CN117467015B - 人IgA的抗体、抗体组合及应用 - Google Patents
人IgA的抗体、抗体组合及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及细胞免疫学技术领域，尤其涉及一种人IgA的抗体、抗体组合及应用。本发明所述特异性检测人IgA的抗体（4C3和/或1D9）对人IgA具有高灵敏度和高特异性，其各自具有特殊的空间表位，对人IgA表现出高亲和力及高特异性。将本发明提供的抗体4C3和1D9共同用于检测人IgA的配对抗体，通过夹心法可特异性检测培养基以及血清中人IgA的含量，亲和力高，且不与其他类似蛋白反应，是理想的人IgA蛋白含量的检测抗体组合。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，尤其涉及一种人IgA的抗体、抗体组合及应用。
背景技术
免疫球蛋白A（IgA）主要由粘膜相关淋巴样组织产生，其中大部分是由胃肠淋巴样组织所合成，少部分由呼吸道、唾液腺和生殖道粘膜组织合成。其含量的高低与许多疾病有密切的联系：在慢性肝病，亚急性或慢性感染性疾病（如结核、真菌感染等)、自身免疫性疾病（如SLE、类风湿关节炎)、囊性纤维化、家族性嗜中性粒细胞减少症、乳腺癌、IgA肾病、IgA骨髓瘤等情况下，IgA会增高；在遗传性或获得性抗体缺乏症、免疫缺陷病、选择性IgA缺乏症、无γ－球蛋白血症、蛋白丢失性肠病、烧伤、抗IgA抗体综合症、免疫抑制剂治疗、妊娠后期等情况下，IgA会降低。血液制品、科学实验、临床诊断中，快速、准确的检测人血清中IgA的含量都有很大的参考价值。IgA有IgA1和IgA2两个亚类。IgA1主要存在于血清中，约占血清中IgA的85%，α1链分子量为56kD；IgA2主要存在于外分泌液中，如唾液、泪液、初乳、鼻和支气管分泌液、胃肠液、尿液、汗液等，是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体，少部分以血清型IgA存在，约占血清中IgA的15%，α2链缺乏铰链区，分子量为52kD。血清中的IgA除单体形式外还有由J链共价相连的二聚体或三聚体等形式。每个IgA单体都有2个抗原结合位点。IgA不能通过胎盘，新生儿血清中无IgA抗体，但可从母乳中获得分泌型IgA。从献血者的血浆中提取的IgG抗体是介导机体粘膜免疫的主要因子，其在粘膜分泌物中能有效地阻止外界抗原(包括可溶性抗原、病原微生物以及存在于食物中的致癌物质)附着或侵入粘膜上皮，从而避免这些外来物给机体造成损伤，保持机体粘膜完整并避免胃肠道疾病，呼吸道疾病及泌尿生殖道各种疾病的发生。
目前常用的IgA测定方法是免疫比浊法，免疫比浊法是利用抗原和抗体可以特异性结合的性质，在液相中产生一定大小的复合物，形成光的折射或吸收，测定折射或吸收后的透射光或散射光推算出其中的含量。其缺点有：需要样本量较多，关键试剂使用量较多（抗人IgA血清）；大批量检测困难，操作复杂，且需要特定的分析仪器；实验重复性较差；液体中形成的复合物分子不够稳定，要足够大足够多才能有较为准确的读值，在样本含量低时准确度会很差；所使用的缓冲体系中还需要用到叠氮钠危险品。紫外-分光光度法测定IgA含量也有上述缺点。
其他的检测方法还有免疫扩散实验，其缺点是实验操作影响因素多，检测时间长，灵敏度差，适合于粗略估计样本中的含量；HPLC及毛细管电泳法，其缺点是需要专门的仪器和经验丰富的人员操作，仪器价格昂贵。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种人IgA的抗体、抗体组合及应用。所述抗体能够准确、快速、高通量地特异性检测人血清或其他含有人IgA的血清类似物中IgA的含量。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供了人IgA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示。
优选地，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，或者与SEQID NO：13具有至少80%的序列相似性；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示，或者与SEQ ID NO：14具有至少80%的序列相似性。
优选地，以上所述的抗体或其抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、单克隆抗体、动物源抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施方式中，提供一种抗体组合物，所述抗体组合物由4C3和1D9组成。这两个抗体可作为人IgA的配对抗体分别作为双抗夹心ELISA中的包被抗体和检测抗体。其中检测抗体还可携带可检测的标记。本发明对所述可检测的标记不作特别限定，本领域常规选用的标记均可。
在本发明的一些实施方式中，提供一种抗体组合物，所述抗体组合物由4C3和1D9组成。其中，4C3作为双抗夹心ELISA中的包被抗体，1D9进行HRP标记后作为检测抗体。
本发明提供的抗体组合物稳定性良好，其可采用双抗体夹心ELISA方法进行人IgA含量的快速检测，具有操作简单，高灵敏度，高特异性，高准确性以及高精密度的优点。
第二方面，本发明提供编码以上所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
第三方面，本发明提供含有以上所述的核酸分子的生物材料。所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体、工程菌或转基因细胞系。
优选地，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
第四方面，本发明提供一种抗体偶联物，其为将所述抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
第五方面，本发明提供了人IgA抗体的组合物，所述组合物包含以下（1）所示的抗体或其抗原结合片段；还包含以下（2）所示的抗体或其抗原结合片段；
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
