WO2016195138A1 - Igm 반정량적 렙토스피라증 진단 키트 - Google Patents

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leptospirosis
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김윤원
이진우
김영진
김승한
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주식회사 이뮨메드
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Definitions

  • the present invention relates to a leptospirosis diagnostic kit consisting of a first kit and a second kit and a method for diagnosing leptospirosis.
  • Leptospirosis is a common infectious disease in humans and animals caused by infection with Leptospira interrogans , a type of Spirillum . It is an acute febrile illness with jaundice and kidney disease, named Weil's disease in 1887 and known as an infectious disease. In 1918, the causative organism was isolated from a patient with Wiles disease, named Spirochaetaicterohaemorrhagiae , and then renamed Leptospira icterohaemorrhagiae .
  • Leptospira belongs to the Leptospiraceae family, and Leptospira genus is classified as Leptospira interrogans and Leptospira biplexa bile flexa bisp .
  • the pathogenic Leptospira interrogans have been classified into 30 serogroups to date and contain about 300 serovars, which are known to have different serotype distributions in different regions.
  • Leptospira interrogans may be present in the tissues of animals infected with leptospira interrogans or live for several weeks if maintained at a temperature of about 20 ° C. Survival in soil or water can infect humans.
  • leptospirosis The symptoms of leptospirosis are acute febrile diseases with typical clinical symptoms such as fever, headache, myalgia, and deprivation at the onset of the onset, and in severe cases, may cause symptoms of internal organ bleeding such as pulmonary hemorrhage, jaundice and kidney failure.
  • the onset mechanism of leptospirosis is that leptospira penetrating through mucous membranes or wounded skin rapidly spreads systemically along the blood vessel and into the tissue, and then leptospira toxin damages the endothelial cells of the vessel. This causes symptoms such as long-term bleeding, lowering of blood volume and hypotension, but it is important to detect antibiotics such as penicillin at the beginning of the onset within 1-2 days and at least 3-4 days after the onset.
  • a method for diagnosing leptospirosis is a microscopic agglutination test (MAT), which is a standard method of the World Health Organization (WHO).
  • MAT has the advantage of being able to make an accurate diagnosis compared to other diagnostic methods.
  • the use of live bacteria has the disadvantage that maintenance and management is cumbersome, expensive equipment is required, and only experienced professionals can test it. Therefore, there is a need for the development of a simple, rapid and accurate method for diagnosing leptospirosis in medical institutions such as health centers and hospitals. Reflecting this, in recent years, a rapid kit applying an immunochromatography assay has been developed.
  • Rapid Kit is a medical device developed to enable rapid and accurate diagnosis of leptospirosis in 15 minutes by applying the point-of-care testing (POCT) concept.
  • POCT point-of-care testing
  • a leptospirosis diagnostic kit is generally developed to be used without substantially distinguishing the epidemic region and the endemic region of leptospirosis.
  • a kit for diagnosing leptospirosis by distinguishing between epidemic regions and endemic regions.
  • a first aspect of the invention consists of a first kit and a second kit, wherein the first kit comprises 1.2 to 2.0 ⁇ g of leptospira antigen, and the second kit comprises 0.6 to 0.9 ⁇ g of leptospira antigen and It includes BSA, wherein the leptospira antigen provides a leptospirosis diagnostic kit, which is a polysaccharide derived from lipopolysaccharide of leptospira.
  • the Ab titer (Ab titer) measured by MAT can be determined from 1: 50 to 1: 200 using the leptospirosis diagnostic kit.
  • the BSA may be 0.1 to 0.4 ⁇ g.
  • the first kit further comprises a gold-conjugate-goat-antihuman IgM antibody of OD 3.5-4.5
  • the second kit is a gold-conjugate-goat-of OD 1.5-2.5. It may further comprise an anti-human IgM antibody.
  • the kit may be a strip type using immunochromatography, a device type using immunochromatography, or a microplate type.
  • the strip type kit may include a nitrocellulose membrane, a conjugate pad, an absorbent pad, and a sample pad.
  • a second aspect of the present invention provides leptospira in a patient's sample using the leptospirosis diagnostic kit to provide information necessary for diagnosing a leptospirosis patient having an Ab titer of 1:50 to 1: 200 as measured by MAT.
  • the patient's sample may be serum, plasma or whole blood.
  • the method may further include comparing whether to detect leptospira IgM antibody in the first kit and whether to detect leptospira IgM antibody in the second kit.
  • the step of detecting the antibody is using an antigen-antibody reaction
  • the antigen-antibody reaction is an enzyme immunoassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), sandwich assay (sandwich assay), One or more methods selected from the group consisting of Western blotting, immunoprecipitation, immunohistochemical staining, flow cytometry, fluorescence activated cell sorting (FACS), enzyme substrate coloring and antigen-antibody aggregation Can be used.
  • a leptospirosis diagnostic kit comprising a first kit and a second kit, and a diagnostic method using the same, can diagnose a leptospirosis patient whose Ab titer (Ab titer) measured by MAT is 1:50 to 1: 200. Therefore, leptospirosis patients can be diagnosed not only in epidemic regions but also in endemic regions.
  • Figure 1 shows a strip type leptospirosis diagnostic kit according to an embodiment of the present invention.
  • the term 'diagnosis' means identifying the presence or characteristic of a pathological condition.
  • the diagnosis is to identify leptospirosis.
  • 'leptospirosis' refers to a disease caused by pathogenic spiral bacteria of the genus Leptospira.
  • epidemic region refers to a region in which a particular epidemic occurs at a certain time.
  • endemic region refers to a region in which a particular infectious disease continues to occur.
  • the leptospirosis diagnostic kit of the present invention comprises a first kit and a second kit, wherein the first kit includes 1.2 to 2.0 ⁇ g of leptospira antigen, and the second kit includes 0.6 to 1.0 ⁇ g of leptospira antigen and BSA, and the leptospira antigen is a polysaccharide derived from lipopolysaccharide of leptospira bacteria.
  • the leptospirosis diagnostic kit of the present invention uses a polysaccharide whose lipid is separated from lipopolysaccharide (LPS) of the genus Leptospira as an antigen.
  • the lipopolysaccharide (LPS) of leptospira is composed of lipid A, core polysaccharide and O-specific side chain. Lipid A and core polysaccharides are linked by 2-keto-3-deoxyoctanic acid (KDO), which consists of glucose, galactose and N-acetylglucosamine. More specifically, a polysaccharide composed of genus-specific O-specific side chains and core polysaccharides from which lipid A has been removed to increase antigen antibody reactivity is used as an antigen (see Example 1).
