러티아(Serratia) 및 다양한 슈도모나스(Pseudomonas) 종과 같은 기타 장내 세균을 포함한다. 이러한 원핵 숙주에서, 일반적으로 숙주 세포와 양립 가능한 발현 제어 서열을 함유하는 발현 담체가 생성될 수도 있다. 이 밖에, 이러한 숙주 세포는 포로모터, 예를 들어 락토스 포로모터 시스템, 트립토판(trp)포로모터 시스템, β-락타마제 포로모터 시스템 또는 박테리오파지 λ로부터의 포로모터 시스템과 같은 포로모터를 더 함유한다. 포로모터는 일반적으로 선택적으로 오퍼레이터 서열과 함께 발현을 제어하고, 전사 및 번역을 개시하고 완료하기 위한 리보솜 결합 부위 서열 등을 갖는다. 효모와 같은 다른 미생물도 본 개시 내용의 폴리펩티드를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 곤충 세포는 배큘로 바이러스 담체와 결합하여 사용할 수도 있다.
일부 바람직한 실시형태에서, 본 개시 내용의 항-PVRIG 항체 또는 항체 단편은 포유동물 숙주 세포를 사용하여 발현 및 생성된다. 예를 들어, 이들은 내인성 면역 글로불린 유전자를 발현하는 하이브리도마 세포계일 수 있다. 바람직하게는, SP2/0 골수종 세포, CHO 세포, HeLa 세포, PER.C6 세포, COS 세포, HKB11 세포, NS0 세포와 같은 임의의 정상 치사 또는 정상 또는 비정상 불멸화 동물 또는 인간 세포를 포함하는 외인성 발현 담체를 갖는 포유동물 세포계를 사용한다. 예를 들어, CHO 세포계, 다양한 Cos 세포계, HeLa 세포, 골수종 세포계, 형질전환된 B-세포 및 하이브리도마를 포함하여 온전한 면역글로불린을 분비할 수 있는 다양한 적합한 숙주 세포계가 개발되었다. 숙주 세포에 함유된 적합한 포로모터는 구성적, 세포 유형 특이적, 단계 특이적 및/또는 조절 및 제어 가능하거나 조절 가능할 수 있다. 사용 가능한 포로모터는 메탈로티오네인 포로모터, 구성적 아데노 바이러스 주요 후기 포로모터, 덱사메타손 유도성 MMTV 포로모터, SV40 포로모터, MRP pollll 포로모터, 구성적 MPSV 포로모터, 구성적 CMV 포로모터 및 당업계에 공지된 포로모터-인핸서 조합을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
공지된 방법으로 관심 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, 항체 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및 발현 제어 서열)을 함유하는 담체를 세포 숙주의 유형에 따라 변화하는 숙주 세포에 전달할 수 있다. 예를 들어, 염화칼슘 형질감염은 흔히 원핵 세포에 사용되는 반면, 인산칼슘 처리 또는 전기천공은 다른 세포 숙주에 사용될 수 있다. 다른 방법은 예를 들어 전기천공, 인산칼슘 처리, 리포솜 매개 형질전환, 주사 및 미세 주사, 비리온, 면역 리포솜, 다가 양이온 핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온 등일 수 있다.
본 발명은 또한 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 전술한 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
약학적으로 허용 가능한 담체는 생리학적으로 양립 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여(예를 들어, 주사 또는 주입 투여)에 적합하다. 상이한 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체는 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산 작용 및 기타 자연 조건으로부터 상기 화합물을 보호하기 위해 특정 물질에 캡슐화될 수 있다.
제공된 약학적 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 항체는 임플란트, 경피 패치 및 미세 캡슐화된 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제제와 같은 적합한 담체와 함께 제조될 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생분해성, 생체 적합성 폴리머를 사용할 수 있다. 이러한 제제를 제조하는 많은 방법은 이미 특허를 받았거나 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제공된 항체는 불활성화를 방지하기 위해 특정 재료로 캡슐화되거나 특정 재료와 함께 투여될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 리포솜 또는 희석제와 같은 적합한 담체로 대상체에게 투여될 수 있다. 허용 가능한 희석제는 식염수 및 수성 완충액을 포함한다. 리포솜은 수중유중수 CGF 에멀젼과 기존 리포솜을 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 주사 용액 또는 멸균 분말로 제조된 멸균 수용액 또는 분산체 등을 포함한다. 본 명세서에서 제공하는 약학적 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 약학적으로 허용 가능한 제형으로 조제될 수 있다.
본 발명은 또한 암 치료용 약물의 제조에서 전술한 항체 또는 전술한 약학적 조성물의 용도를 제공한다.
본 발명은 또한 전술한 항체 또는 전술한 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
“치료학적 유효량” 또는 “유효량”은 원하는 생물학적 응답을 일으키는 데 필요한 PVRIG 항체의 양을 의미한다. 본 발명에 따르면, 치료학적 유효량은 질병을 치료 및/또는 예방하는 데 필요한 PVRIG 항체의 양을 의미한다.
본 명세서에서 제공하는 항체의 치료학적 유효량은 항체 및 조합의 상대적 활성(예를 들어, 세포 성장 억제 활성), 그리고 치료되는 대상체 및 질병 상태, 대상체의 체중 및 연령, 질병 상태의 심각성, 투여 방식에 따라 변화하며, 당업자는 치료학적 유효량을 매우 용이하게 결정할 수 있다. 투여를 위한 용량은 예를 들어, 약 1ng 내지 약 6000mg, 약 5ng 내지 약 5500mg, 약 10ng 내지 약 5000mg, 약 20ng 내지 약 4500mg, 약 30ng 내지 약 5000mg, 약 300ng 내지 약 4,500mg, 약 500ng 내지 약 4,000mg, 약 1μg 내지 약 3,500mg, 약 5μg 내지 약 3,000mg, 약 10μg 내지 약 2,600mg, 약 20μg 내지 약 2,575mg, 약 30μg 내지 약 2,550mg, 약 40μg 내지 약 2,500mg, 약 50μg 내지 약 2,475mg, 약 100μg 내지 약 2,450mg, 약 200μg 내지 약 2,425mg, 약 300μg 내지 약 2,000, 약 400μg 내지 약 1,175mg, 약 500μg 내지 약 1,150mg, 약 0.5mg 내지 약 1,125mg, 약 1mg 내지 약 1,100mg, 약 1.25mg 내지 약 1,075mg, 약 1.5mg 내지 약 1,050mg, 약 2.0mg 내지 약 1,025mg, 약 2.5mg 내지 약 1,000mg, 약 3.0mg 내지 약 975mg, 약 3.5mg 내지 약 950mg, 약 4.0mg 내지 약 925mg, 약 4.5mg 내지 약 900mg, 약 5mg 내지 약 875mg, 약 10mg 내지 약 850mg, 약 20mg 내지 약 825mg, 약 30mg 내지 약 800mg, 약 40mg 내지 약 775mg, 약 50mg 내지 약 750mg, 약 100mg 내지 약 725mg, 약 200mg 내지 약 700mg, 약 300mg 내지 약 675mg, 약 400mg 내지 약 650mg, 약 500mg 또는 약 525mg 내지 약 625mg의 항체 범위 내일 수 있다.