第六方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗体组合物的以下（1）~（5）中的任一种应用：
（1）在制备用于检测人IgA在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
（2）在非诊断和治疗目的的检测人IgA在样品中的存在或其水平中的应用；
（3）在制备用于中和样品中的人IgA活性的产品中的应用；
（4）在制备用于中和体内人IgA活性的药物中的应用；
（5）在含人IgA产品的质量控制或生产中的应用。
优选地，上述（1）或（2）中所述的应用包括：将本发明的抗体或其抗原结合片段制备为用于检测人IgA在样品中的存在或其水平的产品，利用所述产品检测人IgA在样品中的存在或其水平。为便于检测，本发明的抗体或其抗原结合片段还优选包括可检测的标记。
本发明还提供检测人IgA在样品中的存在或其水平的方法，所述方法包括利用本发明的抗体或其抗原结合片段检测人IgA在样品中的存在或其水平。上述方法可以为诊断目的（例如：所述样品是来自患者的样品，包括血液样品等），或者非诊断和治疗目的（例如，所述样品是培养细胞上清液等，并非来自患者的样品）。
利用本发明的抗体或其抗原结合片段检测人IgA的方法可以使用酶联免疫吸附（ELISA）、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
在本发明的一些实施方式中，利用本发明的抗体或其抗原结合片段以双抗体夹心法检测人IgA。双抗体夹心法检测人IgA利用本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段作为包被抗体，以本发明提供的另一种抗体或其抗原结合片段作为检测抗体进行，或者以本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段为包被抗体，以已知的其他抗人IgA抗体为检测抗体进行，或者以已知的其他抗人IgA抗体为包被抗体，以本发明提供的一种抗体或其抗原结合片段作为检测抗体进行。
优选地，上述（3）和（4）中，中和人IgA的活性具体为利用本发明提供的抗体或其抗原结合片段与样品中的人IgA结合，进而中和人IgA活性。
优选地，上述（5）中，含人IgA的产品包括食品、药物等。
第七方面，本发明提供一种试剂盒，其包含以上所述的抗体或其抗原结合片段，或包含以上所述的抗体偶联物，或包含以上所述的抗体组合物。
本发明的一些实施方式提供了人IgA的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含以上所述的抗体或其抗原结合片段，或者包含以上所述的抗体组合物。所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于人IgA标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
第八方面，本发明提供一种非诊断和治疗目的的人IgA检测方法，所述方法包括：利用双抗夹心ELISA方法检测待测样品中是否存在人IgA和/或其存在水平，所述双抗夹心ELISA方法中的包被抗体和检测抗体分别为4C3和1D9。
本发明采用基于双抗体夹心法的酶联免疫吸附检测技术检测人IgA含量的原理如下：将抗人IgA单克隆抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的人IgA会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入HRP标记的抗人IgA抗体，该抗体会与板子上包被抗体捕获的标准品和样本中的人IgA发生特异性结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的人IgA，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的人IgA浓度与OD成正比，通过标准曲线便可计算出样本中人IgA的浓度。这种方法借助了酶显色放大体系，其检测灵敏度较高，可以检测含量比较低的样本。
本发明提供的ELISA检测方法，其与免疫比浊法（mg级别）、紫外-分光光度法（mg级别）、HPLC法（mg级别）等其他方法相比，检测灵敏度高（pg级别），范围为12.5-800 ng/ml。与免疫比浊法（约4 h）、紫外-分光光度法（约4 h）、HPLC法（约4 h）等其他方法相比，检测时间短（2.75 h），可高通量进行检测（以70份样检测时间相比较）。
通过做类似蛋白交叉实验，本发明提供的ELISA检测方法表现良好，不识别猪IgG、兔IgG、大鼠IgG、小鼠IgG、鸭IgG、人IgG。
基于上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明提供了特异性检测人IgA的抗体及应用。所述特异性检测人IgA的抗体（4C3和/或1D9）对人IgA具有高灵敏度和高特异性，其各自具有特殊的空间表位，对人IgA表现出高亲和力及高特异性。将本发明提供的抗体4C3和1D9共同用于人IgA的配对抗体，通过夹心法可特异性检测培养基以及血清中人IgA的含量，亲和力高，且不与其他类似蛋白反应，是理想的人IgA蛋白含量的检测抗体组合。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。
图1为本发明实施例1中单克隆抗体4C3和1D9的电泳检测图，其中M为Marker，泳道1为1D9，泳道5为4C3。
图2为本发明实施例2中双抗夹心ELISA法检测人IgA含量的标准曲线。
图3为本发明实验例3中抗体1D9作为一抗应用在WB上检测人血清中的IgA的实验结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。若未特别指明，实施例中所使用的实验方法均为常规方法；所用的材料、试剂等均可从商业途径得到。
实施例1 抗人IgA单克隆抗体的制备
1、动物免疫
选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用天然提取的人IgA抗原与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，融合前三天再次加强免疫。
2、细胞融合
采用断颈处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：