  • KDO 2-keto-3-deoxyoctanic acid
  • the leptospirosis diagnostic kit of the present invention further goes beyond detecting the presence of an antibody present in a patient, and is a diagnostic kit that allows a certain range of antibody to be selectively developed only when it is instilled in the diagnostic kit.
  • a diagnostic kit is required because the amount of antibodies present in living organisms may vary depending on the epidemic region and the endemic region, and it may be difficult to make an accurate diagnosis using only a diagnostic kit that simply measures the presence or absence of an antibody.
  • the leptospirosis diagnostic kit of the present invention comprises a first kit and a second kit, wherein the first kit comprises 1.2 to 2.0 ⁇ g, preferably 1.4 to 1.8 ⁇ g, most preferably 1.6 ⁇ g of leptospira antigen,
  • the second kit may comprise 0.6 to 0.9 ⁇ g, preferably 0.8 ⁇ g of leptospira antigen.
  • Antigen-antibody reactions in the first and second kits resulted in an IgM cut-off of 50 (MAT Ab titer 1: 50) to an IgM cut-off of 200 (MAT Ab titer 1: 200). Patient can be determined.
  • the second kit may also include BSA or casein. By including BSA or casein, the degree of antigen-antibody response to leptospira can be controlled.
  • the leptospirosis diagnostic kit of the present invention is a kit for diagnosing leptospirosis by measuring the antibody level against leptospirosis in a biological sample.
  • Leptospira acting as an antigen in response to an antibody against leptospirosis to examine antigen-antibody complex formation Polysaccharides derived from the fungus lipopolysaccharide.
  • the amount of BSA or casein included in the second kit of the leptospirosis diagnostic kit of the present invention may be 0.1 to 0.4 ⁇ g.
  • the total amount of the BSA and leptospira antigens included in the second kit is preferably 1 ⁇ g.
  • BSA plays a role in lowering the reactivity of the antigen-antibody specific reaction. If the amount of BSA is greater than 0.4, the second kit may have a low reactivity for the MAT Ab titer of 50 to 200, and if it is less than 0.1, the antigen- There may be a problem that high antibody reactivity may result in false positives. (See Example 2-3)
  • the first kit further comprises a gold-conjugate-goat-antihuman IgM antibody of OD 3.5-4.5
  • the second kit is a gold-conjugate-goat-of OD 1.5-2.5. It may further comprise an anti-human IgM antibody.
  • the gold-conjugate-goat-anti-human IgM antibody of the first kit is included below OD 3.5, color development due to an antigen-antibody reaction may not be well represented, and when included in excess of OD 4.5, cut-off There may be a problem that a sample with a value of MAT Ab titer less than 50 may result in a positive.
  • Immunoassay methods to look at antigen-antibody complex formation include Western blot, enzyme linked immunosorbentassay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), radioimmunodiffusion, Ouchterlony immunodiffusion, rockets (rocket) immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, immunofluorescence, immunochromatography, FACS, etc. It is not.
  • Leptospirosis diagnostic kit of the present invention includes not only the polysaccharide that specifically binds to the antibody but also tools, reagents and the like generally used in the art used for immunological analysis.
  • tools or reagents include, but are not limited to, suitable carriers, labeling materials capable of producing detectable signals, solubilizers, detergents, buffers, stabilizers, and the like.
  • the diagnostic kit of the present invention may be of a type such as, but not limited to, a microplate, a dip-stick device, an immunochromatography test strip, a radiation split immunoassay device, a flow-through device, or the like.
  • Preferred diagnostic kits are strip type diagnostic kits using immunochromatography or diagnostic kits in the form of devices.
  • Diagnosis using immunochromatography involves the reaction of an antibody in serum of a biological sample with a tracer antibody bound to colloidal gold particles, followed by micropores of the nitrocellulose membrane by capillary action. While moving through the micropore, it forms a color band by combining with a capture antigen fixed to the inner surface of the micropores, thereby making it possible to visually distinguish between positive and negative.
  • the "marker antibody” refers to an antibody that reacts with an antibody against leptospira and is associated with color particles.
  • the antigen-antibody complex may use a color particle binding method, and the color particles may be, for example, colloidal gold particles or color glass or plastic (eg, polystyrene, poly) Propylene, latex, etc.) beads can be used. More preferably, gold colloids can be used.
  • the color particles may be, for example, colloidal gold particles or color glass or plastic (eg, polystyrene, poly) Propylene, latex, etc.) beads can be used. More preferably, gold colloids can be used.
  • Figure 1 shows a strip type leptospirosis diagnostic kit according to an embodiment of the present invention.
  • the leptospirosis diagnostic kit of the present invention the sample pad (sample pad) in which the sample is absorbed; A gold conujugation pad comprising a marker antibody that binds to an antibody in the sample; Test membrane is treated with a test line containing a polysaccharide of the present invention, a control line containing a control protein and a pre-test line for removing nonspecific antibodies. ; And an absorption pad on which the remaining amount of the sample is absorbed.
  • the reaction line contains the polysaccharide of the present invention and the control line contains the control protein of rabbit anti-goat IgG.
  • the whole reaction line may include gram-negative bacteria similar in structure to the lipopolysaccharide (LPS) of leptospira of the present invention, for example, lipopolysaccharide (LPS) such as E. coli and Pseudomonas at a concentration of 0.5 to 1 mg / ml.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the gold binding pad may comprise gold-labeled chlorine anti-human IgM.
  • the method for diagnosing leptospirosis is as follows. First, when a biological sample to be tested is dropped on a sample pad, which is a site where a sample of the diagnostic kit is absorbed, the biological sample reaches a gold conjugation pad by capillary action to prevent an antibody in the sample. The marker binds in a gold binding pad, eg, gold-labeled anti-human IgM goat antibody, to form a colloid. At this time, the biological sample to be sampled continues to move without being immobilized on the gold binding pad to reach a test line in which the polysaccharide antigen of the present invention is immobilized.
  • an antigen-antibody reaction with the polysaccharide antigen occurs, i.e., an antibody against leptospira bound to a specific marker antibody in the gold binding pad of the patient is directed to a polysaccharide antigen immobilized on the reaction line.
  • an antibody against leptospira bound to a specific marker antibody in the gold binding pad of the patient is directed to a polysaccharide antigen immobilized on the reaction line.
  • they form a reddish purple band that can be visually observed.
