WO2019125034A1 - 결핵 진단 방법 - Google Patents

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tuberculosis
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김은경
이선희
유승범
손미진
김화중
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주식회사 수젠텍
충남대학교산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a method for rapidly diagnosing tuberculosis by increasing the proportion of tuberculosis free antigens capable of diagnosing tuberculosis.
  • Tuberculosis an infectious disease caused by infection with mycobacterium tuberculosis, is known to have a high incidence and mortality rate worldwide. If the diagnosis of tuberculosis is not made at the early stage of the disease, the possibility of death is high and various methods for diagnosing tuberculosis should be studied.
  • Tuberculin skin test has a low sensitivity and low specificity due to its high sensitivity.
  • Mycobacterium tuberculosis culture method has the disadvantage that it takes a long time to obtain the diagnosis result because it has the highest risk because of the most reliable retrieval method or the isolation and culture of Mycobacterium tuberculosis.
  • a method of shortening the culture period by using a liquid medium has been introduced, but there is a problem that a further confirmation test is required for discrimination from atypical mycobacteria.
  • Nucleic acid amplification method is fast and highly sensitive and can distinguish drug resistance.
  • expensive equipment and manpower are required, there is a problem that it is difficult to use in low-income countries where there is a high demand for tuberculosis diagnosis products.
  • POCT point of care test
  • One of the on - site diagnostic methods of tuberculosis, microscopic smear smearing requires specialized trained personnel and laboratories, and the accuracy of diagnosis is low due to its low sensitivity.
  • Serologic tuberculosis diagnosis method is to diagnose antibodies produced by infecting tuberculosis by collecting blood or serum of patients. It is currently commercialized as a quick and cheap antibody diagnostic product, and it is possible to confirm results within a few minutes. However, it is difficult to differentiate between active tuberculosis and latent tuberculosis and its sensitivity is very low.
  • tubercle bacillus The diagnosis of tubercle bacillus is based on the detection of tuberculosis antigen in sputum, serum, urine or pituitary gland. However, there is a need for culture of tubercle bacilli and low accuracy and sensitivity.
  • An example of a method for diagnosing tuberculosis through detection of Mycobacterium tuberculosis antigen is Korean Patent No. 10-1524109.
  • the present invention solves the problem of the diagnosis method of tuberculosis by dissociating the antigen complex formed in the patient infected with tuberculosis with a simple method and using the free antigens increased by dissociation of the antigen complex, We want to provide a possible method.
  • the present invention provides a method for on-site diagnosis of tuberculosis using an increased free antigen and an increased free antigen by dissociating an antigen from an antigen complex contained in a sample collected from a subject for the purpose of on-site diagnosis of tuberculosis.
  • the present invention provides a method for diagnosing tuberculosis in which an acidic substance is treated on a sample collected from a subject and then the antibody against the secretory antigen of the tuberculosis is treated.
  • the present invention relates to an anti-tuberculosis kit comprising an acidic reagent for dissociating an antigen from a tuberculous antigen complex contained in a sample collected from a subject, a neutralizing reagent for neutralizing the dissociated antigen, and a solid phase to which the antibody is immobilized Lt; / RTI >
  • the present invention can provide a method for on-site diagnosis of tuberculosis with high accuracy and sensitivity.
  • the method of diagnosing tuberculosis of the present invention is simple and quick and can be immediately applied to on-site diagnosis.
  • Figure 1 shows the process of the method of diagnosing tuberculosis of the present invention (TB patient serum;
  • Figure 2 shows the lamination structure of an immunochromatography strip used in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 shows the results of the diagnosis of tuberculosis according to the diagnostic method of the present invention.
  • the present invention relates to a method for on-site diagnosis of tuberculosis, which comprises treating a sample collected from a subject with an acidic substance, treating the antibody against the secretory antigen of the tuberculosis bacterium, or providing information for diagnosing tuberculosis Method can be provided.
  • the present invention provides a method for diagnosing tuberculosis comprising the steps of collecting a sample (sample) of a subject, treating the sample with an acidic substance, neutralizing the sample, and treating the antibody against the Mycobacteria-specific antigen .
  • the subject includes persons and animals infected with or susceptible to tuberculosis, and may refer to all subjects for diagnosing tuberculosis.
  • the sample (or the sample) of the subject is preferably at least one selected from the group consisting of blood (whole blood, plasma, serum), urine, sputum, saliva, joint fluid, oral mucosal transudate and pituitary gland But is not limited to.
  • the sample of the subject can include all of the samples in which the M. tuberculosis antigen complex produced by M. tuberculosis can be present.
  • the acidic substance may include a substance for dissociating the M. tuberculosis antigen from the M. tuberculosis antigen complex contained in the sample of the subject.
  • the acidic substance may be glycine buffer, citrate buffer,
  • Acetate buffer, and the glycine buffer is preferably, but not limited to, one or more selected from the group consisting of acetate buffer.
  • Any acidic substance capable of dissociating the Mycobacterium tuberculosis antigen from the Mycobacterium tuberculosis antigen complex can be used without particular limitation.
  • the M. tuberculosis antigen complex may mean a complex in which the M. tuberculosis antigen can be formed by binding with other biomolecules, compounds or artificial substances.
  • antigen-antigen complexes or antigen-antibody complexes are representative but not limited.
  • the pH of the acidic material in the present invention is 1.0 to 6.0, 1.0 to 5.5, 1.0 to 5.0, 1.0 to 4.5, 1.0 to 4.0, 2.0 to 6.0, 2.0 to 5.5, 2.0 to 5.0, 2.0 to 4.5, .
