CN117417454A - 抗鸡IgY抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗鸡IgY抗体及其应用。本发明提供的抗鸡IgY抗体能够特异性结合鸡IgY，与其他类似蛋白无交叉反应，与鸡IgY具有较高的亲和力，且具有较高的稳定性；基于该抗体利用双抗夹心ELISA法检测鸡IgY具有较高的灵敏度和特异性，可实现快速、准确地检测卵黄、血清、鸡肉等样本或含IgY产品中IgY的含量，在鸡IgY检测中具有较好的应用前景。

Description

抗鸡IgY抗体及其应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及抗鸡IgY抗体及其应用。
背景技术
免疫球蛋白Y（IgY）是在鸟类、两栖动物和爬行动物中发现的主要免疫球蛋白，分子量约为180kDa。IgY的结构和功能与哺乳动物的IgG极其相似，因此也习惯被称为IgG。禽类抗体可以经血液由母体特异性地聚集于卵黄中，卵黄中的抗体占禽类自身所有抗体的80%左右，血清中抗体约为19%。而哺乳动物的抗体则主要存在于血清中，主要是IgG，分子量150~160kDa。IgY具有抗病毒、中和病毒、抗菌及免疫调节等功能，通过检测其含量的变化可以初步反映禽类机体健康状态的变化。随着饲料中禁止使用抗生素，IgY在疾病预防和治疗方面的功能和应用更加受到重视。此外，美国FDA已将鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）列入“一般公认的安全物质”（Generally Recognized as Safe，GRAS），批准卵黄抗体可以作为保健食品的添加剂。而且，鸡IgY在人类等其他动物传染病的预防和治疗方面也具有应用潜力。上述IgY的用途均会涉及IgY含量的检测，然而，目前用于检测鸡IgY的抗体和试剂盒仍较少，并且质量参差不齐，部分产品不具备样本检测等实验数据支撑。因此，开发能够特异性检测鸡IgY的抗体以及准确、特异、高效的IgY检测试剂盒，对于IgY的应用具有重要的作用。
发明内容
本发明提供抗鸡IgY抗体及其应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、CDR2的氨基酸序列为YAS、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
本发明通过以鸡IgY为免疫原免疫小鼠，并经细胞融合和筛选，获得了具有上述CDR序列的抗体，上述抗体能够特异性结合鸡IgY，具有较高的亲和力，且稳定性较高，基于上述抗体开发的双抗夹心ELISA法检测试剂盒可用于检测鸡IgY的含量，具有较广的检测浓度范围和较高的线性相关性，且具有较高的灵敏度和特异性。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.15所示或与如SEQ ID NO.15所示序列具有至少80%的相似性。
上述序列相似性优选为至少85%，更优选为至少90%，更优选为至少95%，更优选为至少98%，更优选为至少99%。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或单链抗体。
第二方面，本发明提供编码以上所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示。
第三方面，本发明提供含有以上所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
第四方面，本发明提供抗体偶联物，所述抗体偶联物为将以上所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
第五方面，本发明提供抗鸡IgY的抗体组合物，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、CDR2的氨基酸序列为YAS、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
优选地，上述（1）中所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示或与如SEQ ID NO.12所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示或与如SEQ ID NO.13所示序列具有至少80%的相似性。
上述（2）中所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示或与如SEQ ID NO.15所示序列具有至少80%的相似性。
上述抗体组合物可用于作为双抗夹心ELISA法检测鸡IgY的配对抗体，抗体组合物中的两个抗体分别作为包被抗体和标记抗体。利用上述抗体组合物采用双抗夹心ELISA法检测鸡IgY，具有较高的特异性和灵敏度。
第六方面，本发明提供以上所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗鸡IgY的抗体组合物在制备用于检测鸡IgY在样品中的存在或其水平的产品中的应用。
以上所述的样品包括来源于鸡的生物样本（例如血清、卵黄、鸡肉等），还包括体外制备的含IgY的产品（例如含IgY的食品、药物、饲料、饲料添加剂等）。
以上所述的产品可用于疾病诊断或治疗目的，例如，通过检测来源于鸡的生物样本中IgY的含量判断鸡的健康状况；也可用于非疾病诊断和治疗目的，例如，检测体外制备的含IgY产品中IgY的含量，以进行产品生产、质量控制等。
上述产品包括检测试剂或试剂盒。
第七方面，本发明提供以上所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗鸡IgY的抗体组合物的以下任一种应用：
（1）在非疾病诊断和治疗目的的检测鸡IgY在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在含鸡IgY产品的质量控制中的应用；
（3）在含鸡IgY产品的生产中的应用。
上述（1）中，非疾病诊断和治疗目的包括检测体外制备的含IgY产品中IgY的含量，以进行产品生产、质量控制等。其中，含IgY产品包括食品、药物、饲料、饲料添加剂等。
