CN101438166A - 产生针对结核病的免疫应答的方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了产生针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(Mtb)的免疫应答的方法。在几个实施例中，免疫应答是保护性免疫应答。在其它实施方案中，公开了预防Mtb感染或治疗Mtb感染的方法。还公开了预防和/或治疗结核病的药物组合物。

Description

产生针对结核病的免疫应答的方法
优先权声明
本申请要求2006年3月14日提交的美国临时专利申请No.60/782,364的权益，该临时专利申请在此引为参考。
政府资助声明
本发明是在依照国立卫生研究院(National Institutes of Health)许可号No.NIH-R01-AI48090和No.NIH NIAID HHSN266200400081CN01-AI-40081的美国政府资助下完成的；美国政府在本发明中有确定的权利。本发明也是在退伍军人事务部(Department of Veteran’s Affairs)的资助下完成的。
发明领域
本申请涉及免疫学领域，更具体来说，涉及产生针对结核病抗原的免疫应答的方法。
发明背景
分枝杆菌属于好氧细胞内细菌生物属，在感染宿主后，存活于单核细胞和巨噬细胞的内体区室中。人类的分枝杆菌疾病包括结核病(由结核分枝杆菌(M.tuberculosis)引起)、麻风病(由麻风分枝杆菌(M.leprae)引起)、Bairnsdale溃疡病(由溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)引起)，以及由海鱼分枝杆菌(M.marinum)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、斯氏分枝杆菌(M.szulgai)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、龟分枝杆菌(M.chelonei)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)和胞内结核杆菌(M.intracellulare)引起的各种不同的感染(参见Wolinsky，E.的《微生物学：包括免疫学和分子遗传学》(第三版)(Microbiology：Including Immunology and MolecularGenetics，3rd Ed.，Harper & Row，Philadelphia，1980)中的第37章。
世界人口中的三分之一携带有结核分枝杆菌，并处在发展结核病(TB)的风险中。在免疫受损的患者中，结核病以接近对数级增加，并出现了多药耐受菌株。此外，以前被认为是非病原性菌株的分枝杆菌菌株(例如鸟分枝杆菌(M.avium))，现在已经变成了免疫抑制的AIDS患者的主要杀手。此外，目前的分枝杆菌疫苗或者不充分(例如用于结核分枝杆菌的BCG疫苗)，或者没有(例如对于麻风分枝杆菌)(Kaufmann，S.，Microbiol.Sci.4：324-328，1987；美国国会技术评估办公室(U.S.Congress，Office of Technology Assessment)的《结核病的持续挑战》(TheContinuing Challenge of Tuberculosis，OTA-H-574，U.S.GovernmentPrinting Office，Washington，D.C.，1993)第62-67页)。
结核分枝杆菌(Mtb)特异性CD4+和CD8+T细胞对于有效控制Mtb感染是关键的。在小鼠模型中，将CD4+T细胞被动转移到被亚致死辐射的动物中，使得它们对Mtb感染的易感性降低了(Orme，J Immunol.140：3589-3593，1988)。其中CD4(CD4-/-)基因或II类MHC分子的基因被破坏的小鼠以及CD4+T细胞被剥夺的野生型小鼠，证明了对Mtb感染的易感性增加(Flory等，J Leukoc Biol.51：225-229，1992)。在人类中，人类免疫缺陷病毒感染的个体在暴露于Mtb之后非常容易发展出结核病(TB)，支持了CD4+T细胞的重要作用(Hirsch等，J Infect Dis.180：2069-2073，1999)。CD8+ T细胞对于有效的T细胞免疫也是重要的(参见Lazarevic和Flynn，Am J Respir Crit Care Med.166：1116-1121，2002)。在人类中，Mtb特异性CD8+T细胞已经在Mtb感染的个体中被鉴定，并包括经典的HLA-Ia限制的(参见例如Lewinsohn等，JImmunol.165：925-930，2000)和非经典的HLA-Ib分子HLA-E限制的(Lewinsohn等，J Exp Med 187：1633-1640，1998)CD8+T细胞。但是，没有有效诱导针对Mtb的免疫应答例如CD8应答的疫苗或治疗策略。因此，对于能够产生针对Mtb的免疫应答、可以用于治疗和/或防护Mtb感染的药剂，仍然存在着需求。
发明简述
本文公开了产生针对结核分枝杆菌(Mtb)的免疫应答的方法。本文还提供了在对象中治疗Mtb感染或预防Mtb感染的方法。Mtb感染可以是潜伏的或活动的。
在几个实施方案中，所述方法包括给对象施用治疗有效量的多肽或编码该多肽的多核苷酸，其中所述多肽含有SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ IDNO：11或SEQ ID NO：12中显示的至少一种氨基酸序列。在其它实施方案中，所述方法包括了给对象施用治疗有效量的多肽，该多肽含有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12中显示的至少一种氨基酸序列的至少9到20个连续的氨基酸，其中9到20个连续氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)。在几个实施例中，免疫应答是保护性免疫应答。在其它实施方案中，公开了预防Mtb感染或治疗Mtb感染的方法。
本文描述的分离的多肽包含SEQ ID NO：1-12中显示的至少一种氨基酸序列的9到20个连续的氨基酸，其中9到20个连续的氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)，其中分离的多肽不包含任何SEQ ID NO：1-12中显示的全长氨基酸序列。编码这些多肽的核酸、包含这些核酸的载体、包含这些核酸的宿主细胞以及包含这些多肽、核酸和/或宿主细胞的免疫原性组合物，也被公开。还描述了包含治疗有效量的这些多肽、核酸和/或宿主细胞的药物组合物。
根据下面的几个实施方案的详细描述并同时参考附图，本发明的上述的和其它的特点和优点将变得更加明显。
附图简述
图1的两张图显示了使用IFN-γ ELISPOT分析方法离体(ex vivo)测定人类效应细胞频率。在IFN-γ ELISPOT分析中，磁珠纯化的CD8+T细胞与用Mtb感染(H37Rv，MOI＝50)或用代表CFP10(每种肽5μg/ml；15-mer长，11个氨基酸重叠)的肽合并物脉冲的DC(20,000/孔)一起培养。每个应答的T细胞种群在4个不同的细胞浓度双份测试。为了测定抗原特异性T细胞的效应细胞频率，将每份中每个孔的斑点的平均数对每个孔的应答细胞的数量进行作图。使用线性回归分析确定线的斜率，它代表了抗原特异性T细胞的频率。如果斑点数量的二项式概率在实验和对照分析中明显不同，那么分析被认为是阳性的(反映了存在有致敏(primed)T细胞应答)。
图2是显示了针对Mtb抗原的离体CD8+T细胞的频率与Mtb感染有关的一组图。如上所述(参见图1)，在IFN-γ ELISPOT分析中，为了确定离体CD8+T细胞的频率，将Mtb感染的或用识别肽合并物脉冲的自体DC与CD8+T细胞一起孵育。评估了没有Mtb感染迹象的对象、患有LTBI的对象以及患有活动的TB的对象(培养证实肺结核)。“Mtb感染的”包括患有潜伏性结核病(TB)感染和活动的结核病的对象。当P＝<0.05时P值是显著的(Wilcoxon/Kruskal-Wallis)。
图3a到3d是显示了确定的抗原特异性和HLA限制性(T细胞克隆D466 D6的性质)的一组数字照片。对于图3a-3c中显示的结果来说，为了鉴定T细胞克隆D466 D6识别的抗原和最小表位，将T细胞(5000细胞/孔)与自体LCL(20,000/孔)和5μg/ml抗原一起孵育。在共培养18小时后通过ELISPOT评估IFN-γ。对于图3a中显示的结果来说，由代表已知CD4+抗原的肽合并物组成的抗原由11个氨基酸重叠的15个氨基酸的肽构成。对于图3b中显示的结果来说，抗原由一起构成肽合并物的个体15个氨基酸的CFP10肽组成。对于图3c中显示的结果来说，抗原由个体的嵌套CFP101-15肽(10个氨基酸，9个氨基酸或8个氨基酸)构成，被用于对表位进一步作图。对于图3d中显示的结果来说，使用表达在一个或两个等位基因上与D466匹配的HLA等位基因的LCL(20,000/孔)来鉴定限制性等位基因，用CFP102-10(5μg/ml)作为APC进行脉冲。2小时后，在IFN-γ ELISPOT分析中，将细胞清洗并与T细胞(500细胞/孔)一起孵育。
图4是显示了证明D466 D6的最小表位作图的线形图。为了证实最小表位，将自体LCL(20,000/孔)用标明浓度的肽进行脉冲，并与T细胞(1000细胞/孔)共培养。在共培养18小时后，通过ELISPOT评估IFN-γ。每个点代表了双份测定的平均值。
图5是显示了CFP10免疫优势模式的分布情况的条形图。为了确定效应细胞的频率，使用每个个体15-mer的肽(5μg/ml)、肽合并物(PP；，每种肽5μg)或从每个供体(D466:CFP102-11；D480:CFP103-11；D481:CFP1075-83；5μg/ml)衍生的T细胞克隆确定的最小表位(ME)对自体DC(20,000/孔)进行脉冲，并针对250,000个磁珠纯化的CD8+T细胞进行了测试。在共培养18个小时后，通过ELISPOT评估IFN-γ的释放。每个点代表了双份测定的平均值。
图6是概述了最小表位作图数据的一组图。为了确定最小表位，将自体LCL(20,000/孔)标明浓度的肽进行脉冲，并与T细胞(1000细胞/孔)共培养。在共培养18小时后通过ELISPOT评估IFN-γ。每个点代表了双份测定的平均值。
图7是显示了对D504克隆进行最小表位作图的线形图。为了确定最小表位，将自体LCL(20,000/孔)与T细胞克隆(1000细胞/孔)以及标明浓度的肽进行共培养。在共培养18小时后通过ELISPOT评估IFN-γ。每个点代表了双份测定的平均值。
序列表
在所附序列表中列出的核酸和氨基酸序列使用在37 C.F.R.1.822.中定义的核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母代码来显示。每个核酸序列只显示了一条链，但是应该理解为对显示的链的任何引用都包括了互补链。在所附的序列表中：
SEQ ID NO：1-12是Mtb多肽的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13-14是Mtb肽的氨基酸。
SEQ ID NO：15-25是编码Mtb多肽的多核苷酸的核酸序列。
SEQ ID NO：26-38是特定的Mtb表位的氨基酸序列。
具体说明
本文公开了产生针对结核分枝杆菌(Mtb)的免疫应答的方法。在几个实施例中，免疫应答是保护性免疫应答。在其它实施方案中，公开了用于预防Mtb感染或治疗Mtb感染的方法。还公开了预防和/或治疗结核病的药物组合物。
术语
除非特别指明，技术术语按照常规的用法使用。常用的分子生物学术语的定义可以在牛津大学出版社(Oxford University Press)1994年出版的Benjamin Lewin的《基因V》(Genes V)，(ISBN 0-19-854287-9))、Kendrew等主编的《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia ofMolecular Biology)，Blackwell Science Ltd.，1994出版(ISBN0-632-02182-9)；和Robert A.Meyers主编的《分子生物学和生物技术：综合桌上参考》(Molecular Biology and Biotechnology：a ComprehensiveDesk Reference)，VCH Publishers，Inc.，1995出版(ISBN 1-56081-569-8)中发现。
为了便于对本公开的各种不同实施方案进行浏览，提供了下面的对特定术语的解释：
佐剂：用于增强抗原性的介质。佐剂包括其上吸附抗原的矿物质(明矾、氢氧化铝或磷酸盐)悬液，或抗原溶液在矿物油中乳化的油包水乳液(弗氏不完全佐剂)，有时还包含杀死的分枝杆菌(弗氏完全佐剂)以进一步增强抗原性(抑制抗原的降解和/或引起巨噬细胞汇集)。免疫刺激性寡核苷酸(例如包含CpG基序的寡核苷酸)也可以用作佐剂(例如，参见美国专利No.6,194,388、美国专利No.6,207,646、美国专利No.6,214,806、美国专利No.6,218,371、美国专利No.6,239,116、美国专利No.6,339,068、美国专利No.6,406,705和美国专利No.6,429,199)。佐剂包括生物分子(“生物佐剂”)，例如协同刺激分子。示例的佐剂包括IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、OX-40L和41 BBL。
抗原：能够在动物中刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质，包括被注射到或吸收到动物中的组合物。抗原与特异性体液或细胞免疫的产物、包括由异源免疫原诱导的产物发生反应。术语“抗原”包括了所有相关的抗原性表位。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞对其作出应答的位点。在一个实施方案中，当表位与MHC分子一起呈递时，T细胞对表位应答。表位可以由连续的氨基酸或通过蛋白的三级折叠而相邻的不连续氨基酸形成。一般来说，T细胞识别连续氨基酸的表位。连续的氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂时通常能够保留，但通过三级折叠形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包含至少3个、更通常至少5个、大约9个或大约8-10个具有独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括例如x-射线晶体学和二维核磁共振。
抗原可以是组织特异性抗原或疾病特异性抗原。这些术语不是排他的，因为组织特异性抗原也可以是疾病特异性抗原。组织特异性抗原在有限数量的组织例如单个组织中表达。组织特异性抗原可以被一种以上相关类型的组织表达，例如肺泡和支气管组织。疾病特异性抗原伴随着疾病过程表达。疾病特异性抗原的具体非限制性例子是其表达与结核病相关或是结核病的预兆的抗原。疾病特异性抗原可以是被T细胞或B细胞识别的抗原。
扩增：对于核酸分子(例如DNA或RNA分子)来说是指使用增加样本中核酸分子的拷贝数的技术。扩增的一个例子是聚合酶链反应，其中从对象收集的生物样品与寡核苷酸引物对在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下进行接触。引物在适当的条件下延伸，从模板解离，然后重新退火、延伸和解离，以扩增核酸的拷贝数。扩增的产物可以使用标准的技术通过电泳、限制性内切酶剪切模式、寡核苷酸杂交或连接、和/或核酸测序来表征。扩增的其它例子包括在美国专利No.5,744,311中公开的链置换扩增、在美国专利No.6,033,881中公开的无转录等温扩增、在WO 90/01069中公开的链修复反应扩增、在EP-A-320 308中公开的连接酶链反应扩增、在美国专利No.5,427,930中公开的间隙填补连接酶链反应扩增以及在美国专利No.6,025,134中公开的NASBATM RNA无转录扩增。
抗体：免疫球蛋白分子或免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特异性结合抗原(与抗原发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。
天然存在的抗体(例如IgG、IgM、IgD)包含通过二硫键相互连接的4条多肽链，两条重(H)链和两条轻(L)链。但是，已经显示抗体的抗原结合功能可以由天然存在的抗体的片段来执行。因此，这些抗原结合片段也打算由术语“抗体”来命名。术语抗体中涵盖的结合片段的具体的非限制性例子包括(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，Nature 341：544-546，1989)；(v)分离的互补决定区(CDR)；以及(vi)F(ab′)2片段，它是含有两个Fab片段的双价片段，两个Fab片段之间在铰链区通过二硫桥连接。
免疫球蛋白及其某些变异体是已知的，并有许多已经在重组细胞培养中制备(参见，例如，美国专利No.4,745,055，美国专利No.4,444,487，WO 88/03565，EP 256,654，EP 120,694，EP 125,023，Faoulkner等，Nature 298：286，1982，Morrison，J.Immunol 123：793，1979，Morrison等，Ann Rev.Immunol 2：239，1984)。
动物：活的多细胞的脊椎动物生物体，包括例如哺乳动物和鸟类的类别。术语哺乳动物包括人类和非人类的哺乳动物。同样地，术语“对象”包括人类和兽医对象。
抗原呈递细胞(APC)：能够将抗原呈递给T细胞、使得T细胞被活化的细胞。树突状细胞是参与初次免疫应答的主要抗原呈递细胞(APC)。它们的主要功能是获得组织中的抗原、迁移到淋巴器官以及呈递抗原以激活T细胞。
当接收到适当的成熟指令时，树突状细胞接收到信号，经历了快速的形态和生理变化，促进了免疫应答的启动和发展。这些变化中有参与抗原呈递的分子的上调，产生对于产生Th1应答来说是关键的前炎性细胞因子、包括IL-12，以及分泌趋化因子帮助驱动周围的幼稚Th细胞的分化、扩增和迁移。总的来说，这些上调分子促进了树突状细胞协调周围其它淋巴细胞的活化和效应子功能的能力，最终为宿主提供保护。
cDNA(互补DNA)：一段缺少了内部非编码片段(内含子)和决定转录的调控序列的DNA。cDNA在实验室中通过从细胞提取的信使RNA进行反转录而合成。
CD4：分化因子簇4，是介导与II类MHC分子的相互作用的T细胞表面蛋白。在HIV感染过程中，CD4也作为HIV在T细胞上的主要受体位点。表达CD4的细胞通常为辅助性T细胞。
CD8：分化因子簇8，是介导与I类MHC分子的相互作用的T细胞表面蛋白。表达CD8的细胞通常为细胞毒性T细胞。“CD8+T细胞介导的免疫”是通过将抗原呈递给CD8+T细胞而实现的免疫应答。
cDNA(互补DNA)：一段缺少了内部非编码片段(内含子)和决定转录的调控序列的DNA。cDNA在实验室中通过从细胞提取的信使RNA进行反转录而合成。
保守变异体：“保守的”氨基酸取代是基本上不影响或降低分枝杆菌多肽的活性或抗原性的取代。保守取代的具体的非限制性的例子包括下面的例子：
Figure A200780016660D00181
术语保守变异也包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，只要针对取代多肽产生的抗体也能够与未取代的多肽发生免疫反应，或针对取代多肽产生的免疫应答与针对未取代的多肽例如分枝杆菌抗原的免疫应答相同就行。因此，在一个实施方案中，非保守的取代是降低了活性或抗原性的取代。
基本上由…构成/由…构成：对于多肽来说，如果它不含有任何其它氨基酸残基，基本上由指定的氨基酸序列构成的多肽。但是，多肽可以含有其它的非肽成分，例如标记物(例如荧光、放射活性或固体颗粒标记物)、糖或脂类。对于多肽来说，由指定的氨基酸序列构成的多肽既不包含任何其它的氨基酸残基，也不包含其它的非肽成分例如脂类、糖或标记物。
接触：将一种试剂在存在另一种试剂的情况下孵育的过程。因此，当细胞与试剂接触时，细胞与试剂一起孵育了一段足以使试剂和细胞发生相互作用的时间。
协同刺激分子：尽管TCR与肽-MHC的结合给T细胞发送了一个信号，但单独的该信号可能不足以活化T细胞。协同刺激分子是当与它们的配体结合时，发送出第二个使T细胞变得活化所需的信号的分子。在T细胞上最广为人知的协同刺激分子是CD28，它与B7-1(也称为CD80)或B7-2(也称为CD86)结合。另一个协同刺激分子是B7-3。也为T细胞的活化提供第二个信号的辅助分子包括细胞内粘附分子(ICAM-1和ICAM-2)以及白细胞功能相关抗原(LFA-1、LFA-2和LFA-3)。整联蛋白和肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员也可以用作协同刺激分子。
细胞因子：由细胞产生的、影响其它细胞例如淋巴细胞的行为的蛋白。在一个实施方案中，细胞因子是趋化因子，这是一种影响细胞运输的分子。具体的非限制性的细胞因子的例子包括白细胞介素(IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-21等)和IFN-γ。
简并变异体：编码Mtb多肽表位的多核苷酸，其包含由于遗传密码而简并的序列。有20种天然氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子指定。因此，所有简并的核苷酸序列都包含在本公开中，只要该核苷酸序列编码的Mtb多肽的氨基酸序列没有改变就行。
树突状细胞(DC)：树突状细胞是参与初次免疫应答的主要抗原呈递细胞(APC)。树突状细胞包括浆细胞样树突状细胞和髓细胞样树突状细胞。它们的主要功能是获得组织中的抗原、迁移到淋巴器官以及呈递抗原以活化T细胞。未成熟的树突状细胞发源于骨髓中，并作为未成熟的细胞驻留在外周中。
诊断：鉴定病理状况例如但不限于结核病的存在或性质。诊断方法在其灵敏度和特异性上不同。诊断分析的“灵敏度”是被测试为阳性的患病个体的百分率(真阳性百分率)。诊断分析的“特异性”是1减去假阳性率，其中假阳性率被定义为被测试为阳性但是没有患病的个体的比例。尽管特定的诊断方法可能不能提供对病症的确定的诊断，但如果该方法提供了有助诊断的阳性指示就令人满意了。“预后”是指预测病理状况例如结核病的发展(例如严重性)的可能性。
展示：将肽:抗原复合物或肽定位在细胞的外表面上、使得肽：抗原复合物或肽能够接近第二种细胞、第二个细胞展示的分子或可溶性因子的过程。肽或肽:抗原复合物，当存在于细胞的外表面上并且可以接近第二种细胞、第二种细胞展示的分子或可溶性因子的时候，被该细胞“展示”。