본 명세서에서, “대상체”는 마우스 또는 래트와 같은 설치류, 필리핀 원숭이(Macaca fascicularis), 붉은털 원숭이(Macaca mulatta) 또는 인간(Homo sapiens)과 같은 영장류를 의미한다. 바람직하게는, 대상체는 영장류 동물이고, 보다 바람직하게는 인간이다. 본 명세서에서, “예방”은 질병의 발병을 예방하거나 지연시키는 것을 목표로 하는 방법을 의미한다.
본 명세서에서, 암의 구현예에는 암, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이 포함되나 이에 헌정되지 않는다. 보다 구체적인 예에는 편평 세포 암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위암, 췌장암, 교모세포종 및 신경 섬유종증과 같은 신경 교세포 종양, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 흑색종, 결장직장암, 자궁내막암, 침샘암, 신종양, 신장암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간암 및 각종 두경부암이 포함된다. 구체적인 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법으로 치료 또는 진단된 암은 흑색종, 유방암, 난소암, 신장암, 위장관/결장암, 폐암 및 전립선암으로부터 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 상기 암은 흑색종, 폐암, 두경부암, 결장직장암, 췌장암, 위암, 신장암, 방광암, 전립선암, 유방암, 난소암 또는 간암을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명은 또한 상기에 언급된 항체 또는 항체 단편 이외에 암 치료를 위한 다른 약물을 포함할 수 있는 약물 조합을 제공한다. 조성물은 단독으로 투여되거나 조합 요범으로 투여될 수 있는데, 즉 기타 약물 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 조합 요법은 본 명세서에서 제공하는 조성물 및 본 명세서에 기재된 항암제와 같은 적어도 하나 또는 복수의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 또한 방사선 요법 및/또는 수술과 조합하여 투여될 수 있다. 항-EGFR항체의 특정 조합은 추가 치료제와 함께 또는 추가 치료제 없이 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
예를 들어, 제공된 다른 암 치료용 약물은 항-CTLA-4 항체, 항-PD-L1 항체, 항-LAG-3 항체, 항-TIM-3 항체, 항-BTLA 항체 또는 기타 항-종양 항체 조합 적용과 같은 항체일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 예시적인 항체는 뮤린 항체이든 인간화 항체이든 상관없이 인간 PVRIG 단백질에 높은 친화도로 결합할 수 있고, 인간 PBMC에 의한 종양 세포의 사멸을 촉진할 수 있다. 이 밖에, 제공된 항체는 또한 생체 내에서 종양 성장 억제 활성을 나타낸다.
당업자는 하기 실시예가 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주해서는 안 된다는 것을 이해할 것이다. 실시예에 구체적인 기술이나 조건이 표시되지 않은 경우, 당업계의 문헌에 설명된 기술 또는 조건 또는 제품 사양에 따라 수행된다. 제조사 표시 없이 사용되는 시약이나 기구는 모두 시중에서 구할 수 있는 재래품이다.
실시예 1
(I) 항-인간 PVRIG 단일클론 항체의 제조
약간의 조정을 거친 기존의 하이브리도마 세포 융합 기술을 참조하여 항-PVRIG 단일클론 항체를 제조하였다. 구체적인 내용은 다음과 같다.
(1) 재조합 융합 단백질의 제조
인간 PVRIG 단백질(SEQ ID NO:45로 표시됨)을 코딩하는 전장 유전자를 인공 합성하고, PCR을 사용하여 SEQ ID NO:46으로 표시된 단백질 단편을 증폭하고, 표적 서열의 C-말단에 인간 IgG1 불변 영역(SEQ ID NO:47로 표시됨)의 단백질 단편을 도입하고, pLVX-IRES-zsGreen 담체에 클로닝하고, 렌티바이러스를 패키징하고, HEK293T 세포계를 감염시켜 과발현된 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 얻은 후, 통상적인 세포 배양을 통해 세포 배양 상청액을 수집하고, Protein G 친화 크로마토그래피(GE Healthcare)로 정제하여 순도 90% 이상인 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 얻었다. 질량 분석기로 확인한 결과, 표적 단백질의 펩티드 세그먼트가 PVRIG 서열과 일치하였으며, 이는 상기 재조합 단백질이 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질임을 증명하였다.
인간 PVRIG 전장 아미노산 서열:
MRTEAQVPALQPPEPGLEGAMGHRTLVLPWVLLTLCVTAGTPEVWVQVRMEATELSSFTIRCGFLGSGSISLVTVSWGGPNGAGGTTLAVLHPERGIRQWAPARQARWETQSSISLILEGSGASSPCANTTFCCKFASFPEGSWEACGSLPPSSDPGLSAPPTPAPILRADLAGILGVSGVLLFGCVYLLHLLRRHKHRPAPRLQPSRTSPQAPRARAWAPSQASQAALHVPYATINTSCRPATLDTAHPHGGPSWWASLPTHAAHRPQGPAAWASTPIPARGSFVSVENGLYAQAGERPPHTGPGLTLFPDPRGPRAMEGPLGVR (SEQ ID NO:45)
인간 PVRIG 세포외 세그먼트 아미노산 서열: (41-172)
Figure pct00002
(SEQ ID NO:46)
인간 IgG1 불변 영역 아미노산 서열:
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:47)
유사한 방법으로 재조합 인간 CD112-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 제조하였다. 여기서 인간 CD112 전장 아미노산 서열은 SEQ ID NO:48로 표시되며, 인간 CD112 세포외 세그먼트 아미노산 서열은 SEQ ID NO:49로 표시된다.