  • the concentration of the acidic substance is 0.05 to 2.0M, 0.05 to 1.5M, 0.05 to 1.0M, 0.05 to 0.5M, 0.05 to 0.1M, 0.1 to 2M, 0.1 to 1.5M, 0.1 to 1.0M, M, 0.1 to 0.8 M, 0.1 to 0.7 M, 0.1 to 0.6 M, 0.1 to 0.5 M, preferably 0.05 to 2.0.
  • the concentration of the acidic substance may be different depending on the type of the antigen complex, and the binding strength of the antigen-antigen or the antigen-antibody may be different and may vary depending on the kind of the neutralizing reagent to be used.
  • antigen-antigen complexes examples include the Ag85 complex such as Ag85A, Ag85B and Ag85C, and the Ag85 complex binds to the fibronectin and elastin proteins of the host cell and contributes to the infection activity of the M. tuberculosis .
  • CFP-10 and ESAT6 are CFP-10 and ESAT6 proteins that are expressed together in the RD1 gene, and CFP10 / ESAT6 in which they are heterodimer formed. CFP10 / ESAT6 is a pathogenic It is known to contribute.
  • the antigen-antibody complex may be an immune complex formed in body fluids such as blood of a patient with tuberculosis, and may be formed by expression of IgG, IgA, IgM, or the like, specifically on secretory antigens secreted by Mycobacterium tuberculosis.
  • the M. tuberculosis antigen-specific antibody may be a monoclonal (or polyclonal) anti-AgFP antibody, a monoclonal (or polyclonal) anti-Ag85A antibody, a monoclonal (or polyclonal) anti- Ag85B antibody, a monoclonal Or monoclonal (or polyclonal) anti-HspX (14 kDa) antibody, a monoclonal (or polyclonal) anti-Mpt64 antibody, a monoclonal (or polyclonal) anti-38 kDa antibody and a polyclonal anti- But it is not limited thereto.
  • the method for diagnosing tuberculosis of the present invention can be more concretely performed by the following method.
  • the method of diagnosing tuberculosis of the present invention comprises the steps of: collecting a sample from a subject; treating the acidic substance to dissociate the antigen from the tuberculous antigen complex contained in the sample; neutralizing the sample containing the dissociated antigen or the dissociated antigen Treating the neutralizing reagent, and treating the antibody capable of specifically binding to the dissociated antigen.
  • the step of collecting the sample from the subject can be carried out by a known detection method according to the kind of the sample (sputum, urine, blood, etc.), and is not particularly limited.
  • the sample collected from the subject may have an antigen complex formed by the M. tuberculosis antigen and the step of treating the acidic substance to dissociate the antigen from the antigen complex.
  • Treatment of the acidic material with the sample results in dissociation of the antigen from the antigen complex and increases the free antigen in the sample.
  • Increased free antigens can increase the sensitivity and sensitivity of diagnosis of tuberculosis by increasing the antigen-antibody response by antibodies specific to the subsequently treated M. tuberculosis antigen.
  • the sample taken from the subject is treated with an acidic substance and then subjected to a neutralization step, which neutralizes the acidic sample or the antigen contained in the sample.
  • the neutralization step is necessary to provide a suitable environment for reacting the free antigen with the antibody.
  • the neutralization reagent for neutralization is not particularly limited as long as it is a basic substance and can be suitably used in accordance with the kind of the acidic substance, the kind of the antigen used, the type of the antibody to be treated later, and the like.
  • the neutralization reagent may include, but is not limited to, one or more selected from the group consisting of TRIS (tris- [hydroxymethyl] -aminomethane), carbonate, and borate.
  • TRIS tris- [hydroxymethyl] -aminomethane
  • the sample and the neutralization reagent are preferably reacted at a ratio of 1: 1 to 1:10 by volume, but the reaction is not limited thereto and can be appropriately adjusted depending on the acidity of the rea
  • the pH of the neutralizing reagent is 8.0 to 10.5, 8.0 to 11.0, 9.0 to 10.0, 9.0 to 10.5, 9.0 to 11.0, and preferably 8.0 to 10.0.
  • the concentration of the neutralizing reagent is in the range of 0.02 to 0.5M, 0.02 to 0.4M, 0.02 to 0.3M, 0.02 to 0.2M, 0.03 to 0.5M, 0.03 to 0.4M, 0.03 to 0.3M, 0.03 to 0.2M, 0.05 to 0.3 M, 0.05 to 0.2 M, 0.06 to 0.5 M, 0.06 to 0.4 M, 0.06 to 0.5 M, 0.04 to 0.4 M, 0.04 to 0.3 M, 0.04 to 0.2 M, 0.05 to 0.5 M, 0.05 to 0.4 M, 0.3M, 0.06 to 0.2M, 0.07 to 0.5M, 0.07 to 0.4M, 0.07 to 0.3M, 0.07 to 0.2M, 0.08 to 0.5M, 0.08 to 0.4M, 0.08 to 0.3M, 0.08 to 0.2M, 0.09 to 0.2M, 0.09 to 0.2M, 0.09 to 0.3M, 0.09 to 0.2M, 0.1 to 0.5M, 0.1 to 0.4M, 0.1 to 0.3
  • the detection effect of Ag85 is significantly Can rise.
  • the detection effect of CFP10 when treating 0.02-0.2 M of tris (TRIS) with a neutralizing reagent during glycine treatment of 0.05 to 1.0 M with an acidic substance to detect CFP10 among tuberculosis antigens It can rise significantly.
  • a method for detecting ESAT6 in which 0.02 to 0.2 M of tris (TRIS) is treated with a neutralizing reagent when 0.05 to 1.0 M of glycine is treated with an acidic substance to detect ESAT6 among tuberculosis antigens Can be significantly increased.