上述（2）、（3）中，含IgY产品包括食品、药物、饲料、饲料添加剂等。
本发明中，检测鸡IgY可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
第八方面，本发明提供一种试剂盒，其包含以上所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗体偶联物，或包含所述抗鸡IgY的抗体组合物。
优选地，所述试剂盒为双抗夹心ELISA检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包含包被抗体和标记抗体，所述包被抗体的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示；所述标记抗体的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、CDR2的氨基酸序列为YAS、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
为便于检测，所述抗体或其抗原结合片段还可包括可检测的标记（例如HRP标记）；所述试剂盒还可包括携带可检测的标记的第二抗体以检测所述抗体或其抗原结合片段。
所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于酶标板、鸡IgY标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
采用基于双抗夹心ELISA法检测鸡IgY含量的原理大致如下：将抗鸡IgY单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的鸡IgY会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入HRP标记的抗鸡IgY抗体，该抗体会与酶标板上包被抗体捕获的标准品和样本中的鸡IgY发生特异性结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的鸡IgY，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的鸡IgY浓度与OD成正比，通过标准曲线便可计算出样本中鸡IgY的浓度。该方法借助了酶显色放大体系，其检测灵敏度较高，加之高亲和力抗体的使用，可以检测鸡IgY含量比较低的样本。
本发明提供的上述用于检测鸡IgY含量的双抗夹心ELISA检测试剂盒，能够准确、快速、高通量检测鸡血清、卵黄或其他含有鸡IgY的生物学样本或产品中鸡IgY的含量；经类似蛋白交叉实验验证，试剂盒表现特异，不识别鸡卵清白蛋白（OVA）、鸡IgM、鹅IgY、小鼠IgG、大鼠IgG、人IgG等；试剂盒的检测范围为0.5-32ng/mL，灵敏度为118 pg/mL；将该试剂盒在37℃条件下进行加速稳定性实验，12天内试剂盒没有显著变化，稳定性高；该试剂盒可以方便准确地检测卵黄、血清、鸡肉等样本或含IgY产品中的IgY含量，反应时间/检测时间仅需3h，仅需在室温静置即可反应，不需要恒温培养箱或震荡孵育器。
第九方面，本发明提供一种非疾病诊断和治疗目的的鸡IgY的检测方法，所述方法包括：利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述试剂盒对待测样品中的鸡IgY的含量进行检测。
上述检测的方法可选自酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测或免疫色谱法等。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的抗鸡IgY抗体能够特异性结合鸡IgY，与其他类似蛋白无交叉反应，与鸡IgY具有较高的亲和力，且具有较高的稳定性；基于该抗体利用双抗夹心ELISA法检测鸡IgY具有较高的灵敏度和特异性，可用于快速、准确地检测卵黄、血清、鸡肉等样本或含IgY产品中IgY的含量，在鸡IgY检测中具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中小鼠抗鸡IgY单克隆抗体的电泳检测图，其中，M：Marker；4：小鼠抗鸡IgY单克隆抗体1C1；5：小鼠抗鸡IgY单克隆抗体2A3。
图2为本发明实施例3中双抗夹心ELISA法检测鸡IgY含量的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中使用的鸡IgY为天然提取的高纯度鸡IgY。
实施例1 抗鸡IgY单克隆抗体的制备
1、动物免疫
选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用天然提取的鸡IgY抗原与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，融合前三天再次加强免疫。
2、细胞融合
采用断颈法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：
（1）免疫脾细胞的制备：
取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死（收集血清，即为阳性血清），于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。
（2）饲养细胞的制备：
取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3 mL RPMI-1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%CO2培养箱中待用。
（3）融合：
