CN116925219B - 小热休克蛋白hspb1的抗体、杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及小热休克蛋白HSPB1的抗体、杂交瘤细胞株及其应用。本发明提供的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人小热休克蛋白HSPB1，且具有较高的亲和力；在进行人小热休克蛋白HSPB1检测时具有较高的灵敏度和特异性，能够实现低含量小热休克蛋白HSPB1的检测，能够满足检测实践的要求，在小热休克蛋白HSPB1的检测领域具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及小热休克蛋白HSPB1的抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
背景技术
热休克蛋白是细胞在应激的环境下（如高热、缺氧、创伤、疾病等）产生的一类具有分子伴侣功能的物质，参与细胞蛋白的折叠、修饰等过程，可提高细胞对逆境的抵抗力。热休克蛋白根据分子量的不同分为大、中、小三种类型。HSPB1是小热休克蛋白的一种，全长205个氨基酸，分子量约27kD。HSPB1对错误折叠的蛋白质有修复或分解功能，在细胞受到应激时，HSPB1表达量增加，通过多种途径帮助细胞应对不利环境，增加细胞存活率，延缓或抑制细胞凋亡。在多种疾病的发展过程中HSPB1 均出现高表达，如糖尿病、心血管疾病、神经系统疾病、肿瘤等。检测HSPB1的表达水平有利于对疾病进程或预后情况进行评估。
目前HSPB1的检测主要采用免疫组化方法，该方法可以评估HSPB1的高表达或低表达，但无法进行精确的定量。基于双抗夹心法的酶联免疫吸附检测技术能够准确、快速地对HSPB1进行定量检测。HSPB1在正常人血清中含量较低，因此，需要开发具有高亲和力的抗体以保证检测的高灵敏度。
发明内容
本发明提供小热休克蛋白HSPB1的抗体、杂交瘤细胞株及其应用。
本发明通过制备人HSPB1抗原，以人HSPB1抗原免疫小鼠进行融合筛选后，得到两株亲和力、特异性和稳定性良好的单克隆抗体，并利用这两株抗体开发了基于双抗夹心法的酶联免疫吸附检测试剂盒，该试剂盒可以较为准确地检测人HSPB1的含量，具有较高的灵敏度和特异性，可以检测人HSPB1含量较低的样本。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、CDR2的氨基酸序列为WAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示或与如SEQ ID NO.11所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.12所示或与如SEQ ID NO.12所示序列具有至少80%的相似性。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、单链抗体、双特异抗体或多特异抗体。
在本发明的一些实施方式中提供小热休克蛋白HSPB1的抗体，所述抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
在上述抗体或其抗原结合片段的基础上，本发明提供编码所述抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
进一步地，本发明提供含有所述核酸分子的生物材料；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
在所述抗体或其抗原结合片段的基础上，本发明提供抗体偶联物，其为将所述小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
本发明提供小热休克蛋白HSPB1的抗体组合物，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示；轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、CDR2的氨基酸序列为WAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、7、8所示；轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、CDR2的氨基酸序列为YAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
上述抗体组合物可用于作为双抗夹心法检测小热休克蛋白HSPB1的配对抗体，抗体组合物中的两个抗体分别作为双抗夹心法中的包被抗体和标记抗体。
优选地，上述（1）中所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示或与如SEQ ID NO.11所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.12所示或与如SEQ ID NO.12所示序列具有至少80%的相似性。
上述（2）中所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示或与如SEQ ID NO.13所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性。
本发明提供杂交瘤细胞株9F8，其于2023年8月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为小鼠抗人HSPB1单抗杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No. 45646。
本发明还提供杂交瘤细胞株20G5，其于2023年8月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为小鼠抗人HSPB1单抗杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No. 45647。
本发明还提供由上述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体，其能够特异性结合小热休克蛋白HSPB1。
本发明提供以上所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述小热休克蛋白HSPB1的抗体组合物或所述杂交瘤细胞株或所述单克隆抗体的如下任一种应用：