  • TIS tris
  • the antibody may be treated to induce an antigen-antibody reaction with a Mycobacterium tuberculosis antigen, including free antigens contained in the sample. And can be appropriately selected depending on the type of the M. tuberculosis antigens to be detected, and is not particularly limited.
  • Antibodies are detection antibodies for the detection of antigens that induce competitive responses with other proteins that are complexed with the antigen.
  • the antibody is preferably a labeled antibody to which an indicator is bound, but is not limited thereto. Labeled antibodies can be labeled as antibody-labeled conjugates.
  • the markers may include, but are not limited to, gold nanoparticles, enzymes such as peroxidase, fluorescent substances, latex beads, and cellulose nano-beads.
  • an immunodetection step may be performed to detect the binding of the antigen and antibody of the sample.
  • the method for immunological detection is not particularly limited, and various known immune detection methods can be used to diagnose the presence or absence of tuberculosis through binding between the antibody and Mycobacterium tuberculosis antigen.
  • an antigen-detecting antibody in a neutralization buffer is reacted with another antibody immobilized on a microplate or immunochromatography, , which can ultimately confirm the infection of tuberculosis.
  • the present invention can provide a tuberculosis diagnostic kit that can perform the above-described tuberculosis diagnosis method and can be used for on-site diagnosis of tuberculosis.
  • the kit for diagnosing tuberculosis of the present invention comprises an acidic reagent for dissociating an antigen from a tuberculous antigen complex contained in a sample collected from a subject, a neutralizing reagent for neutralizing the dissociated antigen, and a solid phase to which the antibody is immobilized can do.
  • the kit for diagnosing tuberculosis according to the present invention can be used as an immunochromatography kit, an ELISA (immunoassay kit), or an immunoassay kit, depending on the type of antibody, enzyme, and labeling substance (radioactive substance, fluorescent substance) enzyme-linked immunosorbant assay kit or a competition assay kit.
  • an immunochromatography kit an ELISA (immunoassay kit)
  • an immunoassay kit depending on the type of antibody, enzyme, and labeling substance (radioactive substance, fluorescent substance) enzyme-linked immunosorbant assay kit or a competition assay kit.
  • the tuberculosis diagnostic kit of the present invention may further comprise an antibody capable of binding to an antibody specific to or immobilized on a tuberculosis antigen, if necessary.
  • an immunochromatography tester For diagnosis of tuberculosis through free antigen detection included in the sample reacted with glycine, an immunochromatography tester was prepared as follows.
  • an immunochromatography tester For diagnosis of tuberculosis through free antigen detection included in the sample reacted with glycine, an immunochromatography tester was prepared as follows.
  • Example 20 Example 21 Example 22 Example 23 Example 24 Example 25 Example 26 Example 27 Example 28 Sample collection site Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Serum (10) Plasma (10) Acidic substance Kinds Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine density 0.02M 0.05M 0.05M 0.1 M 0.1 M 0.5 M 1 M 1M 2M pH 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 Neutralization reagent Kinds TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS density 0.01M 0.01M 0.02M 0.02M 0.05M 0.1M 0.2M 0.4M 0.4M pH 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.

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Abstract

본 발명의 결핵 진단 방법은 피검체의 샘플에 산성 물질을 처리하여 결핵 항원 복합체로부터 항원을 해리하는 전처리 과정을 통해 샘플내 유리 결핵 항원을 증가시켜 결핵 항원과 검출 항체의 반응성의 향상시킬 수 있어 결핵의 현장 진단이 가능하고, 신속하고 간단한 검출 방법으로서 현장 진단에 즉시 활용이 가능하다.

Description

결핵 진단 방법
본 발명은 결핵 여부를 진단할 수 있는 결핵 자유 항원의 비율을 증가시켜 결핵의 신속한 현장진단이 가능한 방법에 관한 것이다.
결핵균(mycobacterium tuberculosis)의 감염에 의한 감염증인 결핵은 전 세계적으로 발병률이 높고 사망률도 높은 질병으로 알려져 있다. 결핵을 발병 초기에 진단하여 치료하지 못하는 경우 사망에 이를 가능성이 높아 다양한 결핵 진단 방법에 대한 연구가 필요하다.
결핵의 진단 방법으로 여러 가지 방법이 알려져 있다. 튜베르쿨린 피부 반응 검사(tuberculin skin test, TST)는 높은 민감도를 가지고 저렴하나 특이성이 낮아 결핵 진단의 신뢰도가 낮은 단점이 있다. 결핵균 배양 방법은 신뢰도가 가장 높은 검색 방법이나 결핵균을 분리 및 배양하기 때문에 위험성이 높고 배양 기간이 길어 진단 결과를 얻기까지 매우 오랜 시간이 걸리는 단점이 있다. 최근에는 액체 배지를 이용하여 배양 기간을 단축시키는 방법이 도입되고 있으나 비정형 결핵균과 감별을 위한 추가 확진 시험이 필요한 문제가 있다. 핵산증폭법(nucleic acid amplification)의 방법은 신속하고 높은 민감도를 보이며 약제 내성도 구별 가능하나 고가의 장비와 인력이 요구되기 때문에 결핵 진단 제품의 요구가 높은 저소득 국가에서 사용하기 어려운 문제가 있다.