表位：抗原决定簇。它们是分子上的特定化学基团或肽序列，具有抗原性，即其引发特异性免疫应答。抗体与多肽例如分枝杆菌多肽上特定的抗原性表位特异性结合。
表达控制序列：调控与其可操作连接的异源核酸序列的表达的核酸序列。当表达控制序列控制和调节核酸序列的转录、以及适当情况下的翻译的时候，就是表达控制序列与该核酸序列可操作地连接。因此，表达控制序列可以包括适合的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前面的起始密码子(即ATG)、维持基因的正确阅读框使得mRNA正确翻译的内含子剪接信号、以及终止密码子。术语“控制序列”是指最小程度包括其存在能够影响表达的组分，也可以包括其存在有利的其它组分，例如前导序列和融合配偶序列。表达控制序列可以包括启动子。
启动子是足以指导转录的最小序列。也包括足以使启动子依赖性基因的表达受到细胞类型特异性、组织特异性的控制或被外部信号或因子诱导的那些启动子元件；这样的元件可以位于基因的5′或3′区域。组成型和诱导型启动子都包括在内(参见例如Bitter等，Methods inEnzymology 153：516-544，1987)。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子例如λ噬菌体的pL、plac、ptrp、ptac(ptrp-lac杂交启动子)等。在一个实施方案中，当哺乳动物细胞系统中克隆时，可以使用源自哺乳动物细胞的基因组的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒的启动子(例如逆转录病毒长末端重复序列；腺病毒晚期启动子；牛痘病毒7.5K启动子)。通过重组DNA或合成技术产生的启动子也可用于提供核酸序列的转录。在一个实施方案中，启动子是细胞肥大病毒启动子。
级分：将样品置于根据物理或化学性质，例如但不限于大小、电荷、溶解度或组成，来分离样品的成分的条件或程序中。级分程序的例子包括但不限于选择性沉淀、有机提取、体积排阻透析、或色谱例如离子交换色谱。在一个实施方案中，级份是生物体例如分枝杆菌的可溶性提取物或有机提取物。
功能上等价：产生与此处描述的相同结果的序列改变，例如在抗原的表位中的序列改变。这样的序列改变可以包括但不限于保守取代、缺失、突变、移码和插入。
异源：源自于不同的遗传来源或物种。与Mtb多肽异源的多肽源自不编码Mtb多肽的核酸。在一个特定的非限制性的例子中，多肽含有来自Mtb多肽的9个连续氨基酸或来自Mtb多肽的最多20个连续氨基酸，并且异源氨基酸序列包括β-半乳糖苷酶、麦芽糖结合蛋白、白蛋白、乙肝表面抗原或免疫球蛋白的氨基酸序列。一般来说，与目标蛋白特异性结合的抗体将不会与异源蛋白特异性结合。
宿主细胞：其中可以繁殖载体和表达其DNA的细胞。细胞可以是原核的或真核的。细胞可以是哺乳动物例如人类的细胞。该术语也包括了对象宿主细胞的任何后代。应该理解的是，所有的后代可以与亲代细胞不一致，因为在复制过程中可能发生突变。但是，当使用术语“宿主细胞”时，包含了这样的后代。
人类白细胞抗原(HLA)：人类主要组织相容性复合物(MHC)的遗传学命名。单个基因座用大写字母表示，例如HLA-E，等位基因用数字表示，例如HLA-A*0201。三种主要的I类MHC基因被称为HLA-A、HLA-B和HLA-C。但是，有许多基因编码与I类MHC基因相连的β2微球蛋白相关细胞表面分子。这些基因的表达在组织分布和细胞上的表达量方面都是可变的；这些基因被称为IB类MHC基因。
免疫应答：免疫系统的细胞例如B细胞、自然杀伤细胞或T细胞对刺激作出的应答。在一个实施方案中，应答特异性针对特定的抗原(“抗原特异性应答”)。在一个实施方案中，免疫应答是T细胞应答，例如Th1、Th2或Th3应答。在另一个实施方案中，免疫应答是抑制性T细胞应答。
免疫原性肽：含有等位基因特异性基序或其它序列的肽，使得该肽将与MHC分子结合，并诱导针对产生免疫原性肽的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答或B细胞应答(例如产生抗体)。
在一个实施方案中，免疫原性肽使用序列基序或本技术领域中已知的其它方法、例如神经网络或多项式确定来鉴定。典型情况下，使用算法来确定肽的“结合阈值”，以选择出其得分使得它们具有高度可能性以确定的亲和性结合并将是免疫原性的那些肽。算法是基于对MHC与特定位置上的特定氨基酸结合的影响、对抗体与特定位置上的特定氨基酸结合的影响、或对含有基序的肽中特定取代的结合的影响。对于免疫原性肽来说，“保守残基”是指在肽的特定位置上，出现频率明显高于通过随机分布预期的频率的残基。在一个实施方案中，保守残基是MHC结构可以提供与免疫原性肽的接触点的残基。
免疫原性肽也可以通过测量它们与特定的MHC蛋白的结合、和通过它们在存在MHC蛋白的情况下刺激CD4和/或CD8的能力来鉴定。
在一个例子中，免疫原性“Mtb肽”是来自Mtb蛋白的一系列连续的氨基酸残基，长度一般在9到20个氨基酸之间，例如长度为大约9到12个残基。在本文中公开的具体的免疫原性多肽长度为9或10个氨基酸残基，或最多12个氨基酸长。一般来说，免疫原性Mtb多肽可以用于在对象中诱导免疫应答，例如B细胞应答或T细胞应答。在一个例子中，免疫原性Mtb多肽当与I类MHC分子结合时，其激活针对Mtb的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。使用合成的肽诱导CTL以及CTL的细胞毒性分析在本技术领域中是已知的，参见美国专利5,662,907，在此引为参考。在一个例子中，免疫原性肽包括等位基因特异性基序或其它序列，使得肽与MHC分子结合，并诱导针对产生免疫原性肽的抗原的细胞毒性T淋巴细胞(“CTL”)应答。
免疫原性组合物：含有免疫原性Mtb多肽或编码免疫原性Mtb多肽的核酸的组合物，其诱导可测量的针对Mtb的CTL应答、或诱导可测量的B细胞应答(例如产生与Mtb多肽特异性结合的抗体)。对于体外应用来说，免疫原性组合物可以由分离的核酸、包括核酸的载体和/或免疫原性肽构成。对于体内应用来说，免疫原性组合物通常包含在可药用的载体中的核酸、包括核酸的载体、和/或免疫原性多肽，和/或其它试剂。免疫原性组合物可任选包含佐剂、协同刺激分子或编码协同刺激分子的核酸。Mtb多肽或编码多肽的核酸，可以通过本技术领域已知的分析容易地测试其诱导CTL的能力。
抑制或治疗疾病：抑制疾病、例如结核病，是指抑制了疾病的完全发展。在几个例子中，抑制疾病是指减轻结核病的症状。“治疗”是指缓解疾病的征象或症状或者与疾病有关的病理状况的治疗性干预，所述疾病例如结核病。
γ干扰素：IFN-γ是具有146个氨基酸的亚单位的二聚体蛋白。该蛋白在两个位点上被糖基化，等电点为8.3-8.5。IFN-γ合成为166个氨基酸的前体蛋白，其中包含23个氨基酸的分泌信号序列。已经描述了20和25kDa的两种分子形式的生物活性蛋白。它们都在25位上被糖基化。25kDa形式在97位上也被糖基化。天然IFN-γ在分子量和电荷上观察到的差异是由于不同的糖基化模式。在非变性条件下观察到的40-60kDa形式是IFN-γ的二聚体和四聚体。人类基因的长度大约为6kb。它含有4个外显子，作图于染色体12q24.1。
IFN-γ可以通过灵敏的免疫分析来检测，例如可以检测产生IFN-γ的个体细胞的ELISPOT测试。少量的IFN-γ可以通过测量IFN诱导的蛋白例如Mx蛋白间接检测。诱导IP-10的合成也已经被用于测量IFN-γ浓度。此外，生物分析可以用于检测IFN-γ，例如利用在2D9细胞中诱导吲哚胺2，3-双加氧酶活性的分析方法。IFN-γ的产生可以用于评估T细胞的活化，例如T细胞被HLA-E呈递的分枝杆菌抗原活化。
分离的：“分离的”核酸已经基本上与核酸天然存在的生物体的细胞中的其它核酸序列、即其它的染色体和染色体外DNA和RNA分开或得以纯化。因此，术语“分离的”包含通过标准的核酸纯化方法纯化的核酸。该术语也包含通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸以及化学合成的核酸。
标记物：直接或间接与另一个分子结合以便于检测该分子的可检测的化合物或组合物。标记物的具体的、非限制性的例子包括荧光标签、酶法连接和放射性同位素。
接头序列：接头序列是共价连接两个多肽结构域的氨基酸序列。接头序列可以包含在本文描述的Mtb表位之间，为连接的多肽结构域提供旋转自由度，从而促进适合的结构域折叠并呈递给MHC。例如，在含有两个Mtb结构域的重组多肽中，可以在它们之间提供接头序列，例如含有Mtb多肽-接头-Mtb多肽的多肽。接头序列，一般长度在2到25个氨基酸之间，在本技术领域中是公知的，包括但不限于Chaudhary等，Nature 339：394-397，1989中描述的甘氨酸(4)-丝氨酸间隔物(GGGGS x3)。
淋巴细胞：参与身体的免疫防御的一类白血细胞。有两种主要类型的淋巴细胞：B细胞和T细胞。
哺乳动物：该术语包括人类和非人类哺乳动物。同样，术语“患者”或“对象”包括人类和兽医对象。
分枝杆菌：好氧的细胞内细菌生物属。在侵入宿主后，这些生物体存活于单核细胞和巨噬细胞的内体区室中。人类分枝杆菌疾病包括结核病(由结核分枝杆菌引起)、麻风病(由麻风分枝杆菌引起)、Bairnsdale溃疡病(由溃疡分枝杆菌引起)，以及由海鱼分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、偶发分枝杆菌、嗜血分枝杆菌、龟分枝杆菌和胞内结核杆菌引起的其他感染。以前被认为是非病原性的分枝杆菌菌株(例如鸟分枝杆菌(M.avium))，现在也已知是免疫抑制的AIDS患者的主要杀手。
针对分枝杆菌的免疫应答可以包括细胞介导的超敏(DTH)反应，其中T细胞和巨噬细胞在细胞内杀死和隔开(或包入)生物体(肉芽肿形成)中发挥了重要的作用。T细胞应答可以涉及识别分枝杆菌热休克蛋白和免疫显性抗原的CD4+淋巴细胞，以及CD8+淋巴细胞。
可操作地连接：当第一个核酸序列与第二个核酸序列以功能上相关的方式放置时，第一个核酸序列与第二个核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响了编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。一般来说，可操作地连接的DNA序列是连续的，在需要连接两个蛋白编码区的地方，开放阅读框架是对齐的。
ORF(开放阅读框架)：编码氨基酸而没有任何终止密码子的一系列核苷酸三联体(密码子)。这些序列通常可以被翻译成多肽。
肽修饰：分枝杆菌多肽包括本文描述的肽的合成实施方案。此外，这些蛋白的类似物(非肽类有机分子)、衍生物(从公开的肽序列开始而获得的化学功能化的肽分子)以及变异体(同源物)可用于本文描述的方法中。本发明的每个多肽包含氨基酸，它们可以是L-和/或D-氨基酸，天然存在的氨基酸和其他。
肽可以通过各种不同的化学技术进行修饰，以产生与未修饰的肽具有基本相同的活性的衍生物，并任选具有其它适宜的性质。例如，蛋白的羧酸基团，不论是羧基末端的还是侧链上的，都可以以可药用的阳离子的盐的形式提供，或者酯化形成C1-C16酯，或转化成式NR1R2的酰胺，其中R1和R2各自独立地是H或C1-C16烷基，或合并形成杂环，例如五或六员环。肽的氨基基团，不论是氨基末端的还是侧链上的，都可以是可药用的酸加成的盐的形式、例如HCl、HBr、乙酸、苯甲酸、甲苯磺酸、马来酸、酒石酸和其它有机盐的形式，或可以修饰成C1-C16烷基或双烷基氨基，或进一步转化成酰胺。
肽侧链的羟基基团可以使用公认的技术转化成C1-C16烷氧基或C1-C16酯。肽侧链的苯环和酚环可以被一个或多个卤素原子取代，例如氟、氯、溴或碘，或用C1-C16烷基、C1-C16烷氧基、羧酸及其酯、或这些羧酸的酰胺取代。肽侧链的亚甲基基团可以被延长成同系的C2-C4亚烷基。硫醇可以用多种公认的保护基团中的任何一种、例如乙酰胺基团来保护。本技术领域的专业人员也了解将环状结构引入本发明的肽中的方法，以便为结构选择和提供构象限制，产生增加的稳定性。
肽模拟物和有机模拟物的实施方案也可以设想，由此使这些肽-和有机模拟物的化学组分的三维排列模拟肽骨架和组分氨基酸侧链的三维排列，导致分枝杆菌多肽的这些肽-和有机模拟物具有可测量的或增强的产生免疫应答的能力。对于计算机模型应用来说，药效团是生物活性的结构要求的理想化的三维限定。可以使用现有的计算机模型软件(使用计算机辅助药物设计或CADD)，设计肽和有机模拟物以适合每个药效团。参见Klegerman & Groves 1993年主编的《药物生物技术》(Pharmaceutical Biotechnology，Interpharm Press：Buffalo Grove，IL)第165-174页，Walters的“计算机辅助的药物模拟”(＂Computer-AssistedModeling of Drugs＂)；以及Munson 1995年主编的《药物学原理》(Principles of Pharmacology)第102章中对CADD中使用的技术的描述。还包括了使用这些技术制备的模拟物。
药剂或药物：当给对象适当施用时能够诱导所需的治疗或预防作用的化学化合物或组合物。
可药用的载体：对于本文描述的多肽和核酸有用的可药用的载体是常规的载体。E.W.Martin的《雷氏药物科学》第15版(Remington′sPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，PA，15th Edition(1975))描述了适合本文公开的融合蛋白的药物投送的组合物和制剂。
总的来说，载体的类型将依赖于使用的具体给药状态。例如，肠胃外制剂通常包含可注射的液体，其中含有药物学和生理学可接受的流体例如水、生理盐水、平衡的盐溶液、葡萄糖水、甘油等作为介质。对于固体组合物(例如粉末、丸剂、片剂或胶囊形式)来说，常规的无毒固体载体可以包括，例如药品级的甘露糖醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性的载体之外，要施用的药物组合物可以含有少量的无毒的辅助性物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂以及pH缓冲剂等，例如乙酸钠或失水山梨糖醇单月桂酸酯。
多核苷酸：线性的核苷酸序列，包含的序列长度超过100个核苷酸碱基。
多肽：任何氨基酸链，无关长度或翻译后修饰(例如糖基化或磷酸化)。“肽”是长度小于100个氨基酸的氨基酸链。在一个实施方案中，“肽”是多肽的一部分，例如长度大于100个氨基酸的多肽的大约10、20、30、40、50或100个连续的氨基酸。
核酸序列的一部分：相关序列、例如编码抗原的序列的至少10、20、30、或40个连续的核苷酸。在某些情况下使用由50个以上核苷酸组成的部分是有利的。例如，当描述抗原的一部分(例如抗原性表位)时，去除含有至少10、20、30、40或50个核苷酸直到全长的相关序列的一部分可能是有利的。
探针和引物：核酸探针和引物可以根据本发明提供的核酸容易地制备。探针包含与可检测的标记物或报告分子相连的分离核酸。典型的标记物包括放射性同位素、配体、化学发光剂和酶。标记的方法和选择适合各种不同目的的标记物的指导，在例如Sambrook等(1989)和Ausubel等(1987)的文献中讨论。
引物是短核酸，优选为长度为15个核苷酸以上的DNA寡核苷酸。引物可以与互补的靶DNA链通过核酸杂交而退火，从而在引物和靶DNA链之间形成杂交体，然后被DNA聚合酶沿着靶DNA链延伸。引物对可以用于扩增核酸序列，例如通过聚合酶链反应(PCR)或其它本技术领域中已知的核酸扩增方法。
制备和使用探针和引物的方法在例如Sambrook等主编的《分子克隆：实验室手册》(第二版)1-3卷(Molecular Cloning-A LaboratoryManual，2nd ed.，vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，1989)和Ausubel等主编的《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing andWiley-Interscience，New York，1987)(定期更新)中有描述。PCR引物对可以从已知的序列衍生，例如通过使用用于此目的的计算机程序，例如Primer(0.5版，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，MA)。
预防或治疗疾病：“预防”疾病是指，例如，在已知处于结核分枝杆菌或麻风分枝杆菌感染风险下的人中抑制疾病的完全发展。已知有易感性的人的例子是与诊断患有结核病的人共同生活的人、卫生护理专业人员、或者已知已经暴露于结核分枝杆菌的其它人。“治疗”是指在疾病或病理状况例如结核病开始发展之后，缓解其征象或症状的治疗性干预。
启动子：启动子是指导核酸转录的一系列核酸控制序列。启动子包括转录起始位点附近的必需的核酸序列，例如在II型聚合酶启动子的情况下，为TATA元件。启动子也任选包括远距离的增强子或阻抑物元件，它们可以位于距离转录起始位点多达几千碱基对的地方。启动子可以是组成型或诱导型启动子。具体的非限制性的启动子例子是HCMV IE启动子。
纯化的：术语纯化的不需要绝对纯，其目的是作为相对的术语。因此，例如，纯化的抗原制备物是其中抗原比蛋白在细胞中其原始环境下的纯度更高的制备物。抗原制备物通常被纯化，使得抗原占制备物总蛋白含量的至少50％。但是，对于某些应用来说可能需要纯化程度更高的制备物。例如，对于这样的应用来说，可以使用其中抗原占总蛋白含量的至少75％或至少90％的制备物。
重组的：重组的核酸或多肽具有不是天然存在的序列、或具有通过将两个或多个本来分开的序列片段进行人工合并而制造的序列。这种人工合并通常是通过化学合成完成的，或更通常是通过对分离的核酸片段进行人工操作、例如通过遗传工程技术来完成的。
序列同一性：氨基酸序列之间的相似性根据序列间的相似性来表示，也被称为序列同一性。序列同一性经常根据百分同一性(或相似性或同源性)来度量；百分数越高，两个序列越相似。当使用标准方法进行比对时，抗原多肽的变异体将具有相对高度的序列同一性。
比对序列进行比较的方法在本技术领域中是众所周知的。Altschul等(1994)提出了序列比对方法和同源性计算的详细考虑。NCBI的基本本地比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)(Altschul等，1990)可以从几个来源获得，包括国家生物技术信息中心(NCBI，Bethesda，MD)和因特网上，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。其可以在NCBI网点上进行评估。关于如何使用该程序来确定序列同一性的描述可以在NCBI网点上获得，缺省参数也是同样。
使用NCBI Blast 2.0，带间隙的blastp设置为缺省参数时，抗原性多肽例如分枝杆菌多肽的变异体的典型特点为与天然抗原序列的氨基酸序列的全长比对范围内，具有至少50％的序列同一性。通过该方法评估时，与参比序列具有更高相似性的蛋白将显示出增加的百分同一性，例如至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少90％或至少95％的序列同一性。当对不足全序列进行序列同一性比较时，变异体一般在10-20个氨基酸的短窗口内具有至少75％的序列同一性，并且根据它们与参比序列的相似性，可以具有至少85％或至少90％或95％的序列同一性。在这样短的窗口内确定序列同一性的方法在NCBI网点上有描述。MHC结构域多肽的变异体也保留了天然多肽的生物学活性。
治疗活性多肽：当通过临床反应测量时，引起了免疫应答的诱导(例如增加免疫细胞群体、增加针对Mtb的细胞裂解活性、或感染的症状的可测量的减轻)的药剂，例如Mtb的表位。治疗活性分子也可以由核酸制成。基于核酸的治疗活性分子的例子是编码Mtb表位的核酸序列，其中核酸序列与控制元件例如启动子可操作地连接。
治疗有效剂量：足以阻止疾病的发展、或引起疾病的减退、或能够缓解疾病引起的症状的剂量。在一个实施方案中，治疗有效剂量是足以防止结核病的发展或缓解结核病症状的剂量。
转导和转化：病毒或载体在将核酸转入细胞时“转导”细胞。当通过将核酸整合到细胞基因组中或通过游离型复制使DNA变得被细胞稳定地复制时，细胞被转导到细胞中的核酸“转化”。在本文中使用的术语转化包括可以将核酸分子引入这样的细胞的所有技术，包括用病毒载体转染、用质粒载体转化和通过电穿孔、脂转染和微粒枪加速来导入裸露的DNA。
结核病(TB)：一般由通常感染肺脏的结核分枝杆菌引起的疾病。但是，其它“非典型的”分枝杆菌例如堪萨斯分枝杆菌可以产生疾病相似的临床和病理表现。
结核分枝杆菌的传播通过通气不良的封闭区域的空气传播途径发生。在超过90％的病例中，在被结核分枝杆菌感染后，免疫系统阻止结核分枝杆菌引起的疾病、通常称为活动性结核病的发展。但是，不是所有的结核分枝杆菌都被杀死，因此形成了小而硬的囊。“原发性结核病”是通常在儿童中观察到的在初始感染后发展的疾病。感染的最初病灶是胸膜下的小肉芽肿，伴有肉芽肿性肺门淋巴结感染。它们一起构成了贡氏综合征(Ghon complex)。在几乎所有病例中，这些肉芽肿消解，感染没有进一步扩散。“继发结核病”主要见于成人，为以前感染的重新活化(或再次感染)，特别是在健康状况下降时。肉芽肿性炎症发展得更加充分和广泛。典型情况下，上肺叶感染最多，并且可能发生空洞形成。结核病的肺外传播可以导致出现许多具有特征性模式的不常见结果，包括骨结核、生殖道结核、尿道结核、中枢神经系统(CNS)结核、胃肠道结核、肾上腺结核、淋巴结核和心脏结核。“潜伏性”结核病是在个体中的Mtb感染可以被诊断分析检测，例如但不限于结核菌素皮肤试验(TST)，其中感染在该个体中不产生症状。“活动性”结核病是对象中的有症状的Mtb感染。
在显微镜下，TB感染产生的炎症是肉芽肿性的，具有上皮样巨噬细胞和郎格罕巨细胞以及淋巴细胞、浆细胞、可能有一些多形核细胞、带有胶原的成纤维细胞，并且在中心具有特征性的干酪样坏死。炎症反应由IV型超敏反应介导，皮肤试验就是基于该反应。在某些实例中，结核病可以通过皮肤试验、酸快速染色、金胺染色或其组合来诊断。最常用的筛查样品是痰液，但是也可以对组织或其它体液进行组织染色。
TB是HIV感染的常见并发症。在感染了人类免疫缺陷病毒(HIV)的对象中的TB感染可以容易地扩散并快速发展成活动性疾病。由Mtb感染引起的肺部疾病的具体症状包括慢性咳嗽和咯血。TB疾病的其它症状包括疲劳、食欲减退、体重减轻、发烧和夜间盗汗。
载体：当导入宿主细胞时的核酸分子，从而产生被转导或被转化的宿主细胞。载体可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体也可以包含一个或多个选择性标记基因和其它在本技术领域中已知的遗传元件。载体包括质粒载体，包括用于在革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌细胞中表达的载体。示例的载体包括用于在大肠杆菌(E.coli)和沙门氏菌(Salmonella)中表达的载体。载体也包括病毒载体，例如但不限于逆转录病毒、正痘病毒、鸟痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、猪痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、α-病毒、杆状病毒、辛德比斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒载体。载体也包括用于在酵母细胞中表达的载体。