  • the marker antibody in the remaining gold binding pads that did not react with the antibody in the biological sample reached the control line and reacted with the control protein to form a red purple band, indicating the suitability of the test.
  • the diagnostic kit of the present invention can quickly check the test result with the naked eye without special equipment by using the immunochromatography method by the antigen-antibody reaction.
  • the diagnostic kit improves the accuracy of the diagnosis of leptospirosis by eliminating the possibility that the diagnostic kit may be mistaken as having the antibody against the leptospira by the pretest line.
  • biological samples from which antibodies against leptospira may be detected include, but are not limited to, blood, serum, plasma, and the like.
  • EMJH Leptospira medium base Ellinghausen McCullough Hohnson Harris
  • sterilization was carried out, and medium was prepared by adding 10ml of leptospira enrichment EMJH.
  • the medium was inoculated with leptospira and shaken for 5 days at 24 ° C.
  • the cells were incubated in EMJH medium for 5 days at 4080xg for 20 minutes, and the cells were washed three times with 1X PBS buffer (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na 2 HPO 4 , 2mM KH 2 PO 4 ) and then 100 ° C. Heated at for 1 h. Proteasease K was treated to be 150 ⁇ g / ml and reacted overnight at 37 ° C. Thereafter, EGTA was added to 2 mM and reacted at 70 ° C. for 15 minutes, followed by centrifugation at 4 ° C. and 180,000 ⁇ g for 2 hours.
  • 1X PBS buffer 137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na 2 HPO 4 , 2mM KH 2 PO 4
  • LPS antigen was treated with acetic acid at 1%, warmed at 100 ° C. for 1 hour, and then centrifuged at 2980 ⁇ g for 20 minutes, and lipid A (lipid A) was removed to prepare a polysaccharide antigen.
  • the amount of the prepared antigen was measured using polysaccharides obtained by treating LPS (Sigma) purified from Escherichia coli in the same manner as the above method as a standard.
  • a plastic backing NC membrane is used as the base skeleton to fix the antigen in the middle, and a glass fiber membrane (conjugate pad) where polymer is accumulated is attached to the bottom, and a cellulose membrane that absorbs excess aqueous solution is applied at both ends (sample pad, absorption). Pads) to be in contact with each other.
  • the glass fiber membrane located at the bottom can absorb the sample in a short time due to its high absorption ability, and can induce an efficient reaction between the analyte and the polymer by prolonging the retention time before the dissolved polymer is transferred to the upper immune strip.
  • the analyte measurement antigen (test line or capture line) and the specific antibody (control line) that can detect the polymer were spatially separated and immobilized.
  • Cellulose membranes which are absorbent pads located, allow the excess sample to be absorbed quickly.
  • Immobilization of specific antigens was performed by electrostatic interaction on nitrocellulose (NC) membranes.
  • the purified antigen polysaccharide
  • the control antibody rabbit anti-goat IgG
  • the deposited membrane was dried at 37 ° C. for 1 hour.
  • Antigen and gold-conjugated concentrations of the conventional leptospirosis diagnostic kits were merely used to detect the presence or absence of antibodies, and thus only the color development due to the antigen-antibody reaction could be used.
  • kits were prepared in each case with the concentrations of antigens in the kits being 0.2 ⁇ g, 0.4 ⁇ g and 0.8 ⁇ g per kit and the Gold-Conjugate OD 1, 2, 3, 4.
  • Antibodies used were standard IgM, showing titers 160, 320 and 640, respectively.
  • Table 1 shows the kit response according to antigen concentration and Gold-Conjugate OD.
  • the gold-conjugate OD value in the kit was set to 2, and 10 kits each having an antigen concentration of 0.2 ⁇ g, 0.4 ⁇ g and 0.8 ⁇ g were prepared. Each kit was tested for the reaction of the kit using 10 antibodies with IgM titers of 160, 320, 640. The antibodies used were as follows.
  • Titer 160 99-7, 00-224, 01-224, 87-109, 88-123
  • Tables 2 to 4 show kit reactions according to the concentrations of antigens and antibodies.
  • BSA was added to the antigens in the kit to make the total amount instilled at 1 ⁇ g per kit.
  • Each kit contained 0.1 ⁇ g antigen + 0.9 ⁇ g BSA, 0.2 ⁇ g antigen + 0.8 ⁇ g BSA, 0.4 ⁇ g antigen + 0.6 ⁇ g BSA, 0.6 ⁇ g antigen + 0.4 ⁇ g BSA, 0.8 ⁇ g antigen + 0.2 ⁇ g BSA, respectively.
  • Each kit was tested for the reaction of the kit using 10 antibodies with IgM titers of 160, 320, 640. The antibodies used were as follows.
  • Titer 160 99-7, 00-224, 01-224, 87-109, 88-123
  • Tables 5 to 9 show kit reactions according to the concentrations of antigen and BSA.
  • BSA makes it easier to determine the degree of color development depending on the amount of antibody.
  • IgM antibody titer 160 and IgM antibody titer 320 were preferred for discrimination.
  • kits each containing 0.8 ⁇ g, 1.6 ⁇ g, or 3.2 ⁇ g of antigen per kit were prepared and three experiments (four per time) were performed.
  • the degree of color development according to the reaction in the kit was the best without noise.
  • the concentration of human serum used in the kit can also induce a nonspecific response when in excess or in small amounts, as with antigens or gold conjugates in the kit. Therefore, if the sample used in the diagnostic kit is serum or plasma, take 3 ⁇ l and dilute about 100-fold with 300 ⁇ l of sample diluent, and for whole blood, take 6 ⁇ l and use about 300 ⁇ l of diluent. It is preferable to use 50-fold dilution. Take 300 ⁇ l of this diluted sample into the sample injection section with a micropipette. Alternatively, 3 ⁇ l of serum or plasma, and 6 ⁇ l of whole blood, are injected into the sample pad at the bottom of the sample injector, and 7 drops of sample diluent is immediately injected into the sample injector. .

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Abstract

본 발명은, 제1 키트 및 제2 키트로 구성된, 렙토스피라증 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 유행 지역(epidemic region) 뿐만 아니라 풍토 지역(endemic region)에서도 렙토스피라증 환자를 구별하여 진단할 수 있다.

Description

IGM 반정량적 렙토스피라증 진단 키트
본 발명은 제1 키트 및 제2 키트로 구성된 렙토스피라증 진단 키트 및 렙토스피라증 진단 방법에 관한 것이다.
