CN109891246B - 包括汉城病毒与普马拉病毒来源的重组核衣壳蛋白及汉坦病毒来源的重组糖蛋白的肾综合症出血热诊断用组合物及包括其的诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明的一实施例涉及一种肾综合症出血热诊断用组合物，包括：由汉城病毒(Seoul virus)及普马拉病毒(Puumala virus)来源的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)构成的重组蛋白质；以及汉坦病毒(Hantaan virus)来源的重组糖蛋白(Glycoprotein)。

Description

包括汉城病毒与普马拉病毒来源的重组核衣壳蛋白及汉坦病 毒来源的重组糖蛋白的肾综合症出血热诊断用组合物及包括 其的诊断试剂盒

【技术领域】

本发明涉及包括汉城病毒与普马拉病毒来源的重组核衣壳蛋白及汉坦病毒来源的重组糖蛋白的肾综合症出血热诊断用组合物及包括其的诊断试剂盒

【背景技术】

汉他病毒(Hantavirus)引起的肾综合症出血热(Hemorrhagic fever with renalsyndrome，HFRS)是一种在全世界范围内每年产生20至30万名患者，其中不足5％发生死亡的急性发热疾病，在韩国，每年有千余名患者发生于大众与军人之中，被分类为第三类法定传染病的疾病。

肾综合症出血热除了表现出典型的临床特征之外，具有与流感症状类似的表现，或者多被观察为隐性感染，并且，在与韩国发病率较高的恙虫病与钩端螺旋体病等发热感染性疾病进行鉴别方面存在困难，由此，实质上的诊断除了依靠临床观察之外，还依靠血清检查结果。

对肾综合症出血热的血清学诊断多使用间接免疫荧光试验(Indirectimmunofluorescence assay，IFA)，因为可能发生主观判断带来的判定错误，需要依靠熟练的观察者，并且该过程十分繁琐，所需时间达4小时以上。

此外，还使用酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、红细胞凝集抑制试验(Hemagglutination inhibition，HI)、空斑减少中和试验(Plaquereduction neutralization test，PRNT)、蛋白印迹分析(Western blot analysis，WB)，以及逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)等多种检查方法，对于患者的疾病发展过程或者治疗程度，以及预后的判定等方面，需要可靠度高的检查方法，但在这一方面仍存在待改善的问题。

目前普遍使用的诊断试剂盒的制作方法大体有酶免疫试验(EnzymeImmunoassay，EIA)、凝集试验(Agglutination Assay)、试条法(Dip-stick)、侧流免疫试验(Lateral flow assay)等四种。EIA具有敏感性高的优点，但其缺点为特异性低，在进行诊断之前需要多个预处理工艺，由此所需时间较长，并且需要特殊的判断设备。平板凝集试验的判断时间很短，然而其缺点为敏感性低，不易进行判断；试管凝集试验的缺点是过程繁琐，时常发生判断模糊，需要长达2个小时的时间。

试条法(Dip-stick)能够适用于多种病原体，并且价格低，然而具有敏感性及特异性低的缺点。因能够在短时间内进行诊断也被称为快速诊断试剂盒(rapid diagnostickit)的侧流免疫试验(Lateral flow assay)是最近开发出的方法，不需要预处理，能够在15分钟内进行肉眼判断，并且价格低廉，然而其局限性在于为采用该方法，必须确保特定病原体的特定抗原。

【发明内容】

【技术问题】

本发明为解决上述现有技术问题，目的在于提供一种能够在短时间内以优秀的诊断敏感性及特异性诊断肾综合症出血热的组合物及诊断试剂盒。

然而，本发明要解决的技术问题并非限于以上言及部分，未言及的其他技术问题将通过以下说明，被本领域普通技术人员所理解。

【解决问题的技术方法】

根据本发明的一实施例，提供一种肾综合症出血热诊断用组合物，包括：由汉城病毒(Seoul virus)及普马拉病毒(Puumala virus)来源的核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein)构成的重组蛋白质；以及汉坦病毒(Hantaan virus)来源的重组糖蛋白(Glycoprotein)。

根据一侧面，所述组合物同时检测肾综合症出血热特异性IgM及IgG。

根据一侧面，所述汉城病毒来源的核衣壳蛋白由SEQ ID NO:1的碱基序列进行编码。

根据一侧面，所述普马拉病毒来源的核衣壳蛋白由SEQ ID NO:2的碱基序列进行编码。

根据一侧面，所述汉坦病毒来源的重组糖蛋白包括汉坦病毒的糖蛋白中抗原决定部位的重组。

根据一侧面，所述汉坦病毒来源的重组糖蛋白由SEQ ID NO:3的碱基序列进行编码。

本发明的另一实施例提供一种肾综合症出血热诊断试剂盒包括试验片(teststrip)，所述试验片包括：吸收试料的样本垫(sample pad)；与试料内抗体结合的金结合垫(gold conjugation pad)；具有包括组合物的反应线(test line)与包括对照组组合物的对照线(control line)的反应膜(test membrane)；以及吸收残余的试料的吸收垫(absorption pad)。

根据本发明的又一实施例，提供一种利用所述诊断试剂盒提供用于诊断肾综合症出血热的信息的方法。

【发明的效果】

根据本发明的一侧面，将抗原性优秀的汉城病毒及普马拉病毒来源的核衣壳蛋白进行重组，并同时使用汉坦病毒来源的重组糖蛋白，能够在短时间内诊断肾综合症出血热的同时，提高诊断敏感性及特异性。