인간 CD112 전장 아미노산 서열:
MARAAALLPSRSPPTPLLWPLLLLLLLETGAQDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGGIIGGIIAAIIATAVAATGILICRQQRKEQTLQGAEEDEDLEGPPSYKPPTPKAKLEAQEMPSQLFTLGASEHSPLKTPYFDAGASCTEQEMPRYHELPTLEERSGPLHPGATSLGSPIPVPPGPPAVEDVSLDLEDEEGEEEEEYLDKINPIYDALSYSSPSDSYQGKGFVMSRAMYV (SEQ ID NO:48)
인간 CD112 세포외 세그먼트 아미노산 서열: (32-360)
QDVRVQVLPEVRGQLGGTVELPCHLLPPVPGLYISLVTWQRPDAPANHQNVAAFHPKMGPSFPSPKPGSERLSFVSAKQSTGQDTEAELQDATLALHGLTVEDEGNYTCEFATFPKGSVRGMTWLRVIAKPKNQAEAQKVTFSQDPTTVALCISKEGRPPARISWLSSLDWEAKETQVSGTLAGTVTVTSRFTLVPSGRADGVTVTCKVEHESFEEPALIPVTLSVRYPPEVSISGYDDNWYLGRTDATLSCDVRSNPEPTGYDWSTTSGTFPTSAVAQGSQLVIHAVDSLFNTTFVCTVTNAVGMGRAEQVIFVRETPNTAGAGATGG (SEQ ID NO:49)
유사한 방법으로 필리핀 원숭이 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 제조하였다. 여기서 필리핀 원숭이 PVRIG아미노산 서열은 SEQ ID NO:50으로 표시되며, 필리핀 원숭이 PVRIG 세포외 세그먼트 서열은 SEQ ID NO:51로 표시된다.
필리핀 원숭이 PVRIG 아미노산 서열:
MRTEAQVLALQSPEPGLEGAMGRRTLALPWVLLTLCVTAGTPEVWVQVQMEATELSSFTVHCGFLGPGSISLVTVSWGGPDGAGGTKLAVLHPELGTRQWAPARQARWETQSSISLALEDSGASSPFANTTFCCKFASFPEGSWESCGSLPPSSDPGLSAPPTPVPILRADLAGILGLSGVLLFGCGYLLHLLRRQKHRPTPRLQPSHTNSQALTAQAWAPSQASQAALHDPYATINTSFCPATLDTAHPNGWASLPTHAAHQPQGPAASASTPILARGSFVSVENGLYTQAGERPPHTGPGLTLFPDCRGPRALEGRFGVR (SEQ ID NO:50)
필리핀 원숭이 PVRIG 세포외 세그먼트 서열: (39-171)
Figure pct00003
(SEQ ID NO:51)
(2) 동물 면역화, 하이브리도마 세포 융합 및 클론 스크리닝
상기에서 얻은 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 동일한 부피의 완전 프로인트 아쥬반트(CFA)와 잘 혼합하고, 8-10주령 BALB/c 암컷 마우스(Shanghai Leske에서 구입, 체중 약 20g)의 초기 면역화를 위해 각 마우스에 40-60μg의 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 복강내 주사하고; 이어서, 2주당 1회 면역화하고, 동일한 용량의 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 동일한 부피의 불완전 프로인트 아쥬반트와 혼합하고, 총 5회 면역화한 후, ELISA에 의해 검출된 마우스의 혈청 역가가 1:105 이상일 때, 마지막으로 부스팅을 위해 40-60μg의 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 주사하였다. 부스팅 후 3일째에 표준 기술을 사용하여 비장 세포를 분리하고 마우스 골수종 세포 SP2/0 세포(ATCC 번호 CRL-1581)와 융합시켰다.
ELISA 및 유세포 분석 확인 결과, 모두 양성 신호를 나타낸 하이브리도마 세포를 서브 클로닝하고 스크리닝하여 4주의 하이브리도마 세포를 얻었다.
(3) 단일클론 항체의 발현 및 정제
단일클론 항체는 마우스 복강 접종법을 사용하여 제조하였다. 먼저 500μl의 멸균된 액체 파라핀을 8-10주령의 BALB/c 암컷 마우스에 복강내 접종하고, 1주일 후 1Х106 하이브리도마 세포를 복강내 주사하고, 약 7-10일에 복수를 수집하고, 고속 원심분리기로 상청액을 수집하였다. 상기 방법으로 얻은 상청액을 Protein G 친화 크로마토그래피로 정제하여 순도 95% 이상의 단일클론 항체를 얻었다.
(II) 항-PVRIG 단일클론 항체의 가변 영역 서열
후보 하이브리도마 세포의 총 수를 106으로 배양하고, 800rpm에서 10분간 원심분리하여 세포를 수집하고, Trizol 키트(Invitrogen)로 총 RNA를 추출하고, 총 RNA를 주형으로 하여 역전사를 통해 cDNA 라이브러리(Invitrogen)를 합성하고, 또한 cDNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 하이브리도마 세포의 해당 가변 영역 핵산 서열을 증폭하였다. 이어서, 시퀀싱을 통해 하이브리도마 세포의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(CDR 서열 포함)을 얻었다.
여기서, 아미노산 서열을 확인한 결과, 각 항체의 서열은 각각 다음과 같다.
항체 4로 넘버링된 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:1로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:2로 표시되며; 항체 1로 넘버링된 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:39로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:40으로 표시되며; 항체 2로 넘버링된 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:41로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:42로 표시되며; 항체 3으로 넘버링된 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:43으로 표시되고, 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:44로 표시된다.
항체 1, 항체 2, 항체 3 및 항체 4로 넘버링된 상기 항체는 모두 뮤린 항체이다.
(III) 인간화 항체의 발현 및 정제:
상기 상이한 항체는 인간화될 수 있는데, 여기에서는 항체 4를 예로 들어 인간화를 수행하고, 얻어진 인간화 항체는 항체 4-hu1 내지 항체 4-hu11를 포함하나 이에 한정되지 않으며, 제조 및 정제는 대체로 하기와 같은 방법으로 수행될 수 있다. 인공 유전자 합성을 통해 인간화 항체를 코딩하는 HC 및 LC 핵산 서열을 포함하는 담체를 얻고, HEK293 또는 CHO와 같은 적절한 숙주 세포를 취하고, 최적의 기설정 HC: LC 담체 비율(예를 들어, 1:1 또는 1:2)을 항체 분비가 가능한 발현 시스템으로 사용하여 일시적 또는 안정적인 형질감염을 수행하였다. 이어서, 세포 배양 상청액을 수집하고 Protein A 친화 크로마토그래피로 정제하여 순도 95% 이상의 인간화 항체를 얻을 수 있다.
실시예 2
실시예 2에서는 상기 실시예 1에서 제조된 상이한 항체의 활성 및 항원 결합 특이성을 평가하였다. 여기서 사용된 동형 대조군은 마우스 IgG1, κ(Biolegend에서 구입)이다.