렙토스피라증은 나선균(Spirillum)의 일종인 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)의 감염으로 발병되는 사람과 동물의 공통 감염병이다. 이는 황달과 신질환을 동반한 급성 열성질환으로서 와일스병(Weil's disease)으로 1887년에 명명되었으며 감염성 질환으로 알려졌다. 1918년에, 와일스병 환자로부터 원인균을 분리하여 스피로게타 익테로헤모레지아(Spirochaetaicterohaemorrhagiae)로 명명하였고, 그런 다음에 렙토스피라 익테로헤모레지아(Leptospira icterohaemorrhagiae)로 개칭되었다. 분류학상, 렙토스피라(Leptospira)는 렙토스피라세어과(Leptospiraceae family)에 속하며, 렙토스피라 속(Leptospira genus)은 병원성 유무에 따라 렙토스피라 인테로간스(Leptospira interrogans)와 렙토스피라 비프렉사(Leptospira biflexa)로 분류된다. 병원성이 있는 렙토스피라 인테로간스는 현재까지 30개의 혈청군(serogroup)으로 분류되어, 약 300여개의 혈청형(serovar)을 포함하고 있는 것으로 알려졌으며, 이들은 지역에 따라 혈청형 분포가 다른 것으로 알려져 있다. 렙토스피라 인테로간스는, 렙토스피라 인테로간스에 감염된 동물의 조직 내에 존재하거나, 또는 동물의 배설물을 통하여 배출되더라도 약 20 ℃의 온도가 유지되면 수 주 동안 살아있을 수 있으므로, 배설물을 통하여 배출된 균이 토양 또는 물에서 생존하다가 인간을 감염시킬 수 있다. 따라서, 인간은 주로 감염된 동물의 조직을 다루거나 감염된 동물에 물리거나, 또는 렙토스피라 인테로간스로 오염된 음식 또는 물을 통하여 감염될 수 있다. 주로, 렙토스피라증은 유럽, 미주, 호주, 베트남, 태국, 말레이시아, 대만, 중국, 일본 등에서 발생하는 것으로 알려져 있다. 한국에는 1942년 혈청학적으로 증명된 렙토스피라증 환자의 발생이 보고되었고, 1984년에 폐출혈 환자로부터 렙토스피라균이 분리되어 확인되었다. 이후 한국에는 쯔쯔가무시병, 신후출혈열, 발진열과 함께 제3군 법정 감염병으로 지정되어 있다.
렙토스피라증의 증상은, 발병 초기에는 발열, 두통, 근육통, 허탈감 등의 전형적인 임상증상을 나타내는 급성 열성질환이며, 심한 경우에는 폐출혈과 같은 내부 장기 출혈, 황달, 신부전증의 증세까지 유발할 수 있다. 렙토스피라증의 발병 메커니즘은 점막 또는 상처난 피부를 통해 침투한 렙토스피라가 혈관을 따라 급속하게 전신으로 퍼지면서 조직 내로 침투하고, 이어서 렙토스피라균 독소가 혈관의 내피세포를 손상시킨다. 이는 장기 출혈, 혈액량의 저하, 저혈압 등의 증상을 일으키지만, 발병 초기에는 페니실린과 같은 항생제를 처방할 수 있으므로 발병으로부터 1 내지 2일, 늦어도 3 내지 4일 내에 발견하는 것이 중요하다.
렙토스피라증을 진단하기 위한 방법으로 WHO (World Health Organization) 표준방법인 MAT (microscopic agglutination test)가 있다. MAT는 다른 진단 방법에 비하여 정확한 진단을 할 수 있다는 장점이 있다. 하지만 살아있는 균을 이용하기 때문에 유지 및 관리가 번거롭고, 고가의 장비가 필요하며, 숙련된 전문가만이 시험 가능하다는 단점이 있다. 그러므로 보건소 및 병원 같은 의료기관에서 간단하고 신속하면서 정확하게 렙토스피라증을 진단할 수 있는 방법의 개발이 요구된다. 이를 반영하여 근래에는 면역크로마토그래피법(immunochromatography assay)을 적용한 래피드(rapid) 키트가 개발되었다. 래피드 키트는 현장진단 POCT (point-of-care testing) 개념이 적용된 것으로써, 렙토스피라증을 15분안에 신속하고 정확하게 진단할 수 있게 개발된 의료기기이다. 그러나 이러한 렙토스피라증 진단 키트는 실질적으로 렙토스피라증의 유행 지역(epidemic region)과 풍토 지역(endemic region)을 구분하지 않고 사용되도록 개발되어 있는 것이 일반적이다. 하지만, 렙토스피라증 풍토 지역(endemic region)에서 키트를 사용하여 환자를 진단하는 경우, 과거에 감염된 환자 또는 불현감염(inapparent infection)을 갖는 환자에 존재하는 항체로 인하여 이들이 렙토스피라증 환자로 진단될 수 있다는 문제점이 있다. 따라서, 유행 지역(epidemic region)과 풍토 지역(endemic region)을 구분하여 렙토스피라증을 진단할 수 있는 키트의 개발이 필요하였다.
본 발명의 목적은, 렙토스피라증 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법을 제공하는 것으로, 보다 구체적으로는, 제1 키트 및 제2 키트로 구성되는, 렙토스피라증 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 제1 측면은, 제1 키트 및 제2 키트로 구성되며, 상기 제1 키트는 1.2 내지 2.0 ㎍의 렙토스피라균 항원을 포함하고, 상기 제2 키트는 0.6 내지 0.9 ㎍의 렙토스피라균 항원 및 BSA를 포함하며, 상기 렙토스피라균 항원은 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 다당류인, 렙토스피라증 진단 키트를 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 렙토스피라증 진단 키트를 사용하여 MAT로 측정되는 Ab 역가(Ab titer)가 1: 50 내지 1: 200를 판별할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 BSA는 0.1 내지 0.4 ㎍ 일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 키트는 OD 3.5 내지 4.5의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체를 더 포함하고, 및 상기 제2 키트는 OD 1.5 내지 2.5의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입, 면역크로마토그래피법을 이용한 디바이스 타입 또는 마이크로플레이트 타입일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 스트립 타입의 키트는 니트로셀룰로즈 멤브레인, 컨쥬게이트패드, 흡수패드 및 샘플패드를 포함할 수 있다.