本发明的效果并非限于上述效果，能够通过本发明的详细说明或权利要求中的构成进行推导的全部效果均属于本发明的范畴。

【附图说明】

图1为比较现有的Soochong病毒与本发明的实施例的各种病毒的核衣壳蛋白氨基酸序列的结果。

图2为显示根据本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断试剂盒内的试验片结构的附图。

图3为显示根据本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断试剂盒的结构的附图。

图4为显示从大肠杆菌确认汉城病毒及普马拉病毒的重组核衣壳蛋白表达及纯化的附图。

图5为显示从昆虫细胞确认汉城病毒及普马拉病毒的重组核衣壳蛋白表达及纯化的附图。

图6为显示从大肠杆菌确认汉坦病毒的重组糖蛋白表达及纯化的附图。

图7为显示根据本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断试剂盒的使用方法的附图。

图8为显示适用/未适用本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断用组合物的试剂盒的检测敏感性评价结果的附图。

图9为显示适用/未适用根据本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断用组合物的试剂盒的交叉反应的评价结果的附图。

【具体实施方式】

下面，参照附图对实施例进行详细说明。在各附图中，相同的附图标记表示相同部件。

能够对以下实施例进行多种变更。以下说明的实施例并非用于限定本发明的实施形式，本发明包括实施例的全部变形、等同替代以及替代。

实施例中使用的术语仅用于说明特定实施例，并非用于限定实施例。单数表达在文中没有明确表示其他含义时包括复数含义。本说明书中的“包括”、“具有”等术语说明具有文中记载的特征、数字、阶段、动作、构成要素、部件及以上组合，并不排除包括或附加有一个或多个其他特征、数字、阶段、动作、构成要素、部件及以上组合的可能性。

在没有特别定义的情况下，包括技术与科学术语在内的全部术语具有本领域普通技术人员所理解的一般含义。通常使用的词典定义的术语，应解释为与技术内容通篇含义一致的含义，在本发明中没有明确定义时，不能解释为理想的或过度形式化的含义。

并且，参照附图进行说明的过程中，相同的构成要素使用相同的附图标记，并且省略对其进行详细说明。在对实施例进行说明的过程中，对相关公知技术的具体说明不必要地模糊本发明的要旨时，省略对其进行详细说明。

根据本发明的一实施例提供一种肾综合症出血热诊断用组合物，包括由汉城病毒(Seoul virus)及普马拉病毒(Puumala virus)来源的核衣壳蛋白(Nucleocapsidprotein)构成的重组蛋白质；及汉坦病毒(Hantaan virus)来源的重组糖蛋白(Glycoprotein)。

本说明书中的术语“肾综合症出血热(Hemorrhagic Fever with RenalSyndrome，HFRS)”是指由汉城病毒(Seoul virus)、普马拉病毒(Puumala virus)、汉坦病毒(Hantaan virus)、布拉瓦-贝尔格莱德病毒(Dobrava-Belgrade virus)等汉他病毒属(Hantavirus)病毒引发的疾病。

本说明书本说明书中使用的术语“诊断(diagnose)”是指确认病理状态的存在或特征的一系列过程，由此，确认是否发生汉他病毒引起的肾综合症出血热。

所述汉他病毒是布尼亚病毒(Bunyaviridae)科(family)汉他病毒(Hantavirus)属(genus)病毒，是一种表面具有包膜的直径为80～120nm的球型病毒(virion)。所述汉他病毒以在美国、巴西、阿根廷、巴拉圭、乌拉圭等栖息的啮齿类为宿主存在于美洲大陆，目前，分布于世界各地。所述汉他病毒的总的基因组为约12kb的单链RNA，包括S(small)、M(medium)，以及L(large)的3个片段。

所述汉他病毒的传染途径是随着啮齿类的排泄物的干燥而通过呼吸系统传播，在出现感染症状之前，在人体内潜伏两周至四周。

具体地，所述汉他病毒的感染症状具有5个阶段，分别为出现发热、恶寒、头痛等疼痛以及呼吸系统或者消化系统问题的发热期；血小板数值下降、脉搏加快，以及出现缺氧症状的低血压期；出现肾功能衰竭与蛋白尿的少尿期；尿液增多为特征的多尿期；以及症状得到改善的恢复期。

引发所述肾综合症出血热的汉他病毒属的地理分布如下。汉城病毒(Seoulvirus)在全世界范围内分布；普马拉病毒(Puumala virus)分布于欧洲、俄罗斯、韩国。汉坦病毒(Hantaan virus)分布于亚洲、俄罗斯东部地区、中国南部地区；多布拉瓦-贝尔格莱德病毒(Dobrava-Belgrade virus)分布于巴尔干地区。

与所述汉他病毒属的地理分布相同，引起各地区肾综合症出血热的汉他病毒属(genus)也各不相同。为检测出以上病毒的抗体，由此确认是否患有肾综合症出血热，需要一种能够检测出引发所述疾病的汉他病毒属的全部抗体的抗原。为此，本发明的发明人制备出能够检测所述抗体的重组蛋白质，用于肾综合症出血热的诊断。

本发明人对引发肾综合症出血热的汉他病毒属的现有Soochong病毒以及各病毒的氨基酸序列进行比较，其结果如图1所示，通过分析它们的相似性，得出如表1的结果。

【表1】

如图1及表1的结果所示，现有Soochong病毒无法全部检测出各地区肾综合症出血热的抗体。为此，将分布于全世界的汉城病毒(Seoul virus)以及分布于欧洲、俄罗斯、韩国的普马拉病毒(Puumala virus)的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)制备为重组蛋白质用于诊断，能够获得优秀的诊断敏感性(sensitivity)与特异性(specificity)。

尤其，所述汉城病毒与普马拉病毒的核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein)及所述汉坦病毒的糖蛋白(Glycoprotein)与肾综合症出血热患者的血清发生反应，与普通血清不发生反应，由此，能够作为用于肾综合症出血热诊断的特异性抗原，因显示出高的抗原性，能够提高诊断敏感性及特异性。