除非另有解释，本文使用的所有技术和科学术语都与本公开所属的技术领域中的专业人员所通常理解的意义相同。单数术语的“a”、“an”和“the”包括了复数的指代物，除非上下文另有明确表示。同样地，单词“或”意指包括“和，除非上下文另有明确表示。此外还应该理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小、以及所有的分子量或分子质量数值，都是大约的，仅供描述。尽管与本文描述相似或等同的方法和材料可以用于本公开的实践或检验，但适合的方法和材料在下文描述。术语“包含”意味着“包括”。所有本文提到的出版物、专利申请、专利和其它参考文献都以其全文引为参考。在有冲突的情况下，以本说明书、包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，而无意是限制性的。
分枝杆菌多肽
本文公开了几种分枝杆菌多肽可以用于诱导针对Mtb的免疫应答，例如T细胞应答。在几个实施方案中，多肽包括或由下面显示的氨基酸序列构成：
1.MX1SRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMX2X3MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILS，(SEQ ID NO：1，其中的X1是A或T，X2是T或A，X3是任何氨基酸，例如Q或没有氨基酸)。
在几个实施例中，多肽包括或由下面显示的氨基酸序列构成：
a.MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILS(SEQ ID NO：2)(也参见TUBERCULIST No.Rv1038c，在2007年3月1日提供，在此引为参考，被称为EsxJ，ES6_2，TB11.0，QILSS)
b.MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS(SEQ ID NO：3，TUBERCULIST No.Rv1197，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为EsxK，ES6_3，TB11.0，QILSS)
c.MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMT+MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS(SEQ ID NO：4，TUBERCULIST No.Rv 1992，在2007年3月1日提供，在此引为参考，被称为EsxM，TB 11.0，QILSS)
d.MATRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS(SEQ ID NO：5，TUBERCULIST No.Rv 2347c，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为EsxP，ES6_7，QILSS)
e.MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS(SEQ ID NO：6，TUBERCULIST No.Rv3620c，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为EsxW，ES6_10，QILSS)
在其它实施方案中，多肽包括或由下面显示的氨基酸序列构成：
2.MSYMIATPAALTAAATDIDGIGSAVSVANAAAVAATTGVLAAGGDEVLAAIARLFNANAEEYHALSAQVAAFQTLFVRTLTGGCGVFRRRRGRQCVTAAEHRAAGAGRRQRRRRSGDGQWRLRQQRHFGCGGQPEFRQHSEHRR(SEQ ID NO：7，TUBERCULISTNO.Rv1088，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为PE9)。
3.VSLVIATPQLLATAALDLASIGSQVSAANAAAAMPTTEVVAAAADEVSAAIAGLFGAHARQYQALSVQVAAFHEQFVQALTAAAGRYASTEAAVERSLLGAVNAPTEALLGRPLIGNGADGTAPGQPGAAGGLLFGNGGNGAAGGFGQTGGSGGAAGLIGNGGNGGAGGTGAAGGAGGNGGWLWGNGGNGGVGGTSVAAGIGGAGGNGGNAGLFGHGGAGGTGGAGLAGANGVNPTPGPAASTGDSPADVSGIGDQTGGDGGTGGHGTAGTPTGGTGGDGATATAGSGKATGGAGGDGGTAAAGGGGGNGGDGGVAQGDIASAFGGDGGNGSDGVAAGSGGGSGGAGGGAFVHIATATSTGGSGGFGGNGAASAASGADGGAGGAGGNGGAGGLLFGDGGNGGAGGAGGIGGDGATGGPGGSGGNAGIARFDSPDPEAEPDVVGGKGGDGGKGGSGLGVGGAGGTGGAGGNGGAGGLLFGNGGNGGNAGAGGDGGAGVAGGVGGNGGGGGTATFHEDPVAGVWAVGGVGGDGGSGGSSLGVGGVGGAGGVGGKGGASGMLIGNGGNGGSGGVGGAGGVGGAGGDGGNGGSGGNASTFGDENSIGGAGGTGGNGGNGANGGNGGAGGIAGGAGGSGGFLSGAAGVSGADGIGGAGGAGGAGGAGGSGGEAGAGGLTNGPGSPGVSGTEGMAGAPG(SEQ ID NO：8，TUBERCULIST NO.Rv2487，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为PE_PGRS42)
4.MHQVDPNLTRRKGRLAALAIAAMASASLVTVAVPATANADPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANTPNAQPGDPNAAPPPADPNAPPPPVIAPNAPQPVRIDNPVGGFSFALPAGWVESDAAHFDYGSALLSKTTGDPPFPGQPPPVANDTRIVLGRLDQKLYASAEATDSKAAARLGSDMGEFYMPYPGTRINQETVSLDANGVSGSASYYEVKFSDPSKPNGQIWTGVIGSPAANAPDAGPPQRWFVVWLGTANNPVDKGAAKALAESIRPLVAPPPAPAPAPAEPAPAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA(SEQ ID NO：9，TUBERCULIST No.Rv1860，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为Apa、modD、mpt32)
5.MLLALLRQHIRPYRRLVAMLMMLQLVSTLASLYLPTVNAAIVDDGVAKGDTATIVRLGAVMLGVTGLQVLCAIGAVYLGSRTGAGFGRDLRSAMFEHIITFSERETARFGAPTLLTRSTNDVRQILFLVQMTATVLVTAPIMCVGGIIMAIHQEAALTWLLLVSVPILAVANYWIISHMLPLFRRMQSLIDGINRVMRDQLSGVRVVRAFTREGYERDKFAQANTALSNAALSAGNWQALMLPVTTLTINASSVALIWFGGLRIDSGQMQVGSLIAFLSYFAQILMAVLMATMTLAVLPRASVCAERITEVLSTPAALGNPDNPKFPTDGVTGVVRLAGATFTYPGADCPVLQDISLTARPGTTTAIVGSTGSGKSTLVSLICRLYDVTAGAVLVDGIDVREYHTERLWSAIGLVPQRSYLFSGTVADNLRYGGGPDQVVTEQEMWEALRVAAADGFVQTDGLQTRVAQGGVNFSGGQRQRLAIARAVIRRPAIYVFDDAFSALDVHTDAKVHASLRQVSGDATIIVVTQRISNAAQADQVIVVDNGKIVGTGTHETLLADCPTYAEFAASQSLSATVGGVG(SEQ ID NO：10，TUBERCULIST No.Rv1273c，在2007年3月1日提供，在此引为参考)。
6.MSYVIAAPEMLATTAADVDGIGSAIRAASASAAGPTTGLLAAAADEVSSAAAALFSEYARECQEVLKQAAAFHGEFTRALAAAGAAYAQAEASNTAAMSGTAGSSGALGSVGMLSGNPLTALMMGGTGEPILSDRVLAIIDSAYIRPIFGPNNPVAQYTPEQWWPFIGNLSLDQSIAQGVTLLNNGINAELQNGHDVVVFGYSQSAAVATNEIRALMALPPGQAPDPSRLAFTLIGNINNPNGGVLERYVGLYLPFLDMSFNGATPPDSPYQTYMYTGQYDGYAHNPQYPLNILSDLNAFMGIRWVHNAYPFTAAEVANAVPLPTSPGYTGNTHYYMFLTQDLPLLQPIRAIPFVGTPIAELIQPDLRVLVDLGYGYGYADVPTPASLFAPINPIAVASALATGTVQGPQAALVSIGLLPQSALPNTYPYLPSANPGLMFNFGQSSVTELSVLSGALGSVARLIPPIA(SEQ ID NO：11，TUBERCULIST No.Rv0159c，在2007年3月1日可用，在此引为参考，也被称为PE3或PE)。
7.MEFPVLPPEINSVLMYSGAGSSPLLAAAAAWDGLAEELGSAAVSFGQVTSGLTAGVWQGAAAAAMAAAAAPYAGWLGSVAAAAEAVAGQARVVVGVFEAALAATVDPALVAANRARLVALAVSNLLGQNTPAIAAAEAEYELMWAADVAAMAGYHSGASAAAAALPAFSPPAQALGGGVGAFLTALFASPAKALSLNAGLGNVGNYNVGLGNVGVFNLGAGNVGGQNLGFGNAGGTNVGFGNLGNGNVGFGNSGLGAGLAGLGNIGLGNAGSSNYGFANLGVGNIGFGNTGTNNVGVGLTGNHLTGIGGLNSGTGNIGLFNSGTGNVGFFNSGTGNFGVFNSGNYNTGVGNAGTASTGLFNAGNFNTGVVNVGSYNTGSFNAGDTNTGGFNPGGVNTGWLNTGNTNTGIANSGNVNTGAFISGNFNNGVLWVGDYQGLFGVSAGSSIPAIPIGLVLNGDIGPITIQPIPILPTIPLSIHQTVNLGPLVVPDIVIPAFGGGIGIPINIGPLTITPITLFAQQTFVNQLPFPTFSLGKITIPQIQTFDSNGQLVSFIGPIVIDTTIPGPTNPQIDLTIRWDTPPITLFPNGISAPDNPLGLLVSVSISNPGFTIPGFSVPAQPLPLSIDIEGQIDGFSTPPITIDRIPLTVGGGVTIGPITIQGLHIPAAPGVGNTTTAPSSGFFNSGAGGVSGFGNVGAGSSGWWNQAPSALLGAGSGVGNVGTLGSGVLNLGSGISGFYNTSVLPFGTPAAVSGIGNLGQQLSGVSAAGTTLRSMLAGNLGLANVGNFNTGFGNVGDVNLGAANIGGHNLGLGNVGDGNLGLGNIGHGNLGFANLGLTAGAAGVGNVGFGNAGINNYGLANMGVGNIGFANTGTGNIGIGLVGDHRTGIGGLNSGIGNIGLFNSGTGNVGFFNSGTGNFGIGNSGRFNTGIGNSGTASTGLFNAGSFSTGIANTGDYNTGSFNAGDTNTGGFNPGGINTGWFNTGHANTGLANAGTFGTGAFMTGDYSNGLLWRGGYEGLVGVRVGPTISQFPVTVHAIGGVGPLHVAPVPVPAVHVEITDATVGLGPFTVPPISIPSLP
IASITGSVDLAANTISPIRALDPLAGSIGLFLEPFRLSDPFITIDAFQVVAGVLFLENIIVPGLTVSGQILVTPTPIPLTLNLDTTPWTLFPNGFTIPAQTPVTVGMEVANDGFTFFPGGLTFPRASAGVTGLSVGLDAFTLLPDGFTLDTVPATFDGTILIGDIPIPIIDVPAVPGFGNTTTAPSSGFFNTGGGGGSGFANVGAGTSGWWNQGHDVLAGAGSGVANAGTLSSGVLNVGSGISGWYNTSTLGAGTPAVVSGIGNLGQQLSGFLANGTVLNRSPIVNIGWADVGAFNTGLGNVGDLNWGAANIGAQNLGLGNLGSGNVGFGNIGAGNVGFANSGPAVGLAGLGNVGLSNAGSNNWGLANLGVGNIGLANTGTGNIGIGLVGDYQTGIGGLNSGSGNIGLFNSGTGNVGFFNTGTGNFGLFNSGSFNTGIGNSGTGSTGLFNAGNFNTGIANPGSYNTGSFNVGDTNTGGFNPGDINTGWFNTGIMNTGTRNTGALMSGTDSNGMLWRGDHEGLFGLSYGITIPQFPIRITTTGGIGPIVIPDTTILPPLHLQITGDADYSFTVPDIPIPAIHIGINGVVTVGFTAPEATLLSALKNNGSFISFGPITLSNIDIPPMDFTLGLPVLGPITGQLGPIHLEPIVVAGIGVPLEIEPIPLDAISLSESIPIRIPVDIPASVIDGISMSEVVPIDASVDIPAVTITGTTISAIPLGFDIRTSAGPLNIPIIDIPAAPGFGNSTQMPSSGFFNTGAGGGSGIGNLGAGVSGLLNQAGAGSLVGTLSGLGNAGTLASGVLNSGTAISGLFNVSTLDATTPAVISGFSNLGDHMSGVSIDGLIAILTFPPAESVFDQIIDAAIAELQHLDIGNALALGNVGGVNLGLANVGEFNLGAGNVGNINVGAGNLGGSNLGLGNVGTGNLGFGNIGAGNFGFGNAGLTAGAGGLGNVGLGNAGS
GSWGLANVGVGNIGLANTGTGNIGIGLTGDYRTGIGGLNSGTGNLGLFNSGTGNIGFFNTGTGNFGLFNSGSYSTGVGNAGTASTGLFNAGNFNTGLANAGSYNTGSLNVGSFNTGGVNPGTVNTGWFNTGHTNTGLFNTGNVNTGAFNSGSFNNGALWTGDYHGLVGFSFSIDIAGSTLLDLNETLNLGPIHIEQIDIPGMSLFDVHEIVEIGPFTIPQVDVPAIPLEIHESIHMDPIVLVPATTIPAQTRTIPLDIPASPGSTMTLPLISMRFEGEDWILGSTAAIPNFGDPFPAPTQGITIHTGPGPGTTGELKISIPGFEIPQIATTRFLLDVNISGGLPAFTLFAGGLTIPTNAIPLTIDASGALDPITIFPGGYTIDPLPLHLALNLTVPDSSIPIIDVPPTPGFGNTTATPSSGFFNSGAGGVSGFGNVGSNLSGWWNQAASALAGSGSGVLNVGTLGSGVLNVGSGVSGIYNTSVLPLGTPAVLSGLGNVGHQLSGVSAAGTALNQIPILNIGLADVGNFNVGFGNVGDVNLGAANLGAQNLGLGNVGTGNLGFANVGHGNIGFGNSGLTAGAAGLGNTGFGNAGSANYGFANQGVRNIGLANTGTGNIGIGLVGDNLTGIGGLNSGAGNIGLFNSGTGNIGFFNSGTGNFGIGNSGSFNTGIGNSGTGSTGLFNAGSFNTGVANAGSYNTGSFNAGDTNTGGFNPGTINTGWFNTGHTNTGIANSGNVGTGAFMSGNFSNGLLWRGDHEGLFSLFYSLDVPRITIVDAHLDGGFGPVVLPPIPVPAVNAHLTGNVAMGAFTIPQIDIPALTPNITGSAAFRIVVGSVRIPPVSVIVEQIINASVGAEMRIDPFEMWTQGTNGLGITFYSFGSADGSPYATGPLVFGAGTSD
GSHLTISASSGAFTTPQLETGPITLGFQVPGSVNAITLFPGGLTFPATSLLNLDVTAGAGGVDIPAITWPEIAASADGSVYVLASSIPLINIPPTPGIGNSTITPSSGFFNAGAGGGSGFGNFGAGTSGWWNQAHTALAGAGSGFANVGTLHSGVLNLGSGVSGIYNTSTLGVGTPALVSGLGNVGHQLSGLLSGGSAVNPVTVLNIGLANVGSHNAGFGNVGEVNLGAANLGAHNLGFGNIGAGNLGFGNIGHGNVGVGNSGLTAGVPGLGNVGLGNAGGNNWGLANVGVGNIGLANTGTGNIGIGLTGDYQTGIGGLNSGAGNLGLFNSGAGNVGFFNTGTGNFGLFNSGSFNTGVGNSGTGSTGLFNAGSFNTGVANAGSYNTGSFNVGDTNTGGFNPGSINTGWLNAGNANTGVAN
AGNVNTGAFVTGNFSNGILWRGDYQGLAGFAVGYTLPLFPAVGADVSGGIGPITVLPPIHIPPIPVGFAAVGGIGPIAIPDISVPSIHLGLDPAVHVGSITVNPITVRTPPVLVSYSQGAVTSTSGPTSEIWVKPSFFPGIRIAPSSGGGATSTQGAYFVGPISIPSGTVTFPGFTIPLDPIDIGLPVSLTIPGFTIPGGTLIPTLPLGLALSNGIPPVDIPAIVLDRILLDLHADTTIGPINVPIAGFGGAPGFGNSTTLPSSGFFNTGAGGGSGFSNTGAGMSGLLNAMSDPLLGSASGFANFGTQLSGILNRGAGISGVYNTGALGVVTAAVVSGFGNVGQQLSGLLFTGVGP(SEQ ID NO：12，TUBERCULIST No.3350c，在2007年3月1日提供，在此引为参考，也被称为PPE56或PPE)。
在第二个实施方案中，在本文公开的方法中使用的Mtb多肽具有与SEQ ID NO：1-12中显示的氨基酸序列具有至少75％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的同源性的序列。例如，多肽可以具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：1-12之一显示的氨基酸序列之一至少有85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性。示例的序列可以使用在因特网上容易获得的计算机程序和本文显示的氨基酸序列来获得。在一个实施例中，多肽保留了Mtb蛋白的功能，例如与特异性结合Mtb表位的抗体结合的功能。
对Mtb一级氨基酸序列进行少量修饰可以产生与本文描述的未修饰的对应多肽相比活性基本上等效的肽。这样的修饰可以是有意的，例如通过定点突变，或者可以是自发的。所有通过这些修饰产生的肽都包括在本文中。因此，Mtb多肽的具体的、非限制性的例子是Mtb多肽的保守变异体。本文提供了保守取代的表格。根据该表格可以对SEQ ID NO：1-12中显示的氨基酸序列进行取代。
本文公开了可以用于诱导免疫应答的Mtb多肽(免疫原性的)。这些多肽包括或由至少9个氨基酸组成，例如上面显示的Mtb多肽的9到20个氨基酸的连续氨基酸。具体的非限制性的例子是上面显示的Mtb多肽之一的12个、11个、10个氨基酸或9个连续的氨基酸。在这些例子中，Mtb多肽不包括SEQ ID NO：1-12中显示的全长氨基酸序列。
公开了包含来自Mtb多肽的9到12个连续氨基酸的分离多肽，其中分离的多肽含有显示为QTVEDEARRMW(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽长度为9、10或11个氨基酸。在其它实施方案中，多肽由SEQ ID NO：13中显示的氨基酸序列组成。公开了包含来自Mtb多肽的9到12个连续氨基酸的分离多肽，其中分离的多肽含有显示为VSAAIAGLF(SEQ ID NO：14)的氨基酸序列。在某些实施方案中，多肽长度为9、10或11个氨基酸。在其它实施方案中，多肽由SEQ ID NO：14中显示的氨基酸序列组成。
在几个实施方案中，分离的Mtb多肽被包含在融合蛋白中。因此，融合蛋白可以包含Mtb多肽(参见上文)和与Mtb共价连接的第二个异源的部分，例如myc蛋白、酶或载体(例如肝炎载体蛋白或牛血清白蛋白)。在几个实施例中，由SEQ ID NO：1-14显示的氨基酸序列之一的9到12个氨基酸组成、结合I类MHC的多肽与载体共价连接。在其它实施例中，由SEQ ID NO：1-14之一显示的氨基酸序列之一组成的多肽与载体共价连接。
在其它实施例中，多肽是融合蛋白，还能包含与Mtb异源的序列(例如长度为至少9个氨基酸的、没有包含在SEQ ID NO：1中的氨基酸序列)。因此，在几个具体的非限制性的例子中，免疫原性肽是融合多肽，例如包含6个连续组氨酸残基、β-半乳糖苷酶氨基酸序列、或免疫球蛋白氨基酸序列的多肽。多肽也能够与载体共价连接。适合的载体包括但不限于乙肝小包膜蛋白HB2Ag。该蛋白具有自我装配成聚集体的能力，并能形成病毒样粒子。HBsAg的制备是公知的，参见例如欧洲专利申请公布No.EP-A-0 226 846、欧洲专利申请公布No.EP-A-0 299 108和PCT公布No.WO 01/117554，氨基酸序列被公开在例如Tiollais等，Nature，317：489，1985和欧洲专利申请公布No.EP-A-0 278 940和PCT公布No.WO 91/14703中，所有这些在此引为参考。
在其它实施方案中，蛋白由Mtb多肽组成。第二个异源的部分可以与Mtb多肽非共价连接。例如，由SEQ ID NO：1-14之一显示的蛋白之一的9到12个连续氨基酸的多肽，能够与载体非共价连接。