결핵의 빠른 진단 및 치료를 위해서는 현장진단(point of care test, POCT)이 가능한 결핵진단방법이 필요하다. 결핵의 현장진단 방법 중 하나인 현미경을 이용한 도말 염색은 훈련된 전문 인력과 실험실이 필요하며 민감도가 낮아 진단의 정확성이 낮다. 혈청학적 결핵 진단 방법은 환자의 혈액이나 혈청을 채취해 결핵균의 감염에 의해 생성된 항체를 진단하는 방법으로 현재 신속하고 저렴한 항체 진단 제품이 상업화되어 있고 수분내에 결과 확인이 가능하며 전문 인력이 필요없는 장점이 있으나 활동결핵과 잠복결핵의 구별이 어렵고 민감도가 매우 낮다. 결핵균의 항원을 통한 진단 방법은 객담, 혈청, 소변이나 뇌하수체에 있는 결핵균 항원 검출을 통해 결핵을 진단하는 방법으로 여러 제품이 있으나 결핵균 배양이 필요하거나 정확도, 민감도 등이 낮은 경우가 있다. 결핵균 항원 검출을 통한 결핵 진단 방법의 예로 한국 등록특허 제10-1524109호 등이 있다.
본 발명은 이러한 결핵의 진단 방법의 문제를 해결하기 위해, 결핵에 감염된 환자에서 형성된 항원 복합체를 간단한 방법으로 해리시키고 항원 복합체의 해리에 의해 증가된 자유 항원을 이용하여 간단하고 신속하게 결핵 현장 진단이 가능한 방법을 제공하고자 한다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
한국 등록특허 제10-1524109호
본 발명은 결핵의 현장 진단을 위해 피검자로부터 채취한 시료에 포함된 항원 복합체로부터 항원을 해리시켜 자유 항원을 증가시키고 증가된 자유 항원을 이용하여 결핵의 현장 진단이 가능한 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 피검체로부터 채취한 샘플에 산성 물질을 처리한 후, 결핵균의 분비 항원에 대한 항체를 처리하는 결핵 진단 방법을 제공한다.
본 발명은 피검체로부터 채취한 샘플에 포함된 결핵 항원 복합체로부터 항원을 해리시키기 위한 산성 시약, 해리된 항원을 중화시키기 위한 중화 시약 및 항체가 고정된 고형체(solid phase)를 포함한 결핵 검사용 키트를 제공한다.
본 발명은 높은 정확도 및 민감도를 가진 결핵의 현장 진단 방법을 제공할 수 있다. 본 발명의 결핵 진단 방법은 간단하고 신속하며 현장진단에 즉시 적용 가능할 수 있다.
도 1은 본 발명의 결핵 진단 방법의 과정을 보여준다(TB patient serum; 결핵 환자 혈청).
도 2는 본 발명의 일 실시예에서 사용한 면역크로마토그래피 스트립(Immunochromatography strip)의 라미네이션 구조를 보여준다.
도 3은 본 발명의 결핵 진단 방법에 따른 결핵 진단 결과를 보여준다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 기술자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 결핵을 현장 진단할 수 있는 방법에 관한 것으로 피검체로부터 채취한 샘플에 산성 물질을 처리한 후, 결핵균의 분비 항원에 대한 항체를 처리하는 결핵 진단 방법 또는 결핵 진단을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공할 수 있다.
구체적으로 본 발명은 피검자의 샘플(시료)을 채취하는 단계, 샘플에 산성 물질을 처리하는 단계, 샘플을 중화시키는 단계 및 결핵균 특이 항원에 대한 항체를 처리하는 단계를 포함하는 결핵 진단 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에서 피검자는 결핵에 감염되었거나 감염 가능성이 존재하는 사람 및 동물을 포함하고, 결핵을 진단하기 위한 대상 전체를 의미할 수 있다.
본 발명에서 피검자의 샘플(또는 시료)은 혈액(전혈, 혈장, 혈청), 소변, 객담, 침, 관절액, 구강점막액(oral mucosal transudate) 및 뇌하수체로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 피검자의 샘플은 결핵균에 의해 생성되는 결핵균 항원 복합체가 존재할 수 있는 샘플을 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 산성 물질은 피검자의 샘플에 포함되어 있는 결핵균 항원 복합체로부터 결핵균 항원을 해리시키기 위한 물질 전반을 포함할 수 있다. 산성 물질은 글리신 버퍼(glycine buffer), 시트르산염 버퍼(citrate buffer), 및
아세트산염 버퍼(acetate buffer)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상이고 글리신 버퍼가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 결핵균 항원 복합체로부터 결핵균 항원을 해리시킬 수 있는 산성 물질이면 특별히 제한되지 않고 사용할 수 있다. 본 발명에서 결핵균 항원 복합체는 결핵균 항원이 다른 생체분자, 화합물 또는 인공물질과 결합하여 형성될 수 있는 복합체를 의미할 수 있다. 예를 들어, 항원-항원 복합체나 항원-항체 복합체가 대표적이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 산성 물질의 pH는 1.0 내지 6.0, 1.0 내지 5.5, 1.0 내지 5.0, 1.0 내지 4.5, 1.0 내지 4.0, 2.0 내지 6.0, 2.0 내지 5.5, 2.0 내지 5.0, 2.0 내지 4.5 바람직하게는 2.0 내지 4.0이다. 본 발명에서 산성 물질의 농도는 0.05 내지 2.0M, 0.05 내지 1.5M, 0.05 내지 1.0M, 0.05 내지 0.5M, 0.05 내지 0.1M, 0.1 내지 2M, 0.1 내지 1.5M, 0.1 내지 1.0M, 0.1 내지 0.9M, 0.1 내지 0.8M, 0.1 내지 0.7M, 0.1 내지 0.6M, 0.1 내지 0.5M, 바람직하게는 0.05 내지 2.0이다. 산성 물질의 농도는 항원 복합체의 종류에 따라 항원-항원 또는 항원-항체의 결합세기가 다를 수 있고, 사용하는 중화시약의 종류에 따라 달라질 수 있다.