分别重组所述汉城病毒与普马拉病毒的核衣壳蛋白各自的编码基因后表达的重组蛋白质，相比单独使用时能够提高抗原性，当混合汉坦病毒的重组糖蛋白时能够进一步提高抗原性。由此，包括上述蛋白质的肾综合症出血热诊断用组合物具有优秀的诊断敏感性(sensitivity)与特异性(specificity)。

具体地，所述汉城病毒来源的核衣壳蛋白及所述普马拉病毒来源的核衣壳蛋白能够分别通过SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的碱基序列进行编码。

一方面，所述汉坦病毒来源的重组糖蛋白能够包括汉坦病毒的糖蛋白中的抗原决定部位的重组。具体地，所述抗原决定部位能够是汉坦病毒的糖蛋白的从第414氨基酸(第1242碱基)到第506氨基酸(第1518碱基)的片段及从第773氨基酸(第2319碱基)到第1009氨基酸(第3027碱基)的片段重组后的全部330aa的蛋白质。此时，所述汉坦病毒来源的重组糖蛋白由SEQ ID NO:3的碱基序列进行编码。

通过基因重组方法，重组所述SEQ ID NO:1及SEQ ID NO:2的碱基序列，在微生物或真核细胞中表达，由此制备所述重组核衣壳蛋白，但并非限定于此。用于所述基因重组方法的载体有与人体及动物不发生感染，同时能够表达重组蛋白质的转移载体，例如能够使用杆状病毒转移载体，但并非限定于此。SEQ ID NO:3的碱基序列也能够在插入转移载体后在微生物或真核细胞中表达，制备重组糖蛋白。

所述重组核衣壳蛋白及重组糖蛋白属于来源于分布在全世界尤其是亚洲地区的汉城病毒、普马拉病毒及汉坦病毒的蛋白质，所述肾综合症出血热诊断用组合物对于分布于全世界的汉他病毒具有高的敏感性与特异性。

并且，所述肾综合症出血热诊断用组合物能够检测由肾综合症出血热患者生成的抗体，即检测肾综合症出血热，尤其检测IgM及IgG，优选地，能够同时对其进行检测。

根据本发明的另一实施例的肾综合症出血热诊断试剂盒，包括试验片(teststrip)，所述试验片(test strip)包括用于吸收试料的样本垫(sample pad)；与试料内的抗体结合的金结合垫(gold conjugation pad)；具有包括所述组合物的反应线(testline)以及包括对照组组合物的对照线(control line)的反应膜(test membrane)；以及吸收残余的试料的吸收垫(absorption pad)。

图2为显示根据本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断试剂盒内的试验片结构的附图。参照图2，所述试验片由样本垫、金结合垫、反应膜，及吸收垫构成。

所述样本垫重叠于金结合垫上形成第一重叠部；所述金结合垫重叠在反应膜上形成第二重叠部。并且，所述反应膜与吸收垫能够形成第三重叠部。

当生物学试料滴注在样本垫时，基于毛细现象能够通过金结合垫，其中，金结合垫包括例如金标记蛋白A(gold-labeled protein A)或金标记羊抗人IgM抗体(gold-labeledgoat anti-human IgM antibody)等。形成所述金标记的金粒子的直径为20nm至55nm，优选直径为20nm至40nm，能够起到染料指示剂(indicator dye)的作用。随着通过所述金结合垫，生物学试料内的抗体与金标记蛋白A等结合形成复合物，所述复合物沿着反应膜移动。

本说明书中使用的术语“生物学试料”或“试料”是指包括肾综合症出血热疑似患者在内的哺乳动物的血清、血浆、血液等。在将所述生物学试料滴注在所述诊断试剂盒的样本垫之前，根据诊断目的，能够决定是否进行稀释以及确定稀释浓度。

当所述生物学试料形成有汉城病毒、普马拉病毒或汉坦病毒抗体时，与所述诊断试剂盒内的重组核衣壳蛋白和/或重组糖蛋白抗原结合，在反应膜上的反应线发生颜色变化，由此实现肉眼识别。

然而，当生物学试料未形成汉城病毒、普马拉病毒，或汉坦病毒抗体时，无法实现与所述抗原蛋白质的结合，肉眼无法观察到任何变化。

即，所述汉城病毒、普马拉病毒，或汉坦病毒的抗体能够与固定在反应膜的反应线的重组核衣壳蛋白和/或重组糖蛋白抗原结合。

通过形成这种抗原-抗体复合物，基于所述金粒子的染料指示剂(indicator dye)得到沉积，由此，出现可检测的紫红色带，由此，能够显示生物学试料内具有汉城病毒、普马拉病毒、或汉坦病毒抗体的阳性反应。

所述反应膜能够包括规格化大小(10*500nm)的硝酸纤维膜(Millipore^TMXA3J072100)等适合的物质。反应膜上能够依次排列有所述反应线及对照线，反应线与对照线的间隔为5mm至10mm，优选为6mm至8mm。

除对照线外，包括所述抗原蛋白质的反应线显示出颜色时，判断对肾综合症出血热产生阳性反应，相反，仅所述对照线显示出颜色时，判断对肾综合症出血热发生阴性反应。通过观察所述对照线是否发生异常，能够确认所述诊断试剂盒是否发生异常。

所述对照线能够包括与金标记结合的对照组组合物，例如兔子抗-羊IgG单克隆抗体、羊抗-人IgG单克隆抗体、兔子抗-人IgM单克隆抗体或者羊抗-人IgM单克隆抗体、抗-鸡IgY单克隆抗体等，为不与检测体发生交叉反应，优选包括抗-鸡IgY单克隆抗体，但并非限定于此。即，所述对照组组合物能够包括抗体蛋白质。并且，包括在所述对照线的所述对照组组合物浓度为0.1mg/ml至1.0mg/ml。