（1）免疫脾细胞的制备：
取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同SP2/0所述，计数后备用。
（2）饲养细胞的制备：
取一只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2-3 mL 1640基础液，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。同上操作制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5% C02培养箱中待用。
（3）融合：
将1-2×107个SP2/0与108个免疫细胞于50 mL离心管中混匀，1000 r/min，离心8min。弃净上清后将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50%PEG 0.8 ml，搅拌后静置30 s。静置后加入37℃预温的1640基础液10 ml。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清于37℃放置5-8 min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250μl/孔，于37℃，5% CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
3、杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能无限增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。具体操作如下：
（1）用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1-10 μg/ml；向微孔中每孔加100μl，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃ 1 h；甩掉孔内液体（尽量拍干空里面的液体）；洗涤3次，每次2-3分钟。
封闭酶标孔中没被抗原包被的位置：向微孔中每孔加200μl封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃ 1 h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2-3min，甩掉孔内液体，拍干，用此法先用洗涤缓冲液洗3次。加样：将待测的杂交瘤每孔取50μl上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀，37℃ 1 h，洗涤，拍干。
加酶标抗抗体：先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μl，轻轻摇匀，置37℃ 1 h；然后洗涤，拍干。加显色液：每孔加新鲜配置的显色液100μl，轻轻摇匀，37℃，10min。终止反应：每孔加终止液50μl。
判定结果：酶标仪OD450下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。
（2）利用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化，其步骤如下：
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到5、10、30个细胞/毫升；
将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μl/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和3个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录；
特异性抗体的检测：在克隆后第7-9天，细胞克隆长满1/3-1/2个视野时，即可检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。
4、细胞上清亲和力数据：
将人IgA抗原包被到酶标板上，并封闭。PBST洗板后将单克隆细胞的细胞上清稀释至饱和浓度加入到酶标板中，100μL/孔，室温静置孵育2h。PBST洗板后依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mol/L的NaSCN溶液60μl/孔，室温静置孵育15min。PBST洗板后，加HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温静置孵育45min显色检测。经洗脱后450nm处OD值下降至未经洗脱的50%所对应的硫氰酸钠浓度即为该抗体的相对亲和力常数，用M（mol/L）表示。结果见表1。表1显示：克隆号为8C3、8B4、7E8、7C11、6G3、6B4、6A9、4C3、4B7、3C12、1E4、1D9、1B12的单克隆细胞分泌的抗人IgA抗体的亲和力较好。可以作为抗体组合物检测人IgA的首选单克隆抗体。
表1
5、对不同单克隆抗体组合的配对效果进行验证
（1）单克隆抗体对的初步配对筛选：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将单克隆抗体分别稀释至2 μg/ml。在96孔聚苯乙烯试剂板反应孔中加0.1μl，4℃静置孵育过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次1 min。经过上述步骤后，用溶液封闭反应板的每个孔，每孔0.3μl静置孵育2 h。弃去孔内溶液，洗板3次并甩干。分别加入100μl 浓度为100ng/ml的人IgA标准品，并做0孔。封板后于室温孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体工作液至反应孔中，封板后于室温孵育45 min，洗板5次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色5~20min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。筛选高点（加入100ng/ml 人IgA)比0孔高的抗体组合，用于检测人IgA抗体对的备选。