将1-2×107个SP2/0与108个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000 r/min，离心8min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50%PEG 0.8 mL (Sigma)，搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的RPMI-1640基础液10mL。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8min。随后用HAT培养基重悬后种于已经铺好饲养层细胞的96孔培养板中，250μL/孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
3、杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，无法利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽然具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。
利用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
（1）包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10μg/mL；向微孔中每孔加100μL，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃ 1h；甩掉孔内液体（尽量拍干孔内液体）；洗涤3次，每次2～3分钟。
（2）封闭酶标孔中未被抗原包被的位置：向微孔中每孔加200μL封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃孵育1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2～3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。
（3）加样：将待测的杂交瘤每孔取50μL上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀，37℃孵育1h，洗涤，拍干。
（4）加酶标第二抗体：先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μL，轻轻摇匀，置37℃孵育1h；然后洗涤，拍干。
（5）加显色液：每孔加新鲜配制的显色液100μL，轻轻摇匀，37℃显色10min。
（6）终止反应：每孔加终止液50μL。
（7）判定结果：酶标仪OD450下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。
利用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化，其步骤如下：
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将待克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到5、10、30个细胞/mL；
将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已装有制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μL/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和3个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；
特异性抗体的检测：在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。
经筛选获得两株特异性结合鸡IgY的单克隆抗体，分别命名为单克隆抗体1C1、2A3。
4、单克隆抗体1C1与2A3的可变区序列测定
收集杂交瘤细胞数量大于106，送至北京擎科生物进行测序。测序结果显示：单克隆抗体1C1的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.13所示；重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.16所示，轻链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.17所示；单克隆抗体2A3的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQID NO.10所示、CDR2的氨基酸序列为YAS、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.18所示，轻链可变区的编码基因序列如SEQ IDNO.19所示。
5、单克隆抗体1C1与2A3的大量制备
将建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，8天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体，并用SDS-PAGE对抗体纯度进行鉴定，结果如图1所示。
实施例2 抗鸡IgY单克隆抗体的亲和力检测
测定单克隆抗体1C1与2A3结合鸡IgY的相对亲和常数，以检测其结合鸡IgY的亲和力，具体步骤如下：
将鸡IgY抗原包被到酶标板上，并封闭。PBST洗板后将单克隆抗体1C1和2A3稀释至饱和浓度加入到酶标板中，100μL/孔，室温静置孵育2h。PBST洗板后依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mol/L的NaSCN溶液60μL/孔，室温静置孵育15min。PBST洗板后，加HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温静置孵育45min，显色检测。经洗脱后，在450nm处OD值下降至未经洗脱的50%所对应的硫氰酸钠浓度即为该抗体的相对亲和力常数，用mol/L表示。结果显示（表1），单克隆抗体1C1和2A3的相对亲和常数均大于2.5mol/L，亲和力较好。