所述反应线包括例如所述重组核衣壳蛋白及重组糖蛋白的抗原蛋白质，反应线包括0.5mg/ml至1.5mg/ml浓度的抗原蛋白质。

适合所述金结合垫的标志物，能够包括例如干燥的胶体金标记蛋白质A(goldlabeled portein A)、金标记抗-人IgG抗体(gold-labeled anti-human IgG antibody)或金标记抗-人IgM抗体(gold-labeled anti-human IgM antibody)等，并且位于邻近样本垫的位置。

并且，所述金结合垫还包括Trehalose溶液，优化检测条件。此时，所述缓冲液的浓度为0.1％至10％。

当所述金标记标记物过量地包括在金结合垫时，即使区域中的待分析的汉他病毒抗体较少，也会由于非特定信号的增加出现假阳性结果。由此，将胶体金原液进行稀释使得以吸光度(optical density；OD)在1至6，优选为1至4的浓度包括所述金标记标志物。

所述吸收垫位于与样本垫相对的末端，吸收通过毛细现象沿着反应膜移动的例如血清、血浆、血液等生物学试料。

利用所述诊断试剂盒的诊断时间为15分钟以内，具体为5分钟至10分钟。诊断结果能够用于诊断患者的汉他病毒属感染状态。例如，从汉他病毒感染对象收集的生物学试料显示出阳性反应，诊断为肾综合症出血热；相反，从未感染汉他病毒的对象收集的生物学试料显示出阴性反应，诊断为未患肾综合症出血热。

将包括从所述SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:3的碱基序列表达的重组核衣壳蛋白及重组糖蛋白作为抗原的诊断试剂盒与间接免疫荧光法(IFA)比较肾综合症出血热敏感性与特异性，其结果，所述诊断试剂盒表现出优秀的敏感性与特异性，即使是检测IgM的初期诊断，相比间接免疫荧光法也显示出更优秀的敏感性。由此，所述诊断试剂盒能够有效诊断肾综合症出血热，尤其，相比现有技术，能够有效地对初期感染进行诊断。

图3为显示根据本发明的一实施例的肾综合症出血热诊断试剂盒的结构的附图。参照图3，包括所述试验片的诊断试剂盒，包括分别检测肾综合症出血热特异性IgM及IgG的区域，即，包括多个试验片能够同时检测肾综合症出血热特异IgM及IgG。

一方面，根据本发明的另一实施例，提供一种通过所述肾综合症出血热诊断试剂盒，提供诊断肾综合症出血热的信息的方法。具体地，所述信息提供方法包括以下步骤；从肾综合症出血热疑似患者采集生物学试料；及利用所述肾综合症出血热诊断试剂盒对所述生物学试料检测抗体。

从肾综合症出血热疑似患者采集生物学试料，例如采集血清，将采集的生物学试料滴注至作为所述诊断试剂盒的吸收试料部位的样本垫(sample pad)，通过毛细现象，生物学试料到达金结合垫(gold conjugation pad)，试料内的抗体与金结合垫内的标志物结合，例如，与金标记蛋白质A(gold-labeled protein A)，金标记抗-人IgG抗体(gold-labeled anti-human IgG antibody)及金标记抗-人IgM抗体(gold-labeled anti-humanIgM antibody)等结合，形成胶体。

此时，待检测的生物学试料并非固定于所述金结合垫，而是持续移动到达固定有所述抗原蛋白质的反应线(test line)。

对于肾综合症出血热患者的生物学试料，能够与所述抗原发生抗原-抗体反应。即，结合在金结合垫内特定标志物的肾综合症出血热患者的抗体，与固定在反应线的所述抗原蛋白质结合，形成紫红色带，由此实现肉眼识别。

与此不同，生物学试料内不与抗体发生反应的其余金结合垫内的标志物到达对照线，与对照组组合物发生反应，由此形成紫红色带，这表示检查的合理性。通过上述方法，检测肾综合症出血热的抗体。

下面，通过实施例进一步详细说明本发明。下面的实施例用于对本发明进行示例，本发明的范围并非限定于此。

【实施例1:汉城病毒及普马拉病毒来源的重组核衣壳蛋白的制备】

(1)基因克隆

连接汉城病毒来源的核衣壳蛋白编码基因(SEQ ID NO:1；357bp；119aa)及普马拉病毒来源的核衣壳蛋白编码基因(SEQ ID NO:2；357bp；119aa)合成整体核衣壳蛋白基因(714bp；238aa)(Bioneer，Korea)。

向pBHA载体将克隆的核衣壳蛋白基因与pET-32a(+)载体用限制酶EcoRI与XhoI完全切割，在1.2％琼脂糖凝胶执行电泳后，使用QIAGEN凝胶回收试剂盒(gel elution kit)(QUAGEN Inc，USA)进行回收。

在UV透照器(transilluminator)上按照预想大小剪开带后移至微管，每净重0.1g琼脂糖凝胶添加100μl的盐(salt)溶液后，在37℃下放置20分钟，使凝胶完全溶解。

在具有基因结合过滤器的试管中，将全部凝胶溶解液以400μl为单位，以30秒为间隔进行离心分离，以500μl为单位放入附带在试剂盒(kit)的乙醇溶液，在相同条件下进行离心分离。利用高速离心分离机(Hanil，4℃，4分钟，13,000rpm)进行离心分离，完全去除残留的乙醇。

仅分离去除乙醇的过滤器，并移至洗脱(elution)用微管，放入30μl洗脱(elution)缓冲液后在常温下反应5分钟，之后，使用离心分离机(Hanil，4℃，4分钟，13,000rpm)进行洗脱(elution)。

将最终产物使用Nanodrop(Thermo，Nanodrop 2000)进行定量，与切割的载体100ng以及切割的基因50ng混合，在4℃下反应20分钟。之后，将10倍浓度的连接酶(ligase)缓冲液及连接酶1μl进行混合，在4℃静置16小时进行反应，由此，克隆重组核衣壳蛋白基因。