（1）在非疾病诊断目的的检测小热休克蛋白HSPB1在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在制备用于检测小热休克蛋白HSPB1在样品中的存在或其水平的产品中的应用；
（3）在制备用于治疗因小热休克蛋白HSPB1过表达导致疾病的药物中的应用。
上述（1）中，所述应用包括利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述单克隆抗体检测小热休克蛋白HSPB1在样品中的存在或其水平。其中，HSPB1在样品中的存在是指样品中是否含有HSPB1，HSPB1在样品中的水平是指样品中HSPB1的含量。所述样品包括体外制备的包含小热休克蛋白HSPB1的样品等。
上述（2）中，所述产品为用于检测小热休克蛋白HSPB1的产品，包括试剂或试剂盒。所述样品包括血浆、血清、血液等来自人体的体液、细胞或组织。
上述（1）和（2）中，利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体检测小热休克蛋白HSPB1的方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
在本发明的一些实施方式中，利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物以双抗夹心法检测小热休克蛋白HSPB1。
本发明中，所述小热休克蛋白HSPB1为人小热休克蛋白HSPB1。
上述（3）中，所述疾病包括但不限于乳腺癌等。
本发明提供一种试剂盒，其包含所述小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，或所述抗体偶联物，或包含所述小热休克蛋白HSPB1的抗体组合物，或包含所述单克隆抗体。
上述试剂盒为小热休克蛋白HSPB1的检测试剂盒。
上述试剂盒中，所述抗体或其抗原结合片段还可包括可检测的标记；所述试剂盒还可包括携带可检测的标记的第二抗体以检测所述抗体或其抗原结合片段。
在本发明的一些实施方式中提供一种小热休克蛋白HSPB1的双抗夹心ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含包被抗体和标记抗体，所述包被抗体的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、CDR2的氨基酸序列为WAS，CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.5所示；所述标记抗体的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：6、7、8所示；轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、CDR2的氨基酸序列为YAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
上述试剂盒在用于小热休克蛋白HSPB1的检测时具有较高的灵敏度，检测范围可达0.078-5ng/mL；具有较好的稳定性，在37℃进行加速稳定性实验，13天内试剂盒无显著变化；且具有较高的特异性，在蛋白交叉实验中不识别人IgG、人白蛋白、mmp2、人1型胶原蛋白α、人高尔基膜蛋白1、人IL-10、人IL-2、人IL-6、人IL-12、人IL-1β、人TNF-α、人IFN-α、小鼠IgG、大鼠IgG等非目标蛋白。
为便于检测，所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于酶标板、小热休克蛋白HSPB1标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
本发明提供一种药物，所述药物包含所述小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，或包含所述单克隆抗体。
本发明提供一种小热休克蛋白HSPB1的检测方法，所述方法包括：利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述试剂盒对待测样品中的小热休克蛋白HSPB1的含量进行检测。
所述检测的方法可选自酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测或免疫色谱法等。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合人小热休克蛋白HSPB1，且具有较高的亲和力；在进行人小热休克蛋白HSPB1检测时具有较高的灵敏度（检测范围可达0.078-5ng/mL）和特异性，能够实现低含量小热休克蛋白HSPB1的检测，能够满足检测实践的要求，在小热休克蛋白HSPB1的检测领域具有重要的应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中纯化的HSPB1蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中M为蛋白质分子量marker。
图2为本发明实施例1中纯化的单克隆抗体9F8和20G5的SDS-PAGE电泳检测结果图，其中M为蛋白质分子量marker。
图3为本发明实施例3中双抗夹心ELISA方法检测HSPB1蛋白的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 抗人HSPB1蛋白单克隆抗体的制备
1、HSPB1蛋白纯化
将HSPB1基因合成到pET-28a载体上，得到重组质粒，命名为HSPB1-28A。将重组质粒HSPB1-28A转化表达菌株大肠杆菌Rosseta，挑取阳性克隆子培养并测序（HSPB1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示），得到重组菌株。将重组菌株诱导表达，同时设置未诱导菌株和空载体菌株对照。通过SDS-PAGE检测HSPB1蛋白表达情况。确定HSPB1蛋白表达后，超声波破碎菌体，分离上清液和沉淀，通过SDS-PAGE检测HSPB1蛋白以何种形式表达。检测结果表明HSPB1蛋白以不溶性的包涵体形式表达，将包涵体复性处理并纯化，得到目的蛋白。SDS-PAGE检测结果如图1所示。
2、动物免疫
选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，使用上述步骤1制得的纯化的HSPB1抗原与等体积弗氏佐剂乳化后进行免疫，免疫周期为两周，免疫3次后取血测效价，融合前三天再次加强免疫。