항원-항원 복합체의 예로 Ag85A, Ag85B 및 Ag85C와 같은 Ag85 복합체(Ag85 complex)가 있고 Ag85 복합체는 숙주 세포(host cell)의 피브로넥틴(fibronectin) 및 엘라스틴(Elastin) 단백질과 결합하여 결핵균의 감염 활동에 기여하는 것으로 알려져 있다. 항원-항원 복합체의 또 다른 예로 CFP-10과 ESAT6은 RD1 유전자에서 함께 발현되는 CFP-10 및 ESAT6 단백질로 이들이 헤테로다이머(heterodimer)를 이루어 형성된 CFP10/ESAT6가 있으며, CFP10/ESAT6는 결핵균의 병원성에 기여하는 것으로 알려져 있다.
항원-항체 복합체는 결핵 환자의 혈액과 같은 체액에서 형성되는 면역 복합체(immune complex)로 결핵균이 분비하는 분비항원에 특이적이 IgG, IgA, IgM 등의 발현으로 인해 형성되는 복합체를 포함할 수 있다.
본 발명에서 결핵균 항원 복합체로부터 해리되는 결핵균 분비 항원은 Mpt64, Esat6(the 6-kDa early secreted antigenic target), Cfp10(the 10-kDa culture filtrate protein), HspX(14kDa), 38kDa 단백질(38kDa protein), LAM 및 Ag85(the antigen 85 complex)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 결핵균 항원 특이 항체는 Monoclonal(또는 polyclonal) anti-CFP10 antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-Ag85A antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-Ag85B antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-Ag85C antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-ESAT6 antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-HspX(14kDa) antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-Mpt64 antibody, Monoclonal(또는 polyclonal) anti-38kDa antibody 및 Monoclonal(또는 polyclonal) anti-LAM antibody 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 결핵 진단 방법은 보다 구체적으로 다음과 같은 방법으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 결핵 진단 방법은 피검체로부터 샘플을 채취하는 단계, 샘플에 포함된 결핵 항원 복합체로부터 항원을 해리시키기 위해 산성 물질을 처리하는 단계, 해리된 항원을 포함한 샘플 또는 해리된 항원을 중화시키기 위해 중화 시약을 처리하는 단계 및 해리된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 처리하는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.
피검체로부터 샘플을 채취하는 단계는 샘플의 종류(객담, 소변, 혈액 등)에 따라 공지의 검출 방법을 통해 진행될 수 있으며 특별히 제한되는 것은 아니다.
피검체로부터 채취한 샘플에는 결핵균 항원에 의해 형성된 항원 복합체가 존재할 수 있고 항원 복합체로부터 항원을 해리시키기 위해 산성 물질을 처리하는 단계를 진행한다. 산성 물질을 샘플에 처리하게 되면 항원 복합체로부터 항원이 해리되게 되고 샘플에 자유 항원(free antigen)이 증가하게 된다. 자유 항원의 증가에 의해, 이후 처리될 결핵균 항원에 특이적인 항체에 의한 항원-항체 반응도 증가하여 결핵 진단의 정확성 및 민감도가 향상될 수 있다.
피검체로부터 채취한 샘플에 산성 물질을 처리한 후 중화 단계를 거치게 되는데, 산성의 샘플 또는 샘플에 포함된 항원을 중화시키게 된다. 중화 단계는 자유항원과 항체를 반응시키기 위해 적합한 환경 제공을 위해 필요하다. 중화를 위한 중화 시약은 염기성 물질이면 특별히 제한되지 않으며 앞서 사용한 산성 물질, 항원의 종류, 이후 처리할 항체의 종류 등에 따라 적절히 사용할 수 있다. 중화 시약은 예를 들어 TRIS(tris-[hydroxymethyl]-aminomethane), 카보네이트(carbonate) 및 보레이트(borate)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 샘플과 중화 시약은 1:1 내지 1:10 부피비로 반응시키는 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니며, 사용 시약과 샘플의 산성 정도에 따라 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명에서 중화 시약의 pH는 8.0 내지 10.5, 8.0 내지 11.0, 9.0 내지 10.0, 9.0 내지 10.5, 9.0 내지 11.0, 바람직하게는 8.0 내지 10.0이다.
본 발명에서 중화 시약의 농도는 0.02 내지 0.5M, 0.02 내지 0.4M, 0.02 내지 0.3M, 0.02 내지 0.2M, 0.03 내지 0.5M, 0.03 내지 0.4M, 0.03 내지 0.3M, 0.03 내지 0.2M, 0.04 내지 0.5M, 0.04 내지 0.4M, 0.04 내지 0.3M, 0.04 내지 0.2M, 0.05 내지 0.5M, 0.05 내지 0.4M, 0.05 내지 0.3M, 0.05 내지 0.2M, 0.06 내지 0.5M, 0.06 내지 0.4M, 0.06 내지 0.3M, 0.06 내지 0.2M, 0.07 내지 0.5M, 0.07 내지 0.4M, 0.07 내지 0.3M, 0.07 내지 0.2M, 0.08 내지 0.5M, 0.08 내지 0.4M, 0.08 내지 0.3M, 0.08 내지 0.2M, 0.09 내지 0.5M, 0.09 내지 0.4M, 0.09 내지 0.3M, 0.09 내지 0.2M, 0.1 내지 0.5M, 0.1 내지 0.4M, 0.1 내지 0.3M, 0.1 내지 0.2M이다. 중화 시약의 농도는 사용하는 산성 물질 및 결핵 항원 복합체의 종류에 따라 다를 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 결핵 항원 중 Ag85를 검출하기 위해 산성 물질로 0.05 내지 2.0M의 글라이신 처리시 중화시약으로 0.1 내지 0.5M의 트리스(TRIS)를 처리할 때 Ag85의 검출 효과가 현저히 상승할 수 있다. 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 결핵 항원 중 CFP10을 검출하기 위해 산성 물질로 0.05 내지 1.0M의 글라이신 처리시 중화시약으로 0.02 내지 0.2M의 트리스(TRIS)를 처리할 때 CFP10의 검출 효과가 현저히 상승할 수 있다. 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 결핵 항원 중 ESAT6를 검출하기 위해 산성 물질로 0.05 내지 1.0M의 글라이신 처리시 중화시약으로 0.02 내지 0.2M의 트리스(TRIS)를 처리할 때 ESAT6의 검출 효과가 현저히 상승할 수 있다.