인간 PVRIG-Fc 융합 단백질에 대한 상이한 클론의 뮤린 항체의 결합 활성을 ELISA에 의해 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
1ХPBS(인산염 완충액)로 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 1.0μg/ml, 100μl/웰로 희석하고, 96웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하고, PBST(0.05%의 Tween20-PBS)로 3회 세척하고, 1%의 BSA로 블로킹하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 2배 희석된 뮤린 항체(항체 1, 항체 2, 항체 3 또는 항체 4)를 각각 첨가하여 8개의 농도로 설정하고, 마우스 IgG1(Biolegend에서 구입)을 음성 대조군으로 사용하고, 100μl/웰, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 각 웰에 100μl겨자무과산화효소(HRP) 표지 염소 항-마우스 IgG 항체(Boster Biologicals에서 구입, 1:10000로 희석)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 각 웰에 100μl의 TMB 기질용액을 첨가하고, 암실에서 10-15분간 발색시키고, 100μl/웰의 정지액(2M의 H2SO4)을 첨가하고, 정지 직후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 검출하고, 파장 450nM에서의 흡광도 값(OD450)을 판독하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1로부터, 상이한 클론의 뮤린 항체가 모두 인간 PVRIG-Fc 융합 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 인간 PVRIG 단백질에 대한 상이한 클론의 뮤린 항체의 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
293T-인간 PVRIG 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 각각 상이한 농도의 각 뮤린 항체(항체 1, 항체 2, 항체 3 또는 항체 4)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 염소 항-마우스 IgG 항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였다.
도 2에 나타낸 결과로부터, 상이한 클론의 뮤린 항체가 모두 세포막 표면의 인간 PVRIG 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 인간 PVRIG와 리간드 CD112와의 결합을 차단하는 상이한 클론의 뮤린 항체의 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
293T-인간 CD112 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 각각 상이한 농도의 각 뮤린 항체(항체 1, 항체 2, 항체 3 또는 항체 4) 및 10μg/ml의 인간 CD112-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 마우스 항-인간 IgG-Fc항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였다.
도 3의 결과로부터, 상이한 클론의 뮤린 항체가 모두 인간 PVRIG와 이의 리간드 CD112의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 인간 PVRIG 단백질에 대한 상이한 클론의 뮤린 항체의 경쟁적 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
293T-human PVRIG 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 각각 10μg/ml의 대조군 항체 마우스 IgG1 및 상이한 클론의 각 뮤린 항체(항체 1, 항체 2, 항체 3 또는 항체 4)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 항체 4 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4로부터, 항체 1, 항체 2 및 항체 4는 인간 PVRIG에 대한 경쟁적 결합 관계를 갖는 반면, 항체 3과 항체 4는 상이한 인간 PVRIG 에피토프에 결합함을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 필리핀 원숭이 및 마우스 PVRIG에 대한 뮤린 항체의 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
293T-필리핀 원숭이 PVRIG 및 293T-마우스 PVRIG 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, AF647 표지 항체 4 뮤린 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5로부터, 항체 4 뮤린 항체는 필리핀 원숭이의 PVRIG 단백질에는 결합할 수 있으나 마우스의 PVRIG 단백질에는 결합할 수 없음을 보아낼 수 있다.
ELISA 방법으로 뮤린 항체의 필리핀 원숭이 PVRIG 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
1ХPBS(인산염 완충액)로 재조합 필리핀 원숭이 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 1.0μg/ml, 100μl/웰로 희석하고, 96웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하고, PBST(0.05%의 Tween20-PBS)로 3회 세척하고, 1%의 BSA로 블로킹하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 각각 2배 희석된 뮤린 항체(항체 4)를 첨가하여 11개의 농도로 설정하고, 100μl/웰의 마우스 IgG1을 음성 대조군으로 사용하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 각 웰에 100μl겨자무과산화효소(HRP) 표지 염소 항-마우스 IgG 항체(Boster Biologicals에서 구입, 1:10000로 희석)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 각 웰에 100μl의 TMB 기질용액을 첨가하고, 암실에서 10-15분간 발색시키고, 100μl/웰의 정지액(2M의 H2SO4)을 첨가하고, 정지 직후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 검출하고, 파장 450nM에서의 흡광도 값(OD450)을 판독하였으며, 결과를 도 6에 나타내었다. 이로부터, 항체 4 뮤린 항체는 필리핀 원숭이의 PVRIG 단백질에 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 NKG 세포의 메산지얼 표면 PVRIG에 대한 뮤린 항체의 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
NKG 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 10μl의 마우스 혈청을 첨가하고, 4℃에서 30분간 블로킹하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 항체 4를 첨가하여 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 검출 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7로부터, 뮤린 항체 4가 NKG 세포계 표면의 인간 PVRIG 단백질에 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 림프구 막 표면의 PVRIG에 대한 뮤린 항체의 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
Ficoll(말초 혈액 림프구 분리액, GE Healthcare) 400g을 사용하여 30분간 원심분리하여 정상 인간 말초 혈액에서 림프구를 분리하고, 1ХPBS로 재현탁하고, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 1Х106개의 세포를 넣고, 10μl의 마우스 혈청을 첨가하고, 4℃에서 30분간 블로킹하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 항체 4, PercP-Cy5.5 표지 마우스 항-인간 CD3항체(Biolegend에서 구입), PE-Cy7 표지 마우스 항-인간 CD8항체(BD에서 구입), BV421 표지 마우스 항-인간 CD4항체(BD에서 구입) 및 BV605 표지 마우스 항-인간 CD56항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 검출 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8로부터, 뮤린 항체 4가 인간 림프구 막 표면의 PVRIG 단백질에 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
유세포 분석으로 종양 세포계 표면 CD112의 발현을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
SW620 결장암 세포계(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences), A375 흑색종 세포계(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences) 및 SK-OV-3 난소암 세포계(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 10μl의 마우스 혈청을 첨가하고, 4℃에서 30분간 블로킹하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, APC 표지 마우스 항-인간 CD112항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 검출 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9로부터, PVRIG의 리간드 CD112가 다양한 종양 세포계 표면에서 모두 고도로 발현됨을 보아낼 수 있다.