（2）单克隆抗体对的初步配对特异性筛选：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将单克隆抗体分别稀释至2 μg/ml。在96孔聚苯乙烯试剂板反应孔中加0.1μl，4℃静置孵育过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次1分钟。经过上述步骤后，用溶液封闭反应板的每个孔，每孔0.3μl静置孵育2 h。弃去孔内溶液，洗板3次并甩干。分别加入100μl 高浓度（10μg/ml）人IgM标准品、人IgG标准品，并做0孔。封板后于室温孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体工作液至反应孔中，封板后于室温孵育45 min，洗板5次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色5~20min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。由于免疫球蛋白结构类似，血清、血浆中含量最多的免疫球蛋白为IgG、IgM和IgA，约占总免疫球蛋白量的99.9%，筛选对高浓度（10μg/ml）的人IgG和人IgM反应OD值低的抗体对组合，用于特异性检测人IgA抗体对的备选。
（3）单克隆抗体配对优化：从上述配对中筛选出与低浓度IgA反应OD值较高，并且与高浓度IgM和IgG（10μg/ml）反应OD值较低的12对组合。进一步验证交叉和初步标曲的调整，结果表明：4C3和1D9的组合，空白对照最低、与IgA反应较高，并且与IgM和IgG结合较弱（表2）。
表2
6、单克隆抗体4C3与1D9可变区序列测定
收集杂交瘤细胞数量大于106送至北京擎科生物进行测序。得到基因测序结果。单克隆抗体4C3的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.17所示，轻链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.18所示。单克隆抗体1D9的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11、12所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.19所示，轻链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.20所示。
7、单克隆抗体4C3和1D9的大量制备
建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体。结果如图1所示。
实施例2 人IgA含量的双抗夹心ELISA试剂盒建立
1、单克隆抗体1D9的HRP标记
将抗体1D9加入到透析袋中，4℃浸入0.01 M 的CB缓冲液中过夜透析。取14 mgHRP，溶于2.8 ml水中。配制新鲜的NaIO4溶液0.1 M，加0.56 ml 0.1 M NaIO4于2.8 ml HRP溶液中，混匀，室温静置避光20 min，浸入1 mM 的NaAc缓冲液中4℃过夜透析。取出过夜透析的抗体和HRP溶液加0.168 ml，0.2 M PH9.5的碳酸盐缓冲液，然后立即在HRP溶液中加入已经取出的抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。称取0.04 g NaBH4溶于10 ml水中，取0.02 ml加入反应液中，混匀，置于4℃，2小时。取出放于透析袋中，于0.01 M PBS中透析，两小时后换一次液，4℃过夜透析。取出过夜透析的标记液，加入等体积甘油，放于-20℃保存。
2、单克隆抗体4C3酶标板的制备
用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将单克隆抗体4C3稀释至2 μg/ml。在96孔聚苯乙烯试剂板反应孔中加0.1μl，4℃静置孵育过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次1分钟。经过上述步骤后，用溶液封闭反应板的每个孔，每孔0.3μl静置孵育2 h。弃去孔内溶液，放干房干燥后抽真空，4℃保存。
3、双抗夹心ELISA方法的建立
实验前30 min，拿出单克隆抗体4C3包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的人IgA标准品，人IgA稀释浓度为800 ng/ml、400 ng/ml、200ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、25 ng/ml、12.5 ng/ml并设空白对照。封板后于室温孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体HRP-1D9工作液至反应孔中，封板后于室温孵育45min，洗板5次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以不同浓度的人IgA标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，其检测范围为12.5-800 ng/ml，R2为1.00000（图2）。
4.双抗夹心ELISA灵敏度检测
检测20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度，灵敏度为20 pg/ml（表3）。
表3
5、双抗夹心ELISA特异性检测
实验前30 min，拿出单克隆抗体4C3包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释倍数的人IgA标准品或高浓度的人IgA结构类似蛋白，包括猪IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、鸭IgG、兔IgG、人IgG。封板后于室温孵箱孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μl 酶标记抗体HRP-1D9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板5次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。结果显示，该抗体对不与其他类似蛋白反应（表4）。