본 발명의 제2 측면은, MAT로 측정되는 Ab 역가(Ab titer)가 1: 50 내지 1: 200인 렙토스피라증 환자 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 렙토스피라증 진단 키트를 사용하여 환자의 시료 내 렙토스피라 IgM 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 렙토스피라증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
일 실시예에 따르면, 상기 환자의 시료는 혈청, 혈장 또는 전혈일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 제1 키트 내 렙토스피라 IgM 항체 검출여부와 상기 제2 키트 내 렙토스피라 IgM 항체 검출여부를 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 상기 항체를 검출하는 단계는 항원-항체 반응을 이용하는 것이며, 상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에 따른, 제1 키트 및 제2 키트로 구성된, 렙토스피라증 진단 키트 및 이를 이용한 진단 방법은, MAT로 측정되는 Ab 역가(Ab titer)가 1: 50 내지 1: 200인 렙토스피라증 환자를 진단할 수 있으므로, 유행 지역(epidemic region) 뿐만 아니라 풍토 지역(endemic region)에서도 렙토스피라증 환자를 진단할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립 타입의 렙토스피라증 진단 키트를 나타낸 것이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에서 사용된 용어, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 목적상, 진단은 렙토스피라증을 확인하는 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, '렙토스피라증'은 렙토스피라(Leptospira) 속의 병인성나선균이 일으키는 질환을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어, 유행 지역(epidemic region)은, 어느 시기에 특정 전염병이 집중적으로 발생하는 지역을 말한다.
본 발명에서 사용된 용어, 풍토 지역(endemic region)은, 지속적으로 특정 전염병이 발생하는 지역을 말한다.
본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는, 제1 키트 및 제2 키트로 구성되며, 상기 제1 키트는 1.2 내지 2.0 ㎍의 렙토스피라균 항원을 포함하고, 상기 제2 키트는 0.6 내지 1.0 ㎍의 렙토스피라균 항원 및 BSA를 포함하며, 상기 렙토스피라균 항원은, 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 다당류이다.
렙토스피라균에 대한 항체를 검출하기 위하여, 본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는 렙토스피라 속의 지질다당류(LPS)에서 지질이 분리된 다당류(polysaccharide)를 항원으로 이용한다. 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)는 지질A(lipid A), 핵심 다당류(core polysaccharide) 및 O-특이적 곁사슬(O-specific side chain)으로 구성된다. 지질 A와 핵심 다당류는 2-케토-3-디옥시옥탄산(2-keto-3-deoxyoctanic acid, KDO)으로 연결되어 있으며, 핵심 다당류는 글루코스, 갈락토스 및 N-아세틸글루코사민으로 구성되어 있다. 보다 구체적으로는, 항원 항체 반응성을 증가시키기 위해 지질 A를 제거한, 속(genus) 특이적인 O-특이적 곁사슬 및 핵심다당류로 구성된 다당류를 항원으로 이용한다(실시예 1 참조).
종래에 사용된 렙토스피라증 진단 키트의 항원 및 골드-컨쥬게이트 농도는 단순히 항체의 존재 유무를 검출하기 위한 목적이었으므로, 항원-항체 반응으로 인한 발색의 유무만 판별 가능하도록 항체의 양을 임의로 선정하여 사용되었다. 하지만, 본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는, 환자 내 존재하는 항체의 유무를 검출하는 것에서 더 나아가, 어느 정도 범위의 항체 양이 진단 키트에 점적될 때만 선택적으로 발색되도록 하는 진단 키트이다. 이러한 진단 키트가 필요한 것은, 유행 지역과 풍토 지역에 따라 생명체에 존재하는 항체의 양이 상이할 수 있기 때문이며, 단순하게 항체의 유무를 측정하는 진단 키트만으로는 정확한 진단을 하기 어려울 수 있다.
본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는, 제1 키트 및 제2 키트로 구성되며, 제1 키트는 1.2 내지 2.0 ㎍, 바람직하게는 1.4 내지 1.8 ㎍, 가장 바람직하게는 1.6 ㎍ 의 렙토스피라균 항원을 포함하고, 상기 제2 키트는 0.6 내지 0.9 ㎍, 바람직하게는 0.8 ㎍ 의 렙토스피라균 항원을 포함할 수 있다. 상기 제1 키트 및 제2 키트에서의 항원-항체 반응을 통하여 IgM 컷오프 (cut-off)가 50 (MAT Ab titer 1 : 50) 내지 IgM 컷오프 (cut-off)가 200 (MAT Ab titer 1 : 200)인 환자를 판별할 수 있다. 또한 제2 키트는 BSA 또는 카제인을 포함할 수 있다. BSA 또는 카제인을 포함함으로써, 렙토스피라균에 대한 항원-항체 반응의 정도를 조절할 수 있다.
본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는, 생물학적 시료에서 렙토스피라균에 대한 항체 수준을 측정하여 렙토스피라증을 진단하기 위한 키트로, 항원-항체 복합체 형성을 살펴보기 위하여 렙토스피라균에 대한 항체에 반응하는 항원으로 작용하는 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 다당류를 포함한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 렙토스피라증 진단 키트의 제2 키트에 포함되는 BSA 또는 카제인의 양은 0.1 내지 0.4 ㎍ 일 수 있다. BSA를 포함하는 경우, 상기 제2 키트에 포함되는 BSA 및 렙토스피라균 항원의 양은 총 합이 1 ㎍ 인 것이 바람직하다. BSA는 항원-항체의 특이반응의 반응성을 낮추는 역할을 수행하는 것으로서, BSA의 양이 0.4 초과이면 MAT Ab 역가가 50 내지 200 인 것에 대하여 제2 키트의 반응도가 떨어질 수 있으며, 0.1 미만이면 항원-항체 반응성이 높아져서 위양성을 초래할 수 있다는 문제점이 있을 수 있다. (실시예 2-3 참조)
일 실시예에 따르면, 상기 제1 키트는 OD 3.5 내지 4.5의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체를 더 포함하고, 및 상기 제2 키트는 OD 1.5 내지 2.5의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 키트의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체가 OD 3.5 미만으로 포함되는 경우에는 항원-항체 반응으로 인한 발색이 잘 나타나지 않을 수 있으며, OD 4.5 초과로 포함되는 경우에는 컷-오프 값인 MAT Ab 역가 50의 미만 검체에서 양성을 초래할 수 있다는 문제점이 있을 수 있다. 또한 상기 제2 키트의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체가 OD 1.5 미만으로 포함되는 경우에는 항원-항체 반응으로 인한 발색이 잘 나타나지 않을 수 있으며, OD 2.5 초과로 포함되는 경우에는 컷-오프 값인 MAT Ab 역가 200의 미만 검체에서 양성을 초래할 수 있다는 문제점이 있을 수 있다(실시예 2-3참조).