表1
实施例3 用于鸡IgY含量检测的双抗夹心ELISA试剂盒的构建
利用单克隆抗体1C1和2A3开发用于鸡IgY含量检测的双抗夹心ELISA试剂盒，具体如下：
1、单克隆抗体2A3的HRP标记
将单克隆抗体2A3加入到透析袋中，4℃浸入0.01M的CB缓冲液中过夜透析。取10mgHRP，溶于2mL水中。配制新鲜的0.1M NaIO4溶液，加入0.4mL 0.1M NaIO4于2mL POD溶液中，混匀，室温避光45min，浸入10mM的NaAc缓冲液中，4℃过夜透析。取出过夜透析的抗体和POD溶液，加入0.1mL的0.2M pH 9.5的碳酸盐缓冲液，调节pH。然后立即在POD溶液中加入已经取出的抗体，室温避光轻轻搅拌2h。称取0.04g NaBH4溶于10mL水中，取0.4mL加入反应液中，混匀，置于4℃，2h。取出放于透析袋中，于0.01M PBS中透析，2h后换一次液，4℃过夜透析。取出过夜透析的标记液，加入等体积甘油，放于-20℃保存。
2、单克隆抗体1C1包被的酶标板的制备
用0.05M pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将单克隆抗体1C1稀释至2μg/mL。在96孔酶标板反应孔中加100μL/孔，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗2次，每次30s。然后用含有2%BSA溶液封闭反应板的每个孔，每孔300μL，封闭2h。弃去孔内溶液后，拍干，干燥16h。将干燥后的酶标板装于避光的铝箔袋中，抽真空密封后，4℃保存。
通过对筛选所得的4个抗体进行配对筛选，在450nm波长下测定OD值，选出其中配对最佳的1对抗体对（单克隆抗体1C1与2A3）制作标准曲线，在450nm波长下测定OD值，进行标准曲线拟合，最终确定HRP标记2A3、1C1包被酶标板的组合效果最佳。
3、双抗夹心ELISA方法的建立
实验前30 min，取出包被好单克隆抗体1C1的酶标板，恢复至室温，洗板3次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL不同稀释浓度的鸡IgY标准品，鸡IgY稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合），结果表明，其检测范围为0.5-32ng/mL，R2为0.99999（图2）。检测20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度，结果显示，双抗夹心ELISA的灵敏度为118pg/mL。
4、双抗夹心ELISA试剂盒的特异性检测
实验前30 min，取出包被好单克隆抗体1C1的酶标板，恢复至室温，洗板3次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL不同稀释浓度的鸡IgY标准品，鸡IgY稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。结果显示，该抗体对与鸭IgY有明显交叉反应，交叉反应率在28%，由于鸡和鸭的IgY结构类似，因此存在交叉反应比较正常，除此之外与其他类似蛋白的交叉反应率均不明显（表2）。
表2
5、双抗夹心ELISA试剂盒的稳定性检测
（1）通过37℃加速实验进行稳定性考核
将单克隆抗体1C1包被好的酶标板、HRP标记的单克隆抗体2A3、及标准品鸡IgY放于37℃进行加速稳定性实验，放置12天（约相当于4℃放置18个月）。随后取出检测，检测方法如下：取出酶标板洗板3次并甩干；加入100μL不同稀释浓度的鸡IgY标准品，鸡IgY稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照；封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min；加入50μL终止液；使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以不同浓度的鸡IgY标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明（表3），在第12天，标准曲线的高点（32ng/mL处）OD值依然大于1.5，并且标准曲线的OD值梯度良好，表明试剂盒的稳定性良好。
表3
（2）将试剂盒置于4℃进行稳定性考核
将单克隆抗体1C1包被好的酶标板、HRP标记的单克隆抗体2A3、及标准品鸡IgY稀释液、洗涤液、显色液和终止液，放于4℃进行稳定性实验，放置9个月。随后取出检测，检测方法如下：取出酶标板洗板3次并甩干；加入100μL不同稀释浓度的鸡IgY标准品，鸡IgY标准品稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照；封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min；加入50μL终止液；使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以不同浓度的鸡IgY标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果显示（表4），将试剂盒全部组分在4℃放置9个月，试剂盒高点（32ng/mL）OD值＞1.3，并且标准曲线梯度良好，表明试剂盒的稳定性良好。
表4
注：表4中，未考核表示试剂盒中的所有试剂均未经4℃放置，全考核表示试剂盒中的所有试剂均经4℃放置9个月，标准品和稀释液表示仅标准品和稀释液在4℃放置9个月，检测抗体表示仅检测抗体在4℃放置9个月，稀释液表示仅稀释液在4℃放置9个月。
实施例4 与其他品牌同种类型试剂盒测试结果比较
选择目前常用的鸡IgY检测试剂盒——A品牌（亚诺法，KA2426）试剂盒进行类比测试，按照各品牌最适的方式进行实验（完全按照其说明书进行操作）。通过测定样本含量，进行结果比对：随机选择6份鸡血清样本和2份卵黄样本同时进行测定（单位mg/mL），根据文献报道正常鸡血清中IgY含量范围为（5.29±1.35）mg/mL（根据年龄、个体不同，含量不同），卵黄中IgY含量约为血清含量的4倍。测定结果显示（表5），本发明实施例3的试剂盒的IgY测定含量与报道一致，而A品牌试剂盒测得的IgY含量则偏低，仅为本发明试剂盒测定值的0.6倍左右。