실험은 계속해서 NK 세포의 세포 독성을 촉진하는 뮤린 항체의 작용을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
Ficoll(말초 혈액 림프구 분리액, GE Healthcare) 400g을 사용하여 30분간 원심분리하여 정상 인간 말초 혈액에서 림프구를 분리하고, 1ХPBS로 재현탁하고; 이어서, NK 세포 분류 키트(Militani, Human NK Cell Isolation Kit)를 적용하여 NK 세포를 정제하였다. 이어서, 정제된 NK 세포를 이펙터 세포로 사용하고, CFSE(Thermo Scientific에서 구입) 표지 SW620 결장암 세포계를 표적 세포로 사용하였으며, 1.25:1, 2.5:1 및 5:1의 이펙터-표적 비율에 따라, 96웰 둥근 바닥 플레이트에 넣고, 배양 시스템에 10μg/ml의 마우스 IgG1를 대조군 항체 및 뮤린 항체(항체 4)로서 각각 250g 첨가하여 4분간 원심분리하고, 이어서, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 사멸된 종양 세포를 7AAD로 표지하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10으로부터, 상이한 이펙터-표적 비율 조건에서, 뮤린 항체(항체 4)가 NK 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 크게 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 인간 PBMC의 세포 독성을 촉진하는 뮤린 항체의 작용을 추가로 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
Ficoll(말초 혈액 림프구 분리액, GE Healthcare) 400g을 사용하여 30분간 원심분리하여 정상 인간 말초 혈액에서 림프구를 분리하고, 1ХPBS로 재현탁하고; 이어서, 인간 PBMC 세포를 이펙터 세포로 사용하고, CFSE(Thermo Scientific에서 구입) 표지 SW620 결장암 세포계 또는 A375 흑색종 세포 또는 SK-OV-3 난소암 세포를 표적 세포로 사용하였으며, 12.5:1, 25:1 및 50:1의 이펙터-표적 비율에 따라, 96웰 둥근 바닥 플레이트에 넣고, 배양 시스템에 10μg/ml의 마우스 IgG1를 대조군 항체 및 뮤린 항체(항체 4)로서 각각 250g 첨가하고, 4분간 원심분리하고, 이어서, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 사멸된 종양 세포를 7AAD로 표지하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11로부터, 상이한 이펙터-표적 비율 조건에서, 뮤린 항체 Antibody 4가 모두 인간 PBMC 세포에 의한 다양한 종양 세포의 사멸을 크게 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 유세포 분석으로 뮤린 항체가 NK 세포의 이펙터 분자 발현을 촉진하는 효과를 추가로 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
Ficoll(말초 혈액 림프구 분리액, GE Healthcare) 400g을 사용하여 30분간 원심분리하여 정상 인간 말초 혈액에서 림프구를 분리하고, 1ХPBS로 재현탁하고; 이어서, 인간 PBMC 세포를 이펙터 세포로 사용하고, SW620 결장암 세포계를 표적 세포로 사용하였으며, 25:1의 이펙터-표적 비율에 따라, 96웰 둥근 바닥 플레이트에 넣고, 배양 시스템에 10μg/ml의 마우스 IgG1를 대조군 항체 및 뮤린 항체(항체 4)로서 각각 250g 첨가하고, 4분간 원심분리하고, 이어서, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션의 마지막 4시간 동안에 2.5μg/ml의 모넨신(Sigma에서 구입) 및 BV510 표지 마우스 항-인간 CD107a항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하였다. 인큐베이션 종료 후, 세포를 수집하고, 1ХPBS로 세척하고, 100μl의 1ХPBS로 세포를 재현탁하고, 10μl의 마우스 혈청을 첨가하여 4℃에서 30분간 블로킹하였다. 1ХPBS로 세척하고, 100μl의 1ХPBS로 세포를 재현탁하고, PercP-Cy5.5 표지 마우스 항-인간 CD3항체(Biolegend에서 구입, PE-Cy7 표지 마우스 항-인간 CD8항체(BD에서 구입), BV421 표지 마우스 항-인간 CD4항체(BD에서 구입) 및 BV605 표지 마우스 항-인간 CD56항체(Biolegend에서 구입)를 각각 첨가하여 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 350g에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer(eBioscience에서 구입)로 세포를 재현탁하고, FITC 표지 마우스 항-인간 IFN-γ(Biolegend에서 구입) 및 PE 표지 마우스 항-인간 TNF-α(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 다음, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 500g에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포를 재현탁하고, 유세포 분석기(BD FACS Celesta)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12로부터, 뮤린 항체(항체 4)가 NK 세포의 탈과립 능력을 향상시키고 사이토카인의 분비를 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 ELISA 방법으로 뮤린 항체가 NK 세포 사이토카인의 분비를 촉진하는 효과를 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다. Ficoll(말초 혈액 림프구 분리액, GE Healthcare) 400g을 사용하여 30분간 원심분리하여 정상 인간 말초 혈액에서 림프구를 분리하고, 1ХPBS로 재현탁하고; 이어서, NK 세포 분류 키트(Militani, Human NK Cell Isolation Kit)를 적용하여 NK 세포를 정제하였다. 이어서, 정제된 NK 세포를 이펙터 세포로 사용하고, SW620 결장암 세포계를 표적 세포로 사용하였으며, 2.5:1의 이펙터-표적 비율에 따라, 96웰 둥근 바닥 플레이트에 넣고, 배양 시스템에 10μg/ml의 마우스 IgG1를 대조군 항체 및 뮤린 항체(항체 4)로서 각각 250g 첨가하고, 4분간 원심분리하고, 이어서, 37℃에서 18시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 배양 상청액을 수집하고, ELISA 키트(Daktronics에서 구입) 배양 상청액 중의 IFN-γ의 함량을 검출하였다. ELISA 분석 통계 결과를 도 13에 나타내었다. 이로부터, 뮤린 항체(항체 4)가 NK 세포에 의한 IFN-γ의 분비를 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 종양 성장을 억제하는 뮤린 항체의 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
SW620 결장암 세포(Shanghai Cell Bank, Chinese Academy of Sciences)를 체외에서 증폭시키고, 세포를 수집하고, 1ХPBS로 2회 세척하고, 800rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다, 멸균 식염수로 세포를 재현탁하고, 세포 계수를 수행하였다, 세포 농도를 1Х107 cells/ml로 조정하고, 6-8주령 B-NDG마우스의 오른쪽 겨드랑이에 100μl의 세포를 접종하고, 7일째에 종양이 있는 세포를 무작위로 그룹화하고, Ficoll에 의해 분리된 인간 PBMC 세포를 마우스당 1Х107개 세포로 꼬리 정맥에 주사하였다. 다음날부터 PBS 또는 마우스 IgG대조군 항체 또는 뮤린 항체 Antibody 4(250μg/마리)를 3일에 1회씩 총 5회 복강내 주사하였다. 마우스의 피하 종양의 장변 및 단변을 3일마다 측정하고 체중을 재였다. 실험 공식(종양 크기=장변Х단변Х단변/2)에 따라 계산하여 종양 크기를 얻었으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다. 결과는 뮤린 항체(항체 4)가 생체 내에서 피하 종양의 성장을 억제할 수 있음을 나타낸다.
실험은 추가로 ELISA 방법으로 인간 PVRIG에 대한 인간화 항체의 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
1ХPBS(인산염 완충액)로 재조합 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 1.0μg/ml, 100μl/웰로 희석하고, 96웰 ELISA 플레이트를 4℃에서 밤새 코팅하고, PBST(0.05%의 Tween20-PBS)로 3회 세척하고, 1%의 BSA로 블로킹하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 2배 희석한 인간화 항체를 각각 첨가하여 8개의 농도로 설정하고, 100μl/웰의 인간 IgG4(Biolegend에서 구입)를 음성 대조군으로 사용하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. PBST로 3회 세척하고, 각 웰에 100μl겨자무과산화효소(HRP) 표지 마우스 항-인간 IgG4-Fc항체(Southern Biotech에서 구입, 1:5000로 희석)를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 각 웰에 100μl의 TMB 기질용액을 첨가하고, 암실에서 10-15분간 발색시키고, 100μl/웰의 정지액(2M의 H2SO4)을 첨가하고, 정지 직후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 검출하고, 파장 450nM에서의 흡광도 값(OD450)을 판독하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15로부터, 인간화 항체가 모두 인간 PVRIG 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 유세포 분석으로 인간 PVRIG에 대한 인간화 항체의 결합 활성을 평가하였다.