항원-항체 복합체 형성을 살펴보는 면역 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbentassay), 방사선면역분석(RIA: radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complement Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence), 면역크로마토그래피법(immunochromatography), FACS 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 렙토스피라증 진단용 키트는 항체와 특이적으로 결합하는 상기 다당류뿐만 아니라 면역학적 분석에 사용되는 해당 분야에서 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다. 이러한 도구 또는 시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제, 완충제, 안정화제 등을 포함하나 이로 제한하지 않는다. 또한 본 발명의 진단용 키트는 이에 한정되는 것은 아니나 마이크로 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사 분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등의 타입일 수 있다.
바람직한 진단 키트는 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입의 진단 키트 또는 디바이스 형태의 진단 키트이다. 면역크로마토그래피법을 이용한 진단은, 생물학적 시료의 혈청 중에 들어 있는 항체가 콜로이드성 금입자(colloidal gold particle)에 결합된 표식자 항체(tracer antibody)와 반응한 다음, 모세관 현상에 의해 니트로셀룰로즈 막의 미세구멍(micropore)을 통하여 이동하는 도중에 미세구멍의 내부 표면에 고정되어 있는 포획 항원(capture antigen)과 결합하여 발색띠를 형성함으로써, 양성 및 음성을 육안으로 판별 가능하도록 한다. 상기 "표식자 항체"는 렙토스피라균에 대한 항체와 반응하며 색채입자와 결합되어 있는 항체를 말한다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는, 항원-항체 복합체는 색채입자결합법을 이용할 수 있으며, 색채입자로는 예를 들어 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예, 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 골드 콜로이드를 이용할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른 스트립 타입의 렙토스피라증 진단 키트를 나타낸 것이다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 렙토스피라증 진단 키트는, 시료가 흡수되는 샘플패드(sample pad); 시료 내의 항체와 결합하는 표식자 항체를 포함하는 금 결합 패드(gold conujugation pad); 본 발명의 다당류를 포함하는 반응선(test line)과 대조군 단백질을 포함하는 대조선(control line) 및 비특이적 항체를 제거하기 위한 전반응선(pre-test line)이 처리되어 있는 반응막(test membrane); 및 잔량의 시료가 흡수되는 흡수패드(absorption pad)를 포함하는 테스트 스트립으로 구성될 수 있다. 상기 반응선은 본 발명의 다당류를 포함하고 있으며, 상기 대조선은 토끼 항-염소 IgG의 대조군 단백질을 포함하고 있다. 또한 전반응선은 본 발명의 렙토스피라균의 지질다당류(LPS)와 구조가 유사한 그람 음성 세균, 예를 들어 E. coli, 슈도모나스 등의 지질다당류(LPS)를 0.5내지 1mg/ml의 농도로 포함할 수 있다. 상기 금 결합 패드는 골드-라벨된 염소 항-인간 IgM을 포함할 수 있다.
일 실시예에 따라, 본 발명의 렙토스피라증 진단 키트가, 면역크로마토그래피법을 이용한 스트립 타입의 진단 키트인 경우, 렙토스피라증을 진단하는 방법은 다음과 같다. 먼저, 검사하고자 하는 생물학적 시료를 상기 진단 키트의 시료가 흡수되는 부위인 샘플패드 (sample pad)에 점적하면, 생물학적 시료는 모세관 현상에 의해 금 결합 패드(gold conjugation pad)에 도달하여 시료 내의 항체가 금 결합 패드 내의 표식자 항체, 예를 들어 골드-라벨된 항 인간 IgM 염소 항체(gold labeled anti-human IgM goat antibody) 에 결합하여 콜로이드를 형성하게 된다. 이때, 검체하고자 하는 생물학적 시료는 상기 금 결합 패드에 고정화되지 않고 계속 이동하여 본 발명의 다당류 항원이 고정화되어 있는 반응선(test line)에 도달하게 된다. 렙토스피라균에 감염된 환자의 생물학적 시료인 경우에는 상기 다당류 항원과 항원-항체 반응을 일으키게 되는데, 즉 환자의 금 결합 패드 내의 특정 표식자 항체에 결합된 렙토스피라균에 대한 항체는 반응선에 고정된 다당류 항원에 결합하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 육안으로 관찰할 수 있게 된다. 그리고, 생물학적 시료 내 항체와 반응하지 않은 나머지 금 결합 패드 내의 표식자 항체는 대조선에 도달하여 대조군 단백질과 반응하여 붉은 보라색 밴드를 형성함으로써 검사의 적합성을 나타내게 된다. 이와 같이 본 발명의 상기 진단 키트는 항원-항체 반응에 의한 면역크로마토그래피 방법을 이용함으로써 특별한 장비 없이 육안으로 검사결과를 빠르게 확인할 수 있다. 또한, 상기 진단키트는 전반응선(pretest line)에 의해 실제로 렙토스피라균에 대한 항체를 보유하고 있지 않음에도 보유하고 있는 것으로 오판될 수 있는 가능성을 제거함으로써 렙토스피라증 진단의 정확성이 향상된다.
일 실시예에 따르면, 렙토스피라균에 대한 항체가 검출될 수 있는 생물학적 시료는 혈액, 혈청, 혈장 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
실시예 1 : 렙토스피라균 유래 다당류 항원 제조
1-1. 렙토스피라 균주 배양
EMJH(Leptospira medium base Ellinghausen McCullough Hohnson Harris)를 0.23g/100ml로 녹여 멸균한 후, leptospira enrichment EMJH 10ml을 첨가하여 배지를 만들었다. 이 배지에 렙토스피라균을 접종하여 24℃에서 5일간 진탕 배양하였다.
1-2. 렙토스피라 항원 제조
EMJH 배지에서 5일간 배양한 렙토스피라균을 4080xg에서 20분간 원심분리하여 균체를 1X PBS buffer (137mM NaCl, 2.7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2mM KH2PO4)로 3회 세척한 후 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 여기에 단백분해효소(Proteinase) K가 150㎍/㎖이 되도록 처리하여 37℃에서 overnight동안 반응 시켰다. 그 후 EGTA가 2mM이 되도록 첨가하여 70 ℃에서 15분간 반응 시킨 후, 4℃, 180,000xg로 2시간 동안 원심분리하였다. 침전물에H2O를 가하여 부유시켜 지질다당류(lipopolysaccharide)를 제조하였다 (Westpha & Jann, 1965). 이렇게 정제된 LPS 항원에 아세트산이 1% 되도록 처리하여 100℃에서 1시간 동안 가온한 후 2980xg로 20분간 원심 분리하고 침전 부분인 지질 A(lipid A)를 제거하여 다당류 항원을 제조하였다. 제조된 항원은 에스케리시아 콜리(Escherichia coli)에서 정제된 LPS(Sigma)를 위 방법과 동일하게 처리하여 얻은 다당류를 대조군(standard)으로 사용하여 양을 측정하였다.