多肽可任选含有本文公开的一个或多个Mtb多肽的重复。在一个具体的非限制性例子中，多肽含有上述的Mtb多肽之一的2、3、4、5、或多达10个重复。或者，一个以上的多肽可以被包含在融合多肽中。因此，在几个实施例中，多肽可以包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个SEQ ID NO：1-14显示的氨基酸序列。在Mtb多肽之间可任选包含接头序列。
本文公开的Mtb多肽可以通过标准方法化学合成，或者可以重组生产。示例的多肽生产方法描述在Lu等，Federation of EuropeanBiochemical Societies Letters.429：31-35，1998中。它们也可以通过包括制备型色谱和免疫分离的方法来分离。
如果需要的话，多肽也可以通过新兴的技术进行化学合成。一种这样的方法描述在W.Lu等，Federation of European BiochemicalSocieties Letters.429：31-35，1998中。多肽也可以使用分子遗传学技术生产，例如通过将编码Mtb或其表位的核酸插入到表达载体中，将表达载体导入宿主细胞，并分离多肽(参见下文)。
Mtb多肽可以与载体共价连接，载体是与抗原性分子结合的免疫原性大分子。选择载体以增加结合分子的免疫原性和/或引发针对载体的较高滴度的、在诊断、分析和/或治疗上有用的抗体。分子与载体的共价连接可以产生增强的免疫原性和T细胞依赖性(参见Pozsgay等，PNAS 96：5194-97，1999；Lee等，J.Immunol.116：1711-18，1976；Dintzis等PNAS 73：3671-75，1976)。有用的载体包括聚合物载体，可以是天然的(例如来自细菌或病毒的多糖、多肽或蛋白)、半合成的或合成的物质，它们含有一个或多个可以连接反应试剂部分的功能性基团。细菌产物和病毒蛋白(例如乙肝表面抗原和核心抗原)、以及来自高等生物体的蛋白例如匙孔血蓝蛋白、鲎血蓝蛋白、麻仁球蛋白、哺乳动物血清白蛋白和哺乳动物免疫球蛋白、也可以用作载体。其它可用作载体的细菌产物包括细菌胞壁蛋白和其它产物(例如链球菌或葡萄球菌的细胞壁和脂多糖(LPS))。
还提供了编码本文公开的Mtb多肽的多核苷酸。示例的核酸序列显示如下：
ESXJ(类ESAT-6蛋白2)
atggcctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatc
tcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga
(SEQ ID NO：15)
ESXK(类ESAT-6蛋白3)
atggcctcacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt
tccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa
(SEQ ID NO：16)
ESXM(类ESAT-6蛋白ESXM)
atggcctcacgttttatgacggatccgcatgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt
tccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacctagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctgagcagctag
(SEQ ID NO：17)
ESXP(类ESAT-6蛋白7)
atggcaacacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatc
tcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa
(SEQ ID NO：18)
ESXW(类ESAT-6蛋白10)
atgacctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag
gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt
tccggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatg
aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc
gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga
(SEQ ID NO：19)
PE9(PE家族的蛋白)
atgtcatacatgattgccacaccagcggcgttgacggcggcggcaacggatatcgacggg
attggctcggcggttagcgttgcgaacgccgcggcggtcgccgcgacaaccggagtgctg
gccgccggtggcgatgaagtgttggcggccatcgctaggctgttcaacgcaaacgccgag
gaatatcacgccctcagcgcgcaggtggcggcgtttcaaaccctgtttgtgcgcaccttg
actggggggtgcggagtctttcgccggcgccgaggccgccaatgcgtcacagctgcagag
catcgcgcggcaggtgcggggcgccgtcaacgccgtcgccggtcaggtgacgggcaatgg
cggctccggcaacagcggcacttcggctgcggcggccaacccgaattccgacaacacagc
Gagcatcgccgatag
(SEQ ID NO：20)
PE_PGRS42(PE-PGRS家族的蛋白)
gtgtcgttggtgatcgcgacgccgcagctgctggcaactgcggctttggatttagcgagt
attggttcgcaggtgagcgcggctaatgcggccgcggcgatgccgacgacggaagtggtg
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ggcgcggctggcgggttcggtcaaaccggcggcagcggaggcgcggccgggttgatcggc
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gccgctgccggtggcggcggcggcaacggcggcgacggcggagtcgcgcagggcgacatt
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ggcgccggcgggaccggcggcgcgggcggcaacggcggcgccggcgggttgttgttcggc
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ggcgcgggcggtagcggcggtgaggcaggcgcggggggcctcaccaacggccccgggtcc
cctggcgtttccggcaccgaaggcatggccggcgcgcccggctag
(SEQ ID NO：21)
Rv1860(纤连蛋白结合蛋白)
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ccggagccagcgcccccggtacccacaacggccgcctcgccgccgtcgaccgctgcagcg
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cctgtcattgccccaaacgcaccccaacctgtccggatcgacaacccggttggaggattc
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ccgggcacccggatcaaccaggaaaccgtctcgctcgacgccaacggggtgtctggaagc
gcgtcgtattacgaagtcaagttcagcgatccgagtaagccgaacggccagatctggacg
ggcgtaatcggctcgcccgcggcgaacgcaccggacgccgggccccctcagcgctggttt
gtggtatggctcgggaccgccaacaacccggtggacaagggcgcggccaaggcgctggcc
gaatcgatccggcctttggtcgccccgccgccggcgccggcaccggctcctgcagagccc
gctccggcgccggcgccggccggggaagtcgctcctaccccgacgacaccgacaccgcag
Cggaccttaccggcctga
(SEQ ID NO：22)
Rv1273c(可能的药物跨膜运输ATP结合蛋白ABC转运蛋白)
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atgatgctgcagctggtcagcaccctggcttcgctatacctcccgacggtcaacgccgca
atcgtcgacgacggcgtcgccaagggcgacaccgccaccatcgtacggctgggtgcggtg
atgcttggggtgaccggattgcaggtgctgtgcgcgatcggggcggtctatctgggctcc
cggaccggggcgggtttcggccgtgacctgcgctcggcaatgttcgaacacatcatcacc
ttctcggaacgcgagaccgcccgattcggcgctccgacgttgttgacccgcagcaccaac
gacgtccggcagatcctgttcctggtccagatgaccgccaccgtgctggtcaccgcaccg
atcatgtgcgtcggcggaatcatcatggccatccaccaggaggccgcgctgacatggctg
ctgctggtcagcgttccgattctggccgtagcaaactactggatcatctcccacatgctg
ccgctcttccgccgcatgcagagcctgatcgacggcatcaaccgggtgatgcgcgatcag
ctgtccggggtgcgagtggtccgcgccttcacccgcgaaggctatgaacgcgacaagttc
gcgcaggccaatacggcgctgtcgaatgccgcactgagcgccggcaactggcaagcactg
atgctgccggtgaccacgctgaccatcaacgcatccagcgtcgcactgatctggttcggt
gggctacgcatcgacagcggccagatgcaggtcggctccctgatcgccttcctgtcctac
ttcgcccagatcctgatggcggtgttgatggcgaccatgacgctggccgtgctgccacga
gcgtcggtctgcgccgaacgcatcaccgaggtgctttccacgcccgccgcactcggtaac
cccgacaatcccaagttcccgacggacggggtcacgggcgtagtgcgcttggctggcgca
acctttacctatcctggcgccgactgcccggtgctgcaggacatttcgttgactgcgcgg
cccggtaccaccaccgcgatcgtcggcagtaccggttcgggcaagtcgacactggtgtcg
ttgatctgccggctctacgacgtcaccgctggcgcggtcttggttgacggtatcgacgtc
cgcgagtaccacaccgagcggctctggtcagcgatcgggctggtgccccagcgcagctac
ctcttctccggaaccgtcgcggacaacctgcgctacggcgggggcccagaccaggtagtc
accgagcaggagatgtgggaggcgctgcgggtcgccgcggccgacggctttgtacaaaca
gacgggctgcagacgcgtgtcgcccaaggtggtgtcaacttctccggcgggcagcgccaa
cggctggcgatagcccgagcggtcatccgacgtccggccatctatgtgttcgacgacgcg
ttctccgcacttgacgtgcacaccgacgccaaagtccacgcatcgctgcgacaggtatct
ggtgatgcaaccatcattgttgttacacaacggatttcgaatgccgctcaggccgaccag
gtcatcgttgtcgataacggtaagatcgtcggcacgggcacccacgaaacgctgctggcc
gattgccccacctatgccgaattcgccgcctcacaatcgctgagcgccacggtcgggggt
Gtagggtga
(SEQ ID NO：23)
Rv0159c(PE家族的蛋白)
atgtcctacgtcatcgcggccccggagatgttggcaacgacggccgcggacgtggacggg
atcggttcggcgatacgagcggccagcgcgtccgctgcgggtccaacgaccggactgctg
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gaatgtcaagaggtcctaaagcaggctgcggcgttccatggcgagttcacccgggcgctg
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accgccgggtccagcggcgccctcggttctgtcgggatgctgtcaggcaacccgctaacc
gcgttgatgatgggcggcaccggggaaccgatccttagtgaccgcgtcttggcgatcatt
gacagcgcatacattcggcccattttcgggcccaacaacccggtcgcccagtacacgccc
gagcagtggtggccgtttatcgggaacctgtcactggaccaatccatcgcccagggtgtc
acgctgctgaacaacggcatcaacgcggaactacaaaatgggcatgacgtcgtcgttttc
ggctactcgcaaagcgccgcggtagcgaccaatgaaatacgcgctcttatggcgttacca
ccgggccaagccccagatccaagccggctggctttcacgttgatcggtaatatcaataac
cccaacggcggcgtcctcgagcgttacgtgggcctttacctcccgttcttggatatgtcg
ttcaacggtgcgactccaccggattccccctaccagacctacatgtacaccggccaatac
gacggctacgcccacaacccgcagtacccgctcaatatcttgtcggacctcaacgccttc
atgggcatcagatgggtgcacaacgcgtaccccttcaccgcggccgaggttgccaatgcc
gtgccgttgcccacgtctccgggctacaccggcaacacccattactacatgtttctgacc
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gagctgattcagcccgacctacgggtgctagtcgacttgggctatggctacggctacgcc
gacgtacccaccccggccagcctgttcgcgccaatcaacccgatcgccgtggcctcggcc
ctggcgaccgggaccgtgcaaggcccccaagccgccctagtaagcatcggattgttaccg
cagtccgcgctacccaatacgtatccgtatcttccgtcggcgaatccgggcctgatgttc
aacttcggtcaatccagtgtgacggagttgtcggtgctcagtggcgccctcgggtccgta
gcgagattgattccaccgatcgcgtga
(SEQ ID NO：24)
Rv3350c(PPE家族蛋白)
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tcgagcccgttgctggcggcggccgcggcgtgggatgggctggctgaggagttggggtcg
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gcggtgtcgaatctgttggggcagaacacgccggcgatcgcggccgccgaggccgagtac
gagctgatgtgggccgccgatgtggcggcgatggccggctaccattccggcgcgtcggct
gctgccgcggcgttgccggcgttcagcccaccggcgcaggcgctggggggaggtgtcggc
gcgttccttaccgccctgttcgccagccctgcgaaggcgctgagcctgaatgcgggtttg
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ggcaatgtgggtgggcagaatctgggtttcgggaatgccggtggcaccaatgtcgggttc
ggcaacctcggtaacgggaatgtcgggttcggcaactccggtctgggggcgggcctggcc
ggcttgggcaatatcgggttgggcaatgcgggcagcagcaactatggtttcgcaaacctg
ggtgtgggcaacatcggtttcggcaacaccggcaccaacaacgtcggcgtcgggctcacc
ggcaaccacctgacgggtatcgggggcctgaattcgggcaccgggaatatcgggttgttc
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aacgccggcgacaccaacaccggtggcttcaaccccggcggtgtgaacaccggctggctg
aacaccggcaacaccaacaccggcatcgccaactcgggcaacgtcaacaccggcgcgttc
atctcgggcaacttcaacaacggcgtgctgtgggtgggtgactaccagggcctgttcggc
gtctccgccggctcgtcgatccccgcaattcccatcggcctggtgctcaacggcgacatc
ggcccgatcaccatccagcccatcccgatcctgcccaccatcccgctcagcattcaccaa
accgtcaacttgggcccgctggtggttcccgacatcgtgatccccgccttcggcggcggt
atcggcatacccatcaacatcggcccgctgaccatcacacccatcaccctgtttgcccaa
cagacatttgtcaaccaattgccctttcccaccttcagtttagggaaaatcacaattcca
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gacaccaccattcccggacccaccaatccacagattgatttaacgatcagatgggatacc
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gtgagtgtgtcgatcagtaacccgggctttaccatcccgggatttagtgttcccgcgcag
ccgttgccgttgtcgatcgatatcgagggccagatcgacgggttcagcaccccgccgatc
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cagggccttcatatcccggcggcgccgggagtggggaacaccaccacggccccgtcgtcg
ggattcttcaactccggtgcgggtggggtgtcgggtttcggcaacgtcggcgcgggcagc
tcgggctggtggaaccaggcgccgagcgcgctgttgggggccggttcgggtgttggcaac
gtgggcaccctgggctcgggtgtgctcaacctgggctcagggatctcggggttctacaac
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ggtgcggccaacatcggtgggcacaacctgggcctgggcaatgtcggggacggcaacctg
gggttgggcaacatcggccatggcaacctggggtttgccaacttgggcctgaccgccggc
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aacatgggtgtgggcaatattgggtttgccaacaccggcacgggcaacatcgggatcggg
ctggtcggggaccatcggaccgggatcgggggcttgaactccggcatcggcaatatcggg
ttgttcaactccggcaccggcaacgtcgggttcttcaattccgggaccggcaacttcggc
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ctcttcaatgccggcagcttcagcaccggcatcgccaacactggtgactacaacacgggc
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tggttcaacaccgggcatgccaacaccgggttggccaacgcgggcaccttcggcaccggc
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gtcggcgtccgcgtcgggcccacgatctcccaattcccggtcaccgtgcacgcgatcggc
ggggtgggcccgctgcatgtggcgcccgtcccggtacccgccgtgcacgtcgagatcacc
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atcgccagcatcaccggaagcgtggacctggccgcaaacaccatctcgccgattcgcgct
cttgacccgctcgccggttcgatagggctttttctcgagccgttccgcctcagtgaccca
tttatcaccattgatgcgttccaagttgttgccggtgtcttgttcctagagaacatcatt