293T-human PVRIG 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 상이한 농도의 각 인간화 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 마우스 항-인간 IgG-Fc항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 16에 나타내었다. 이로부터, 각 인간화 항체가 모두 세포막 표면의 인간 PVRIG 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 유세포 분석으로 필리핀 원숭이 PVRIG에 대한 인간화 항체의 결합 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
293T-필리핀 원숭이 PVRIG 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 상이한 농도의 각 인간화 항체를 각각 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 마우스 항-인간 IgG-Fc항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17로부터, 각 인간화 항체가 모두 세포막 표면의 필리핀 원숭이의 PVRIG 단백질에 특이적으로 결합할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 유세포 분석으로 인간 PVRIG와 리간드의 결합을 차단하는 인간화 항체의 활성을 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
293T-인간 CD112 세포계를 수집하고, 1ХPBS로 세척하여 재현탁한 후, 세포 계수를 수행하였다. 이어서, 각각의 1.5ml Ep 튜브에 2Х105개의 세포를 넣고, 각각 인간화 항체 및 10μg/ml의 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 첨가하고, 4℃에서 30분간 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 100μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, AF647 표지 마우스 항-인간 IgG-Fc항체(Biolegend에서 구입)를 첨가하고, 4℃에서 30분간 암실에서 인큐베이션하고, 이어서, 1×PBS를 첨가하여 2회 세척하고, 3500rpm에서 5분간 원심분리하여 세포를 수집하였다. 200μl의 1ХPBS로 세포 펠렛을 재현탁하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였다. 분석 통계 결과를 도 18에 나타내었으며, 이로부터 인간화 항체가 모두 인간 PVRIG와 리간드 CD112의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 보아낼 수 있다.
실험은 인간화 항체가 인간 PBMC의 세포 독성을 촉진하는 작용을 추가로 평가하였다. 실험 과정은 다음과 같다.
Ficoll(말초 혈액 림프구 분리액, GE Healthcare) 400g을 사용하여 30분간 원심분리하여 정상 인간 말초 혈액에서 림프구를 분리하고, 1ХPBS로 재현탁하고; 이어서, 인간 PBMC 세포를 이펙터 세포로 사용하고, CFSE(Thermo Scientific에서 구입) 표지 SW620 결장암 세포계를 표적 세포로 사용하였으며, 25:1의 이펙터-표적 비율에 따라, 96웰 둥근 바닥 플레이트에 넣고, 배양 시스템에 10μg/ml의 인간 IgG4를 대조군 항체, 뮤린 항체(항체 4) 및 인간화 항체로서 각각 250g 첨가하여 4분간 원심분리하고, 이어서, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 사멸된 종양 세포를 7AAD로 표지하고, 유세포 분석기(BD LSR II)를 사용하여 검출하였으며, 분석 통계 결과를 도 19에 나타내었다. 이로부터, 인간화 항체가 모두 인간 PBMC 세포에 의한 종양 세포의 사멸을 크게 촉진할 수 있음을 보아낼 수 있다.
표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 친화도 상수 측정:
표면 플라즈몬 공명(Biacore) 측정 방법으로 인간 PVRIG에 대한 본 발명의 항체의 결합 동역학 및 해리 평형 상수(KD)를 측정하였다. 간단히 말하면, CM5 칩에 인간 PVRIG-인간 IgG1 Fc 융합 단백질을 코팅하고, 블로킹 후, 상이한 농도의 항체 용액을 CM5 칩에 고정된 유속으로 통과시켜 항원에 2분간 결합시키고, 이어서, 해리 완충액으로 옮겨 6분간 해리율을 측정하였다. 1:1 결합 모델을 사용하여 동역학을 분석하였다.
대체로 전술한 바와 같은 실험에서, 측정된 뮤린 항체의 친화도를 표 1에 나타내었고, 각 인간화 항체의 친화도를 표 2에 나타내었다.
표 1: 뮤린 항체의 친화도 크기
Figure pct00004
표 2: 인간화 항체의 친화도 크기
Figure pct00005
상기 내용으로부터, 얻어진 항체 1 ~ 4 및 대응되는 항체 4의 인간화 항체는 모두 PVRIG에 대한 우수한 친화도를 나타내며, 양호한 항종양 효과를 나타낼 수 있음을 보아낼 수 있다.
본 명세서의 설명에서, 참조 용어 "일 실시예”, "일부 실시예”, "예시”, "구체적인 예시” 또는 "일부 예시” 등의 설명은 상기 실시예 또는 예시를 결합하여 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시예 또는 예시에 포함되는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 상기 용어의 예시적인 표현이 반드시 동일한 실시예 또는 예시에 대한 것은 아니다. 또한, 설명된 구체적인 특징, 구조, 재료 또는 특징은 하나 이상의 실시예 또는 예시에서 적합한 방식으로 결합될 수 있다. 이 밖에, 서로 모순되지 않은 경우, 당업자는 본 명세서에서 설명된 상이한 실시예 또는 예시 및 상이한 실시예 또는 예시의 특징을 결합 및 조합할 수 있다.