表5
实施例5 鸡血清IgY含量测定
利用实施例3的试剂盒基于双抗夹心ELISA方法测定鸡血清IgY含量，具体如下：
实验前30 min，取出单克隆抗体1C1包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干；加入100μL不同稀释倍数的鸡IgY标准品和鸡血清样本，鸡IgY标准品稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照；封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min；加入50μl终止液；使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。根据文献报道正常鸡血清中IgY含量范围为（5.29±1.35）mg/mL（根据年龄、个体不同，含量不同）。测定结果显示（表6），本发明的试剂盒测定的IgY含量与报道一致，结果表明，本发明的试剂盒能准确测定鸡血清IgY的含量。
表6
实施例6 鸡卵黄、卵清IgY含量测定
利用实施例3的试剂盒基于双抗夹心ELISA方法测定鸡卵黄、卵清IgY含量，具体如下：
实验前30 min，取出单克隆抗体1C1包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干；加入100μL不同稀释倍数的鸡IgY标准品和鸡卵黄、卵清样本，鸡IgY标准品稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照；封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min；加入50μl终止液；使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。根据文献报道，正常鸡卵黄中IgY含量范围为鸡血清的4倍。鸡卵清中IgY的含量则很低。测定结果显示（表7），本发明的试剂盒测定的IgY含量与报道一致，结果表明，本发明的试剂盒能够准确测定鸡卵黄IgY的含量。
表7
实施例7 鸡肉中IgY含量测定
利用实施例3的试剂盒基于双抗夹心ELISA方法测定鸡肉IgY含量，具体如下：
实验前30 min，取出单克隆抗体1C1包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干；加入100μL不同稀释倍数的鸡IgY标准品和不同处理提取的鸡肉总蛋白，鸡IgY标准品稀释浓度为32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，并设空白对照；封板后于室温孵箱孵育2h，洗板4次并在吸水纸上充分拍干。加入100μL酶标记抗体HRP-2A3工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板4次并在吸水纸上充分拍干；加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min；加入50μL终止液；使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。检测结果显示（表8），PBS匀浆和裂解液裂解的生鸡肉中检出IgY，并且含量接近；熟鸡肉中检测不到IgY；生肉中IgY的含量远低于血清和卵黄，这与文献报道一致。结果表明，本发明的试剂盒可以检测鸡组织中IgY的含量。
表8
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示、CDR2的氨基酸序列为YAS、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示或与如SEQ IDNO.15所示序列具有至少80%的相似性。
3.根据权利要求1或2所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或单链抗体。
4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~3任一项所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料含有权利要求4所述的核酸分子；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物为将权利要求1~3任一项所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.权利要求1~3任一项所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物在制备用于检测鸡IgY在样品中的存在或其水平的产品中的应用。
8.权利要求1~3任一项所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物的以下任一种应用：
（1）在非疾病诊断和治疗目的的检测鸡IgY在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在含鸡IgY产品的质量控制中的应用；
（3）在含鸡IgY产品的生产中的应用。
9.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的抗鸡IgY抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物。
10.一种非疾病诊断和治疗目的的鸡IgY的检测方法，其特征在于，所述方法包括：利用权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求9所述的试剂盒对待测样品中的鸡IgY的含量进行检测。
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