CN103864907B - 用于结核病诊断的蛋白以及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物化学和免疫学领域，涉及一种用于结核病诊断的蛋白以及试剂盒。具体地，本发明涉及一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示。本发明的蛋白可以作为作为细胞水平的结核病免疫诊断分子标识，具有良好的符合率和反应强度。

Description

用于结核病诊断的蛋白以及试剂盒
技术领域
本发明属于生物化学和免疫学领域，涉及一种用于结核病诊断的蛋白以及试剂盒。
背景技术
结核分枝杆菌是对人类健康威胁最大的病原体之一，结核病是当今世界上成年人中的主要传染病，已对国际公共卫生构成严峻挑战。结核菌在感染人体以后，多处于潜伏状态或持续感染状态，它能在感染宿主细胞内逃避宿主的防御作用而大量繁殖并和宿主达到一种微妙的平衡，感染者一生中的任何时候都有可能发病。一般情况下，10%的感染者将发展为活动性肺结核。一个未经治疗的活动性肺结核病人，一年能传染10－15人。
近五十年来，结核病的控制理论与技术、临床诊断治疗水平与研究均有长足的进步。由于有效化疗药物(异烟肼、利福平、吡嗪酰铵、链霉素、乙胺丁醇等)的普遍应用和卡介苗在世界范围的推广，使得结核病的发病率曾一度降低，以至于人们乐观地认为，结核病将同天花一样被人类彻底消灭。但在八十年代中期，由于过分乐观的估计形势，减少投资、缩减机构，放松对结核病的治疗与管理，结核病又在许多国家死灰复燃，发病率在全世界范围内再次回升。1993年WHO宣布结核病处于“全球紧急状态”，并呼吁“迅速采取行动与结核病危机进行斗争”，这在WHO历史上发表这样的声明尚属首次。耐药及耐多药结核病也已成为当前结核病控制工作中的重大威胁。
在常用的肺结核诊断技术中存在着阳性率低、周期长、操作复杂、假阳性率高等问题。故此需要一种快速、简便、敏感、特异的诊断方 法。
目前结核病毒诊断方法有：（一）痰菌检查：痰涂菌检查和痰结核菌检查简便易行，准确性较高，痰中查出结核菌，就能确诊患了结核病。一般初次就诊要查三个痰标本，即夜间痰、清晨痰和即时痰。它虽然是诊断肺结核“金指标”但诊断率低，培养周期长。痰结核菌培养，结果可信度高，并能做结核菌药敏试验，但需时6－8周，应用受到限制。（二）Ⅹ射线检查：胸部Ⅹ线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受。胸部CT可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般Ⅹ线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。（三）肺结核病免疫学诊断：1.常用的有结核菌素纯蛋白衍化物（PPD）试验，该试验阳性是感染过结核菌的证据之一，但是假阳性率高，容易误诊。2.血中、痰中结核抗体检测阳性也有助于诊断，也容易出现假阳率。3.BACTEC法测结核分枝杆菌的代谢物，一般两周可分离出分枝杆菌，但菌量多少能影响阳性结果出现的天数。5.聚合酶链反应（PCR），优点是敏感性可达98%－100%，缺点是特异性较差。（四）其他检查：只能作为辅助诊断，不能作为诊断依据。1.纤维支气管镜检查，可以直接观察或间接判断支气管、肺内病变，并且有活组织检查、灌洗、录像、拍摄气管内照片等功能，对于诊断和鉴别诊断特别有用。2.胸腔镜和纵隔镜检查，均可用于观察胸腔、纵隔内肿大淋巴结，并可取出活组织检查以利诊断和鉴别诊断。3.超声波检查，主要用于胸腔积液的诊断和鉴别诊断。
结核分枝杆菌（MTB）培养物滤液中有一种早期分泌抗原靶蛋白(early secretoryantigenic target，ESAT-6)，GenBank登录号为：NC_00962，gi：15608177，相对分子质量为6000，在MTB感染早期即可被机体的免疫系统所识别，是重要的T细胞抗原抗原。ESAT-6来源的合成多肽被广泛地用于外周血MTB特异性γ-干扰素(IFN-γ)应答情况的检测，临床上用于诊断是否有MTB感染指标之一[Ravn P.Munk ME.Andersen AB Prospective evaluationofa whole-blood test using Mycobacterium tuberculosis-specific antigens ESAT-6and CFP-10for diagnosis of active tuberculosis2005；Harbce M.OetteingerT.Wiker HG Evidence for oceurrence of the ESAT-6protein in Mycobacteriumtuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its absence inMycabacterium bovis BCG1996；Zhang,M.,H.Wang,M.Liao,et al.(2010)."Diagnosis oflatent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guerin vaccinated subjectsin China by interferon-gamma ELISpot assay."Int J Tuberc Lung Dis14(12):1556-1563.]。
尽管如此，目前尚需要发现新的诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识，以及新的检测诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的方法和试剂。
发明内容
本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，得到了一类蛋白，本发明人惊奇地发现，本发明的蛋白能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。由此提供了下述发明：