3、细胞融合
采用断颈方法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇的作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。具体操作如下：
（1）骨髓瘤（SP2/0）细胞活化
解冻并复苏商品化SP2/0细胞，随后重悬于营养液（添加20%胎牛血清的RPMI-1640基础培养基）中，置于37℃、5%CO2条件下培养箱培养；3-5d后进行传代；
收集细胞并悬浮于RPMI-1640基础培养基中，计数后取0.5~1×106个细胞注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5 min后无菌操作取瘤。
剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，添加RPMI-1640基础培养基充分研磨后补加10mL RPMI-1640基础培养基，静置2 min，吸取上层细胞悬液置于另一离心管中，再补加10mLRPMI-1640基础培养基，重复研磨两次；将上述取得的细胞悬液于1000 r/min离心10 min去上清，随后重悬于30 mL RPMI-1640基础培养基中，得到细胞悬液。
于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞悬液小心置于分离液之上；随后1200 r/min离心15min，采用吸管吸取位于界面致密的白色细胞层，使用RPMI-1640基础培养基清洗细胞2遍后重悬于10mL RPMI-1640基础培养基中，计数后备用。
（2）免疫脾细胞的制备
取加强免疫的BALB/c鼠一只，眼眶放血处死（收集血清，即为阳性血清），于75%酒精中浸泡5-10 min消毒，随后将其固定于解剖板上进行解剖，取出脾脏并剪破，置于灭菌的匀浆器中；研磨及细胞悬液制取方法同步骤（1）中的SP2/0，计数后备用。
（3）饲养细胞的制备
取1只未免疫的BALB/c鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入2~3mL RPMI-1640基础培养基，吹打后吸出置于另一离心管中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。制备脾细胞悬液，并放入腹腔巨噬细胞管中。1000 r/min离心10 min去上清，细胞用HAT培养基悬浮后，置于37℃，5%CO2培养箱中待用。
（4）细胞融合
将1~2×107个SP2/0与108个免疫细胞于50mL离心管中混匀，1000 r/min，离心8min。弃净上清后，将装有细胞混合物的离心管置于37℃水浴中，随后加入预温至37℃的50%PEG 0.8 mL（Sigma），搅拌后静置30s。静置后加入37℃预温的RPMI-1640基础培养基10mL。混匀后1000 r/min离心5 min，弃上清，于37℃放置5-8min。随后与饲养细胞悬浮液混合，分种于96孔培养板中，250μL/孔，于37℃，5%CO2培养箱中培养。融合后第4天换HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。
4、杂交瘤阳性克隆的筛选和细胞的克隆化
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，采用HAT选择性培养基。在HAT选择性培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，无法利用补救途径合成DNA而死亡。未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但因其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞无限增殖的特性，因此能在HAT选择性培养基中存活和增殖。
采用间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
（1）包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至1~10mg/mL；向微孔中每孔加100μL，轻轻摇匀，4℃冰箱过夜或37℃放置1h；甩掉孔内液体（尽量拍干孔内液体）；洗涤3次，每次2~3分钟。
（2）封闭酶标孔中未被抗原包被的位置：向微孔中每孔加200μL封闭液（5%的脱脂奶粉或者0.1%的BSA），轻轻摇匀，37℃处理1h；甩掉孔内液体；逐孔加满洗涤缓冲液，静置2~3min，甩掉孔内液体，拍干，用洗涤缓冲液洗3次。
（3）加样：将待测的杂交瘤每孔取50μL上清液按顺序加入酶标孔中，轻轻摇匀，于37℃处理1h，洗涤，拍干。
（4）加酶标抗抗体：先用稀释液将酶标第二抗体按说明稀释到适当的工作浓度，每孔加入100μL，轻轻摇匀，置于37℃处理1h；然后洗涤，拍干。
（5）加显色液：每孔加新鲜配制的显色液100μL，轻轻摇匀，37℃，10min。
（6）终止反应：每孔加终止液50μL。
（7）判定结果：采用酶标仪于OD450下进行读数，大于阴性孔3倍可判定为阳性。
采用有限稀释法对上述筛选获得的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，具体步骤如下：
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将需要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞；将细胞用完全培养基稀释至10个细胞/mL；
将上述浓度的细胞悬液分别加入装有饲养细胞的96孔培养板中，100μL/孔，使相应的每孔含1个细胞。培养至第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况并记录；
特异性抗体的检测：在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3~1/2个视野时，即可进行特异性抗体的检测；阳性孔的细胞可移至24孔培养板，待24孔培养板中的细胞生长良好时，可腹腔接种小鼠采制腹水。
经筛选获得两株特异性结合人HSPB1蛋白的单克隆抗体及产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为单克隆抗体9F8和20G5以及杂交瘤细胞株9F8和20G5。