중화 단계 이후 또는 중화 시약 처리와 함께 샘플에 항체를 처리하여 샘플에 포함된 자유 항원을 포함한 결핵균 항원과 항원-항체 반응을 유도할 수 있다. 항체의 검출 대상인 결핵균 항원의 종류에 따라 적절하게 선택할 수 있으며 특별히 제한되는 것은 아니다. 항체는 항원의 검출을 위한 검출 항체(detection antibody)로서 항원과 복합체를 이루는 다른 단백질들과 경쟁 반응을 유도하게 된다. 항체는 표지체(indicator)가 결합된 표지 항체(labeled antibody)가 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 표지 항체는 항체-표지체 접합체로 표기될 수 있다. 표지체는 금나노입자, 페록시다아제(peroxidase)와 같은 효소, 형광물질(fluorescent substance), 라텍스 비드(latex bead), 셀룰로오스 나노 비드와 같은 다양한 염색 물질을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
항체 처리 후 샘플의 항원과 항체가 결합한 것을 검출하기 위해 면역 검출 단계를 수행할 수 있다. 면역 검출을 위한 방법은 특별히 제한되지 않으며 공지의 다양한 면역 검출 방법을 사용하여 항체와 결핵균 항원간의 결합을 통한 결핵 여부를 진단할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 중화 버퍼(neutralization buffer)내 항원-검출 항체를 면역크로마토그래피(immunochromatography)나 마이크로플레이트(microplate)에 고정된 또 다른 항체(immobilized antibody)와 반응시키고 세척 및 발색 반응을 통해 결핵의 감염 여부를 최종적으로 확인할 수 있다.
본 발명은 이상의 결핵 진단 방법을 수행할 수 있고, 결핵의 현장진단에 사용할 수 있는 결핵 진단용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명의 결핵 진단용 키트는 피검체로부터 채취한 샘플에 포함된 결핵 항원 복합체로부터 항원을 해리시키기 위한 산성 시약, 해리된 항원을 중화시키기 위한 중화 시약 및 항체가 고정된 고형체(solid phase)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 결핵 진단용 키트는 항체가 고정된 고형체나 항원-항체 반응을 위해 사용하는 물질인 항체, 효소, 표지물질(방사능 물질, 형광 물질 등) 등의 종류에 따라 면역크로마토그래피 키트, ELISA(enzyme-linked immunosorbant assay) 키트 또는 경합 어세이(competition assay) 키트로 제작할 수 있다.
본 발명의 결핵 진단용 키트는 필요에 따라 결핵 항원에 특이적이거나 고정화된 항체와 결합할 수 있는 항체를 더 포함할 수 있다.
이하에서 본 발명을 실시하기 위한 실시예에 대하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 실시하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명이 실시예에 의해 한정 해석되어서는 안된다.
[실시예 1]
( 1)면역크로마토그래피법을 이용한 결핵 진단
결핵에 걸린 피검체로부터 채취한 혈청 또는 혈장 샘플을 산성물질인 pH 2.0~4.0의 1.0M 글라이신(glycine)에 1/10(샘플/산성물질)의 부피비로 섞은 후 30분 이내로 전처리하여 반응시켰다.
글라이신에 반응시킨 샘플에 포함된 자유 항원 검출을 통한 결핵 진단을 위해 면역크로마토그래피 테스트기를 다음과 같이 제조하였다.
- 항체 고정화 : NC 멤브레인 상에 항체를 라인 형태로 분주하여 건조하고 고정시켰다.
- 중화 패드 구성 : pH 8.0의 100mM Tris-HCl, 0.5~2.0% 카제인(casein), 0.5~2% 계면활성제(Tween20, Triton X-100), 20~500mM NaCl을 처리한 버퍼를 제조하고, 유리섬유(glass fiber)에 적셔 건조시켜 중화 패드를 구성하였다.
- 중화 버퍼 : pH 8.0 이상의 100mM Tris-HCl, 0.5~2.0% 카제인(casein), 0.5~2% 계면활성제(Tween20, Triton X-100), 20~500mM NaCl을 처리한 버퍼를 제조하였다.
- 항체-금 접합체(gold-antibody conjugate) 제조 : 40~60nm 크기의 금콜로이드(colloidal gold)에 마우스 유래 항 결핵항원단일클론항체를 1~10㎍/㎖로 반응시키고, 블록킹 시약(blocking agent)로 카제인이나 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 0.1~1.0%로 처리한 후 세척하여 정제된 항 결핵항체-금 접합체를 얻었다.
- 접합체 패드(conjugate pad)의 제조 : 항 결핵항체-금 접합체를 수크로스(sucrose)와 BSA가 첨가된 인산 완충액(phosphate buffer)에 적정 농도로 처리하고 0.45㎛ 필터로 여과한 후 접합체 패드에 적시고 건조시켜 패드를 구성하였다.