gtgcccggcctcacggttagcggtcagatattggtcaccccgacaccaattcccctaacc
ctcaacttggacaccaccccgtggacgcttttcccgaatggtttcaccattcccgcgcaa
acccccgtgacggtgggtatggaggtcgccaacgacgggttcaccttcttcccgggtggg
ctgacctttccgcgggcctccgccggggtcaccggactgtccgtggggctggacgcgttc
acgctgttgcccgacgggttcaccctcgacaccgtgccggcgaccttcgacggcaccatc
ctcatcggcgatatcccgatcccgatcatcgatgtgccggcggtgccggggttcggcaac
accaccacggccccatcgtcggggttcttcaacaccggcggcggcggtggatcggggttc
gccaacgtcggcgcgggcacgtcgggctggtggaaccaggggcacgacgtgttagcaggg
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aatctcggcagcgggaacgtcgggttcggcaacatcggtgccggcaacgtcgggttcgcc
aactcgggtccggcggtgggcctggccggcctgggcaacgtggggttgagcaatgccggc
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tcgggtagtggcaatatcggattgttcaattccggcaccggcaatgtcgggttcttcaac
accggcaccggcaacttcggactgttcaactccggtagtttcaacaccggcatcggtaat
agcggaaccggcagtactgggctcttcaatgccggcaatttcaacaccggcatcgccaac
cccgggtcgtacaacacgggcagcttcaatgtcggtgataccaacaccggtggtttcaac
ccgggcgacatcaacaccggctggttcaacaccggcattatgaatacgggcacccgcaac
accggcgccctcatgtcggggaccgacagcaacggcatgctgtggcgcggcgaccacgag
ggcctgttcggcctgtcctatggcatcacgatcccgcaattcccgatccgcatcaccacg
actggcggtatcggccccatcgtcatcccggacaccacgatccttccgccgctgcacctg
cagatcaccggcgacgcggactacagcttcaccgtgcccgacatccccatccccgccatc
cacatcggcatcaatggcgtcgtcaccgtcggcttcaccgccccggaagccaccctgctg
tccgccctgaagaataacggtagcttcatcagcttcggccccatcacgctctcgaatatc
gatattccgcccatggatttcacgttaggcctgcccgttcttggtcctatcacgggccaa
ctcggaccaattcatcttgagccaatcgtggtggccgggatcggtgtgcccctggagatc
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tccgtggacatcccggcggtcacgatcacaggcaccaccatttccgcgatcccgctgggc
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ccgggcttcgggaactcgacccagatgccgtcgtcggggttcttcaacaccggtgccggc
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accccggcggtgatctcggggttcagcaacctcggcgaccatatgtcgggggtgtccatc
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gacgcggccatcgccgagctgcagcacctcgacatcggcaacgctttggccttgggcaat
gtcggcggggtgaacctcggtttggctaacgtcggtgagttcaacctgggtgcgggcaac
gtcggcaacatcaacgtcggcgccggcaacctcggcggcagcaacttggggttgggcaac
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ctggacctcaacgaaaccctcaacctgggccccatccacatcgagcagatcgacatcccc
ggcatgtcgctgttcgacgtccacgaaatcgtcgagatcggacccttcaccatcccgcag
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atcccgcccattccggtcggcttcgccgcggtcggtggcatcggcccgatcgccatcccg
gacatctctgttccatccattcacttgggcctcgaccccgccgtccatgtcggctccatc
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(SEQ ID NO：25)
这些多核苷酸包括编码目的多肽的DNA、cDNA和RNA。编码序列中的沉默突变源自遗传密码的简并性(即冗余性)，从而一个以上的密码子能编码同样的氨基酸残基。因此，例如亮氨酸可以由CTT、CTC、CTA、CTG、TTA或TTG编码，丝氨酸可以由TCT、TCC、TCA、TCG、AGT或AGC编码，天冬酰胺可以由AAT或AAC编码，天冬氨酸可以由GAT或GAC编码，半胱氨酸可以由TGT或TGC编码，丙氨酸可以由GCT、GCC、GCA或GCG编码，谷氨酰胺可以由CAA或CAG编码，酪氨酸可以由TAT或TAC编码，异亮氨酸可以由ATT、ATC或ATA编码。显示了标准遗传密码的表格可以在各种不同来源中找到(例如L.Stryer，1988，《生物化学》第三版，Biochemistry，3rd Edition，W.H.5Freeman and Co.，NY)。
编码Mtb多肽的核酸可以通过体外方法克隆或扩增，例如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、基于转录的扩增系统(TAS)、自动维持的序列复制系统(3SR)和Qβ复制酶扩增系统(QB)。例如编码蛋白的多核苷酸可以通过使用基于分子的DNA序列的引物进行cDNA的聚合酶链反应来分离。各种各样的克隆和体外扩增方法对于本技术领域的专业人员来说是熟知的。PCR方法在例如美国专利No.4,683,195；Mullis等，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，1987；以及Erlich主编的《PCR技术》(PCR Technology，Stockton Press，NY，1989)中有描述。多核苷酸也能够通过选自所需多核苷酸序列的探针，在严紧的杂交条件下筛选基因组或cDNA文库来分离。
编码Mtb多肽的多核苷酸包括掺入到载体、到自主复制的质粒或病毒、或到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的分离的分子(例如cDNA)存在。本发明的核苷酸可以是核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或两种核苷酸之一的修饰形式。该术语包括单链和双链形式的DNA。
在一个实施方案中，载体被用于在酵母例如酿酒酵母(S.cerevisiae)或乳酸克鲁维斯酵母(Kluyveromyces lactis)中表达。已知有几种启动子用于酵母表达系统，例如组成型启动子质膜H+-ATPase(PMAl)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GPD)、磷酸甘油酸激酶-1(PGK1)、乙醇脱氢酶-1(ADHl)、和多重药物抗性泵(PDR5)。此外，也可以使用诱导型启动子，例如GALl-10(由半乳糖诱导)、PHO5(由低的细胞外无机磷酸盐诱导)和串联的热休克HSE元件(由温度升高到37℃诱导)。对可滴定的诱导物作出反应指导可变表达的启动子包括甲硫氨酸响应性MET3和MET25启动子以及铜依赖性的CUP1启动子。任何这些启动子都可以克隆到多拷贝(2μ)或单拷贝(CEN)质粒中，提供对表达水平的附加水平的控制。质粒可以包含用于在酵母中筛选的营养标记(例如URA3、ADE3、HIS1等)，以及用于在细菌中繁殖的抗生素抗性(AMP)。在乳酸克鲁维斯酵母中表达的质粒是已知的，例如pKLAC1。因此，在一个实施例中，在细菌中扩增后，可以通过与细菌转化类似的方法将质粒导入相应的酵母营养缺陷体中。
Mtb多肽可以在各种不同的酵母菌株中表达。例如，7种多重药物抗性转运蛋白YORl、SNQ2、PDR5、YCF1、PDR10、PDR11和PDR15与它们的活化转录因子PDR1和PDR3一起，已经同时从酵母宿主细胞中缺失了，使得产生的菌株对药物敏感。质膜脂类组成改变的酵母菌株，例如在麦角甾醇生物合成中缺陷的erg6突变株，也可以使用。对于蛋白水解高度敏感的蛋白，可以在缺乏控制其它液泡水解酶活化的主要液泡内肽酶Pep4的酵母中表达。如果相应的无效突变体不能存活，可以采用在带有基因的温度敏感性(ts)等位基因的菌株中进行异源表达。
也可以制备编码本文公开的Mtb多肽的病毒载体。已经构建了许多病毒载体，例如多形瘤SV40(Madzak等，1992，J.Gen.Virol.，73：1533-1536)、腺病毒(Berkner，1992，Cur.Top.Microbiol.Immunol.，158：39-6；Berliner等，1988，Bio Techniques，6：616-629；Gorziglia等，1992，J.Virol.，66：4407-4412；Quantin等，1992，Proc.Nad.Acad.Sci.USA，89：2581-2584；Rosenfeld等，1992，Cell，68：143-155；Wilkinson等，1992，Nucl.Acids Res.，20：2233-2239；Stratford-Perricaudet等，1990，Hum.Gene Ther.，1：241-256)、牛痘病毒(Mackett等，1992，Biotechnology，24：495-499)、腺相关病毒(Muzyczka，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：91-123；On等，1990，Gene，89：279-282)、疱疹病毒包括HSV和EBV(Margolskee，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：67-90；Johnson等，1992，J.Virol.，66：2952-2965；Fink等，1992，Hum.Gene Ther.3：11-19；Breakfield等，1987，Mol.Neurobiol.，1：337-371；Fresse等，1990，Biochem.Pharmacol.，40：2189-2199)、辛德比斯病毒(H.Herweijer等，1995，Human Gene Therapy 6：1161-1167；美国专利No.5,091,309和美国专利No.5，2217，879)、α-病毒(S.Schlesinger，1993，Trends Biotechnol.11：18-22；I.Frolov等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11371-11377)和鸟类的逆转录病毒(Brandyopadhyay等，1984，Mol.Cell Biol.，4：749-754；Petropouplos等，1992，J.Virol.，66：3391-3397)、鼠的逆转录病毒(Miller，1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：1-24；Miller等，1985，Mol.Cell Biol.，5：431-437；Sorge等，1984，Mol.Cell Biol.，4：1730-1737；Mann等，1985，J.Virol.，54：401-407)以及人类来源的逆转录病毒(Page等，1990，J.Virol.，64：5370-5276；Buchschalcher等，1992，J.Virol.，66：2731-2739)。杆状病毒(苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)多核型多角体病毒；AcMNPV)载体在本技术领域中也是已知的，并可以从商业来源获得(例如PharMingen，San Diego，Calif.；Protein Sciences Corp.，Meriden，Conn.；Stratagene，La Jolla，Calif.)。
因此，在一个实施方案中，编码Mtb多肽的多核苷酸包含在病毒载体中。适合的载体包括逆转录病毒载体、正痘病毒载体、鸟痘病毒载体、禽痘病毒载体、羊痘病毒载体、猪痘病毒载体、腺病毒载体、疱疹病毒载体、α-病毒载体、杆状病毒载体、辛德比斯病毒载体、牛痘病毒载体和脊髓灰质炎病毒载体。具体的示例载体是痘病毒载体例如牛痘病毒、禽痘病毒和高度减毒的牛痘病毒(MVA)、腺病毒、杆状病毒等。
用于实践本发明方法的痘病毒包括正痘病毒、猪痘病毒、鸟痘病毒和羊痘病毒。正痘病毒包括痘苗病毒、鼠痘病毒和浣熊痘病毒。使用的正痘病毒的一个例子是痘苗病毒。鸟痘病毒包括禽痘病毒、金丝雀痘病毒和鸽痘病毒。羊痘病毒包括山羊痘病毒和绵羊痘病毒。在一个例子中，猪痘病毒是家猪痘病毒。用于表达的痘病毒载体的例子描述在例如美国专利No.6,165,460中，在此引为参考。其它可以使用的病毒载体包括其它DNA病毒例如疱疹病毒和腺病毒，以及RNA病毒例如逆转录病毒和脊髓灰质炎病毒。
在某些情况下，牛痘病毒载体可能引发强烈的抗体应答。因此，当可以用牛痘病毒载体进行很多加强时，在某些情况下它的重复使用可能并没有用处。但是，这种敏感性问题可以通过使用其它属的痘病毒进行加强来最小化。在一个实施例中，当第一次或最初的痘病毒载体是牛痘病毒时，第二个和随后的痘病毒载体是选自不同属的痘病毒，例如与牛痘病毒免疫原性截然不同的猪痘病毒、鸟痘病毒、羊痘病毒或正痘病毒。
牛痘病毒的基因组在本技术领域中是已知的。它由HIND F13L区、TK区和HA区构成。重组的牛痘病毒已经被用于掺入外源基因以表达外源基因产物(参见，例如，Perkus等，Science 229：981-984，1985；Kaufman等，Int.J.Cancer 48：900-907，1991；Moss，Science 252：1662，1991)。编码目的抗原例如免疫原性Mtb多肽的基因，可以被整合到重组牛痘病毒载体的HIND F13L区中，或整合到TK区中(或牛痘病毒基因组的其它非必需区中)。Baxby和Paoletti(Vaccine 10：8-9，1992)公开了非复制性的痘病毒，包括金丝雀痘病毒、禽痘病毒和其它鸟的种类，作为载体的构建和使用。Sutter和Moss(Proc.Nat′l.Acad Sci U.S.A.89：10847-10851，1992)和Sutter等(Virology 1994)公开了在载体的构建和使用中，非复制性的重组安哥拉病毒(MVA，修饰的安哥拉牛痘病毒)作为载体的构建和使用。
适合的载体被公开在例如美国专利No.6,998,252中，在此引为参考。在一个实施例中，通过插入嵌合基因，对重组的痘病毒例如重组的牛痘病毒进行了合成修饰，所述嵌合基因含有牛痘调控序列或功能上与其等价的DNA序列，并且其侧翼带有的DNA序列在天然状态下与侧翼的编码Mtb多肽的牛痘病毒调控DNA序列是不相邻的。含有这样的嵌合基因的重组病毒有效地表达Mtb多肽。在一个实施例中，牛痘病毒载体含有(A)包含(i)编码Mtb多肽的第一DNA序列和(ii)痘病毒启动子的片段，其中痘病毒启动子与编码Mtb多肽的DNA序列相邻并对它进行转录控制；和在该片段侧翼，(B)来自痘病毒基因组的非必需区的DNA。病毒载体编码选择性标记。在一个实施例中，痘病毒包括例如胸腺嘧啶激酶基因(参见美国专利No.6,998,252，在此引为参考)。
编码Mtb多肽的病毒载体、例如痘病毒载体，含有至少一种与编码Mtb多肽的核酸序列操作性连接的表达控制元件。表达控制元件被插入到病毒载体中以控制和调节核酸序列的表达。用于这些载体的表达控制元件的例子包括但不限于lac系统、λ噬菌体的操纵子和启动子区、酵母启动子和源自多瘤病毒、腺病毒、逆转录病毒或SV40的启动子。其它的操纵元件包括但不限于前导序列、终止密码子、多聚腺苷化信号以及对于在宿主系统中适当转录和后续翻译编码Mtb多肽的核酸序列的所必需的任何其它序列。表达载体可以含有对于在宿主系统中转移和后续复制含有核酸序列的表达载体所必需的其它元件。这样的元件的例子包括但不限于复制起点和选择性标记。本技术领域的专业人员将进一步理解，这样的载体易于使用常规方法构建(Ausubel等，(1987)，《分子生物学现代方法》，＂Current Protocols in MolecularBiology，＂John Wiley and Sons，New York，N.Y.)，并且可以商购。
制备含有编码一个或多个Mtb多肽的异源DNA序列的重组DNA病毒的基本方法在本技术领域中是已知的。这些技术包括，例如，在侧翼具有供体质粒中的DNA序列的病毒DNA序列和亲本病毒中存在的同源序列之间进行同源重组(Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7415-7419)。具体来说，重组病毒载体例如痘病毒载体可以用于投送基因。载体可以通过例如本技术领域中已知的步骤来构建，例如与美国专利No.5,093,258中描述的创建禽痘病毒合成重组体的方法类似的步骤，该专利在此引为参考。其它的技术包括使用天然存在或人工插入到亲本病毒载体中的独特的限制性内切酶位点来插入异源DNA。
一般来说，DNA供体载体包含下列元件：(i)原核的复制起点，使得载体可以在原核宿主中扩增；(ii)编码标记的基因，它允许筛选含有载体的原核宿主细胞(例如编码抗生素抗性的基因)；(iii)至少一种编码一个或多个Mtb多肽的DNA序列，位于能够指导序列表达的转录启动子附近；以及(iv)在元件(iii)的结构侧翼具有与亲本病毒基因组中将要插入外源基因的区域同源的DNA序列。将多个外源基因导入痘病毒的供体质粒的构建方法在PCT公布No.WO 91/19803中有描述，在此引为参考。
一般来说，构建供体载体的DNA片段，包括含有转录启动子的片段和含有与亲本病毒基因组中将要插入外源DNA序列的区域同源的序列的片段，可以从基因组DNA或克隆的DNA片段中获得。供体质粒可以是单价、二价或多价的(即含有一个或多个插入的外源DNA序列)。供体载体可以含有编码标记的附加基因，它将允许鉴定含有插入的外源DNA的重组病毒。可以使用几种类型的标记基因以允许重组病毒的鉴定和分离。这些包括编码抗生素或化学抗性的基因(例如，参见Spyropoulos等，1988，J.Virol.62：1046；Falkner和Moss，1988，J.Virol.62：1849；Franke等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1918)，以及基因例如大肠杆菌lacZ基因，它允许通过比色分析鉴定重组病毒噬斑(Panicali等，1986，Gene 47：193-199)。
要插入到病毒中的DNA基因序列可以被放置在供体质粒例如大肠杆菌或沙门氏菌质粒构建物中，其中与DNA片段、例如痘病毒中将要插入DNA的插入位点同源的DNA已经被插入。将要插入的DNA基因序列单独与启动子连接。将启动子-基因连锁放置在质粒构建物中，使启动子-基因连锁两端上侧翼的DNA具有与侧翼带有作为预期插入区域的痘病毒DNA区域的DNA序列同源。对于亲本痘病毒载体来说，使用痘启动子。然后将得到的质粒构建物通过在大肠杆菌细菌中生长进行扩增并分离。接下来，将含有待插入的DNA基因序列的分离质粒与亲本病毒例如痘病毒一起转染到细胞培养物中，例如鸡胚成纤维细胞。质粒和病毒基因组中同源痘DNA之间的重组相应地产生了重组痘病毒，其在不影响病毒存活性的位点上，被其基因组中存在的启动子-基因构建物所修饰。
正如前面所述，DNA序列被插入到病毒中不影响所产生的重组病毒存活性的区域(插入区)中。本技术领域的专业人员通过例如随机地测试病毒DNA中的片段以寻找允许重组体形成而不严重影响重组体的病毒存活性的区域，能够容易地鉴定这样的区域。可以易使用并存在于许多病毒中的一个区域是胸腺嘧啶激酶(TK)基因。TK基因在所有被检查的痘病毒基因组中均可找到，包括兔痘病毒(Upton等，1986，J.Virology 60：920)；肖普(shope)纤维瘤病毒；山羊痘病毒(Gershon等，1989，J.Gen.Virol.70：525)肯尼亚绵羊-1；正痘病毒(Weir等，1983，J.Virol.46：530)牛痘病毒(Esposito等，1984，Virology 135：561)；猴痘病毒和天花病毒(Hruby等，1983，PNAS 80：3411)牛痘病毒(Kilpatrick等，1985，Virology 143：399)；亚巴猴肿瘤病毒；鸟痘病毒(Binns等，1988，J.Gen.Virol.69：1275)；禽痘病毒(Boyle等，1987，Virology 156：355)；禽痘病毒(Schnitzlein等，1988，J.Virological Methods 20：341)；禽痘病毒、鹌鹑痘病毒；昆虫痘病毒(Lytvyn等，1992，J.Gen.Virol.73：3235-3240)。在牛痘病毒中，除了TK区之外，其它的插入区包括例如HindIII M片段。在禽痘病毒中，除了TK区之外，其它的插入区包括例如在EPO申请No.0 308220 A1中提出的BamHI J片段(Jenkins等，1991，AIDSResearch and Human Retroviruses 7：991-998)、EcoRI-HindIII片段、EcoRV-HindIII片段、BamHI片段和HindIII片段(也参见Calvert等，1993，J.Virol.67：3069-3076；Taylor等，1988，Vaccine 6：497-503；Spehner等，1990；Boursnell等，1990，J.Gen.Virol.71：621-628)。