本发明的一个方面涉及一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：1（本发明中有时称为Rv1198）或SEQ ID NO：2（本发明中有时称为Rv2016）所示。所述蛋白为用于结核病诊断或结核杆菌检测的蛋白。
Rv1198的氨基酸序列：86aa
MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYE（SEQ ID NO：1）
Rv2016的氨基酸序列：180aa
FLAALVGTIRDTRFDIADMRNWRPGWFPTMHSRCLSNLIHDRIWAHLVTLIASNPGTSIKDKGATREIVVGAHLRLRIKRHHAGDEISTYPTRTAIEFWQQGSQPAFPGLEEVRIAVGYRWDPDTREIGAPLLSLRDGKDHVIWVVELDEPAAGVKITWTPIEPTLPSIDFGDLGEDSGA（SEQ ID NO：2）
本发明的另一方面一种分离的核苷酸，其编码本发明的蛋白；具体地，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示。
Rv1198的核苷酸序列（读码框）：258bp
ATG ACC ATC AAC TAT CAA TTC GGG GAT GTC GACGCT CAC GGC GCC ATG ATCCGC GCT CAG GCC GGG TTGCTG GAG GCC GAG CAT CAG GCC ATC ATT CGT GAT GTGTTG ACCGCG AGT GAC TTT TGG GGC GGC GCC GGT TCGGCG GCC TGC CAG GGG TTC ATT ACC CAGTTG GGC CGTAAC TTC CAG GTG ATC TAC GAG CAG GCC AAC GCC CACGGG CAG AAG GTG CAGGCT GCC GGC AAC AAC ATG GCGCAA ACC GAC（SEQ ID NO：3）
Rv2016的核苷酸序列（读码框）：540bp
TTC CTT GCT GCT CTT GTT GGC ACC ATC AGG GATACG CGC TTC GAC ATC GCCGAC ATG CGG AAC TGG CGGCCG GGA TGG TTT CCG ACC ATG CAT AGC CGG TGT CTGTCC AACCTC ATC CAC GAC AGA ATC TGG GCA CAC CTGGTC ACC CTC ATC GCG AGC AAT CCA GGCACC AGC ATCAAG GAC AAG GGT GCC ACC CGC GAG ATT GTG GTT GGCGCA CAC CTG CGG TTGCGA ATC AAA CGC CAC CAC GCAGGT GAC GAG ATC AGC ACC TAC CCG ACC CGA ACC GCCATCGAA TTC TGG CAA CAG GGC AGC CAG CCC GCC TTCCCG GGG CTG GAA GAG GTT CGC ATTGCG GTG GGC TAT CGG TGG GAC CCT GAT ACC CGC GAG ATC GGA GCC CCCCTG CTG TCGCTT CGC GAC GGG AAA GAT CAC GTC ATCTGG GTA GTC GAA CTC GAC GAG CCT GCG GCCGGC GTGAAG ATC ACC TGG ACC CCG ATC GAG CCG ACA CTA CCGTCC ATC GAC TTC GGT GACTTG GGT GAA GAC TCT GGAGCA（SEQ ID NO：4）
Rv1198和Rv2016的读码框的核苷酸序列可以由实施例1或2中的相应的质粒或PCR产物测序得到，并可进一步根据读码框核苷酸序列推知编码的氨基酸序列。当然，上述的读码框的核苷酸序列也可以通过人工合成得到。所述蛋白可以通过将读码框序列通过合适的表达载体和宿主细胞得到。
本发明的再一方面涉及一种重组载体，其含有本发明的核苷酸。
本发明的再一方面涉及一种重组宿主细胞，其含有本发明的重组载体。
本发明的再一方面涉及一种引物对，其包含SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示的核苷酸序列，和/或包含SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列。具体地，所述引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO：7和SEQ ID NO：8所示，和/或如SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示。
本发明的再一方面涉及一种抗体，其能够与本发明的蛋白（Rv1198和/或Rv2016）特异性结合；具体地，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体；具体地，所述抗体连接有可检测的标记物。
所述多克隆抗体或单克隆抗体可以参照本领域人员知悉的方法制备。
在本发明中，术语“特异性结合”具有免疫学的一般含义，例如抗原抗体间的结合。
本发明的再一方面涉及一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部 分，其中，所述抗体部分为本发明的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类、和生物素中的一种或多种
本发明的再一方面涉及一种组合物，其含有本发明的蛋白（Rv1198和/或Rv2016）、本发明的核苷酸、本发明的重组载体、本发明的重组宿主细胞、本发明的引物对、本发明的抗体、或者本发明的抗体偶联物；可选地，所述组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂；具体地，所述组合物为疫苗组合物，并且所述药学上可接受的载体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂。