- 면역크로마토그래피 스트립의 제조 : 항체 고정화 NC 멤브레인, 중화 패드, 항체-금 접합체가 처리된 접합체 패드를 사용하여 도 2와 같이 면역크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
( 2)면역크로마토그래피법을 이용한 결핵 진단
결핵에 걸린 피검체로부터 채취한 혈청 또는 혈장 샘플을 산성물질인 pH 2.0~4.0의 1.0M 글라이신(glycine)에 1/10(샘플/산성물질)의 부피비로 섞은 후 30분 이내로 전처리하여 반응시켰다.
글라이신에 반응시킨 샘플에 포함된 자유 항원 검출을 통한 결핵 진단을 위해 면역크로마토그래피 테스트기를 다음과 같이 제조하였다.
- 항체 고정화 : NC 멤브레인 상에 항체를 라인 형태로 분주하여 건조하고 고정시켰다.
- 중화 항체 : pH 8.0의 100mM Tris-HCl, 0.5~2.0% 카제인(casein), 0.5~2% 계면활성제(Tween20, Triton X-100), 20~500mM NaCl을 처리한 버퍼를 제조하고, 40~60nm 크기의 금콜로이드(colloidal gold)에 마우스 유래 항 결핵항원단일클론항체를 1~10㎍/㎖로 반응시키고, 블록킹 시약(blocking agent)로 카제인이나 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)을 0.1~1.0%로 처리한 후 세척하여 정제된 항 결핵항체-금 접합체를 첨가한 후 안정제로서 PEG, dextran, PVA, sucrose, trehalose, mannitol 등의 성분을 적량 추가하였다. 이와 같이 액상의 중화 항체 내지 이를 추가적으로 16~48시간 동안 동결건조를 진행하여 건조된 중화 항체를 제조하였다.
- 면역크로마토그래피 스트립의 제조 : 항체 고정화 NC 멤브레인 및 크로마토그래피를 위한 Glass fiber 내지 cellulose Pad류들을 사용하여 도 2 와 동일한 구조의 면역크로마토그래피 스트립을 제조하였다.
이상에서 제조한 면역크로마토그래피 스트립에 글라이신으로 전처리한 피검체의 샘플 자체 또는 전처리한 피검체의 샘플과 중화 버퍼 내지 전처리한 피검체의 샘플과 중화 항체를 적정 비율로 섞어 처리하고, 결핵 항원 검출 결과 여부를 확인하였다(도 3).
결핵 항원인 CFP-10 검출을 위해 항체로 항CFP-10 항체를 사용하였다.
결핵 항원 검출 결과, 글라이신으로 전처리한 샘플의 경우 면역크로마토그래피 스트립의 검사선 위치에서 뚜렷한 밴드가 나타나 결핵 항원이 검출됨을 확인할 수 있었다. 그러나, 글라이신으로 전처리하지 않은 샘플의 경우 검사선 위치에서 밴드가 거의 나타나지 않아 결핵 항원의 검출 정도가 매우 낮았다.
결핵 항원으로 Ag85 검출을 위해 항 Ag85 항체를 사용한 경우(실시예 2~34 참조)에도 글라이신으로 전처리한 샘플의 경우 면역크로마토그래피 스트립의 검사선 위치에서 뚜렷한 밴드가 나타나 결핵 항원이 검출됨을 확인할 수 있었으나, 글라이신 전처리가 없는 샘플의 경우 검사선 위치에서 밴드가 거의 나타나지 않아 결핵 항원의 검출 정도가 매우 낮았다.
이러한 결과는 일반적인 항원-항체 반응으로는 정확한 결핵 여부 판별이 어려운 환자(결핵 항원 복합체에 의해 검출 항원이 충분하지 않은 환자 등)라도 본 발명의 결핵 진단 방법으로는 정확한 진단이 가능한 것을 보여준다.
또한, 면역크로마토그래피 스트립은 간단하게 제조할 수 있고 제조비용도 저렴하여 현장 진단에 본 발명의 결핵 진단 방법을 즉시 적용하여 활용할 수 있다.
[실시예 2 내지 실시예 34]
실시예 1과 같은 방법으로 결핵 항원 검출을 실시하였다. 사용한 산성물질, 중화시약, 항체 및 검출여부는 아래 [표 1], [표 2], [표 3], [표 4]에 나타내었다.
검출여부는 총 20개의 면역크로마토그래피 스트립에서 검사선에 나타난 밴드(결핵 항원 복합체에서 해리된 결핵 항원과 사용 항체의 결합에 의해 나타남)의 수를 통해 확인하였고, 아래 식에 따라 계산한 결과 60% 이상인 경우 검출강도를 높음으로 하였고, 20% 이상 60% 미만에서 검출강도는 낮음으로 하였고, 20% 미만은 검출되지 않음으로 하였다.
검출강도 = [검사선에 밴드가 나타난 면역크로마토그래피 스트립 수/총 면역크로마토그래피 스트립 수]*100
(현장 진단에 사용하기 위해서는 육안으로 즉시 판별할 수 있는지 여부가 중요하므로, 검사선의 밴드의 나타남 여부는 육안으로 판별하였다.