(2)感受态细胞(competent cell)制备及转化

将在LB培养基培养16小时的大肠杆菌JM109的接种1/100至LB培养基，在37℃下进一步培养3小时后，将温度降低至4℃，分开装入50ml试管后进行离心分离(eppendorf，3,000rpm，5分钟)。

去除上层液，将预先低温保管的0.1M CaCl₂向每个试管放入5ml后轻轻打匀沉积的大肠杆菌，接着，在冰块中放置20分钟，并进行离心分离(eppendorf，3,000rpm，5分钟)。

在无菌作业台去除上层液，向每个试管放入2.5ml的0.1M CaCl₂的15％丙三醇溶液，使用移液管(pipette)轻轻打匀沉积物后，以100μl为单位倒出后进行保管，其中一个用于转化。

将所述克隆产物与感受态细胞混合后放入冰块中放置20分钟，之后在42℃施加热冲击，将全部混合物接种至添加有氨苄青霉素(Ampicillin)的LB琼脂平板培养基，并在37℃中培养。

挑选一个大肠杆菌菌落，接种至添加有氨苄青霉素的LB培养基3ml后培养18小时，利用GeneAll小量提取试剂盒(Mini-prep kit)(GeneAll.，Korea)提取DNA。将用于克隆的限制酶以同样的方法对提取的DNA再次进行处理，在1.2％琼脂糖凝胶执行电泳。电泳结果，将完成克隆的DNA在4℃下进行保管。

(3)基于大肠杆菌的蛋白质表达及纯化

将确认克隆DNA在大肠杆菌C43感受态细胞进行转化。将在LB琼脂平板培养基培养的C43大肠杆菌菌落接种至添加有氨苄青霉素的LB培养基，在37℃下培养18小时后，以1/100接种至新LB培养基进行培养直到OD₆₀₀＝0.5～0.6。添加IPTG使其浓度达到0.5mM，接着培养3个小时后进行离心分离(Hanil，4℃，6,000rpm)。废弃上层液，仅将沉积物通过1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM咪唑(imidazole))悬浮后，利用超声波粉碎机以10秒为间隔进行粉碎。通过离心分离进行分离，使得上层液为可溶部分(soluble fraction)，沉积物为非可溶部分(insoluble fraction)。

注入5mlHis-bind树脂(Novagen)到柱，使用蒸馏水以及1X charge buffer(100mMNiSO4)，1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM咪唑(imidazole))准备柱。

对于抗原蛋白质可溶部分，利用1X冲洗缓冲液(washing buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM咪唑(imidazole))冲洗，经过洗脱缓冲液(Elution buffer)(500mM咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl pH 8.0)以1ml为单位回收蛋白质。另一方面，对于非可溶部分(insoluble fraction)，经过其他柱后，利用1X冲洗缓冲液(washing buffer)(6M尿素(Urea)，500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM咪唑(imidazole))冲洗，经过Elution buffer(6M尿素(Urea)，500mM咪唑(imidazole)，0.5MNaCl，20mM Tris-Cl pH 8.0)后以1ml为单位回收蛋白质。

在各部分添加bradford试剂，仅回收出现青色的部分。利用透析缓冲液(10mM磷酸钠(Sodium phosphate)或10mM磷酸钾(potassium phosphate))透析抗原后，利用BCA法进行定量后在4℃中保管。利用SDS-PAGE确认保管的抗原的表达(图4)。以表达与收率为基础，对于核衣壳蛋白，仅将可溶部分作为滴注用抗原。

(4)基于昆虫细胞的蛋白质表达及纯化

将确认克隆的DNA在大肠杆菌DH10ba中转化。转化方法与如上所述方法相同。在大肠杆菌DH10bac内部的Bacmid基因与pFast Bac HT A载体中有相互变化内部基因位置的部分，由此，在转化的同时还发生基因位置变化。

在LB琼脂平板培养基中进行培养时，一同处理X-gal与IPTG，在37℃下培养18小时后通过形成白色菌落确认基因位置变化。向添加有氨苄青霉素(ampicillin)与卡那徽素(kanamycin)的LB培养基3ml接种白色菌落，培养18小时后，利用中量提取试剂盒(Midi-prep kit)(QIAGENE Inc.，USA)获得DNA。

将所获得的DNA转导至作为昆虫来源细胞的Sf21细胞。此时，在转导中利用Invitrogen(Thermo，USA)的

II试剂。将2μg DNA与8μl试剂在常温下反应15分钟，之后将反应物放入Sf21细胞培养瓶。在72小时后，回收上层液作为病毒使用。回收的病毒再次感染Sf21细胞，用于抗原表达。

将相当于细胞培养体积的1/10的病毒放入细胞培养培养基进行感染，在27℃培养3.5天后，回收抗原表达的细胞，之后进行离心分离(Eppendorf，4℃，1,500rpm)，废弃上层液，仅将沉积物在1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM咪唑(imidazole))悬浮后，利用超声波粉碎机以10秒为间隔粉碎36次。通过离心分离进行分离，使上层液为可溶部分(soluble fraction)，沉积物为非可溶部分(insolublefraction)。

注入5mlHis-bind树脂(Novagen)到柱，使用蒸馏水以及1X charge buffer(100mMNiSO4)，1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM咪唑(imidazole))准备柱。

使抗原蛋白质经过柱后，利用1X冲洗缓冲液(washing buffer)(6M尿素(Urea)，500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM咪唑(imidazole))冲洗，经过洗脱缓冲液(Elution buffer(6M尿素(Urea)，500mM咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl pH8.0)后以1ml为单位回收蛋白质。

在各部分添加bradford试剂，仅回收出现青色的部分。利用透析缓冲液(10mM磷酸钠(Sodium phosphate)或10mM磷酸钾(potassium phosphate))透析抗原后，利用BCA法进行定量，并在4℃中保管。利用SDS-PAGE确认保管的抗原的表达(图5)。