在本发明中，术语“疫苗用载体或赋形剂”是指选自如下物质的一种或多种，包括但不限于：pH调节剂、表面活性剂、佐剂、离子强度增强剂。具体地，例如，pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液，表面活性剂包括但不限于阳离子，阴离子或者非离子型表面活性剂。其中，非离子型表面活性剂包括但不限于:Tween-80。佐剂包括但不限于氢氧化铝，氟氏完全佐剂。离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明的抗体、本发明的抗体偶联物、或者本发明的引物对；具体地，所述试剂盒为用于诊断结核病特别是肺肺结核或者检测结核杆菌的试剂盒。
本发明的再一方面涉及一种筛选药物的模型，其包含本发明的蛋白（Rv1198和/或Rv2016）或者本发明的核苷酸；具体地，所述药物为诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为抗结核杆菌的药物。
例如，可以通过被筛选的药物是否能够检测本发明的蛋白（Rv1198和/或Rv2016）或者本发明的核苷酸，来判断被筛选的药物是否能够用作诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为抗结核杆菌的药物。
本发明的再一方面涉及本发明的蛋白或者本发明的核苷酸在制备 或者作为筛选药物的模型中的用途，具体地，所述所述药物为诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物或者为检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物。
本发明的再一方面涉及本发明的蛋白（Rv1198和/或Rv2016）、本发明的核苷酸、本发明的重组载体、本发明的重组宿主细胞、本发明的引物对、本发明的抗体或者本发明的抗体偶联物在制备诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病特别是肺结核的药物（包括但不限于疫苗）或者制备检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物中的用途。
本发明的再一方面涉及一种在体内或体外检测结核杆菌的方法，包括使用本发明的抗体或者本发明的引物对的步骤；具体地，所述方法为抗原检测方法（例如western blot或者ELISA）或者PCR法。一种在体内或体外检测结核杆菌的方法，其为ELISPOT法。检测的样本包括但不限于：被检测者的痰液、血液、组织、淋巴细胞、DNA等等。
本发明的再一方面涉及一种诊断结核病特别是肺结核的方法，包括使用本发明的抗体或者本发明的引物对的步骤；具体地，所述方法为抗原检测方法（例如western blot或者ELISA）或者PCR法。一种诊断结核病特别是肺结核的方法，其为ELISPOT法。
下面还给出了本发明涉及的部分术语的解释。
表达载体
本发明还涉及包含本发明核酸序列、启动子和转录及翻译终止信号的重组表达载体。可以将上述各种核酸和调控序列连接在一起来制备重组表达载体，该载体可以包括一个或多个方便的限制位点，以便在这些位点插入或取代编码本发明的蛋白或抗体的核酸序列。或者，可以通过将核酸序列或包含该序列的核酸构建体插入适当表达载体而表达本发明所述核酸序列。制备表达载体时，可使编码序列位于载体中以便与适当的表达调控序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何便于进行重组DNA操作并表达核酸序列的载体(例如质粒或病毒)。载体的选择通常取决于载体与它将要导入的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭环质粒。
载体可以是自主复制型载体(即存在于染色体外的完整结构，可独立于染色体进行复制)，例如质粒、染色体外元件、微小染色体或人工染色体。载体可包含保证自我复制的任何机制。或者，载体是一个当导入宿主细胞时，将整合到基因组中并与所整合到的染色体一起复制的载体。此外，可应用单个载体或质粒，或总体包含将导入宿主细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒，或转座子。
优选本发明所述载体含有一个或多个便于选择转化细胞的选择标记。选择标记是这样一个基因，其产物赋予对杀生物剂或病毒的抗性、对重金属的抗性，或赋予营养缺陷体原养型等。细菌选择标记的例子如枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者抗生素如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素的抗性标记。
优选本发明所述载体包含能使载体稳定整合到宿主细胞基因组中，或保证载体在细胞中独立于细胞基因组而进行自主复制的元件。
就进行自主复制的情况而言，载体还可以包含复制起点，使载体能在目标宿主细胞中自主地复制。复制起点可以带有使其在宿主细胞中成为温度敏感型的突变(参见例如，fEhrlich,1978，美国国家科学院学报75：1433)。
可以向宿主细胞插入一个以上拷贝的本发明核酸序列以提高该基因产物的产量。该核酸序列的拷贝数增加可以通过将该序列的至少一个附加拷贝插入宿主细胞基因组中，或者与该核酸序列一起插入一个可扩增的选择标记，通过在有合适选择试剂存在下培养细胞，挑选出含有扩增拷贝的选择性标记基因、从而含有附加拷贝核酸序列的细胞。
用于连接上述各元件来构建本发明所述重组表达载体的操作是本领域技术人员所熟知的(参见例如Sambrook等，分子克隆实验手册，第二版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989)。
宿主细胞
本发明还涉及包含可用来重组生产本发明的蛋白或抗体的本发明所述核酸序列（多核苷酸）的重组宿主细胞。可将包含本发明之核酸序列的载体导入宿主细胞，从而使该载体以上述染色体整合体或自我复制的染色体外载体形式得以维持。术语“宿主细胞”涵盖任何由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的后代。宿主细胞的选择很大程度上取决于本发明的蛋白或抗体编码基因及其来源。
宿主细胞可以是原核细胞或者真核细胞，例如细菌或酵母细胞。可以通过本领域技术人员熟知的技术将载体导入宿主细胞。