杂交瘤细胞株9F8于2023年8月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为小鼠抗人HSPB1单抗杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.45646。
杂交瘤细胞株20G5于2023年8月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为小鼠抗人HSPB1单抗杂交瘤细胞株，保藏编号为CGMCC No.45647。
5、单克隆抗体9F8与20G5可变区序列测定
收集杂交瘤细胞：收集分泌单克隆抗体9F8和20G5的杂交瘤细胞，使其数量大于106，采用总RNA提取试剂盒（索莱宝科技有限公司），并按照说明书操作分别提取两株细胞的总RNA；按照反转录试剂盒（索莱宝科技有限公司）合成cDNA第一条链；送至擎科生物进行后续构建及测序。
测序结果显示，单克隆抗体9F8的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQID NO.4所示、CDR2的氨基酸序列为WAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；重链可变区（122个氨基酸）的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示，轻链可变区（113个氨基酸）的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区编码基因（366bp）的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，轻链可变区编码基因（339bp）的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
单克隆抗体20G5的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6、7、8所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示、CDR2的氨基酸序列为YAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。重链可变区（116个氨基酸）的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区（107个氨基酸）的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示，重链可变区编码基因（348bp）的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，轻链可变区编码基因（321bp）的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
6、单克隆抗体9F8与20G5的大量制备
将建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体，SDS-PAGE检测纯化的抗体，结果如图2所示。
实施例2 单克隆抗体9F8和20G5的亲和力检测
对单克隆抗体9F8和20G5结合人HSPB1蛋白的亲和力（相对亲和常数测定）进行检测，具体方法如下：
将抗原（人HSPB1蛋白）包被到酶标板上，并封闭。PBST洗板后分别将单克隆抗体9F8和20G5稀释至饱和浓度加入到酶标板中，100μL/孔，室温静置孵育2h。PBST洗板后依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mol/L的NaSCN溶液60μL/孔，室温静置孵育15min。PBST洗板后，加HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温静置孵育45min显色检测。经洗脱后450nm处OD值下降至未经洗脱的50%所对应的硫氰酸钠浓度即为该抗体的相对亲和常数，用mol/L表示。结果显示（表1），单克隆抗体9F8和20G5的相对亲和常数均远大于2.5mol/L，亲和力较好。
表1
实施例3 双抗夹心ELISA方法的建立和评价
1、单克隆抗体的生物素标记
将Protein G亲和层析纯化的单克隆抗体20G5用0.1M的碳酸盐缓冲液（pH 9.5）稀释到2~20mg/mL；在4℃条件下，用0.1M的碳酸盐缓冲液（pH 9.5）对抗体进行充分透析。取NHS-D-Biotin溶于DMSO中，配制5mg/mL的溶液。将配制的NHS-D-Biotin溶液加入到透析过夜的抗体溶液中，室温避光，轻轻搅拌4小时。在4℃条件下将反应后的溶液用0.01M PBS（pH7.2~7.4）充分透析。
从透析袋中取出标记好的单克隆抗体20G5，置于抗体管中，于-20℃保存。
2、单克隆抗体包被酶标板的制备
使用96孔平底聚苯乙烯酶标板作为固相载体，将Protein G亲和层析纯化的单克隆抗体9F8用抗体包被液稀释至2 μg/mL，将稀释后的抗体加入到酶标板的微孔中，100 μL/孔，用封板膜封板后置于4℃包被过夜，将包被好的酶标板取出，弃去孔中液体，用ELISA洗涤液洗板3次后，加入含有2% BSA的封闭液，250 μL/孔，用封板膜封板后置于室温封闭2h，弃去板孔中的液体，置于烘干房中烘干16~18h。放入含有干燥剂的铝箔袋中，真空密封，4℃保存。
3、双抗夹心ELISA方法的建立
在实验前30 min，取出单克隆抗体9F8包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将人HSPB1标准品进行倍比稀释（5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 pg/mL）后，加入到酶标板中，100 μL/孔，同时设置空白对照孔；室温（25±2℃）静置孵育2h，然后洗涤。将生物素标记的单克隆抗体20G5稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育1h，然后洗涤。将酶结合物稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育30 min，然后洗涤。在各个反应孔中加入TMB显色底物，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置显色10~20 min。最后在各个反应孔中加入终止液，50 μL/孔，终止反应在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以人HSPB1标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合），结果表明，该方法对人HSPB1蛋白的检测范围为78.125-5000pg/mL，R2为0.99948（图3）。