【实施例2:制备汉坦病毒来源的重组糖蛋白】

(1)基因克隆

以汉坦病毒来源的糖蛋白基因碱基序列为基础，挑选具有抗原性的部位，将其进行重组，制备由SEQ ID NO:3的碱基序列构成的重组基因。具体地，从汉坦病毒糖蛋白414aa(1,242bp)到506aa(1,518bp)的94aa(282bp)及从773aa(2,319bp)到1,009aa(3,027bp)的236aa(708bp)进行结合，合成整体为330aa(990bp)的重组糖蛋白基因(Bioneer，Korea)。

向pBHA载体将糖蛋白基因与pET-32a(+)载体用限制酶NdeI与XhoI完全切割，在1.2％琼脂糖凝胶执行电泳后，使用QIAGEN凝胶回收试剂盒(gel elution kit)(QUAGENInc，USA)进行回收。

在UV透照器(transilluminator)上按照预想大小切割带后，移入微管，每净重0.1g琼脂糖凝胶添加100μl的盐(salt)溶液后，在37℃下放置20分钟，使凝胶完全溶解。

在具有基因结合过滤器的试管中，将全部凝胶溶解液以400μl为单位，以30秒为间隔进行离心分离，以500μl为单位放入附带在试剂盒(kit)的乙醇溶液，在相同条件下进行离心分离。利用高速离心分离机(Hanil，4℃，4分钟，13,000rpm)进行离心分离，完全去除残留的乙醇。

仅分离去除乙醇的过滤器，并移至洗脱(elution)用微管，放入30μl洗脱(elution)缓冲液后在常温下反应5分钟，之后，使用离心分离机(Hanil，4℃，4分钟，13,000rpm)进行洗脱(elution)。

将最终产物使用Nanodrop(Thermo，Nanodrop 2000)进行定量，与切割的载体100ng以及切割的基因50ng混合，在4℃下反应20分钟。之后，将10倍浓度的连接酶(ligase)缓冲液及连接酶1μl进行混合，在4℃静置16小时进行反应，由此，克隆重组核衣壳蛋白基因。

(2)感受态细胞(competent cell)制备及转化

将在LB培养基培养16小时的大肠杆菌JM109的接种1/100至LB培养基，在37℃下进一步培养3小时后，将温度降低至4℃，分开装入50ml试管后进行离心分离(eppendorf，3,000rpm，5分钟)。

去除上层液，将预先低温保管的0.1M CaCl₂向每个试管放入5ml后轻轻打匀沉积的大肠杆菌，接着，在冰块中放置20分钟，并进行离心分离(eppendorf，3,000rpm，5分钟)。

在无菌作业台去除上层液，向每个试管放入2.5ml的0.1M CaCl₂的15％丙三醇溶液，使用移液管(pipette)轻轻打匀沉积物后，以100μl为单位倒出后进行保管，其中一个用于转化。

将所述克隆产物与感受态细胞混合后放入冰块中放置20分钟，之后在42℃施加热冲击，将全部混合物接种至添加有氨苄青霉素(Ampicillin)的LB琼脂平板培养基，并在37℃中培养。

挑选一个大肠杆菌菌落，接种至添加有氨苄青霉素的LB培养基3ml后培养18小时，利用GeneAll小量提取试剂盒(Mini-prep kit)(GeneAll.，Korea)提取DNA。将用于克隆的限制酶以同样的方法对提取的DNA再次进行处理，在1.2％琼脂糖凝胶执行电泳。电泳结果，将完成克隆的DNA在4℃下进行保管。

(3)基于大肠杆菌的蛋白质的表达及纯化

将确认克隆DNA在大肠杆菌C43感受态细胞进行转化。将在LB琼脂平板培养基培养的C43大肠杆菌菌落接种至添加有氨苄青霉素的LB培养基，在37℃下培养18小时后，以1/100接种至新的LB培养基，进行培养直到OD₆₀₀＝0.5～0.6。添加IPTG使其浓度达到0.5mM后培养3个小时，接着进行离心分离(Hanil，4℃，6,000rpm)。废弃上层液，仅将沉积物通过1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM咪唑(imidazole))悬浮后，利用超声波粉碎机以10秒为间隔进行粉碎300次。通过离心分离进行分离，使得上层液为可溶部分(soluble fraction)，沉积物为非可溶部分(insolublefraction)。

注入5mlHis-bind树脂(Novagen)到柱，使用蒸馏水以及1X charge buffer(100mMNiSO4)，1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM咪唑(imidazole))准备柱。

对于抗原蛋白质可溶部分，利用1X冲洗缓冲液(washing buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM咪唑(imidazole))冲洗，经过洗脱缓冲液(Elution buffer)(500mM咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl pH 8.0)后以1ml为单位回收蛋白质。另一方面，对于非可溶部分(insoluble fraction)，经过其他柱后，利用1X冲洗缓冲液(washing buffer)(6M尿素(Urea)，500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM咪唑(imidazole))冲洗，经过洗脱缓冲液(Elution buffer)(6M尿素(Urea)，500mM咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl pH 8.0)后以1ml为单位回收蛋白质。

在各部分添加bradford试剂，仅回收出现青色的部分。利用透析缓冲液(10mM磷酸钠(Sodium phosphate)或10mM磷酸钾(potassium phosphate))对抗原进行透析后，利用BCA法进行定量后在4℃中保管。利用SDS-PAGE确认保管的抗原的表达(图6)。以表达与收率为基础，对于糖蛋白，仅将非可溶部分作为滴注用抗原。

(4)基于昆虫细胞的蛋白质表达及纯化

将克隆的DNA在大肠杆菌DH10bac中转化。转化方法与如上所述方法相同。在大肠杆菌DH10bac内部的Bacmid基因与pFast Bac HT A载体中有相互变化内部基因位置的部分，由此，在转化的同时还发生基因位置变化。