表4
实施例3 人血清IgA含量测定
实验前30 min，拿出单克隆抗体4C3包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择自愿献血人血清16份，加入100μl 稀释的人血清样本或不同浓度的标准品，样品稀释倍数2万倍，人IgA标准品稀释浓度为800 ng/ml、400 ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50ng/ml、25 ng/ml、12.5 ng/ml，并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μl酶标记抗体HRP-1D9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板5次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。根据文献报道正常人血清中IgA含量范围为0.71~3.85mg/ml（根据年龄、个体不同含量不同），检测结果表明该方法能准确测定人血清IgA的含量（表5）。
表5
实验例1 同其他品牌同种类型试剂盒测试结果进行比较
本实验例选择国内X品牌（Elabscience）进行类比测试，按照各品牌最适的方式进行实验（完全按照其说明书进行操作）。通过以下两个方面对2种试剂盒的性能进行比较。
a. 标准曲线比对：结果表明本试剂盒拟合曲线高于其他品牌试剂盒（R2=1.00000）且本试剂盒梯度明显，本底表现优良（零孔值为0.008）（表6），X品牌标曲显色低，梯度差。
表6
b.样本测定结果比对：随机选择16份自愿献血人血清样本同时进行测定（单位mg/ml），根据文献报道正常人血清中IgA含量范围为0.71~3.85mg/ml（根据年龄、个体不同含量不同）。测定结果显示X品牌测的含量偏低，本试剂盒测的样本含量更接近文献报道的结果（表7）。
表7
实验例2 双抗夹心ELISA稳定性检测
本实验例通过37℃加速实验对试剂盒进行稳定性考核：
将单克隆抗体4C3包被好的酶标板、HRP标记的单克隆抗体HRP-1D9、人IgA标准品放于37℃进行加速稳定性实验，放置12天（等同于4℃约18个月）。随后取出检测，检测方法为，取出酶标板洗板3次并甩干。加入100μl不同稀释浓度的标准品，浓度为800 ng/ml、400ng/ml、200 ng/ml、100 ng/ml、50 ng/ml、25 ng/ml、12.5 ng/ml，并设空白对照。封板后于室温孵箱孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μl酶标记抗体HRP-1D9工作液至反应孔中，封板后于室温孵箱孵育45 min，洗板5次并甩干。加入100μl显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μl终止液。使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以不同浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果表明，在第152，标准曲线的高点（800ng/ml处）OD值依然大于1.5，并且标曲OD值梯度良好，表明试剂盒稳定性良好（表8）。
表8
实验例3
本实验例对抗体1D9作为一抗应用在WB上检测人血清中的IgA效果进行了验证：取自愿献血者的血清样本，制备样本，SDS-PAGE后，转膜；将转膜后的NC膜置于含有1D9抗体的稀释液中孵育；洗膜后，置于含有HRP标记的羊抗小鼠IgG标记二抗的稀释液中孵育；洗膜后，加ECL发光液，显影曝光。结果如图3所示。
图3显示：在约65kDa处出现较深的条带，表明单克隆抗体1D9可以与血清中的IgA重链结合。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (12)
1.人IgA的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单克隆抗体、动物源抗体或人源化抗体。
4.核酸分子，其特征在于，其编码权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，其含有权利要求4所述的核酸分子；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为将权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.人IgA抗体的组合物，其特征在于，所述组合物包含以下（1）所示的抗体或其抗原结合片段；还包含以下（2）所示的抗体或其抗原结合片段；
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：7、8、9所示；轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：10、11、12所示。
8.权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述组合物在制备用于检测人IgA在样品中的存在或其水平的产品中的应用。
9.权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述组合物在非诊断和治疗目的的检测人IgA在样品中的存在或其水平中的应用。
10.权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述组合物在含人IgA产品的质量控制或生产中的应用。
11.试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任意一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物，或包含权利要求7所述的组合物。
12.根据权利要求11所述试剂盒，其特征在于，其为酶联免疫检测试剂盒、荧光免疫检测试剂盒或化学发光免疫检测试剂盒。
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