실시예 2 : 진단 키트 제작
플라스틱 백킹(backing)된 NC 막을 기본골격으로 중간에 항원을 고정하고 중합체가 축적된 유리섬유막(컨쥬게이트 패드)을 하부에 붙이고, 과량의 수용액을 흡수하는 셀룰로즈 막을 양쪽 끝부분에 (샘플패드, 흡수 패드) 접촉되게 붙여서 상호간에 연결된 형태로 구성된다. 하단에 위치한 유리섬유막은 흡수력이 높아 단시간 내에 시료를 흡수할 수 있을 뿐만 아니라, 용해된 중합체가 상부의 면역 스트립으로 이동되기 전에 정체시간을 연장시킴으로써 분석물질과 중합체간의 효율적인 반응을 유도할 수 있다. 중간의 면역 스트립상에는 분석물질 측정항원(테스트 라인 또는 고정 라인(capture line))과 중합체를 감지할 수 있는 특이항체(대조라인(control line))를 공간적으로 분리하여 고정화시켰으며, 면역 스트립 상단에 위치한 흡수패드(absorbent pad)인 셀룰로즈 막은 과량의 시료가 신속히 흡수될 수 있도록 하였다.
2-1. 니트로셀룰로즈 막상에 렙토스피라 항원(polysaccharide) 고정화
분석 특이항체를 포획하는 역할을 하는 특이 항원의 고정화는 니트로셀룰로즈(NC) 막상에서 정전기 상호작용(electrostatic interaction)에 의해 수행하였다. 정제된 항원(polysaccharide)을 플라스틱 백킹된 NC 막 스트립 4 X 25mm)의 하단으로부터 1cm 떨어진 부분에, 대조군 항체(rabbit anti-goat IgG)는 1.4cm 떨어진 위치에 디스펜서(dispenser)를 사용하여 1ul/cm의 속도로 점적하였다. 점적된 막은 37℃에서 1시간 동안 건조시켰다.
2-2. 전반응선(pre-test line)에 사용할 항원 결정
항원(polysaccharide)에 의한 비특이적 시그널이 발생할 시, 비특이항체를 제거하기 위해 항원 점적위치 앞쪽에 전반응선(pretest line)을 점적함으로써 제거할 수 있었다. 렙토스피라 LPS와 일부 유사한 다른 세균 (E. coli, Psudomonasaeruginosa)의 LPS를 사용하였다.
2-3. 항원 농도와 골드-컨쥬게이트 농도
종래에 사용된 렙토스피라증 진단키트의 항원 및 골드-컨쥬게이트 농도는 단순히 항체의 존재 유무를 검출하기 위한 목적이었으므로, 항원-항체 반응으로 인한 발색의 유무만 판별 가능하여 사용되었다. 하지만, 항체의 유무를 측정하는 것에서 더 나아가, 어느 정도 범위의 항체 양이 진단 키트에 점적될 때만 선택적으로 발색되도록 하는 항원 및 골드-컨쥬게이트 농도를 결정하는 것이 중요하다. 이는, 앞서 언급한 바 있듯이, 유행 지역과 풍토 지역에 따라 생명체에 존재하는 항체의 양이 상이할 수 있기 때문에 단순하게 항체의 유무만으로는 정확한 진단을 하기 어렵기 때문이다.
(1) 항원 농도와 골드 컨쥬게이트 농도
키트 내 점적되는 항원의 농도를 키트 당 0.2 ㎍, 0.4 ㎍, 0.8㎍ 로 하고, 골드-컨쥬게이트 OD를 1, 2, 3, 4 로 하여 각각의 경우에 있어서 키트를 9개씩 제조하였다. 사용된 항체는 표준 IgM으로, 각각 역가 160, 320, 640을 나타내는 것을 사용하였다.
표 1은, 항원 농도 및 골드-컨쥬게이트 OD에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.
IgM 160 IgM 320 IgM 640
Gold OD 0.2 0.4 0.8 0.2 0.4 0.8 0.2 0.4 0.8
1 - - - - - - - W+ W+
2 - - W+ W+ W+ W+ W+ W+ +
3 W+ W+ W+ + + + W+ + +
4 W+ W+ W+ + + + + + +
표 1에서 알 수 있듯이, 항원 농도 및 골드-컨쥬게이션의 OD에 따라 검출 가능한 항체의 양이 달랐으며, 특히 골드-컨쥬게이션 OD 값이 2인 경우에 항원 및 항체의 양에 따라 유의적인 결과를 얻을 수 있었다.
(2) 제2 키트 항원 농도
키트 내 골드-컨쥬게이트 OD 값은 2로 하고, 항원의 농도는 키트당 0.2 ㎍, 0.4 ㎍, 0.8㎍로 하는 키트를 각각 10개씩 제조하였다. 각각의 키트에 IgM 역가가 160, 320, 640을 나타내는 항체 10개를 사용하여 키트의 반응을 테스트 하였다. 사용된 항체는 다음과 같다.
- 역가 160: 99-7, 00-224, 01-224, 87-109, 88-123
- 역가 320 : 90-226, 95
- 역가 640 : 99-4, 00-100, 91-188
표 2 내지 4 는, 항원 및 항체의 농도에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.
0.2 ㎍/kit
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 W+ 90-226 W+ 99-4 W+
00-224 W+ 95 + 00-100 +
01-224 W+ 91-188 +
87-109 -
88-123 -
0.4 ㎍/kit
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 W+ 90-226 W+ 99-4 +
00-224 W+ 95 + 00-100 +
01-224 W+ 91-188 +
87-109 -
88-123 -
0.8 ㎍/kit
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 + 90-226 + 99-4 +
00-224 + 95 + 00-100 +
01-224 + 91-188 +
87-109 -
88-123 -
골드-컨쥬게이트 OD 값을 2로 고정하고, 항원의 양과 항체의 양에 따른 발색 정도를 테스트한 결과, 항원의 양이 0.4 ㎍ 이하로 점적되는 경우, 발색의 정도가 낮게 나오거나 항체의 양에 따른 구별이 용이하지 않다는 문제가 있었다.