在LB琼脂平板培养基中进行培养时，一同处理X-gal与IPTG，在37℃下培养18小时后，通过形成白色菌落确认基因位置变化。向添加有氨苄青霉素(ampicillin)与卡那徽素(kanamycin)的LB培养基3ml接种白色菌落，培养18小时后，利用中量提取试剂盒(Midi-prep kit)(QIAGENE Inc.，USA)获得DNA。

将所获得的DNA转导至作为昆虫来源细胞的Sf21细胞。此时，在转导中利用Invitrogen(Thermo，USA)的

II试剂。将DNA 2μg与试剂8μl在常温下反应15分钟，之后将反应物放入Sf21细胞培养瓶。在72小时后，回收上层液作为病毒使用。回收的病毒再次感染Sf21细胞，用于抗原表达。

将相当于细胞培养体积的1/10的病毒放入细胞培养培养基进行感染，在27℃培养3.5天后，回收抗原表达的细胞，之后进行离心分离(Eppendorf，4℃，1,500rpm)，废弃上层液，仅将沉积物在1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM咪唑(imidazole))悬浮后，利用超声波粉碎机以10秒为间隔粉碎36次。通过离心分离进行分离，使上层液为可溶部分(soluble fraction)，沉积物为非可溶部分(insolublefraction)。

注入His-bind树脂(Novagen)5ml到柱，使用蒸馏水以及1X charge buffer(100mMNiSO4)，1X结合缓冲液(binding buffer)(500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，5mM咪唑(imidazole))准备柱。

使抗原蛋白质经过柱后，利用1X冲洗缓冲液(washing buffer)(6M尿素(Urea)，500mM NaCl，20mM Tris-HCl(pH 8.0)，40mM咪唑(imidazole))冲洗，经过洗脱缓冲液(Elution buffer(6M尿素(Urea)，500mM咪唑(imidazole)，0.5M NaCl，20mM Tris-Cl pH8.0)后以1ml为单位回收蛋白质。在各部分添加bradford试剂，仅回收出现青色的部分。利用透析缓冲液(10mM磷酸钠(Sodium phosphate)或10mM磷酸钾(potassium phosphate))对抗原进行透析后，利用BCA法定量，接着在4℃中进行保管。利用SDS-PAGE确认保管的抗原的表达(未图示)。

【实施例3:制作试剂盒】

为确认根据所述实施例1及2制作的汉城/普马拉病毒核衣壳蛋白及汉坦病毒糖蛋白的肾综合症出血热诊断剂的效果，利用分配器(dispenser)(KINEMATIC Automation)制作诊断用试验片样本(图2)。

具体地，试验片由反应膜、样本垫、吸收垫、金结合垫(玻璃纤维)构成。反应膜使用Millipore公司生产的产品，为防止膜的损伤，在一面附着塑料。向反应膜滴注3种蛋白质。

1种是为了检测存在于患者的血清中的肾综合症出血热病毒抗体，将混合有从大肠杆菌或昆虫细胞表达的抗原蛋白质(汉城/普马拉病毒核衣壳蛋白、汉坦病毒糖蛋白)的蛋白质滴注至反应线(test line)。

另一种滴注至判断变色系统是否正常反应的对照线(control line)，剩下一种是为了去除包括在人体血清中，与大肠杆菌或者昆虫细胞来源的蛋白质引发抗原-抗体反应的抗体，将不表达抗原蛋白质的大肠杆菌或者昆虫细胞培养提取液滴注至预反应线(pretest line)。

利用分配器，将适量的蛋白质喷射至预反应线、反应线、对照线后，在常温下干燥48小时。在玻璃纤维中吸收5％海藻糖(trehalose)以及适量的胶体金结合物后，在常温下干燥48小时。

将样本垫与吸收垫切割为所需大小，其中，使样本垫在Tris溶液或者sodiumborate溶液中使Tween20达到1％制备的溶液中进行吸收后，在常温下完全干燥48小时，由此，更易吸收血清、血浆。

在反应膜下部重叠喷射有胶体金结合物的金结合垫(玻璃纤维)，在其下部重叠样本垫。在反应膜上部重叠有吸收垫。

根据用途，将最终的诊断用试验片样本制作为两种。一种为仅检测血清中的肾综合症出血热抗原蛋白质的IgG，另一种仅检测IgM。

检测IgG的诊断用试验片能够检测中期以后的患者，检测IgM的诊断用试验片能够有效使用于初期患者。本发明将2种试验片放入一个塑料盒，由此，能够同时对两种进行诊断(图3)。

【实施例4:试剂盒性能试验】

利用根据所述实施例3制作的试剂盒，进行患者血清与正常血清的效果试验。具体地，按照图7所示的方法放入检测体，放入检测体稀释液后，在15分钟后查看结果。此时，作为对照组，使用未适用所述实施例1及2的蛋白质的试剂盒。

观察结果，在所述实施例3的试剂盒中，IgM、IgG的颜色变化相对明显。并且，在对照组为假阴性的检测体，所述实施例3的试剂盒能够判断为阳性，具有较高的敏感性。由此，所述实施例3试剂盒能够迅速、准确、便捷地诊断肾综合症出血热(图8)。

此外，使用作为其他急性发热疾病的恙虫病患者血清进行交叉试验的结果，对照组试剂盒对于恙虫病患者检测体出现颜色变化，存在交叉反应，相反，所述实施例3的试剂盒未发生反应，相比现有试剂盒，特异性得到提高(图9)。

综上，通过有限的附图对实施例进行了说明，本领域普通技术人员能够基于所述记载进行多种更改与变形。例如，所说明的技术按照与说明的方法不同的顺序执行，和/或所说明的构成要素按照与说明的方法不同的形态进行结合或组合，或者由其他构成要素或者等同物置换或代替，也能得到适当的结果。