制备方法
本发明还涉及重组制备本发明本发明的蛋白或抗体的方法，该方法包括：(a)在适于产生本发明的蛋白或抗体的条件下，培养含有核酸构建体的宿主细胞，该核酸构建体包含编码所述本发明的蛋白或抗体的核酸序列；和(b)回收该肽。
在本发明所述制备方法中，用本领域已知方法在合适本发明的蛋白或抗体产生的营养培养基中培养细胞。例如，可以在合适的培养基中，在允许本发明的蛋白或抗体表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、分批加料或固态发酵)来培养细胞。在包含碳源和氮源以及无机盐的合适的培养基中，采用本领域已知的步骤进行培养。合适的培养基可由供应商提供或者可以参照公开的组成(例如，美国典型培养物保藏中心的目录中所述)来制备。如果本发明的蛋白或抗体被分泌到培养基中，则可以直接从培养基中回收。如果本发明的蛋白或抗体不分泌，可以从细胞裂解物中回收。
可以用本领域已知方法回收所产生的本发明的蛋白或抗体。例如，可以通过常规操作(包括，但不限于离心、过滤、抽提、喷雾干燥、蒸 发或沉淀)从培养基中回收。
可以通过各种本领域已知的操作来纯化本发明所述本发明的蛋白或抗体，这些操作包括，但不限于层析(例如，离子交换层析、亲和层析、疏水作用层析、层析聚焦、和大小排阻层析)、HPLC、电泳(例如，制备性等电点聚焦)、差示溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或抽提(例如参见，蛋白质纯化，J.C.Janson和Lars Ryden编，VCH Publishers,New York,1989)。
在本发明中，术语“结核杆菌”，包括但不限于，例如，结核分枝杆菌；术语“结核分枝杆菌”包括但不限于，结核分枝杆菌H37Rv。
发明的有益效果
本发明的蛋白可以作为作为结核病（例如肺结核）或结核杆菌细胞免疫诊断分子标识，具有良好的符合率和反应强度。
附图说明
图1：Rv2127-Rv2234基因片段的PCR扩增结果。其中，泳道M表示DNA marker（DL2000：2000，1000，750，500，250，100bp）；泳道2为Rv1198；泳道3为Rv2016。
图2：表达后Rv1198和Rv2017的PAGE。其中，泳道M表示蛋白marker，泳道4为Rv2016，泳道6为Rv1198。
图3：蛋白纯化结果。其中，泳道M表示蛋白marker；泳道1为Rv2016；泳道2为Rv1198。
图4：1160个蛋白的ELISPOT初筛鉴定结果分布图。其中，白色小星为Rv1198的细胞免疫反应强度，黑色小星为Rv2016的细胞免疫反应强度。
图5：10个蛋白的ELISPOT鉴定部分结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件（例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社）或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：MTB H37Rv的相关基因的克隆和表达（Gateway法）
Invitrogen公司的Gateway技术为蛋白的重组和表达提供了一种可能，它是从PCR产物开始创建GatewayTM入门克隆。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONRTM(包含attP位点)以及GatewayTM BP ClonaseTM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与GatewayTM目的载体pDEST17进行重组表达，快速高效得到目的蛋白[Walhout AJ,Temple GF,Brasch MA.etal.GATEWAY recombinational cloning:application to the cloning of large numbers of open reading frames orORFeomes.Methods Enzymol,.2000,328:575-592；Rachael M.Goldstone,NicoleJ.Moreland,Ghader Bashiri,etal.A new Gateway_vector and expression protocolfor fast and efficient recombinant protein expression in Mycobacteriumsmegmatis.Protein Expression and Purification57(2008)81–87；A high throughputscreen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophilaembryogenesis.PNAS1998;95;9973-9978.]。
本实验以于MTB H37Rv的基因组为模板，利用Invitrogen公司提供的Gateway技术，表达全部ORF编码的蛋白质，经过western blot方法检测临床血浆获得具有较高敏感性特异性抗原，为临床诊断、疾 病治疗、预防控制提供坚实的物质基础。
一、实验方法
1.基因序列的获取
根据已经公开的MTB H37Rv的ORFs基因序列，用Primer designer设计引物序列，按照Gateway系统的引物设计方案，为引物序列添加attB臂，由北京新擎科公司完成引物的合成。
其为正向引物臂为：
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC（SEQ ID NO：5）；
反向引物臂为：
GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCCTA（SEQ ID NO：6）。
共完成引物设计3535对，因篇幅所限，部分引物如下面的表1所示。
表1：部分合成引物（不含att臂的部分）
以H37Rv基因组为模板（来源于北京结核病预防控制所），用添加了attB臂的正反向引物来扩增不同ORFs，PCR体系如下：