4、双抗夹心ELISA方法的特异性检测
在实验前30 min，取出单克隆抗体9F8包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将人HSPB1标准品进行倍比稀释（5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 pg/mL）后，加入到酶标板中，100 μL/孔；同时分别将表2中所示的各重组蛋白加入到酶标板中，100μL/孔；同时设置空白对照孔和阴性对照孔；室温（25±2℃）静置孵育2h，然后洗涤。将生物素标记的单克隆抗体20G5稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育1h，然后洗涤。将酶结合物稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育30 min，然后洗涤。在各个反应孔中加入TMB显色底物，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置显色10~20 min。最后在各个反应孔中加入终止液，50 μL/孔，终止反应在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。结果如表2所示，除人HSPB1以外的各重组蛋白均未检测到明显的交叉反应，表明具有较高的特异性。
表2
5、双抗夹心ELISA方法的稳定性检测
将单克隆抗体9F8包被的酶标板、生物素标记的单克隆抗体20G5及标准品人HSPB1置于37℃进行加速稳定性实验，放置13天（约相当于4℃放置19.5个月）。随后取出检测，检测方法为：酶标板洗板3次并甩干。将人HSPB1标准品进行倍比稀释（5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 pg/mL）后，加入到酶标板中，100 μL/孔；同时将待检样本加入到酶标板中，100 μL/孔；同时设置空白对照孔和阴性对照孔；室温（25±2℃）静置孵育2h，然后洗涤。将生物素标记的单克隆抗体20G5稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育1h，然后洗涤。将酶结合物稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育30 min，然后洗涤。在各个反应孔中加入TMB显色底物，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置显色10~20 min。最后在各个反应孔中加入终止液，50 μL/孔，终止反应在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合），建立方程。结果如表3所示，标准曲线的OD值CV＜10%，表明试剂盒稳定性良好。
表3
6、双抗夹心ELISA方法的回收率和线性检测
在实验前30 min，取出单克隆抗体9F8包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将人HSPB1标准品进行倍比稀释（5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 pg/mL）后，加入到酶标板中，100 μL/孔；分别选取RPMI-1640基础培养基和健康志愿者的血清（人血清1-4），加入不同浓度的HSPB1标准品，100 μL/孔；同时设置空白对照孔和阴性对照孔；室温（25±2℃）静置孵育2h，然后洗涤。将生物素标记的单克隆抗体20G5稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育1h，然后洗涤。将酶结合物稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育30min，然后洗涤。在各个反应孔中加入TMB显色底物，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置显色10~20 min。最后在各个反应孔中加入终止液，50 μL/孔，终止反应在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合），建立方程，计算加标回收率。结果如表4所示，回收率在80%~120%之间，加标回收率良好。
表4
在实验前30 min，取出单克隆抗体9F8包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将人HSPB1标准品进行倍比稀释（5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 pg/mL）后，加入到酶标板中，100 μL/孔；分别选取RPMI-1640基础培养基和健康志愿者的血清（人血清1-3），加入HSPB1标准品，进行倍比稀释，然后加入到酶标板中，100 μL/孔；同时设置空白对照孔和阴性对照孔；室温（25±2℃）静置孵育2h，然后洗涤。将生物素标记的单克隆抗体20G5稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育1h，然后洗涤。将酶结合物稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育30 min，然后洗涤。在各个反应孔中加入TMB显色底物，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置显色10~20 min；最后在各个反应孔中加入终止液，50 μL/孔，终止反应在5min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合），建立方程，计算线性稀释回收率。结果如表5所示，回收率在80%~120%之间，线性稀释回收率良好。
表5
实施例4 与市售同种类型试剂盒的检测结果对比