(3) BSA농도
키트 내 점적되는 항원에 BSA를 첨가하여, 점적되는 총량이 키트당 1 ㎍가 되도록 제조하였다. 각 키트는 0.1 ㎍ 항원 + 0.9 ㎍ BSA, 0.2 ㎍ 항원 + 0.8 ㎍ BSA, 0.4 ㎍ 항원 + 0.6 ㎍ BSA, 0.6 ㎍ 항원 + 0.4 ㎍ BSA, 0.8 ㎍ 항원 + 0.2 ㎍ BSA 가 각각 포함되었다. 각각의 키트에 IgM 역가가 160, 320, 640을 나타내는 항체 10개를 사용하여 키트의 반응을 테스트 하였다. 사용된 항체는 다음과 같다.
- 역가 160: 99-7, 00-224, 01-224, 87-109, 88-123
- 역가 320 : 90-226, 95
- 역가 640 : 99-4, 00-100, 91-188
표 5 내지 9 는, 항원 및 BSA의 농도에 따른 키트 반응을 나타낸 것이다.
0.1 ㎍ 항원 + 0.9 ㎍ BSA
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 - 90-226 - 99-4 -
00-224 - 95 W+ 00-100 W+
01-224 - 91-188 +
87-109 -
88-123 -
0.2 ㎍ 항원 + 0.8 ㎍ BSA
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 - 90-226 - 99-4 -
00-224 - 95 W+ 00-100 W+
01-224 - 91-188 +
87-109 -
88-123 -
0.4 ㎍ 항원 + 0.6 ㎍ BSA
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 - 90-226 - 99-4 -
00-224 - 95 + 00-100 +
01-224 - 91-188 +
87-109 -
88-123 -
0.6 ㎍ 항원 + 0.4 ㎍ BSA
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 - 90-226 W+ 99-4 W+
00-224 - 95 + 00-100 +
01-224 - 91-188 +
87-109 -
88-123 -
0.8 ㎍ 항원 + 0.2 ㎍ BSA
OD 2 IgM 160 IgM 320 IgM 640
99-7 W+ 90-226 W+ 99-4 W+
00-224 W+ 95 + 00-100 +
01-224 W+ 91-188 +
87-109 -
88-123 -
BSA를 첨가함으로서 항체의 양에 따른 발색의 정도 판별이 더 용이해졌다. 또한, 0.6 ㎍ 항원 + 0.4 ㎍ BSA 및 0.8 ㎍ 항원 + 0.2 ㎍ BSA 인 경우, IgM 항체 역가 160과 IgM 항체 역가 320을 판별하기에 바람직하였다.
(4) 제1 키트 항원 농도
키트당 항원의 농도를 0.8 ㎍, 1.6 ㎍, 또는 3.2 ㎍로 포함하는 키트를 각각 12개씩 제조하고, 3회 (회당 4개씩)에 걸쳐 실험을 수행하였다.
항원의 농도가 1.6 ㎍ 인 경우, 키트 내 반응에 따른 발색의 정도가 가장 노이즈 없이 좋게 나타났다.
2-4. 검체의 농도
키트에 사용되는 사람 혈청의 농도 또한, 키트 내 항원이나 골드 컨쥬게이트와 마찬가지로 과량 또는 소량인 경우 비특이적 반응을 유도할 수 있다. 따라서, 진단 키트에 사용되는 검체가 혈청이나 혈장인 경우에는, 3 ㎕를 취하여 희석액(Sa mple diluent) 300 ㎕로 약 100배 희석하여 사용하며, 전혈인 경우에는 6 ㎕를 취하여 희석액 300 ㎕로 약 50배 희석하여 사용하는 것이 바람직하다. 마이크로피펫으로 이 희석된 검체 300 ㎕를 취하여 검체주입부에 주입한다. 또는, 혈청이나 혈장인 경우 3 ㎕, 전혈인 경우에는 6 ㎕를 마이크로피펫으로 취하여 검체주입부 바닥의 샘플패드에 흡수되도록 주입하고, 즉시 희석액(Sample diluent)을 7방울을 검체주입부에 주입한다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.

Claims (8)

  1. 제1 키트 및 제2 키트로 구성되며,
    상기 제1 키트는 1.2 ㎍ 내지 2.0 ㎍ 의 렙토스피라균 항원을 포함하고,
    상기 제2 키트는 0.6 ㎍ 내지 0.9 ㎍ 의 렙토스피라균 항원 및 BSA를 포함하며,
    상기 렙토스피라균 항원은, 렙토스피라균의 지질다당류로부터 유래한 다당류인, 렙토스피라증 진단 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    유행 지역 또는 풍토 지역에 따른 렙토스피라증을 구별하기 위한, 렙토스피라증 진단 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    MAT로 측정되는 Ab 역가(Ab titer)가 1: 50 내지 1: 200을 판별할 수 있는, 렙토스피라증 진단 키트.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 BSA는 0.1 내지 0.4 ㎍ 인, 렙토스피라증 진단 키트.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 키트는 OD 3.5 내지 4.5의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체를 더 포함하고, 및
    상기 제2 키트는 OD 1.5 내지 2.5의 골드-컨쥬게이트-산양-항인간 IgM 항체를 더 포함하는 것인, 렙토스피라증 진단 키트.
  6. 유행 지역 또는 풍토 지역에 따른 렙토스피라증을 구별하고,
    MAT로 측정되는 Ab 역가(Ab titer)가 1: 50 내지 1: 200인 렙토스피라증 환자 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    제1항의 렙토스피라증 진단 키트를 사용하여 환자의 시료 내 렙토스피라 IgM 항체를 검출하는 단계를 포함하는, 렙토스피라증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제1 키트 내 렙토스피라 IgM 항체 검출여부와 상기 제2 키트 내 렙토스피라 IgM 항체 검출여부를 비교하는 단계를 더 포함하는, 렙토스피라증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 항체를 검출하는 단계는 항원-항체 반응을 이용하는 것이며,
    상기 항원-항체 반응은 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmnoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immnohistochemical staining), 유체 세포 측정법 (flow cytometry), 형광활성화 세포분류법(FACS), 효소기질발색법 및 항원-항체 응집법으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 방법을 이용하는 것인, 렙토스피라증 진단을 위한 정보를 제공하는 방법.
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