因此，其他体现、其他实施例、以及权利要求的等同物均属于本权利要求的范畴。

【序列表自由文字】

序列表

<110> ImmuneMed Incorporation

<120> 包括汉城病毒与普马拉病毒来源的重组核衣壳蛋白及汉坦病毒来源的重组糖蛋白的肾综合症出血热诊断用组合物及包括其的诊断试剂盒

<130> FPC-2016-0145/PCT

<150> KR 10-2016-0178953

<151> 2016-12-26

<150> KR 10-2017-0158651

<151> 2017-11-24

<160> 3

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 357

<212> DNA

<213> 汉城病毒

<400> 1

atggcaacta tggaagaaat ccagagagaa atcagtgctc acgaggggca gcttgtgata 60

gcacgccaga aggtcaagga tgcagaaaaa cagtatgaga aggatcctga tgatttaaat 120

aagagggcac tgcatgatcg ggagagtgtc gcagcttcaa tacaatcaaa aattgatgaa 180

ttgaagcgcc aacttgccga caggattgca gcagggaaga acatcgggca agaccgggat 240

cctacagggg tagagccggg cgatcatctc aaggaaagat cagcattaag ctatgggaat 300

acactggacc tgaatagtct tgacattgat gaacctacag gacagacagc tgattgg 357

<210> 2

<211> 360

<212> DNA

<213> 普马拉病毒

<400> 2

atgagtgact taaaagatat acaggaggac atagcccgcc atgagcaaca acttgttgtt 60

gccagacaaa agctcaggga tgcagaaaag gcagtggaga tggacccaga tgacgttaac 120

aaaaacacac tgcaagcaag gcaacaaaca gtgtcagcat tggaggataa aattgcagac 180

ttcaagagaa gaatggcaga cattgtgtcc cggaaaaaga tggatactaa gcctgctgac 240

ccgactggga ttgagcctga tgaccacctc aaggagagat caagtcttcg atatggaaat 300

gtccttgatg tgaatgccat tgacattgag gaaccaagtg gtcagacagc agactggtga 360

360

<210> 3

<211> 993

<212> DNA

<213> 汉坦病毒

<400> 3

atgcggttaa cagaacagca agtgaatttt gtgtgtcagc gagtggacat ggacattgtt 60

gtgtactgca acgggcagag gaaagtaata ttaacaaaaa ctctagttat tggacagtgt 120

atatatacta taacaagctt attctcatta ctacctggag tagcacattc tattgctgtt 180

gaattgtgtg tacctgggtt ccatggttgg gccacagctg ctctgcttgt tacattctgt 240

ttcggatggg ttcttatacc agcaattaca tttatcatac tagtgggcac aggctgtaca 300

gcatgtggtt tatacctaga tcaactgaaa ccagttggta gtgcttataa aattatcaca 360

ataaggtaca gcaggagagt ctgtgttcag tttggggagg aaaacctttg taagataata 420

gacatgaatg attgttttgt atctaggcat gttaaggtct gcataattgg tacagtatct 480

aaattctctc agggtgatac cttattgttt tttggaccgc ttgaaggtgg tggtctaata 540

tttaaacact ggtgtacatc cacatgtcaa tttggtgacc caggagatat catgagtcca 600

agagacaaag gttttttatg ccctgagttt ccaggtagtt tcaggaagaa atgcaacttt 660

gctactaccc ctatttgtga gtatgatgga aatatggtct caggttacaa gaaagtgatg 720

gcgacaattg attccttcca atcttttaat acaagcacta tgcacttcac tgatgaaagg 780

atagagtgga aagaccctga tggaatgcta agggaccata taaacatttt agtaacgaag 840

gacattgact ttgataacct tggtgaaaat ccttgcaaaa ttggcctaca aacatcttct 900

attgaggggg cctggggttc tggtgtgggg ttcacattaa catgtctggt atcactaaca 960

gaatgtccta cctttttgac ctcaataaag tag 993

Claims (7)

1.一种肾综合症出血热诊断用组合物，包括：

由下列核衣壳蛋白构成的重组蛋白：

由SEQ ID NO:1的碱基序列编码的汉城病毒来源的核衣壳蛋白、及

由SEQ ID NO:2的碱基序列编码的普马拉病毒来源的核衣壳蛋白；以及

由SEQ ID NO:3的碱基序列编码的汉坦病毒来源的重组糖蛋白。

2.根据权利要求1所述的肾综合症出血热诊断用组合物，所述组合物同时检测肾综合症出血热特异性IgM及IgG。

3.根据权利要求1或2所述的肾综合症出血热诊断用组合物，所述汉坦病毒来源的重组糖蛋白包括汉坦病毒的糖蛋白中抗原决定部位的重组。

4.一种肾综合症出血热诊断试剂盒，包括：

试验片，所述试验片包括：

样本垫，供吸收试料；

金结合垫，与试料内的抗体结合；

反应膜，具有包括权利要求1至权利要求3中任一项所述的组合物的反应线与包括对照组组合物的对照线；以及

吸收垫，供吸收残余试料。

5.下列蛋白用于制造肾综合症出血热诊断用组合物的用途：

由下列核衣壳蛋白构成的重组蛋白：

由SEQ ID NO:1的碱基序列编码的汉城病毒来源的核衣壳蛋白、及

由SEQ ID NO:2的碱基序列编码的普马拉病毒来源的核衣壳蛋白；以及

由SEQ ID NO:3的碱基序列编码的汉坦病毒来源的重组糖蛋白。

6.根据权利要求5所述的用途，所述组合物同时检测肾综合症出血热特异性IgM及IgG。

7.根据权利要求5或6所述的用途，所述汉坦病毒来源的重组糖蛋白包括汉坦病毒的糖蛋白中抗原决定部位的重组。

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