PCR反应条件为：98℃热启动（初试温度为94℃），97℃变性1min，60℃（58－65℃）退火1min，72℃延伸3min，30个循环。最后72℃温育，30min。
取5μl PCR扩增产物在0.8%琼脂糖凝胶进行电泳，用DNAMarker DL2,000作标准分子量，在紫外灯下观察电泳结果，并进行拍照。
琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下切出含有目的大小DNA片断的胶块，每切一次，用超纯水冲洗刀片，并擦干净，将切下的胶片尽可能的切成小片，放入Eppdorf管；短暂离心，观看体积，加3倍体积的QG，50℃水浴，10min，直到胶完全溶解（溶液呈黄色），水浴过程中，反转Eppendorf管2－3次每隔3min，如果片断大小在400bp以下或4000bp以上，则在EP管中加1倍体积的异丙醇，混匀；将溶解的胶液加入到QIAquick spin column中，12000r/min，离心1min弃去收集管中液体；在QIAquick spin column中再加入500μl的溶胶液QG，12000r/min，离心1min，以除去多余的琼脂，弃去收集管中液体，在QIAquick spin column中加入750μl洗液PE，静止3－5min，12000r/min，离心1min；弃去废液，12000r/min，再次离心1min；将QIAquick spin column放入新的写好编号1.5mLEppendorf管，在 QIAquick spincolumn中心加50μl温热的DNA溶解液（EB溶液），静止5min，然后12000r/min离心1min，把Eppendorf管中液体重复离心一次，以增加DNA洗脱量。
琼脂糖凝胶电泳检测，定量，-20℃保存，备用。
2.Gateway系统的BP反应
重组是从PCR产物创建GatewayTM入门克隆的另一种方法。这种方法是通过合并attB位点到上游和下游引物上，然后共同孵育PCR扩增产物和pDONRTM载体(包含attP位点)以及GatewayTMBPClonaseTM酶混合物。接着转化进大肠杆菌中，将会获得包含目的基因的入门克隆，同时目的基因两侧具有attL重组位点。这个入门克隆可以与任何GatewayTM目的载体进行重组。
反应体系同时设阳性对照，pEXP7-tet50ng/μl，取1μl，其余用水补齐；
attB-PCR product(≥10ng/μl;final amount15－150ng)，7μl；
pDONRTM211，1μl；
TE buffer，pH8.0，8μl。
从低温冰箱取出BP ClonaseTM II enzyme mix冰上融解，漩涡震荡二次，每次2s，每孔样品加入2μlBP ClonaseTM II，震荡二次，轻微离心；将BP ClonaseTM II enzyme mixto迅速放回低温冰箱；25℃孵育过夜；每孔2μg/μl蛋白激酶K加入1μl，37℃，1h，终止反应。将连接好的反应产物，转化感受态细胞。
3.重组质粒的转化
按照参考文献（J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔主编.分子克隆实验指南[M]第三版，[9]：1217-1265.）执行，从低温冰箱取出已经制备好的感受态菌并向其中加入3.5μl连接产物，混匀后冰浴30min。将96孔板移入42水浴中，恰好停留90s（切忌振荡）；立即将96孔板置于冰浴中，5min；向96孔板中加入450μl LB液体培养基，在37恒温振荡（2000r/min）培养60min。收集培养的细菌，涂布到带卡那霉素抗性的LA平板上，37℃孵育过夜；挑取单克隆菌落接种，散布在50μl 灭菌超纯水中，99℃变性，做菌落PCR，验证是否为阳性克隆，同时分出25μl接种在含有卡那霉素抗性96孔板中（LB培养基）；37℃孵育过夜，准备提取质粒。
菌落PCR引物的选择：根据pDONR221质粒而来，此菌落扩增是从M13噬菌体开始的，选用：
M13forward primer：GTAAAACGACGGCCAGT（SEQ ID NO：43）；reverse primer:CAGGAAACAGCTATGAC（SEQ ID NO：44）；
阳性对照：H37Rv基因组DNA0.5μl，25μl体系，用水补齐；阴性对照：不加菌。
25μlPCR体系：
PCR反应条件为：98℃热启动97℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环。最后72℃温育30min。
0.8%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆菌落（大小正确的即为阳性）以待下步提质粒建立Eetry clone。
4.质粒提取
96孔板质粒的提取方法，在96V型底板中得到纯化后的DNA。
Qiagen试剂盒提取高拷贝质粒pDONR221和低拷贝质粒pDEST17（http//www.qiagen.com）
提取质粒用缓冲液：BufferI（重悬液）室温保存，BufferII（裂 解液）室温保存，Buffer III（中和液）室温保存，Buffer IV（杂质清除液A），4℃保存。Buffer V（杂质清除液B）室温保存，Buffer VI（杂质清除液C），4℃保存，RNase A（20mg/mL）-20℃保存。
所需其它试剂：TE（Tris-HCl10mM，EDTA1mM，pH8.0，超纯水配制，高压或过滤灭菌），异丙醇和70%乙醇（超纯水与无水乙醇配制）。
试剂盒可作20次（<150mL菌液/次）质粒提取纯化。常温运输。RNase A于-20℃保存，首次使用时加入BufferI中混匀，置4℃保存。Buffer IV与Buffer VI置4℃保存，其余溶液保存于室温。有效期6个月。Buffer II和Buffer V可能会有沉淀产生。请各在37℃水浴和50℃水浴加热溶解，然后混匀使用。Buffer IV如有分层，混匀即可使用。
质粒提取前准备：将RNase A加入Buffer P1终浓度为100μg/mL；如果Buffer P2有沉淀可以加热到37℃溶解；预冷BufferP3至4℃
质粒的提取步骤：
1）向QIAGEN-tip500加入10mL的QBT，使溶液随重力流线，预平衡之；