이상에서 본 발명의 실시예가 도시되고 설명되었지만, 상술한 실시예는 예시적인 것일 뿐 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안되며, 당업자는 본 발명의 범위 내에서 전술한 실시예를 변화, 수정, 대체 및 변형시킬 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Hefei TG ImmunoPharma Co., Ltd. <120> ANTI-PVRIG PROTEIN ANTIBODY OR ANTIBODY FRAGMENT AND USE THEREOF <130> HI5210020P <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> heavy chain variable region <400> 1 QVQLQQSGAE LVKPGASVKI SCKATGYTFS SFSIEWVKQR 40 PGHGLAWIGE ILPGSNSTNY NEKFKGKATF TADTSSNTAY 80 MQLSSLTSED SAVYYCSSYW FAYWGQGTLV TVSA 114 <210> 2 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> light chain variable region <400> 2 DIVMTQSPSS LSVSAGEKVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLA 40 WYQQKPGQPP KLLIYGASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT 80 ISSVQAEDLA VYYCQNAHSY PPTFAAGTKL ELK 113 <210> 3 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> heavy chain variable region <400> 3 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SFSIEWVRQA 40 PGQGLEWMGE ILPGSNSTNY NEKFKGRVTI TADESTSTAY 80 MELSSLRSED TAVYYCARYW FAYWGQGTLV TVSS 114 <210> 4 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> 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gtccgaggat accgctgtgt actattgtgc caggtattgg 300 ttcgcttatt ggggccaggg caccctggtg accgtgtcct ccgcctccac caagggcccc 360 tccgtgttcc ccctggctcc ctgtagccgg tccaccagcg agtccaccgc tgccctgggc 420 tgtctggtga aggactattt ccccgagccc gtgaccgtga gctggaatag cggcgccctg 480 acctccggcg tgcacacatt ccctgctgtg ctgcagagct ccggcctgta tagcctgtcc 540 tccgtggtga ccgtgccctc ctcctccctg ggcaccaaga cctatacctg caatgtggac 600 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agggtggaga gcaagtacgg ccctccttgc 660 cctccttgcc ccgctccaga gttcctgggc ggcccaagcg tgtttctgtt tcctcccaag 720 cctaaggaca ccctgatgat ctccaggacc cctgaggtga cctgcgtggt ggtggatgtg 780 tcccaggagg accctgaggt gcagttcaac tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcacaac 840 gccaagacca agccccggga ggagcagttc aacagcacct accgggtggt gagcgtgctg 900 accgtgctgc accaggattg gctgaatggc aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag 960 ggcctgccta gcagcatcga gaagaccatc tccaaggcca agggccagcc cagggagcct 1020 caggtgtata ccctgccccc tagccaggag gagatgacca agaaccaggt gagcctgacc 1080 tgcctggtga agggctttta tcctagcgat 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aactccacct acagggtggt gtccgtgctg 900 accgtgctgc accaggactg gctgaatggc aaggagtaca agtgtaaggt gagcaacaag 960 ggcctgcctt ccagcatcga gaagaccatc tccaaggcta agggccagcc tcgggagcct 1020 caggtgtaca ccctgccccc tagccaggag gagatgacca agaaccaggt gtccctgacc 1080 tgcctggtga agggctttta tccctccgac atcgccgtgg agtgggagag caatggccag 1140 cctgagaaca attataagac cacccctcct gtgctggaca gcgatggctc cttctttctg 1200 tactcccggc tgaccgtgga caagagcagg tggcaggagg gcaatgtgtt ctcctgtagc 1260 gtgatgcacg aggccctgca caaccactac acccagaagt ccctgtccct gtccctcggc 1320 aag 1323 <210> 18 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> heavy chain variable region <400> 18 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SFSIEWVRQA 40 PGQGLEWIGE ILPGSNSTNY NEKFKGKATF TADTSTNTAY 80 MELSSLRSED TAVYYCSSYW FAYWGQGTLV TVSS 114 <210> 19 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> heavy chain <400> 19 EVQLVQSGAE VKKPGSSVKV SCKASGGTFS SFSIEWVRQA 40 PGQGLEWIGE ILPGSNSTNY NEKFKGKATF TADTSTNTAY 80 MELSSLRSED 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41 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> heavy chain variable region <400> 41 QVQLQQSGAE LTKPGASVKI SCKATGYTFS TFAIDWIKQR 40 PGHGLAWIGE ILPGGNNTNY NEKFKGKATF TADTSSNTAY 80 MHLSSLTSED SAVYYCSTYW FAYWGQGTLV TVSA 114 <210> 42 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> light chain variable region <400> 42 DIVMTQSPSS LSVSAGEKVT MSCKSSQSLL NSGNQKNYLA 40 WYQQKPGQPP KLLMYGASTR ESGVPDRFTG SGSGTDFTLT 80 ISSVQAEDLA VYYCQNAHSY PPAFGAGTKL ELK 113 <210> 43 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> heavy chain variable region <400> 43 EVQLQQSGPE LVKPGASMKI SCKASGYSFT AYTMNWVKQS 40 HGKNLEWIGL INPYNGGTSY NQKFKGKATL TGDKSSSTAY 80 MELLSVTSED SAVYFCAREG NYYGSRGDFD YWGQGTTLTV 120 SS 122 <210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> light chain variable region <400> 44 DILLTQSPAI LSVSPGERVS FSCRASQTIV TNILWYQQRT 40 NGSPRLLIRY ASESISGIPS RFSGSGSGTD FTLSINSVES 80 EDIAHYYCQQ SHSWPFTFGS GTKLEIK 107 <210> 45 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> human PVRIG full length amino acid <400> 45 MRTEAQVPAL QPPEPGLEGA MGHRTLVLPW VLLTLCVTAG 40 TPEVWVQVRM EATELSSFTI RCGFLGSGSI SLVTVSWGGP 80 NGAGGTTLAV LHPERGIRQW APARQARWET QSSISLILEG 120 SGASSPCANT TFCCKFASFP EGSWEACGSL PPSSDPGLSA 160 PPTPAPILRA DLAGILGVSG VLLFGCVYLL HLLRRHKHRP 200 APRLQPSRTS PQAPRARAWA PSQASQAALH VPYATINTSC 240 RPATLDTAHP HGGPSWWASL PTHAAHRPQG PAAWASTPIP 280 ARGSFVSVEN GLYAQAGERP PHTGPGLTLF PDPRGPRAME 320 GPLGVR 326 <210> 46 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> human PVRIG extracellular segment amino acid <400> 46 TPEVWVQVRM EATELSSFTI RCGFLGSGSI SLVTVSWGGP 40 NGAGGTTLAV LHPERGIRQW APARQARWET QSSISLILEG 80 SGASSPCANT TFCCKFASFP EGSWEACGSL PPSSDPGLSA 120 PPTPAPILRA DL 132 <210> 47 <211> 330 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> human IgG1 constant region amino acid <400> 47 ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS 40 WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT 80 YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPELLGG 120 PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW 160 YVDGVEVHNA KTKPREEQYN STYRVVSVLT VLHQDWLNGK 200 EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE 240 LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVEWESNGQP ENNYKTTPPV 280 LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT 320 QKSLSLSPGK 330 <210> 48 <211> 538 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> human CD112 full length amino acid <400> 48 MARAAALLPS RSPPTPLLWP LLLLLLLETG