실시예 2 실시예 3 실시예 4 실시예 5 실시예 6 실시예 7 실시예 8 실시예 9 실시예 10
샘플 채취 부위 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10)
산성물질 종류 Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine
농도 0.05M 0.1 M 0.5 M 0.5 M 1 M 1 M 1.5M 2M 2M
pH 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
중화시약 종류 TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS
농도 0.05M 0.05M 0.1M 0.2M 0.1M 0.2M 0.3M 0.5M 0.8M
pH 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0
산성물질/중화시약 반응비(v/v) 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1
항체 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B 항-Ag85B
검출강도 검출되지 않음 낮음 높음 높음 높음 높음 높음 높음 낮음
[표 1]의 결과에 따르면, Glycine의 농도가 0.5~2.0M, TRIS의 농도 범위가 0.1~0.5M일 때 결핵-항원 복합체에서 Ag85B의 효과적인 해리 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 11 실시예 12 실시예 13 실시예 14 실시예 15 실시예 16 실시예 17 실시예 18 실시예 19
샘플 채취 부위 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10)
산성물질 종류 Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine
농도 0.02M 0.05M 0.05M 0.1 M 0.1 M 0.5 M 1 M 1M 2M
pH 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
중화시약 종류 TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS
농도 0.01M 0.01M 0.02M 0.02M 0.05M 0.1M 0.2M 0.4M 0.4M
pH 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0
산성물질/중화시약 반응비(v/v) 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1
항체 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10 항-CFP10
검출강도 검출되지 않음 낮음 높음 높음 높음 높음 높음 낮음 검출되지 않음
[표 2]의 결과에 따르면, Glycine의 농도가 0.05~1.0M, TRIS의 농도 범위가 0.02~0.2M일 때 결핵-항원 복합체에서 CFP10의 효과적인 해리 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 20 실시예 21 실시예 22 실시예 23 실시예 24 실시예 25 실시예 26 실시예 27 실시예 28
샘플 채취 부위 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10)
산성물질 종류 Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine
농도 0.02M 0.05M 0.05M 0.1 M 0.1 M 0.5 M 1 M 1M 2M
pH 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
중화시약 종류 TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS TRIS
농도 0.01M 0.01M 0.02M 0.02M 0.05M 0.1M 0.2M 0.4M 0.4M
pH 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0
산성물질/중화시약 반응비(v/v) 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1
항체 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6 항-ESAT6
검출강도 검출되지 않음 낮음 높음 높음 높음 높음 높음 낮음 검출되지 않음
[표 3]의 결과에 따르면, Glycine의 농도가 0.05~1.0M, TRIS의 농도 범위가 0.02~0.2M일 때 결핵-항원 복합체에서 ESAT6의 효과적인 해리 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 29 실시예 30 실시예 31 실시예 32 실시예 33 실시예 34
샘플 채취 부위 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10) 혈청(10)혈장(10)
산성물질 종류 Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine Glycine
농도 0.1M 0.1M 0.1 M 0.1 M 0.1 M 0.1 M
pH 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
중화시약 종류 Borate Carbonate Borate Carbonate Borate Carbonate
농도 0.05M 0.05M 0.05M 0.05M 0.05M 0.05M
pH 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0 9.0
산성물질/중화시약 반응비(v/v) 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1 1:1
항체 항-Ag85B 항-Ag85B 항-CFP10 항-CFP10 항-ESAT6 항-ESAT6
검출강도 높음 높음 높음 높음 높음 높음
[표 4]의 결과에 따르면 중화시약으로 Borate 및 Carbonate를 사용하였을 때도 결핵 항원 복합체로부터 Ag85B, CFP10 및 ESAT6의 효과적인 해리 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.
이상의 결과를 통해, 산성물질처리 및 중화시약의 처리에 의해 결핵 항원 복합체로부터 결핵 항원(CFP10, Ag85, ESAT6)을 효과적인 해리 및 검출이 가능함을 확인할 수 있었다.

Claims (10)

  1. 피검체로부터 채취된 샘플에 포함된 결핵 항원 복합체로부터 항원을 해리시키기 위해 산성 물질을 처리하는 단계;
    해리된 항원을 포함한 샘플 또는 해리된 항원을 중화시키기 위해 중화 시약을 처리하는 단계; 및
    해리된 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 처리하는 단계;
    를 포함하는 결핵 진단 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 피검체로부터 채취된 샘플은 혈액(전혈, 혈장, 혈청), 소변, 객담, 침, 관절액, 구강점막액(oral mucosal transudate) 및 뇌하수체로 이루어진 군에서 선택되는 것인 결핵 진단 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 항원은 Mpt64, Esat6(the 6-kDa early secreted antigenic target), Cfp10(the 10-kDa culture filtrate protein), Ag85(the antigen 85 complex), Ag85A, Ag85B, Ag85C, HspX, LAM 및 38kDa 단백질로 이루어진 군에서 선택되는 결핵 진단 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 산성 물질은 글리신 버퍼(glycine buffer), 시트르산염 버퍼(citrate buffer) 및 아세트산염 버퍼(acetate buffer) 로 이루어진 군에서 선택되는 결핵 진단 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 산성 물질의 pH는 2.0 내지 4.0인 결핵 진단 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 중화 시약을 처리하는 단계는 염기성 버퍼 용액 또는 염기성 버퍼 건조패드를 사용하여 수행되는 것인 결핵 진단 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 항체를 처리하는 단계는 항체-표지체 접합체가 처리된 건조 패드를 사용하여 수행되는 것인 결핵 진단 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 중화 시약을 처리하는 단계 및 상기 항체를 처리하는 단계는 염기성 버퍼 용액에 항체-표지체 접합체가 첨가된 용액; 또는 염기성 버퍼 용액에 항체-표지체 접합체가 첨가된 용액을 동결건조한 고상물을 사용하여 동시에 수행되는 것인 결핵 진단 방법.
  9. 피검체로부터 채취된샘플에 포함된 결핵 항원 복합체로부터 항원을 해리시키기 위한 산성 시약;
    해리된 항원을 중화시키기 위한 중화 시약; 및
    항체가 고정된 고형체(solid phase)를 포함한 결핵 검사용 키트.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 키트는 면역크로마토그래피 키트 또는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트인 결핵 검사용 키트.
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