2）挑取单克隆菌落接种到4mL LB培养基中，300r/min培养过夜；第二天按1：500放大，加入氨苄青霉素终浓度为50μg/mL，培养12－16h，收集500mL菌液，装入合适的离心瓶中，6,000g，于4℃离心15min沉淀菌体，完全弃除上清。
3)加入125mL BufferI，充分混悬震荡菌体沉淀，使其完全分散开，至无絮块存在。加入125mL BufferII，轻轻颠倒离心管6－8次，室温放置5min，使细菌完全裂解，溶液透明。
4)加入125mL预冷Buffer III，立即颠倒离心管6－8次，充分混匀，至白色絮状物产生。冰上放置30min。
5)上述裂解液于4℃20000g离心30min，小心吸出上清，移入新的离心管中。
6)4℃20000g再次离心15min，小心吸出上清，提前平衡好的GIAGEN-tip中。靠重力流出液体，质粒进入树脂；
7)加入600mL的Buffer QC洗涤；
8)加入100mLBuffer QF，洗脱；
9）加入70mL的室温放置的异丙醇，混合，立即15,000g，4℃离心30min；
10）用室温放置的70%的乙醇洗涤，15,000g，4℃离心10min；
11）干燥10－20min，加入1mLTEe（pH8.0）；
12）反复溶解一次。
13）琼脂糖电泳鉴定提取得质粒DNA。
5.LR反应，BP反应产生入门克隆
LR反应是含attL位点的入门克隆（Entry clone）和包含attR位点的目的载体之间的重组反应。LR反应产生一表达克隆。表达克隆包含目的基因和目的载体特异的启动子或者一些元件。
反应体系，同时设阳性对照pENTRTM-gus（卡那霉素抗性）
入门克隆(50－150ng) 7μl
Destionation vector(150ng/μl，pDEST17) 1μl
TE buffer,pH8.0 总计8μl
从低温冰箱取出LR ClonaseTM II enzyme mix冰上融解，漩涡震荡二次，每次2s，
每孔样品加入2μlLR ClonaseTM II enzyme mix，震荡二次，轻微离心；
将LR ClonaseTM II enzyme mix迅速放回低温冰箱；
25℃孵育过夜；
每孔加入2μg/μl蛋白激酶K1μl，终止反应。
将连接好的反应产物，转化感受态细胞。
质粒提取同上，以表达质粒PCR来验证阳性结果，25μl体系，引物引物的选择:attB位点已经恢复，
Forward primer attB1：
GGGG-ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TTC（SEQ ID NO：5）
Reverse primer attB2：
GGGG-AC-CAC-TTT-GTC-CAA-GAA-AGC-TGG-GTC-CTA （SEQ ID NO：6）。
阳性对照：H37Rv基因组DNA0.5μl，用水补齐25μl。阴性对照：未加菌。
25μlPCR体系：
PCR反应条件为：98℃热启动97变性1min，60℃退火1min，72℃延伸3min，30个循环。最后72℃温育30min。
0.8%琼脂糖凝胶电泳，鉴定阳性克隆菌落（大小正确的即为阳性）以待下步提取质粒，建立Expression clone；
6.将表达克隆转化到表达菌株
携带目的基因的表达质粒带有氨苄青霉素抗性，转化到表达菌株BL21（DE3）和携带氯霉素抗性Competent Cells中，转化步骤同上2.5，挑取单克隆菌落，接种到含不同抗性的LB液体中，37℃，200r/min，过夜；
IPTG诱导表达
取2.9.1中过夜生长的96-well-plate菌液50μl（1:20）稀释到1mL LB（Ampr）的96-well-plate（2板）中，37℃培养细菌，300r/min，大约3－4h，到OD600=0.6。
IPTG诱导步骤：
取100mM IPTG加入96-well-plate中，至终浓度0.5mM.(200x稀释)，例如1mL培养基中加5μl。96-well-plate中为Amp抗性培养基
一板37℃，250r/min诱导5h，一板37℃，250r/min诱导过夜，设未加IPTG的阴性对照和gus阳性对照。然后4℃，3950r/min离心5min，弃上清，后进行上样样品的处理
注：可以设为三个不同诱导温度0.2mM，0.5mM，0.8mM。温度28℃，37℃。
7.不连续SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
上层：浓缩胶（staking or concertration gel）5%缓冲液pH6.8；
下层：分离胶（separation or resolving gel）12%缓冲液pH8.8。
加入TEMED以后，迅速混合并灌注在胶板内，注意留出灌注成层胶所需空间（梳子的齿长再加0.5－1cm）。用水密封胶(压平和防止氧化)。室温下（约30－45min）聚合。
聚合后弃去水封，用滤纸吸干。
配制积层胶：
先插入梳子，然后加入TEMED，混匀后立即在聚合的分离胶上灌注积层胶，小心避免混入气泡，凝胶垂直放置于室温下。
成层胶聚合完全后，大约20min，小心移出梳子，把凝胶板转移至电泳装置上，准备上样。
上样样品的处理（可先处理）：把诱导过的样品4000r/min，离心10min，弃上清，然后加50μl灭菌超纯水震荡混匀，然后取出20μl到96-well plate，加2x样品缓冲液20μl，连同蛋白Marker100℃变性10min，上样20μl，空孔用样品缓冲液补，阴性对照用未诱导过的菌同时培养的感受态细胞。
上样：组装上每块胶板，观察是否漏液，用八孔道移液器或是单 个加样，小心将插入样品孔上方，轻轻推入样品15－20μl，防止注射器内气泡进入孔内（蛋白Marker加20μl）。
以不同位置蛋白Marker来区分不同的蛋白组合。
电泳：将垂直电泳槽中加入电泳缓冲液（液面高过电极线路）。接上电源开始电泳。开始电压80V，当染料进入分离胶后（约0.5h），电压增加到100V，继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部后切断电源（约2h）。
取胶，用刮勺撬开玻璃板，按不同的组合放入不同的染色缸，染色1h，脱色后1h，并对照不同的基因对应的蛋白大小切除正确大小的蛋白凝胶于1.5mLEP管，－20℃保持，以待后续分析用。