在家猪痘病毒中，插入位点包括胸腺嘧啶激酶基因区。除了需要将基因插入到插入区中之外，插入的基因被修饰的痘病毒成功表达还需要存在与所需基因可操作地连接的启动子。一般来说，启动子被放置在位于将被表达的基因的上游。启动子在本技术领域中是众所周知的，可以根据你希望作为靶的宿主和细胞的类型容易地选择。在一个实施例中，在痘病毒中使用痘病毒启动子例如牛痘病毒7.5K、40K或禽痘启动子例如FPV CIA。也可以组合使用增强子元件以增加表达的水平。此外，可以使用诱导型启动子。
在感染的细胞中供体质粒DNA与病毒DNA之间的同源重组可以导致整合了所需元件的重组病毒的形成。适合进行体内重组的宿主细胞一般来说是能够被病毒感染并被质粒载体转染的真核细胞。这样的适合与痘病毒一起使用的细胞的例子是鸡胚成纤维细胞、HuTK143(人类)细胞以及CV-1和BSC-40(都是猴肾)细胞。细胞被痘病毒的感染和这些细胞用质粒载体的转染通过本技术领域中标准的技术来完成(参见美国专利No.4,603,112和PCT公布No.WO 89/03429)。
体内重组之后，可以通过几种技术之一来鉴定重组的病毒后代。例如，如果DNA供体载体被设计成将外源基因插入到亲本病毒胸腺嘧啶激酶(TK)基因中，则含有整合的DNA的病毒将是TK-的，并且可以在此基础上筛选(Mackett等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：7415)。或者，将编码标记的基因或指示基因与上面描述的目的外源基因进行共整合，可以用于鉴定重组后代。一个具体的非限制性的指示基因的例子是大肠杆菌lacZ基因。表达β-半乳糖苷酶的重组病毒可以使用该酶的生色底物进行筛选(Panicali等，1986，Gene 47：193)。一旦重组病毒被鉴定，可以使用各种不同的公知方法来分析被插入的DNA片段编码的Mtb序列的表达。这些方法包括黑噬斑分析(在病毒噬斑上进行的原位酶免疫分析)、Western印迹分析、放射免疫沉淀(RIPA)和酶免疫分析(EIA)。
本公开包涵为了具有多价疫苗的目的而含有一个以上目的抗原的重组病毒。例如，重组病毒可以含有病毒基因组或其一部分、编码Mtb多肽的核酸序列以及编码乙肝表面抗原或任何其它载体蛋白的核酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种组合物，所述组合物包含的重组病毒含有牛痘病毒基因组或其一部分、或编码Mtb多肽的核酸序列和只含有或与编码免疫刺激分子B7-2的核酸分子一起含有编码免疫刺激分子B7.1的核酸序列的重组病毒，或者所述组合物包含的重组病毒同时含有Mtb多肽和免疫刺激分子的基因。本公开也包涵含有Mtb多肽的重组病毒，它与含有病毒基因组或其一部分以及编码一个或多个B7分子的一个或多个核酸序列的第二种重组病毒、例如表达B7-1和/或B7-2的重组牛痘病毒一起施用。
因此，在一个实施例中，公开的重组病毒是含有B7-1的重组牛痘病毒和含有B7-2的重组牛痘病毒(分别命名为rV-B7-1和rV-B7-2)；组合物可以包含rV-B7-1和/或rV-B7-2以及免疫原性Mtb多肽。
B7分子包括但不限于B7-1、B7-2及其类似物。B7基因可以从哺乳动物来源克隆，包括但不限于哺乳动物组织、基因组文库或cDNA文库，例如鼠或人类来源。不受理论的束缚，据认为B7家族的协同刺激分子(即B7-1、B7-2以及可能的B7.3)是免疫球蛋白基因超家族的成员。这些分子存在于巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞(抗原呈递细胞(APCs))上。没有协同刺激时，一般不会发生针对给定抗原的免疫应答的显著扩增(June等，Immunology Today 15：321-331，1994；Chen等，Immunology Today 14：483-486；Townsend等，Science 259：368-370)。Freeman等(J.Immunol.143：2714-2722，1989)报道了B7-1基因的克隆和测序。Azuma等(Nature 366：76-79，1993)报道了B7-2基因的克隆和测序。因此，在一个实施方案中，B7-1基因或B7-2基因与Mtb多肽一起施用。已经公开了将编码B7-1和B7-2的核酸插入到牛痘病毒中(参见，例如，美国专利No.6,893,869，在此引为参考；该美国专利还公开了编码IL-2的核酸在牛痘病毒中的使用)。几种包含IL-2、B7-1和B7-2的载体已经根据布达佩斯公约的条款于1994年10月3日保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(例如rV-CEA/nIL-2(ATCC名称VR2480)、rV-mB7-2(ATCC名称VR2482)和rV-mB7-1(ATCC名称VR 2483))。
编码Mtb多肽的DNA序列可以通过将DNA转移到适合的宿主细胞中进行体外表达。细胞可以是原核的或真核的。该术语也包括了对象宿主细胞的任何后代。应该理解所有的后代可以与亲本细胞不相同，因为在复制过程中可能发生突变。稳定的转移，其意义为外源DNA被持续维持在宿主中，该方法在本技术领域中是已知的。
正如前面注意到的那样，编码Mtb多肽的多核苷酸序列可以与表达控制序列可操作地连接。表达控制序列与编码序列的可操作地连接是在与表达控制序列相容的条件下能够使编码序列表达的连接。表达控制序列包括但不限于适合的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前方的起始密码子(即ATG)、维持基因的正确阅读框架使得mRNA正确翻译的内含子剪接信号、以及终止密码子。
宿主细胞可以包括微生物、酵母、昆虫和哺乳动物宿主细胞。在原核生物中表达含有真核或病毒序列的DNA序列的方法在本技术领域中是众所周知的。适合的宿主细胞的非限制性的例子包括细菌、古菌(archea)、昆虫、真菌(例如酵母)、分枝杆菌(例如耻垢分枝杆菌(M.smegmatis))、植物和动物细胞(例如哺乳动物细胞，例如人类)。示例的可用细胞包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、SF9细胞、C 129细胞、293细胞、脉孢菌(Neurospora)、以及永生化的哺乳动物骨髓样和淋巴样细胞系。在培养中繁殖哺乳动物细胞的技术是众所周知的(参见Jakoby和Pastan主编，1979，《细胞培养-酶学方法》，Cell Culture.Methods in Enzymology，58卷，Academic Press，Inc.，Harcourt Brace Jovanovich，N.Y.)。常用的哺乳动物宿主细胞系的例子是VERO和HeLa细胞、CHO细胞、以及WI38、BHK和COS细胞系，尽管可以使用细胞系，例如被设计用来提供较高地表达所需糖基化模式或其它特点的细胞。正如上面讨论的那样，用于转化酵母细胞的技术，例如聚乙二醇转化、原生质体转化和基因枪，在本技术领域中也是已知的(参见Gietz和Woods，Methodsin Enzymology 350：87-96，2002)。
用重组DNA转化宿主细胞可以通过本技术领域的专业人员熟知的常规技术来完成。当宿主是原核细胞例如但不限于大肠杆菌时，可以通过在指数生长期后收获细胞、然后使用本技术领域中熟知的程序通过CaCl2方法处理细胞来制备能够摄入DNA的感受态细胞。或者，可以使用MgCl2或RbCl。如果需要的话，转化也可以在形成宿主细胞的原生质体后进行，或通过电穿孔进行。
当宿主是真核细胞时，可以使用的转染DNA的方法例如磷酸钙共沉淀、常规的机械方法例如微注射、电穿孔、插入包装在脂质体中的质粒或病毒载体。真核细胞也可以用编码Mtb多肽的多核苷酸序列和编码选择性表现型的第二个外源DNA分子、例如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因进行共转化。另一种方法是使用真核病毒载体，例如猴病毒40(SV40)或牛乳头状瘤病毒，来瞬时感染或转化真核细胞并表达蛋白(参见例如Gluzman主编的《真核病毒载体》，Eukaryotic Viral Vectors，Cold Spring Harbor Laboratory，1982)。
治疗方法和药物组合物
本文公开的Mtb多肽或编码Mtb多肽的核酸可以用于在对象中产生免疫应答。在几个实施例中，对象被Mtb感染或处于被Mtb感染的风险中。因此，在几个实施方案中，方法包括给对象施用治疗有效量的一种或多种本文公开的Mtb多肽(或编码这些多肽的多核苷酸)，以产生免疫应答，例如但不限于保护性免疫应答。
在示例的应用中，组合物以足以产生针对Mtb的免疫应答的量给对象施用。这些Mtb多肽或编码这些多肽的多核苷酸是用于防止Mtb感染、防止在有潜伏性Mtb感染的对象中疾病发展、或在Mtb感染的对象中治疗结核病。在几个实施例中，施用治疗有效量的含有本文公开的一种或多种Mtb多肽(或编码这些多肽的多核苷酸)的组合物，诱导了充分的免疫应答，减轻了由于Mtb感染引起的疾病症状、防止了结核病的一种或多种症状的发展、或防止了Mtb的感染。
在某些实施例中，组合物用于预防将来的Mtb感染。因此，将治疗有效量的组合物给处于Mtb感染风险中的对象施用。组合物在对象以后一旦暴露于Mtb后，预防结核病、例如潜伏性或活动性结核病的发展。
在其它的实施例中，将组合物给患有潜伏性Mtb感染的对象施用，防止了结核病症状的发展。因此，组合物用于治疗患有潜伏性结核病的对象，例如还没有发展成活动性结核病的对象。
对于这些应用有效的量依赖于疾病的严重性、患者的总体健康状况、以及患者免疫系统的强壮程度。在一个实施例中，治疗有效量的化合物是提供症状的客观性减轻或临床医生或其它有资格的观察者所注意到的主观可鉴定到的改善的化合物量。在其它实施例中，治疗有效量是当对象以后暴露于Mtb后，足以防止Mtb感染的量。在其它实施例中，治疗有效量是在感染了Mtb的对象中足以防止症状发展的量。
Mtb多肽可以通过本技术领域的专业人员所熟知的任何方式(参见Banga，A.，《治疗性肽和蛋白》中的“治疗性肽和蛋白的肠胃外受控投送”，＂Parenteral Controlled Delivery of Therapeutic Peptides andProteins，＂in Therapeutic Peptides and Proteins，Technomic Publishing Co.，Inc.，Lancaster，PA，1995)局部或全身性给药，例如通过肌肉注射、皮下注射、腹膜内感染、静脉注射、口服、鼻部给药、透肤给药或甚至肛门给药。在一个实施方案中，用药通过口服、皮下注射或肌肉注射进行。为了延长肽或蛋白可以用来刺激应答的时间，肽或蛋白可以提供为植入物、油状注射剂或作为颗粒系统。颗粒系统可以是微粒、微胶囊、微球、纳米胶囊或类似的颗粒(参见例如Banga，同上)。基于合成聚合物的颗粒载体已经被显示除了提供受控的释放之外，还可以用作佐剂增强免疫应答。铝盐也可以用作佐剂以产生免疫应答。
在一个具体的非限制性的例子中，Mtb多肽以指导免疫应答向细胞应答(即细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答)而不是体液(抗体)应答的方式施用。
任选一种或多种细胞因子，例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ，一种或多种生长因子例如GM-CSF或G-CSF；一种或多种分子例如OX-40L或41 BBL，或这些分子的组合，可以用作生物佐剂(参见例如Salgaller等，1998，J.Surg.Oncol.68(2)：122-38；Lotze等，2000，Cancer J Sci.Am.6(Suppl 1)：S61-6；Cao等，1998，StemCells 16(Suppl 1)：251-60；Kuiper等，2000，Adv.Exp.Med.Biol.465：381-90)。这些分子可以向宿主全身(或局部)给药。在几个例子中，施用了IL-2、RANTES、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ、G-CSF、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2、B7-1B7-2、OX-40L、41BBL和ICAM-1。
已知有许多方法在体外和体内诱导细胞应答。脂类已经被鉴定为能够在体内帮助引发针对各种不同抗原的CTL的试剂。例如，如美国专利No.5,662,907中描述的那样，棕榈酸残基可以连接到赖氨酸残基的α和∈氨基基团上，然后再连接(例如通过一个或多个连接残基，例如甘氨酸、甘氨酸-甘氨酸、丝氨酸、丝氨酸-丝氨酸等)到免疫原性肽上。然后可以将脂化的肽以胶束形式直接注射、掺入到脂质体中、或在佐剂中乳化。作为另一个例子，大肠杆菌脂蛋白，例如三棕榈酰基-S-甘油基半胱氨酰丝氨酰-丝氨酸，当与适当的肽共价连接时(参见Deres等，Nature 342：561，1989)，可以用于引发肿瘤特异性CTL。此外，因为中和性抗体的诱导也可以用连接有展示适当表位的肽的同样分子来引发，在认为需要的时候可以将两种成分合并以同时引发体液和细胞介导的应答。
这样就提供了包含Mtb多肽的药物组合物。这些组合物用于促进针对Mtb的免疫应答。在一个实施方案中，Mtb多肽与含有两种或多种稳定化去污剂、胶束形成剂和油的佐剂混合。适合的稳定化去污剂、胶束形成剂和油被详细描述在美国专利No.5,585,103、美国专利No.5,709,860、美国专利No.5,270,202和美国专利No.5,695,770中，它们都引为参考。稳定化去污剂是任何允许乳液的成分保持为稳定的乳液的去污剂。这样的去污剂包括聚山梨酸酯80(吐温)(失水山梨糖醇-单-9-十八碳烯酸酯-聚(氧-1，2-乙二基)，由ICI Americas，Wilmington，DE生产)、TWEEN 40TM、TWEEN 20TM、TWEEN 60TM、ZWITTERGENTTM3-12、TEEPOL HB7TM和SPAN 85TM。这些去污剂通常以大约0.05到0.5％、例如大约0.2％的量提供。胶束形成剂是能够稳定与其它成分形成的乳浊液、从而形成类似胶束的结构的试剂。这样的试剂通常在注射的位点引起一些刺激，以便征召巨噬细胞来增强细胞应答。这样的试剂的例子包括BASF Wyandotte出版物例如Schmolka，J.Am.Oil.Chem.Soc.54：110，1977和Hunter等，J.Immunol 129：1244，1981描述的聚合物表面活性剂，PLURONICTML62LF、L101和L64、PEG1000和TETRONICTM 1501、150R1、701、901、1301和130R1。这样的试剂的化学结构在本技术领域中是熟知的。在一个实施方案中，选择具有0到2之间的亲水-亲脂平衡(HLB)的试剂，象Hunter和Bennett，J.Immun.133：3167，1984中定义的那样。试剂可以以有效量提供，例如在0.5和10％之间，或者1.25和5％之间的量。
选择组合物中包含的油，以促进抗原在水包油乳液中的保留，从而为所需抗原提供介质，并且优选具有低于65℃的熔化温度，以便在室温(大约20℃到25℃)或一旦乳液的温度被降低到室温时，乳液形成。这样的油的例子包括鲨烯、角鲨烷、EICOSANETM、四十四烷、甘油、和花生油或其它植物油。在一个具体的非限制性的例子中，油的提供量为1到10％之间或2.5到5％之间。油应该是可生物降解和生物相容的，以便经过一段时间身体可以降解油，并使得在使用油后没有不良作用，例如肉芽肿。
在一个实施方案中，佐剂是稳定化去污剂、胶束形成剂和油的混合物，可以在商品名PROVAX
Figure A200780016660D0069172756QIETU
(IDEC Pharmaceuticals，San Diego，CA)下获得。佐剂也可以是免疫刺激性的核酸，例如包含CpG基序的核酸，或生物佐剂(参见上文)。
控释的肠胃外剂型可以被制成植入物、油状注射剂或颗粒系统。对于蛋白投送系统的广泛概述，参见Banga的《治疗性肽和蛋白：配制、加工和投送系统》(Therapeutic Peptides and Proteins：Formulation，Processing，and Delivery Systems，Technomic Publishing Company，Inc.，Lancaster，PA，1995)。颗粒系统包括微球、微粒、微胶囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒。微胶囊含有治疗性蛋白作为中央核心。在微球中，治疗性药剂被分散在整个颗粒中。小于大约1μm的颗粒、微球和微胶囊一般被分别称为纳米颗粒、纳米球和纳米胶囊。毛细血管直径大约为5μm，因此只有纳米颗粒通过静脉给药。微粒的直径一般在100μm左右，并通过皮下或肌肉给药(参见Kreuter的《胶体药物投送系统》(Colloidal Drug Delivery Systems)，J.Kreuter主编，Marcel Dekker，Inc.，New York，NY，pp.219-342，1994；Tice & Tabibi，《受控药物投送专集》(Treatise on Controlled Drug Delivery)，A.Kydonieus主编，MarcelDekker，Inc.New York，NY，pp.315-339，1992)。
聚合物可以用于离子控制的释放。用于受控药物投送的各种不同的可降解和不可降解的聚合物基质在本技术领域中是已知的(Langer，Accounts Chem.Res.26：537，1993)。例如，嵌端共聚物伯洛沙姆(polaxamer)407在低温下以粘稠的但仍然流动的液体存在，但是在体温下形成半固体凝胶。它已经显示出是配制和持续投送重组白介素-2和脲酶的有效介质(Johnston等，Pharm.Res.9：425，1992；以及Pec，JParent.Sci.Tech.44(2)：58，1990)。或者，羟基磷灰石已经被用作蛋白受控释放的微载体(Ijntema等，Int.J.Pharm.112：215，1994)。另一方面，脂质体被用于脂类包裹药物的受控释放以及药物定向(Betageri等，《脂质体药物投送系统》(Liposome Drug Delivery Systems)，TechnomicPublishing Co.，Inc.，Lancaster，PA，1993)。已知有大量其它的用于治疗性蛋白的受控投送的系统(例如美国专利No.5,055,303、美国专利No.5,188,837、美国专利No.4,235,871、美国专利No.4,501,728、美国专利No.4,837,028、美国专利No.4,957,735、和美国专利No.5,019,369、美国专利No.5,055,303、美国专利No.5,514,670、美国专利No.5,413,797、美国专利No.5,268,164、美国专利No.5,004,697、美国专利No.4,902,505、美国专利No.5,506,206、美国专利No.5,271,961、美国专利No.5,254,342和美国专利No.5,534,496)。
在另一个实施方案中，药物组合物包含编码Mtb多肽的核酸。为了产生免疫应答，可以给对象施用治疗有效量的Mtb多核苷酸。
任选一种或多种细胞因子例如IL-2、IL-6、IL-12、RANTES、GM-CSF、TNF-α或IFN-γ，一种或多种生长因子例如GM-CSF或G-CSF，一种或多种协同刺激分子例如ICAM-1、LFA-3、CD72、B7-1、B7-2或其它B7相关分子；一种或多种分子例如OX-40L或41 BBL，或这些分子的组合，可以用作生物佐剂(参见例如Salgaller等，1998，J.Surg.Oncol.68(2)：122-38；Lotze等，2000，Cancer J Sci.Am.6(Suppl 1)：S61-6；Cao等，1998，Stem Cells 16(Suppl 1)：251-60；Kuiper等，2000，Adv.Exp.Med.Biol.465：381-90)。这些分子可以对宿主全身性给药。应该注意到，这些分子可以通过将编码分子的核酸插入到载体例如重组痘病毒载体中来共同施用(参见例如美国专利No.6,045,802)。在各种不同的实施方案中，编码生物佐剂的核酸可以克隆到与Mtb多肽编码序列同样的载体中，或核酸可以被克隆到一个或多个分别的载体中共同施用。此外，非特异性免疫调节因子例如卡介苗(BCG)和左旋咪唑也可以共同施用。
施用核酸的一种方法是用质粒DNA、例如用哺乳动物表达质粒直接免疫。正如上面描述的那样，编码Mtb多肽的核酸序列可以被置于启动子的控制之下，以增加分子的表达。
以核酸构建物进行免疫在本技术领域中是熟知的，并在例如美国专利No.5,643,578(它描述了通过导入编码所需抗原的DNA免疫脊椎动物以引发细胞介导的或体液应答的方法)和美国专利No.5,593,972及美国专利No.5,817,637(其描述了将编码抗原的核酸序列与允许表达的调控序列的可操作地连接)中教导。美国专利No.5,880,103描述了几种将编码免疫原性肽或其它抗原的核酸投送到生物体中的方法。方法包括核酸(或合成的肽本身)的脂质体投送，以及免疫刺激性构建物或ISCOMSTM的脂质体投送，它们是带负电荷的大小为30-40nm的笼状结构，通过同时混合胆固醇和Quil ATM(皂苷)而形成。在各种不同的感染实验模型、包括弓形体病和EB病毒诱导的肿瘤中，已经使用ISCOMSTM作为抗原的投送介质产生了保护性免疫(Mowat和Donachie，ImmunolToday 12：383，1991)。已经发现在ISCOMSTM中低至1μg的包裹的抗原剂量，产生了I类介导的CTL应答(Takahashi等，Nature 344：873，1990)。
在使用核酸进行免疫的另一种方法中，Mtb多肽也可以被减毒的病毒宿主或载体或细菌载体表达。重组的牛痘病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、逆转录病毒或其它病毒载体可以用于表达肽或蛋白，从而引发CTL应答。例如，可用于免疫方案的牛痘载体和方法描述在美国专利No.4,722,848中。BCG(卡介苗)提供了另一种表达肽的载体(参见Stover，Nature 351：456-460，1991)。
当利用病毒载体时，希望给接受体提供的组合物中每种重组病毒的剂量在从大约105到大约1010噬斑形成单位/mg哺乳动物的范围内，尽管更低或更高的剂量也可以施用。重组病毒载体的组合物可以(1)在有任何Mtb感染的迹象之前导入到哺乳动物中；(2)导入到哺乳动物中防止结核病感染的个体中结核病的发展；或(3)在Mtb感染的哺乳动物中减轻结核病的症状。将组合物给药到哺乳动物中的方法的例子包括但不限于将细胞离体暴露于重组病毒、或将组合物注射到感染的组织中或静脉、皮下、真皮或肌肉内施用病毒。或者，重组病毒载体或重组病毒载体的组合可以在可药用的载体中局部给药。一般来说，带有一种或多种Mtb多肽的核酸序列的重组病毒载体的施用量，是基于病毒粒子的滴度。施用的免疫原的示例范围是每个哺乳动物例如人类105到1010个病毒粒子。