选择市售常用的人HSPB1蛋白双抗夹心ELISA检测试剂盒（SZ试剂盒（SinoBiological的SEK10351）和AY试剂盒（艾博抗的ab303741）进行类比测试，按照各品牌说明书中的方式进行实验。通过以下两个方面对以本发明的单克隆抗体9F8和20G5分别作为包被和标记抗体的双抗夹心ELISA检测试剂盒以及市售试剂盒的性能进行比较。
1、标准曲线比对：结果表明本发明的试剂盒和两种市售试剂盒的标准曲线的R2>0.999，拟合度都表现良好；且本发明的试剂盒和AY试剂盒本底表现优良（零孔值<0.1），优于SZ试剂盒（零孔值>0.1）（表6）。
表6
2、样本测定结果比对：随机选择17份人血清样本和19份人血浆样本同时采用上述试剂盒进行测定（单位ng/mL）。测定结果显示（表7），本发明的试剂盒和SZ试剂盒的CV在0%~31%，本发明的试剂盒和AY试剂盒的CV在0%~132%，表明本发明的试剂盒的测定结果与SZ试剂盒相一致，与AY试剂盒差异比较大。结果分析显示，样本含量高于100ng/mL的样本，本发明的试剂盒与AY试剂盒的CV＜41%，并且随着样本含量降低，CV呈现增大趋势，并且AY试剂盒测得样本含量明显低于本发明的试剂盒，因此推测是AY试剂盒在样本含量低的情况，对样本中人HSPB1蛋白的捕获能力更差，其在低浓度样本中检测的准确性明显低于本发明的抗体组合物。
表7
实施例5 单克隆抗体9F8和20G5在人血清和血浆HSPB1含量检测中的应用
以单克隆抗体9F8和20G5分别作为包被抗体和标记抗体，采用双抗夹心ELISA方法进行真实样本的人血清和血浆HSPB1含量检测，具体如下：
在实验前30 min，取出单克隆抗体9F8包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。将人HSPB1标准品进行倍比稀释（5000、2500、1250、625、312.5、156.25、78.125 pg/mL）后，加入到酶标板中，100 μL/孔，同时设置空白对照孔；分别选取28份人血清样本和20份人血浆样本，稀释后，加入到酶标板中，100 μL/孔，室温（25±2℃）静置孵育2h，然后洗涤。将生物素标记的单克隆抗体20G5稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育1h，然后洗涤。将酶结合物稀释到工作浓度，加入到酶标板的各反应孔中，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置孵育30 min，然后洗涤。在各个反应孔中加入TMB显色底物，100 μL/孔；室温（25±2℃）静置显色10~20 min。最后在各个反应孔中加入终止液，50 μL/孔，终止反应在5 min之内，使用酶标仪进行双波长检测，测定450 nm最大吸收波长和630 nm参考波长下的OD值，并用450 nm的OD测定值减去630 nm的OD测定值。以标准品浓度为横坐标，吸光度OD值为纵坐标，用ELISA Calc软件绘制标准曲线（使用四参数拟合），建立方程，计算样本浓度。结果如表8所示，其中血清样本的人HSPB1含量范围为0.17~169.42ng/mL，含量平均值为34.13 ng/mL。血浆样本的人HSPB1含量范围为5.02~84.60 ng/mL，含量平均值为19.94 ng/mL，上述检测结果与文献报道的人血清/血浆中HSPB1的含量相符，表明利用本发明的单克隆抗体能够准确测定人血清和血浆中HSPB1的含量。
表8
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (12)
1.小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示、CDR2的氨基酸序列为WAS，CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示或与如SEQID NO.11所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示或与如SEQ ID NO.12所示序列具有至少80%的相似性。
3.根据权利要求1或2所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链抗体。
4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~3任一项所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料含有权利要求4所述的核酸分子；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物为将权利要求1~3任一项所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.小鼠抗人HSPB1单抗杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为9F8，杂交瘤细胞株9F8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45646。
8.单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求7所述的杂交瘤细胞株产生，且能够特异性结合小热休克蛋白HSPB1。
9.权利要求1~3任一项所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的杂交瘤细胞株或权利要求8所述的单克隆抗体在制备用于检测小热休克蛋白HSPB1在样品中的存在或其水平的产品中的应用。
10.权利要求1~3任一项所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求8所述的单克隆抗体在非疾病诊断目的的检测小热休克蛋白HSPB1在样品中的存在或其水平中的应用。
11.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物，或包含权利要求8所述的单克隆抗体。
12.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1~3任一项所述的小热休克蛋白HSPB1的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求8所述的单克隆抗体。
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