二、实验结果
切胶纯化后96孔板基因电泳结果，共得到3535个目的基因，3372入门克隆，3245个表达克隆，表达蛋白1916个。
其中，Rv1198和Rv2017的基因电泳结果如图1所示。
蛋白Rv1198和Rv2017的SDS-PAGE结果如图2所示。
96孔板基因扩一共有32板，每个基因的大小均有不同的列表，因为较多的图片资料，故只列出Rv1198和Rv2017的电泳图。
三、结果分析
与从http://www.ncbi.nlm.nih.gov/下载的H37Rv基因组开放阅读框（ORFs）总数及表达蛋白在其中的分布结果进行比对，如下面的表2所示。
表2：表达蛋白的功能分布
由表2可见，本实验中表达的蛋白对全基因组有很好的覆盖率。
实施例2：蛋白表达和纯化
一、实验方法
蛋白纯化是进行下游实验的必要条件，原核细胞表达后可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究某一个蛋白质，必须首先将该蛋白质从其他蛋白质和非蛋白质分子中纯化出来方能够去除外源的杂蛋白造成的假阳性，要高效率高纯度的蛋白需要通过高通量的蛋白纯化。本实验的表达蛋白为含有6His标签的原核表达，因此采用His.Tag序列相邻组氨酸和固定化金属镍离子的亲和力来进行纯化。
1.菌种复活及扩增
制备菌种复苏及扩增所需LB培养基，待其冷却后加入相应抗生素。氨苄青霉素储存浓度50mg/mL，使用浓度50μg/mL；氯霉素储存浓度50mg/mL，使用浓度34μg/mL），将第一章鉴定表达的菌种从低温冰箱取出，解冻后每管接种10μl菌种。37℃，200r/min，过夜。菌种扩增、表达及菌种保存：扩增LB中同样加入相应浓度抗生素，1：50扩增（视情况1：20），约2小时左右至OD600至0.6（留1mL不加抗生素的LB做阴性对照，任意接一个菌用于测量OD值）。菌种至0.6时，先各取1mL菌液做未诱导对照，其余加入IPTG(1mL：50μl)，依原诱导条件37℃或28℃，200r/min，过夜诱导12－16小时。剩余菌液用于保存菌种，各两管（甘油终浓度15％）。
先从诱导后菌液中取2mL，4℃，6000r/min，15min收集沉淀，溶解于100μl纯水中，做诱导后对照.其余菌液4℃，6000r/min，15min收集菌体沉淀，留200μl上清，浓缩，检测是否属于分泌性蛋白。
沉淀称重，以5－10mLlysisbuffer/g溶解。
加入0.1mg/mLlysozyme，1mMPMSF（终浓度），4℃搅拌30min。
超声裂解。10sec超声，10sec间歇，共10－15分钟。注意一直在冰上操作。
每超声一个样品，彻底清洗探头。
4℃，12000r/min，20min分别收集上清液与沉淀。
在进行纯化之前先取上清和沉淀做可溶性鉴定，根据蛋白分布决定纯化方法。
裂解上清液可直接用于纯化，注：留30μl上清液做对照。沉淀以洗涤液重新溶解，洗涤一次。
4℃，12000r/min，20min收集沉淀，称重，重新以bindingbuffer（含8M尿素）溶解，10－20mg/mL，室温作用1小时。
4℃，12000r/min，20min收集变性上清液，直接用于纯化，留30μl做对照。
2.蛋白纯化
填料混合物预先处理，乙醇沉降，用纯水冲洗一次，缓冲液平衡。
裂解上清液和变性上清液经0.45um滤膜过滤，与适量填料结合1小时（裂解上清液应一直放在冰上）。
收集流出液。
以bindingbuffer洗涤1－2次，分别收集洗涤液。
以1mL不同浓度洗脱液洗脱目的蛋白，分别收集洗脱液。
SDS-PAGE分析。其中，蛋白Rv1198和Rv2017的SDS-PAGE结果如图3所示。
BCA试剂盒蛋白定量。
BCA试剂盒蛋白定量定量比较适合多个蛋白定量，以96孔板为基础，按试剂盒程序操作。
二、实验结果
纯化共得到1600个蛋白，用于实施例3中的实验。
其余的316个蛋白在纯化过程中没有得到，不拘于理论的限制，原因可能是：纯化过程按包涵体纯化，如果是融合蛋白可能会丢失；大规模纯化没有再对这些蛋白进行再次纯化；可能是表达量非常低，小体积纯化得不到。
实施例3：ELISPOT分析
酶联免疫斑点（ELISPOT）技术是当今世界上检测生物体细胞免 疫水平的最佳技术。它集高灵敏度、高可信度、高通量、单细胞水平、功能性检测与低成本等诸多优点于一身，在国内外免疫学界获得了广泛的应用，成为主流免疫学检测技术之一。ELISPOT检测原理如下：
A.用抗γ-干扰素的单克隆抗体包被在检测孔的底部。
B.分离待检测样本的淋巴细胞。
C.将待测细胞放入检测孔中培养约20小时，同时加入抗原（刺激物）。在培养期间，对抗原有特异反应的T淋巴细胞就会被激活，开始分泌特定的细胞因子（如γ-干扰素），这些细胞因子同时被板底的单克隆抗体捕获；对抗原没有反应的细胞则不受刺激，也不分泌特定的细胞因子（如γ-干扰素）。
D.移出细胞，板底留下细胞因子的潜在影像。
E.这种潜在的影像可以通过酶联显色的方式变成真正的影像-斑点。
F.每一个斑点代表了一个对特异抗原有反应的特异性T淋巴细胞。斑点的数目多少就反映了样本的细胞免疫的识别状态：斑点多说明免疫识别状态好，斑点少说明免疫识别状态差或者出现免疫耐受。
结核感染的免疫应答反应以细胞免疫为主，作为免疫应答的一部分，T细胞受结核抗原刺激致敏，形成活化的效应T细胞，包括CD4和CD8，从全血中单独被分离出来，在体外受抗原特异性的刺激并被记数。因此结核病的诊断可以应用此方法来诊断。
两个单独具有特异性的抗原ESAT-6和CFP10，联合应用能够提高检测灵敏度。ELISPOT检测是高灵敏度的，在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前，其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子。因此本实验以临床病人的检测平台，对ESAT-6检测阳性的病人（临床诊断标准为：ESAT-6阳性，痰涂阳性或培养阳性或PCR阳性）为研究对象，提取其PBMC，按ELISPOT检测方法筛选可用于细胞免疫诊断分子诊断标识的筛选。
一、实验方法
使用深圳达科为提供的试剂盒（Human IFN-γprecoated Elispot Kit,货号：DKW22-1000-500）进行试验。