在使用第一种重组病毒载体和第二种重组病毒载体的组合的实施方案中，其中第一种重组病毒载体带有一种或多种Mtb多肽的核酸序列，而第二种重组病毒载体带有一种或多种免疫刺激分子的核酸序列，哺乳动物可以用不同比率的第一和第二种重组病毒载体进行免疫。在一个实施方案中，第一种载体与第二种载体的比率是大约1:1，或大约1:3，或大约1:5。第一种载体与第二种载体的最适比率可以使用本技术领域熟知的方法来容易地滴定(参见例如美国专利No.6,893,869，在此引为参考)。
在一个实施方案中，已经构建了单独或以各种组合表达细胞因子(例如TNF-α、IL-6、GM-CSF和IL-2)和协同刺激分子和附属分子(B7-1、B7-2)的重组病毒。免疫刺激分子和Mtb多肽的同时生产增加了特异性效应物的产生。不受理论的束缚，依赖于具体的免疫刺激分子，可能有不同的机制是免疫原性增强的原因：辅助信号的增加(IL-2)、专职APC的征集(GM-CSF)、CTL频率的增加(IL-2)、对抗原加工途径和MHC表达的影响(IFN-γ和IFN-α)等。例如，IL-2、IL-6、干扰素、肿瘤坏死因子或编码这些分子的核酸，可以与Mtb免疫原性多肽或编码Mtb多肽的核酸一起施用。Mtb多肽与至少一种免疫刺激分子的共表达可以在动物模型中有效地显示出抗肿瘤效应。
在一个实施方案中，编码Mtb多肽的核酸被直接导入到细胞中。例如，核酸可以通过标准方法荷载在金微球上，并通过装置例如Bio-Rad的HeliosTM基因枪导入到皮肤中。核酸可以是“裸露的”，由在强启动子控制下的质粒组成。典型情况下，DNA被注射到肌肉中，尽管它也可以直接注射到其它位点中，包括转移瘤附近的组织。注射的剂量通常在0.5μg/kg到大约50mg/kg左右，典型为大约0.005mg/kg到大约5mg/kg(参见例如美国专利No.5,589,466)。
在一个具体的非限制性的例子中，用于静脉给药的药物组合物将包含每天每个患者大约0.1μg到10mg免疫原性Mtb多肽。可以使用每天每个患者0.1到大约100mg的剂量，特别是如果药剂被施用于隔离的位点而不在循环或淋巴系统中，例如给到体腔或器官腔中时。用于制备可施用的组合物的实际方法对于本技术领域的专业人员来说是已知的或显然的，并且在文献例如《雷氏药物学》第十九版(RemingtonsPharmaceutical Sciences，19th Ed.，Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1995)中进行了更详细的描述。
根据对象需要和能耐受的剂量和频率，对组合物进行单次或多次给药。在一个实施方案中，剂量作为丸剂(bolus)一次施用，但是在另一个实施方案中可以定期应用，直到达到治疗结果。在一个实施方案中，药剂足以治疗或缓解结核病的症状或征象，而不产生对象不能接受的毒性。在另一个实施方案中，剂量足以防止以后暴露于Mtb时被Mtb感染。在另一个实施方案中，剂量足以在患有潜伏性Mtb感染的对象中防止结核病的症状。可以利用全身或局部给药。
在另一个方法中，从目的对象中分离抗原呈递细胞(APC)例如树突细胞，并用含有Mtb多肽的肽进行体外脉冲或共孵育。在一个具体的非限制性的例子中，抗原呈递细胞是从目的对象中分离的自体细胞。将治疗有效量的抗原呈递细胞施用于(重新导入)目的对象。
Mtb多肽可以通过本技术领域已知的任何方法投送到树突细胞或树突细胞前体细胞中，这些方法包括但不限于直接用抗原对树突状细胞进行脉冲、或利用多种多样的抗原投送载体例如脂质体或其它已知的载体将抗原投送到细胞。在一个具体的非限制性的例子中，抗原性制剂包含大约0.1μg到大约1000μg、或大约1到大约100μg所选的Mtb多肽。Mtb多肽也可以与促进树突细胞成熟的试剂一起施用。所用试剂的具体的非限制性的例子是白介素-4(IL-4)和粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或flt-3配体(flt-3L)。在其它成分中，制备物也可以含有缓冲液、赋形剂和防腐剂。
在一个实施方案中，产生了呈递免疫原性Mtb多肽的成熟的抗原呈递细胞。然后将这些树突细胞单独施用于Mtb感染的对象或处于Mtb感染风险中的对象。在另一个实施方案中，成熟的树突细胞与抗病毒剂一起施用。
或者，APC被用于敏化CD8细胞，例如外周血淋巴细胞(PBL)。PBL可以来待治疗的同一对象(自体)。或者，PBL可以是异源的。但是它们至少应该是限制为对象所具有的HLA类型的I类MHC。然后将有效量的敏化细胞施用于对象。
外周血单核细胞(PBMC)可以用作细胞毒性T淋巴细胞(CTL)前体的应答细胞源。将适当的抗原呈递细胞与肽孵育，然后将载有肽的抗原呈递细胞与应答细胞群体在最适的培养条件下孵育。阳性CTL的活化可以通过分析培养物中存在杀死放射性标记的靶细胞的CTL来确定，靶细胞包括了特异性肽脉冲冲击的靶、以及表达肽序列所源自的抗原的内源加工形式的靶细胞。
或者，识别Mtb多肽的CD8+T细胞克隆可以从目的对象中分离。该CD8+T细胞克隆可以在体外使用本技术领域已知的方法来扩增。然后将治疗有效量的CD8+T细胞施用于目的对象。
因此，可以将细胞施用于对象以治疗Mtb感染，例如减轻Mtb感染的症状。在这些应用中，将治疗有效量的活化的抗原呈递细胞，或活化的淋巴细胞，以足以唤起针对Mtb的免疫应答的量用于对象。
在补充方法中，治疗方案通过施用细胞因子、例如白介素(IL)-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-15、GM-CSF、干扰素等而得到了加强。在其它方法中，给对象施用了其它的抗病毒剂。
下面的非限制性的实施例对本公开进行了说明。
实施例
对于许多感染来说，CD8应答的所有组成部分表现为抗原进入MHC-I处理途径、肽和/或非肽抗原与MHC-I分子的结合、以及这些结构被T细胞识别。最终，出现了相对限制的病原特异性T细胞亚组。尽管已经描述了许多通常被识别的CD4 Mtb抗原(Reed等，MicrobesInfect 7：922-931，2005)(ESAT-6、CFP10、Ag85等)，但令人吃惊的是关于被人类CD8+T细胞识别的常见Mtb抗原的了解很少。大部分已经被鉴定的CD8表位是通过测试所选的Mtb肽对Ia类MHC分子(在大多数情况下是HLA-A2(参见例如Lalvani，Microbes Infect 7：922-931，1998))结合的高亲和性来确定的。但是，在几乎所有这些中，这些T细胞在Mtb感染的个体中的离体(ex vivo)频率是低的或不能检测到的，表明这些特异性可能不代表免疫显性应答。相反，在使用T细胞确定包含在选定的Mtb抗原中的表位的有限例子中，已经证实了高的离体频率(参见Lewinsohn等，Am J Respir Crit Care Med 166：843-848，2002)，表明以T细胞为中心的方法可以鉴定免疫显性表位。此外，已经在感染Mtb的人中检测到高频率的针对某些代表良好的CD4抗原的Mtb抗原(CFP10、ESAT-6、Ag85和Mtb39)的CD8 T细胞应答。因此，使用代表几个已知的CD4 Mtb抗原的交叠的合成肽的有限文库，在患有活动性结核病(TB)和潜伏性结核病感染(LTBI)的人以及未感染的对象中确定了针对这些抗原的CD8应答的量级。此外，一组Mtb特异性的CD8+T细胞克隆被用于定义在这些抗原中被识别的最小表位，并确定这些新的表位对离体Mtb特异性CD8应答的贡献。
实施例1
材料和方法
人类对象。结核菌素皮肤测试(TST)阴性以及没有已知的Mtb感染风险因素的未感染个体被定义为健康个体。具有LTBI的个体被定义为TST阳性并且没有活动性TB的症状和征象的健康人。在所有活动性结核病例中，肺结核由县TB控制中心(TB Controller of the county)诊断，并通过痰液培养结核分枝杆菌阳性加以证实。外周血单核细胞(PBMC)从通过静脉穿刺或单采血液成分术(apheresis)获得的全血中分离。
培养基和试剂。培养基由补充10％胎牛血清(FBS；Bio Whittaker)、5X10-5M 2 ME(Sigma-Aldrich)和2mM谷氨酰胺(GIBCO BRL)的RPMI1640组成。对于Mtb反应性T细胞克隆的生长和分析来说，RPMI 1640中补充了10％人类血清。Mtb株H37Rv从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(Rockville，MD)获得，并按照以前的描述制备(Lewinsohn等，J Immunol 165：925-930，2000)。肽由GenemedSynthesis，Inc，(San Francisco，CA)合成。由11个氨基酸重叠的15-mer组成的合成肽合并物代表Mtb蛋白，证明是有效的CD4抗原。合成了代表CFP-10(Berthet等，Microbiology 144：3195-3203，1998；Dillon等，J Clin Microbiol 38：3285-3290，2000)、ESAT-6(Sorenson等，Infect Immun63：1710-1717，1995)、Mtb39a(两个合并物，A & B，参比)(Dillon等，InfectImmun 67：2941-2950，1999)、Mtb8.4(Coler等，J Immunol 161：2356-2364，1998)、Mtb 9.9(Alderson等，J Exp Med 191：551-560，2000)(Coler等，J Immunol 161：2356-2364，1998)、Mtb 9.9(Alderson等，J Exp Med191：551-560，2000)、EsxG(Rosenkrands等，Electrophoresis 21：3740-3756，2002)、19kDa抗原(Collins等，J Gen Microbiol 136：1429-1436，1990)、抗原85b(Borremans等，Infect Immun 57：3123-3130，1989)(两个合并物A & B，参比)的肽合并物。将肽重新悬浮在DMSO中，将多达50种肽合并在一个合并物中以便合并物中的每种肽的浓度为1mg/ml。将肽合并物储存在-80℃。
细胞系和T细胞克隆。EBV转化的B细胞系LCL或者使用来自细胞系9B5-8(美国典型培养物保藏中心)的上清液产生，或者从国家骨髓捐献项目(National Marrow Donor Program，NMDP；Minneapolis，MN)获得。LCL按照以前的描述通过连续传代维持(Heinzel等，J Exp Med196：1473-1481，2002)。Mtb特异性T细胞克隆从患有LTBI或活动性结核病的个体中使用Mtb感染的DC作为APC以及以前描述的有限稀释克隆方法(Lewinsohn等，J Immunol 165：925-930，2000)进行分离。简单来说，按照制造商的说明书(Miltenyi Biotec，Auburn CA)，使用CD4抗体包被的珠子进行阴性选择、然后使用CD8抗体包被的磁性珠子进行阳性选择，或通过流式细胞仪，从PBMC中分离CD8+T细胞。在这种情况下，CD4-PE(BD Biosciences，目录号555347)阴性、CD8-APC(BDBiosciences，目录号555369)阳性细胞(纯度>99％)在Becton DickensonLSR II上分拣。在由200μl补充了10％人类血清的RPMI 1640构成的细胞培养基中，在按照下面的描述产生的1 X 105个辐射过的自体Mtb感染DC以及rIL-2(5ng/ml)的存在下，接种不同浓度的T细胞。对10-14天之间表现出生长的孔用ELISPO评估Mtb特异性，以Mtb感染的DC作为APC源。保留了Mtb特异性的T细胞被进一步通过FACS针对αβT细胞受体表达和CD8表达来确定表现型，并按照下面的描述进行扩增。使用来自Beckman Coulter的IOTest Beta Mark试剂盒确定了Vβ的使用。
T细胞克隆的扩增。为了扩增CD8+T细胞克隆，使用以前描述的使用抗CD3 mAb刺激的快速扩增方法(Heinzel等，J Exp Med196：1473-1481，2002)。
外周血DC的产生和感染。制备了单核细胞衍生的DC(Heinzel等，同上；Romani等，J Exp Med 180：83-93，1994)。为了产生Mtb感染的DC，将细胞(1 X 106个)在存在Mtb的情况下培养过夜(感染复数[MOI]＝50:1)。18小时后，收获细胞并重新悬浮在RPMI/10％人类血清中。
MHC结合分析。利用MHC-肽结合分析测量了肽配体抑制放射性标记的肽与纯化的MHC分子结合的能力，它已经在别处被详细地描述过了(Sidney等，1999，在Coligan等主编的《免疫学现代方法》(CurrentProtocols in Immunology，John Wiley & Sons，Inc.，1996)中的18.3节“通过凝胶过滤测量MHC/肽的相互作用”(Measurement of MHC/peptideinteractions by gel filtration.))。简单来说，将纯化的MHC分子、测试肽和放射性标记的探针肽在存在人类B2-微球蛋白以及蛋白酶抑制剂混合物的情况下在室温孵育。经过两天的孵育之后，通过将MHC/肽复合物捕获在W6/32抗体(抗HLA A、B和C)或B123.2(抗HLA B、C和一部分A)包被的板上，测定放射性标记的肽与相应的I类MHC分子的结合，并使用微型闪烁计数器测量每分钟的结合数(cpm)。对于竞争分析来说，计算出对放射性标记的肽的结合产生50％抑制的肽浓度。典型情况下，在覆盖了100,000倍剂量范围的6个不同浓度下、和在三个或以上的独立分析中对肽进行测试。在所用的条件下，即[标记物]<[MHC]和IC50≥[MHC]的情况下，测量到的IC50值约等于真实的Kd值。
IFN-γ ELISPOT分析。IFN-γ ELISPOT分析按照以前的描述进行(Beckman等，J Immunol 157：2795-2803，1996)。为了测定针对Mtb感染或Mtb抗原应答的CD4+或CD8+T细胞的离体频率，从PBMC中使用磁珠(Miltenyi Biotec，Auburn CA)作为应答T细胞源对CD4+或CD8+T细胞进行了阳性选择，并在4个不同的细胞浓度下进行双份测试。自体DC(20,000细胞/孔)被用作APC，将DC用Mtb感染或用肽合并物(每种肽的终浓度为5μg/ml)脉冲，然后加入到分析中。对于使用T细胞克隆的分析来说，将T细胞(1000或5000个细胞/孔)与自体LCL(20,000细胞/孔)在存在或不存在抗原的情况下孵育。
数据分析：为了确定抗原特异性T细胞的离体频率，将双份中每份的每孔平均斑点数对每孔应答细胞数进行作图。使用线性回归分析确定直线的斜率，这代表抗原特异性T细胞的频率。如果斑点数量的二项式概率(Lewinshon等，Microbes Infect 8：2587-2598，2006)在实验和对照分析中明显不同，那么分析被认为是阳性的，即反映了存在致敏T细胞应答。为了确定组间离体T细胞频率的差异，使用Wilcoxon/Kruskal-Wallis分析。
实施例2
确定免疫显性的Mtb特异性CD8+抗原
为了确定免疫显性的Mtb特异性CD8+抗原，以及确定这些应答是否来自于Mtb感染，使用了来自未感染的、具有LTBI或被Mtb活动性感染的供体的CD8+T细胞。应答通过直接离体、或使用通过对Mtb感染的自体DC的有限稀释克隆(Lewinsohn等，J Immunol 165：925-930，2000)获得的CD8+T细胞克隆来确定。因为对于显性CD4+Mtb抗原的了解较多，选择这些被普遍认识的抗原组进行进一步评估。它们是：Mtb39、CFP10和Mtb8.4、Mtb9.9、ESAT-6、Ag85b、19kDa和EsxG。为了避免由于使用预测的HLA结合特异性的肽而引入的偏差，我们合成了交叠的肽(15个氨基酸，有11个氨基酸交叠)以代表目的蛋白(Lewinshon等，J Immunol 166：439-446，2001)。
为了精确测定CD8+T细胞的离体效应细胞频率，采用了线性回归分析。如图1所示，在IFN-γ ELISPOT分析中，在CD8+T细胞数量范围内针对肽脉冲的DC测试了磁珠纯化的CD8+T细胞。阳性分析按照下面的描述确定，如果是阳性，使用线性回归确定了抗原特异性频率。
评估了未感染的对象(n＝14)、具有LTBI的对象(n＝20)和患有活动性TB的对象(n＝12)针对Mtb CD4+T细胞抗原组以及针对Mtb感染的DC的CD8+应答。所有被测试的对象对Mtb感染的DC有强烈的CD8+T细胞应答，并且在患有活动性TB的个体中比具有LTBI的个体中强度更高(p＝0.01，图2，表1)。但是，针对Mtb抗原组的CD8+T细胞应答几乎专门在感染了Mtb的个体中被发现，因为对于10种抗原中的7种来说，在应答的强度(图2)和阳性分析的比例(表I)两方面，都注意到了未感染的和Mtb感染的个体之间的统计学显著性差异。
表I、针对已知TB抗原的CD8+T细胞应答
Figure A200780016660D00801
a在文中定义的阳性。
但是在患有活动性TB和LTBI的个体之间，CD8+T细胞应答的差异没有统计学上的差别。尽管针对许多测试的抗原观察到了强的CD8+T细胞应答，但是同样注意到的是几个具有强的Mtb指导的CD8+T细胞应答的对象对许多被测试的抗原没有可证实的应答。
这些离体频率数据证明了对于许多已知的Mtb抗原存在着高频应答，但是没有阐明目的基因中的限制性等位基因、最小表位或显性序位。为了解决这个问题，使用Mtb感染的DC进行了人类CD8+T细胞的有限稀释克隆(参见Lewinsohn等，J Immunol 166：439-446，2001)，产生了典型的和非典型的HLA限制的CD8+T细胞克隆组。使用代表已知CD4+抗原的肽合并物，在超过一半的克隆中定义了HLA-Ia限制性克隆的抗原特异性(表II)。
表II、许多CD8+T细胞克隆识别已知的CD4+T细胞抗原。
Figure A200780016660D00811
这种方法在来自患有活动性TB的对象的代表性克隆D466 D6中得到了详细的证明。如图3A所示，针对用一组肽合并物脉冲的自体DC进行的克隆测试毫无疑义地将抗原性特异性确定为CFP10。然后针对包含CFP10合并物的每个15-mer肽测试克隆，表明表位被包含在CFP101-15中(图3B)。然后合成了每个可能的8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸和11个氨基酸的肽并测试了它们的反应性，表明抗原性活性位于氨基酸2-11之间(图3C)。同样地，针对与供体共有至少一种HLA类型的类淋巴母细胞系(LCL)对每个克隆进行了测试(图3D)。共有B4501和C1601的自体LCL和IHW 9058 LCL向克隆呈递了表位，将B4501和C1601都鉴定为可能的限制性等位基因。但是，C1601+D433LCL没有呈递表位，这消除了C1601作为候选的限制性等位基因。因此，D466 D6被HLA-B4501所限制。如图4所示，通过在广范围的浓度内测试每个似乎可能的表位，对于D466 D6来说将最小表位确定为CFP102-10。在补充的图中提供了对每个克隆支持最小表位的指派的实验数据。抗原性特异性、最小表位和HLA限制性等位基因的概述显示在表III中。令人意外的是，所有T细胞克隆中只有一个不受HLA-B等位基因限制。此外，观察到它们中少数长度为9个氨基酸。
表III、鉴定的表位概述
Figure A200780016660D00821
a括号中为姊妹克隆数。
b显示了每250,000个CD8+T细胞中SFU的数量。
c显示了以nm为单位的IC50。
d以前发表的，J Immunol.2001 Jan 1；166(1).439-46。
e显示了测量到的对B3501的结合亲和性。
f显示了测量到的对B1501的结合亲和性。
NA＝没有。
IND＝不确定。
TBD＝准备做。
因为每个个体CD8+T细胞克隆是基于Mtb感染的DC的生长而产生的，这确定了鉴定到的抗原和表位是否鉴定了所反映离体免疫显性表位。采用了两种独立的方法，第一种确定应答是否以高频率出现，第二种确定针对抗原的总的应答中由表位构成的比例。为了确定离体效应细胞的频率，如图1中所描述的那样，用自体DC和源自分离T细胞克隆的供体的磁珠纯化的CD8+T细胞对每个表位进行了测试。效应细胞频率的概述显示在表III中。大多数表位反映了高频率的应答，因此可以被认为是由暴露于Mtb而引发的应答。值得注意的是，从4个供体分离到的T细胞克隆识别CFP10。为了确定所限定的表位是否反映了针对目的抗原的总应答的绝大部分，来自3个具有足够可用的外周血单核细胞(PMBC)的供体的磁珠纯化的CD8+T细胞，被测试与每个个体15-mer肽、肽合并物和代表最小表位的肽的反应性。如图5中所证实的那样，对最小表位、含有最小表位的15-mer肽以及肽合并物的离体频率是明显一致的。这些数据表明对于每个供体来说，显性序位已经被清楚地确立，并反映在原始的克隆中。最后，正如在表III中注意到的那样，经常鉴定到具有同样特异性的子克隆，这个结果可以根据免疫显性序位来预测。TCR Vβ染色被用于证实子克隆之间的克隆关系。有趣的是，在两种情形下，相同的最小表位和HLA限制性由两种不同的克隆所代表(表III)。
因为有关针对Mtb的人类CD8+T细胞应答的许多工作依赖于使用HLA预测算法，因此当确定每个表位时，我们会问表位是否已经被这些方法预测。许多这些表位没有明确的归类。这可能说明这些算法在使用时的局限性。为了在实验上阐明这个问题，测定了在确定最小表位的过程中合成的每个肽针对一组人类HLA分子的IC50。表III中显示了具有关联的限制性等位基因的最小表位的IC50。数据证明，T细胞表位与HLA强烈结合，在T细胞表位数据和HLA结合数据之间显示出高度的一致性。
数据证实了在Mtb感染的人中存在CD8+T细胞应答，其频率与许多常见的病毒感染例如牛痘病毒、流感病毒和CMV感染后观察到的频率相当。在所有作图的表位中只有一个不受HLA-B分子限制。数据表明，通过使用T细胞驱动的鉴定表位的方法，可以在Mtb感染的人类中确定显性表位。
实施例3
筛选针对基因组肽文库的T细胞克隆
针对基因组肽文库，筛选了不识别已知的Mtb抗原肽合并物之一(Rv3875、Rv3874、Rv1886c、Rv0287、Rv3763、Rv1174c，、Rv1196、Rv1793、Rv2346c，Rv1037c、Rv3619c和Rv1198)的典型受限制和非典型受限制的T细胞克隆(参见上面的表II)。该肽文库表现了389个基因，代表了Mtb基因组的大约10％。对于每个基因产物来说，肽为有11个交叠的15-mer。单个合成50nmol每种肽，然后在96孔板格式(9块板)中合并成777个50种肽的合并物。在9块板的每块中，包含有5个空白孔和一个无关的肽合并物SIV gag的孔。为了针对基因组肽文库筛选克隆，首先将克隆扩增，并针对Mtb感染的DCs进行测试，以确保来自该特定扩增的每个克隆在ELISPOT分析中产生强烈的Mtb特异性信号。然后将最多6个T细胞克隆合并。为了进行筛选，将T细胞克隆(每个克隆5,000个细胞/孔)、自体DC(20,000个细胞/孔)、IL-2(0.5ng/ml)和肽合并物(每种肽5μg/ml)在ELISPOT分析中在37℃下孵育过夜。对每种合并物只进行了一次技术重复，因为每个孔中有5000个T细胞克隆对肽抗原产生了绝对阳性的应答，产生了确定性的结果。针对基因组肽文库对6个来自D504的典型克隆进行了筛选，导致发现了新的表位。该表位来自含有EsxJ、EsxW、EsxK和EsxP四个蛋白的家族。这些蛋白共有98％的同源性，只有3个氨基酸的差别。该家族的第五个成员EsxM(Rv1792)，它没有包含在基因组肽文库中。