AQDVRVQVLP 40 EVRGQLGGTV ELPCHLLPPV PGLYISLVTW QRPDAPANHQ 80 NVAAFHPKMG PSFPSPKPGS ERLSFVSAKQ STGQDTEAEL 120 QDATLALHGL TVEDEGNYTC EFATFPKGSV RGMTWLRVIA 160 KPKNQAEAQK VTFSQDPTTV ALCISKEGRP PARISWLSSL 200 DWEAKETQVS GTLAGTVTVT SRFTLVPSGR ADGVTVTCKV 240 EHESFEEPAL IPVTLSVRYP PEVSISGYDD NWYLGRTDAT 280 LSCDVRSNPE PTGYDWSTTS GTFPTSAVAQ GSQLVIHAVD 320 SLFNTTFVCT VTNAVGMGRA EQVIFVRETP NTAGAGATGG 360 IIGGIIAAII ATAVAATGIL ICRQQRKEQT LQGAEEDEDL 400 EGPPSYKPPT PKAKLEAQEM PSQLFTLGAS EHSPLKTPYF 440 DAGASCTEQE MPRYHELPTL EERSGPLHPG ATSLGSPIPV 480 PPGPPAVEDV SLDLEDEEGE EEEEYLDKIN PIYDALSYSS 520 PSDSYQGKGF VMSRAMYV 538 <210> 49 <211> 329 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> human CD112 extracellular segment amino acid <400> 49 QDVRVQVLPE VRGQLGGTVE LPCHLLPPVP GLYISLVTWQ 40 RPDAPANHQN VAAFHPKMGP SFPSPKPGSE RLSFVSAKQS 80 TGQDTEAELQ DATLALHGLT VEDEGNYTCE FATFPKGSVR 120 GMTWLRVIAK PKNQAEAQKV TFSQDPTTVA LCISKEGRPP 160 ARISWLSSLD WEAKETQVSG TLAGTVTVTS RFTLVPSGRA 200 DGVTVTCKVE HESFEEPALI PVTLSVRYPP EVSISGYDDN 240 WYLGRTDATL SCDVRSNPEP TGYDWSTTSG TFPTSAVAQG 280 SQLVIHAVDS LFNTTFVCTV TNAVGMGRAE QVIFVRETPN 320 TAGAGATGG 329 <210> 50 <211> 322 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Macaca fascicularis PVRIG amino acid <400> 50 MRTEAQVLAL QSPEPGLEGA MGRRTLALPW VLLTLCVTAG 40 TPEVWVQVQM EATELSSFTV HCGFLGPGSI SLVTVSWGGP 80 DGAGGTKLAV LHPELGTRQW APARQARWET QSSISLALED 120 SGASSPFANT TFCCKFASFP EGSWESCGSL PPSSDPGLSA 160 PPTPVPILRA DLAGILGLSG VLLFGCGYLL HLLRRQKHRP 200 TPRLQPSHTN SQALTAQAWA PSQASQAALH DPYATINTSF 240 CPATLDTAHP NGWASLPTHA AHQPQGPAAS ASTPILARGS 280 FVSVENGLYT QAGERPPHTG PGLTLFPDCR GPRALEGRFG 320 VR 322 <210> 51 <211> 133 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> <222> <223> Macaca fascicularis PVRIG extracellular segment <400> 51 AGTPEVWVQV QMEATELSSF TVHCGFLGPG SISLVTVSWG 40 GPDGAGGTKL AVLHPELGTR QWAPARQARW ETQSSISLAL 80 EDSGASSPFA NTTFCCKFAS FPEGSWESCG SLPPSSDPGL 120 SAPPTPVPIL RAD 133

Claims (13)

  1. 항체 또는 항체 단편으로서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3, 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 포함하고;
    여기서 HCDR1은 GYTFSSFS, GYTFSTFA 또는 GYSFTAYT로 표시되는 서열로부터 선택되며,
    HCDR2는 ILPGSNST, ILPGINNT, ILPGGNNT 또는 INPYNGGT로 표시되는 서열로부터 선택되고,
    HCDR3은 SSYWFAY, STYWFAY 또는 AREGNYYGSRGDFDY 로 표시되는 서열로부터 선택되며;
    여기서, LCDR1은 QSLLNSGNQKNY 또는 QTIVTN로 표시되는 서열로부터 선택되고,
    LCDR2는 GAS 또는 YAS로 표시되는 서열로부터 선택되며;
    LCDR3은 QNAHSYPPT, QNAHSYPPA 또는 QQSHSWPFT로 표시되는 서열로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체 단편.
  2. 항체 또는 항체 단편으로서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 각각 하기 중 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체 단편:
    (1) GYTFSSFS, ILPGSNST 및 SSYWFAY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPT를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
    (2) GYTFSTFA, ILPGINNT 및 STYWFAY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPT를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
    (3) GYTFSTFA, ILPGGNNT 및 STYWFAY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QSLLNSGNQKNY, GAS 및 QNAHSYPPA를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편; 및
    (4) GYSFTAYT, INPYNGGT 및 AREGNYYGSRGDFDY를 포함하는 중쇄 상보성 결정 영역; 및 QTIVTN, YAS 및 QQSHSWPFT를 포함하는 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  3. 항체 또는 항체 단편으로서,
    상기 항체 또는 항체 단편은 하기 중 적어도 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체 단편:
    (1) SEQ ID NO:1로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:1로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:2로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
    (2) SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열로부터 선택되거나 SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:33으로 표시되는 서열로부터 선택되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:36으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
    (3) SEQ ID NO:39로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:39로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:40으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편;
    (4) SEQ ID NO:41로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:41로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편; 및
    (5) SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 중쇄 가변 영역; 및 SEQ ID NO:44 로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:44로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 경쇄 가변 영역;을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    중쇄 및 경쇄를 포함하고, 상기 중쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:34로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열이며;
    상기 경쇄 아미노산 서열은 SEQ ID NO:37로 표시되는 서열이거나 SEQ ID NO:37로 표시되는 서열과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 치환을 갖는 서열인 것을 특징으로 하는, 항체 또는 항체 단편.
  5. 분리 가능한 핵산으로서,
    상기 핵산은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 것을 특징으로 하는, 분리 가능한 핵산.
  6. 발현 담체로서,
    상기 발현 담체는 제5항에 따른 핵산을 함유하는 것을 특징으로 하는, 발현 담체.
  7. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편을 발현하는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 숙주 세포는 제6항에 따른 발현 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
  9. 약학적 조성물로서,
    상기 약학적 조성물은 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  10. 암 치료용 약물의 제조에 있어서 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편 또는 제9항에 따른 약학적 조성물의 용도.
  11. 약물 조합으로서,
    (1) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편, 또는 제9항에 따른 약학적 조성물; 및
    (2) (1)과 상이한 암 치료용 항체;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 약물 조합.
  12. 체외에서 샘플 중 PVRIG 단백질의 활성을 억제하는 방법으로서,
    상기 샘플을 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편, 또는 제9항에 따른 약학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 체외에서 샘플 중 PVRIG 단백질의 활성을 억제하는 방법.
  13. 암의 예방 또는 치료 방법으로서,
    제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 항체 단편 또는 제9항에 따른 약학적 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료 방법.
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