分离外周淋巴细胞，并使细胞数为2x106每毫升，每孔加100μl细胞悬液(无血清培养基稀释细胞)（深圳达科为，DKW34-EU0100），分别加入刺激物，设空白对照、阳性对照及实验表达的阳性对照，阴性对照等，盖上板，放细胞于37℃，CO2孵箱，合适的时间15－20小时（在此期间不要摇动或平移平板）；其中：
阳性对照为ESAT-6（终浓度5μg/ml）以及本实验表达纯化的ESAT-6（8μg/ml），同时设阴性对照（体系缓冲液）和空白对照（只加细胞不加刺激物），以表达纯化的蛋白作为待检测蛋白（8μg/ml）。如果试剂盒的阳性对照ESAT-6检验结果为阳性，本实验表达纯化的ESAT-6对照同样为阳性，并且待检蛋白也为阳性，则这个待检蛋白可以作为阳性反应抗原。浓度备注：表达纯化的蛋白只经过HIS标签纯化，没有进行更进一步纯化，因此真正起作用的蛋白的量是经过胶图分析，按实际表达蛋白在纯化后总蛋白量所占的比例推算。
本实验使用植物凝集素PHA作为阳性指控条件，其只要有细胞孔中就有斑点，因为它是非特异的刺激细胞产生一些因子并可以显示出斑点（终浓度5μg/ml）。
在洗涤槽上轻弹培养板倒空液体，并在吸水纸上拍干；
每孔加100μl含0.1%Tween20的PBS，4℃放置2分钟；
弃去液体，反复用含0.1%Tween20的PBS洗板5次，并彻底拍干；
每一块板，稀释100μl检测抗体（生物素标记的抗human INFγ抗体，即2抗）是试剂盒中提供的，可以与包被的单克隆抗体相结合；
到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100μl，封闭培养板放于37℃1小时；
倒空培养板并用含0.1%Tween20的PBS洗5次，拍干；
每一块板，稀释10μl链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物到10ml含1%BSA的PBS中，每孔加100μl，封闭培养板放于37℃1小时；
倒空，用含0.1%Tween20的PBS洗5遍，反复用吸水纸吸以去 尽所有残存的液体。
每孔加100μl备用显色溶液，让反应在室温进行5－20分钟。肉眼可见小斑点形成。
用蒸馏水洗三次。
干燥每孔，计数斑点。斑点在4℃过夜后可能会变得明显，放置培养板于室温，避免直接光照。
二、实验结果
判定方法：读值大于40个点判定为阳性，标准阳性孔阳性且表达蛋白为阳性记录统计结果，并计算表达蛋白与标准阳性蛋白的符合率。
实验结果如图4所示。
共进行了1600个蛋白的鉴定，对120例临床病人进行了初筛，得到61个阳性蛋白，并对这61个阳性蛋白中反应比较强的10个蛋白进行了复筛，复筛方法和初筛相同。
复筛的如图5所示，复筛的病人数10个，健康对照4个，得到了2个和现今正在使用的阳性标准反应蛋白符合的蛋白Rv1198和Rv2016，符合率分别为70%和60%，计算方法是表达的蛋白阳性数在试剂盒中的ESAT-6阳性数中占的比例。
表3：验证高水平反应的两个蛋白的ELISPOT结果
经计算，Rv1198和Rv2016与ESAT-6的反应强度分别为56%和46%（表达蛋白反应点数与表达的ESAT-6反应点数之比），这两个蛋白随比ESAT-6符合率低，反应强度也稍弱，但作为细胞水平的免疫诊断分子标识具有重要的应用价值。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (18)

1.一种分离的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
2.一种分离的核苷酸，其编码权利要求1所述的蛋白。
3.根据权利要求2所述的分离的核苷酸，其中，所述核苷酸的序列如SEQ ID NO：4所示。
4.一种重组载体，其含有权利要求2或3所述的核苷酸。
5.一种重组宿主细胞，其含有权利要求4所述的重组载体。
6.一种抗体，其能够与权利要求1所述的蛋白特异性结合。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中，所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
8.根据权利要求6或7所述的抗体，其中，所述抗体连接有可检测的标记物。
9.一种抗体偶联物，包括抗体部分和偶联部分，其中，所述抗体部分为权利要求6至8中任一项所述的抗体，所述偶联部分为选自放射性核素、药物、毒素、细胞因子、酶、荧光素、载体蛋白、脂类和生物素中的一种或多种。
10.一种组合物，其含有权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的核苷酸、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组宿主细胞、权利要求6至8中任一项所述的抗体或者权利要求9所述的抗体偶联物。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中，所述组合物还含有药学上可接受的载体或赋形剂。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，所述组合物为疫苗组合物，并且所述药学上可接受的载体或赋形剂为疫苗用载体或赋形剂。
13.一种试剂盒，其包含权利要求6至8中任一项所述的抗体或者权利要求9所述的抗体偶联物。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，所述试剂盒为用于诊断结核病或者检测结核杆菌的试剂盒。
15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述结核病是肺结核。
16.权利要求1所述的蛋白、权利要求2或3所述的核苷酸、权利要求4所述的重组载体、权利要求5所述的重组宿主细胞、权利要求6至8中任一项所述的抗体或者权利要求9所述的抗体偶联物在制备诊断和/或治疗和/或预防和/或辅助治疗结核病的药物或者制备检测结核杆菌或抗结核杆菌的药物中的用途。
17.根据权利要求16所述的用途，其中，所述药物为疫苗。
18.根据权利要求16或17所述的用途，其中，所述结核病是肺结核。
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