针对这些肽合并物中的个体15-mer对克隆进行筛选。所有6个典型的克隆都识别EsxJ 21-35。这是与该家族的其它4个成员相同的EsxJ区域。接下来，从该15-mer制备了9、10和11-mer的肽，并针对每个克隆进行筛选。最小表位被确定是EsxJ 24-34。此外，HLA限制性被发现是B5701。
实施例4
针对基因组肽文库的T细胞克隆的附加筛选
针对上面描述的基因组肽文库对11个来自D432B的典型克隆进行了筛选。对于两个克隆确定了抗原，导致鉴定了两个新的表位PE_PGRS4247-55和PE953-67。一个克隆的最小表位被确定是PE_PGRS4247-55，HLA限制性被发现是B3514。另一个克隆的最小表位还没有被确定，但是包含在15-mer的PE953-67中。该克隆的HLA限制性被发现是B3905。
表IV、从基因组肽文库筛选中发现的新表位的详细情况。
Figure A200780016660D00861
括号中为识别每个供体的表位的克隆数量。*这是具有几乎相同的序列的蛋白家族。该家族由Rv1038c、Rv1197、Rv2347、Rv3620c组成。
表V、完成的克隆筛选的概述。
 
供体 TB状态 可用的典型克隆数(被筛选的)       可用的非典型克隆数(被筛选) 筛选中阳性孔数     被证实的击中数     新表位数 鉴定的典型克隆表位数     鉴定的非典型克隆表位数  
426 PPD+ 1(1) 4(4) 1 0 0 0 1
431 活动性 1(1) 1(1) 1** 0 0 0 1
432 活动性 11(11) 14(7) 11 3 2 3 8
454 PPD+ 1*(0) 6(4) 0 0 0 0 0
466 活动性 1(1) 4(4) 1 0 0 0 1
504 PPD+ 6(6) 9(9) 5 4 1 6 0
21(20) 38(29) 18 7 3 9 11
*来自D454的典型克隆在再次扩增后不识别Mtb，没有针对文库进行筛选。
**来自426和431的典型克隆被一起筛选，所以这两个克隆之间是一个阳性孔。
实施例5
筛选针对基因组肽文库的离体CD8+T细胞
针对上面描述的基因组肽文库对来自LTBI供体D610(SE Asian)的CD8+T细胞进行了筛选。每个板的基因组肽文库板被双份筛选，每次筛选总共18个ELISPOT板。CD8+T细胞从低温保存在PBMC通过使用磁珠分离的CD8+选择来制备。得到的细胞群体含有≥96％的CD8+T细胞。将CD8+T细胞(250,000个细胞/孔)、自体DC(20,000个细胞/孔)和IL-2(0.5ng/ml)加入到ELISPOT板的肽中(每种肽终浓度5μg/ml)。每块板包含5个培养基对照孔。对于每块板来说，从该板的每个孔中减去这5个孔的平均值，以便使板之间归一化。然后对每块板的每个技术重复进行计分。一个孔，如果斑点形成单位(SFU)减去培养基孔的平均值后大于或等于10，并且SFU大于或等于培养基平均值的两倍，就被计分为阳性(Hudgens等，J.Immunol.Methods 288：19-34，2004)。该供体对含有EsxJ、EsxW、EsxK和EsxP的4个肽孔有反应。然后针对这些肽合并物中每个15-mer对CD8+T细胞进行筛选，并发现其只对EsxJ 21-35有反应，这是与上面实施例3中描述的EsxJ、EsxW、EsxK和EsxP的同样区域。
针对基因组肽文库筛选了7个其它供体。表7中详细描述了前10位应答。4个用黄色标亮的肽合并物含有来自仅仅一个基因的肽。这4个基因含有4个新的表位。
表7、7个供体的肽合并物筛选中的前10位应答。斑点形成单位是对于250,000个CD8+T细胞的。
 
肽合并物 供体 平均SFU 孔中呈现的Rv数 功能类别
C09_1 D560 208.2 Rv1860(50) 细胞壁和细胞加工
C12_4 D545 156.4 Rv0468(27)：Rv0456c(23) 脂类代谢
A04_3 D454 136 Rv0284(17)：Rv0288(11)：Rv0287(22)               细胞壁和细胞加工
B10_3 D560 112.3 Rv1273c(50) 细胞壁和细胞加工
E04_4 D560 78.2 Rv0152c(40)：Rv0151c(10) PE/PPE
G12_8 D560 77.4 Rv3478(18)：Rv3507(32) PE/PPE
E07_4 D525 76.8 Rv0159c(50) PE/PPE
A10_8 D560 70.4 Rv3136(47)：Rv3144c(3) PE/PPE
E11_8 D560 66.4 Rv3350c(50) PE/PPE
E08_9 D545 60.2 Rv1404(13)：Rv2711(37) 调控蛋白
实施例6
动物模型
在结核病研究中，小鼠模型被广泛用于模拟疾病的各个方面。小鼠可以通过各种途径感染，包括静脉内、腹膜内和气管。一个途径是将生物体气溶胶化用于呼吸感染。将小鼠在仓室中暴露于气溶胶(整个身体或仅仅鼻子感染)。感染(invention)的剂量可以通过操纵喷雾器中Mtb的浓度或暴露的时间来改变。通过气溶胶的低剂量例如大约50个菌落形成单位(CFU)的感染，导致肺中细菌数量缓慢而稳定地增长，一般在4周时达到峰值，这与肺中T细胞的峰值数量相一致。起始时期被认为是感染的急性阶段。感染后，细菌向纵隔淋巴结扩散。一般在2到3周之间可以检测到T细胞引发。在大约4周后，细菌的数量稳定了，产生了缓慢进展的病理性反应。该系统用于模拟活动性感染。因此上面描述的多肽或编码这些多肽的多核苷酸可以在感染前施用。然后评估Mtb多肽(或编码这些多肽的多核苷酸)防止感染的能力。或者，给小鼠施用Mtb，并监测Mtb多肽(或编码这些多肽的多核苷酸)治疗Mtb感染的能力。可以通过测量T细胞应答、例如CD8+或CD4+T细胞的数量、和/或测量细菌的数量、和/或评估病理学来监测Mtb多肽(或多核苷酸)的效力。
示例的方案提供如下(也参见Repique等，Infec.Immun.70：3318-3323，2002，在此引为其他方案的参考)：
A.短期小鼠模型：
按照适合的方案，用包含一种或多种Mtb多肽或编码这一种或多种多肽的多核苷酸的组合物接种C57BL/6小鼠，然后饲养4到6周。将被免疫的小鼠用有毒力的结核分枝杆菌的低剂量气溶胶(50-100CFU)感染，通过评估激惹后30天时活菌的数量来评估保护作用。
通过将器官匀浆并将连续的10倍稀释液铺于7H11琼脂板上，对小鼠的肺和脾脏上进行活菌计数。平板被培养最多21天，确定每个器官的菌落形成单位数。
BCG接种的小鼠与PBS处理的小鼠相比，在它们的肺脏和脾脏中具有大约1 Log 10的保护作用。
B.短期豚鼠模型
用包含一种或多种Mtb多肽或编码这一种或多种多肽的多核苷酸的组合物接种远系繁殖的Hartley豚鼠，然后饲养8-10周。将被免疫的豚鼠用有毒力的结核分枝杆菌的低剂量的气溶胶(10-30CFU)感染，通过评估激惹后30天时活菌数量来评估保护作用。
通过将器官匀浆并将连续的10倍稀释液铺于7H11琼脂板上，对豚鼠的肺和脾脏进行活菌计数。平板被培养最多21天，确定每个器官的菌落形成单位数。取下部分肺脏和脾脏用于组织学分析。
BCG接种的豚鼠与PBS处理的豚鼠相比，在它们的肺脏和脾脏中具有大约2-3 Log 10的保护作用。此外，BCG接种的豚鼠与未接种的动物相比具有轮廓分明的肉芽肿。
C.长期豚鼠模型
该豚鼠模型与小鼠模型类似，但是实验是终点开放的存活类型，可以持续长达两年。豚鼠发展出与患有活动性结核病(TB)的人类相似的“典型”肉芽肿，并且当肺部组织坏死发展时，它们与人类相似开始体重降低并死于TB。可以评估肺脏和脾脏中的菌落形成单位数。也可以进行组织学检查以确定肺部牵涉和组织破坏的程度。在暴露于低剂量的气溶胶后，豚鼠中生物体的数量在前3周进行性增加，然后到达平台期进入慢性阶段。在感染的后期，在肺中细菌的载量增加，这与恶化的病理状况有关。不治疗的话，在感染的豚鼠的肺中CD4和CD8T细胞相伴升高。
按照适合的方案，用实验疫苗接种远系繁殖的Hartley豚鼠，然后饲养8-10周。然后将被免疫的豚鼠用有毒力的结核分枝杆菌的低剂量的气溶胶(10-30CFU)感染。对豚鼠每周称量体重，每天监测疾病的征象(例如呼吸增加和生长迟滞)。未接种的豚鼠在激惹后20到25周死于感染，而BCG免疫接种的豚鼠在激惹后存活了50到55周。
尸检时，评估肺脏和脾脏的CFU数量和病理程度。实验组合物的相对保护作用与BCG接种的动物进行了比较。
显然，在不背离本文描述的精神下，可以对所述的方法或组合物的具体细节进行改变或修改。我们对所有落入所附权利要求的范围和精神之内的这样的修改和改变要求权利。
序列表
<110>俄勒冈健康科学大学
     美国政府退役军人事务部
<120>产生针对结核病的免疫应答的方法
<130>SCT083984-00
<150>US 60/782,364
<151>2006-03-14
<160>38
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>97
<212>PRT
<213>Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(2)..(2)
<223>Xaa can be A or T
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(58)..(58)
<223>Xaa can be T or A
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(59)..(59)
<223>Xaa any amino acid or no amino acid
<400>1
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<210>2
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<213>Mycobacterium tuberculosis
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<213>Mycobacterium tuberculosis
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<213>Mycobacterium tuberculosis
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Claims (55)

1.在对象中产生针对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的免疫应答的方法，包括
给对象施用治疗有效量的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含：
(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列的至少一种；或
(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列的至少一种中至少9到20个连续氨基酸，其中9到20个连续氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)；
从而诱导针对结核分枝杆菌的免疫应答。
2.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ IDNO：1显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
3.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ IDNO：1中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
4.权利要求3的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列QTVEDEARRMW(SEQ ID NO：1的24到34位氨基酸)或编码所述多肽的多核苷酸。
5.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ IDNO：2显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
6.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ IDNO：2中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
7.权利要求6的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含VSAAIAGLF(SEQ ID NO：2的47到55位氨基酸)的多肽或编码所述多肽的多核苷酸。
8.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ IDNO：3显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
9.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ IDNO：3中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
10.权利要求9的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：3的53到67位氨基酸的多肽或编码所述多肽的多核苷酸。
11.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：4显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
12.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：4中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
13.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：5显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
14.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：5中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
15.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：6显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
16.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：6中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
17.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：7显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
18.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：7中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
19.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：8显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
20.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：8中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
21.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：9显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
22.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQ
ID NO：9中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
23.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：10显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
24.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：10中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
25.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：11显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
26.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：11中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
27.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：12显示的氨基酸序列的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
28.权利要求1的方法，包括给对象施用治疗有效量的包含SEQID NO：12中特异性结合I类MHC的至少9个连续氨基酸的多肽，或编码所述多肽的多核苷酸。
29.权利要求1-28任一项的方法，包括给对象施用治疗有效量的多肽。
30.权利要求29的方法，其中所述多肽与载体共价连接。
31.权利要求1的方法，其中所述多肽由下述组成：
(a)SEQ ID NO：1-12之一显示的至少一种氨基酸序列；或
(b)SEQ ID NO：1-12显示的至少一种氨基酸序列的至少9个连续氨基酸，其中所述9个连续的氨基酸特异性结合I类MHC。
32.权利要求1-31任一项的方法，还包括施用治疗有效量的佐剂。
33.权利要求1-32任一项的方法，其中免疫应答是保护性免疫应答。
34.权利要求1-32任一项的方法，其中对象被Mtb感染。
35.权利要求1-32任一项的方法，其中对象处于Mtb感染的风险之中。
36.权利要求1-32任一项的方法，其中对象具有潜伏性的Mtb感染。
37.分离的多肽，其包含SEQ ID NO：1-12显示的至少一种氨基酸序列的9到20个连续氨基酸，其中9到20个连续氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)，其中分离的多肽不包含SEQ ID NO：1-12显示的任何氨基酸序列。
38.权利要求37的分离的多肽，其由SEQ ID NO：1-12显示的至少一种氨基酸序列的9到20个连续氨基酸组成，其中9到20个连续氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)。
39.分离的多核苷酸，其编码权利要求37-38之一的多肽。
40.权利要求38的多核苷酸，其与启动子可操作地连接。
41.载体，其包含权利要求40的多核苷酸。
42.权利要求41的载体，其中所述载体是质粒载体。
43.权利要求41的载体，其中所述质粒载体在酵母中表达。
44.权利要求41的载体，其中所述载体是病毒载体。
45.权利要求44的载体，其中所述载体是逆转录病毒、正痘病毒、鸟痘病毒、禽痘病毒、羊痘病毒、猪痘病毒、腺病毒、疱疹病毒、α-病毒、杆状病毒、辛德比斯病毒、牛痘病毒和脊髓灰质炎病毒载体。
46.分离的宿主细胞，其包含权利要求41-45任一项的载体。
47.权利要求46的分离的宿主细胞，其中所述宿主细胞是分枝杆菌。
48.药物组合物，其包含权利要求37-39任一项的多肽和可药用的载体。
49.药物组合物，其包含在可药用载体中治疗有效量的权利要求46的宿主细胞。
50.药物组合物，其包含在可药用载体中治疗有效量的权利要求39的多核苷酸。
51.治疗被结核分枝杆菌感染的对象的方法，包括给对象施用治疗有效量的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含：
(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列的至少一种；或
(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12显示氨基酸序列的至少一种中至少9到20个连续氨基酸，其中的9到20个连续氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)；
从而治疗被结核分枝杆菌感染的对象。
52.权利要求51的方法，其中结核分枝杆菌感染的对象没有结核病的症状。
53.权利要求52的方法，其中对象的治疗包括防止结核病在对象中发展。
54.在对象中抑制结核分枝杆菌感染的方法，包括给对象施用治疗有效量的多肽、或编码所述多肽的多核苷酸，其中所述多肽包含：
(a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列的至少一种；或
(b)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12显示的氨基酸序列的至少一种中至少9到20个连续氨基酸，其中9到20个连续氨基酸特异性结合I类主要组织相容性复合物(MHC)；
从而抑制对象中结核分枝杆菌的感染。
55.权利要求54的方法，其中给对象施用治疗有效量的多肽或编码所述多肽的多核苷酸防止结核分枝杆菌的感染。
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