BRPI0708912A2 - mÉtodos para detecÇço de uma infecÇço por mycobacterium tuberculosis - Google Patents

mÉtodos para detecÇço de uma infecÇço por mycobacterium tuberculosis Download PDF

Info

Publication number
BRPI0708912A2
BRPI0708912A2 BRPI0708912-0A BRPI0708912A BRPI0708912A2 BR PI0708912 A2 BRPI0708912 A2 BR PI0708912A2 BR PI0708912 A BRPI0708912 A BR PI0708912A BR PI0708912 A2 BRPI0708912 A2 BR PI0708912A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
gly
seq
wing
asn
thr
Prior art date
Application number
BRPI0708912-0A
Other languages
English (en)
Inventor
David Lewinsohn
Deborah Lewinsohn
Original Assignee
Univ Oregon Health & Science
Us Gov Dba Veterans Affairs
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Oregon Health & Science, Us Gov Dba Veterans Affairs filed Critical Univ Oregon Health & Science
Publication of BRPI0708912A2 publication Critical patent/BRPI0708912A2/pt
Publication of BRPI0708912B1 publication Critical patent/BRPI0708912B1/pt
Publication of BRPI0708912B8 publication Critical patent/BRPI0708912B8/pt

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

MÉTODOS PARA DETECÇçO DE UMA INFECÇçO POR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS. A presente invenção refere-se a métodos para detecção de uma infecção com Mycobacterium tuberculosis (Mtb) em um indivíduo que são descritos. Os métodos incluem detecção da presença de células TCD8+ que especificamente reconhecem polipeptídio de Mtb. Os métodos incluem ensaios in vivo para detecção da presença de células T CD8+ em uma amostra biológica, e ensaios in vivo que detectam uma reação de hipersensibilidade do tipo retardado. Os métodos podem também incluir detecção de polipeptídios e polinucleotídeos de Mtb. Reagentes para detecção de uma infecção por Mtb são também descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA DETECÇÃO DE UMA INFECÇÃO POR MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS".
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido ProvisórioU.S. Nq 60/782.364 depositado em 14 de março de 2006, que é aqui incor-porado a título de referência.
DECLARAÇÃO DE APOIO DO GOVERNO
A presente invenção foi feita com o apoio do governo dos Esta-dos Unidos sob a Concessão Nq NIH-R01-AI48090 e Concessão N9 NIHNIAID HHSN266200400081 N01-AI-40081 do National Institutes of Health] ogoverno dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção. A presenteinvenção foi também feita com apoio do Department of Veterans Affairs.
CAMPO
O presente pedido refere-se ao campo de diagnóstico, especifi-camente a métodos para detecção de uma infecção com Mycobacteriumtuberculosis (Mtb) em um indivíduo.
ANTECEDENTES
Micobactérias são um gênero de organismos bacterianos intra-celulares aeróbicos que, quando da infecção de um hospedeiro, sobrevivemdentro de compartimentos endossomais de monócitos e macrófagos. Doen-ças micobacterianas humanas incluem tuberculose (causada por M. tubercu-losis), lepra (causada por M. leprae), úlceras de Bairnsdale (causadas por M.ulcerans) e várias infecções causadas por M. marinum, M. kansasii, M. scro-fulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M. chenolei, M. haemophilume M. intracellulare (vide Wolinsky, E., capítulo 37 em Microbiology: IncludingImmunology and Molecular Genetics, 3è Ed., Harper & Row, Filadélfia, 1980).
Um terço da população do mundo carrega M. tuberculosis e estásob risco de desenvolver tuberculose (TB). Em pacientes imunocomprometi-dos, tuberculose está aumentando em uma taxa quase logarítmica, e cepasresistentes a multifármaco estão aparecendo. Ainda, cepas micobacterianasque foram previamente consideradas ser cepas não-patogênicas (por exem-plo, M. avium) se tornaram agora matadoras principais de pacientes comAIDS imunocomprometidos. Além disso, vacinas Micobacterianas atuais sãoou inadequadas (tal como a vacina BCG para M. tuberculosis) ou não-disponíveis (tal como para M. íepraé) (Kaufmann, S., Microbiol., 4:324-328,1987; U.S. Congress, Office of Technology Assessment, The ContinuingChailenge of Tuberculosis, PP. 62-67, OTA-H-574, U.S. Government PrintingOffice, Washington, D.C., 1993).
Inibição do espalhamento de tuberculose requer vacinação efi-caz e diagnóstico precoce, eficaz, da doença. Atualmente, vacinação combactérias vivas é o método mais eficiente para indução de imunidade prote-tora. A Micobactéria mais comum empregada para este propósito é BaciilusCaimette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de Mycobacterium bovis. Noentanto, a segurança e eficácia de BCG são uma fonte de controvérsia ealguns países, tal como os Estados Unidos, que não vacinam o público geral.
Diagnóstico de tuberculose é geralmente obtido usando um testede pele; que envolve exposição transdermal à tuberculina PPD (derivadopurificado de proteína) de tuberculina. Respostas de célula T específicas deantígeno resultam em endurecimento mensurável no sítio de injeção por 48a 72 horas após injeção, o que indica exposição a antígenos Micobacteria-nos. No entanto, a sensibilidade e a especificidade deste teste não são ide-ais; indivíduos vacinados com BCG não podem ser distinguidos de indiví-duos infectados. Deste modo, há uma necessidade na técnica de métodosde diagnóstico aperfeiçoados para detecção de tuberculose.
SUMÁRIO
Métodos para diagnóstico de uma infecção com Myeobaeteriumtuberculosis (Mtb) são descritos aqui. Os métodos podem incluir detecção decélulas T CD8+ e/ou CD4+ que se ligam especificamente a um polipeptídeode Mtb de interesse. Os métodos podem também incluir detecção de umareação de hipersensibilidade do tipo retardada em um indivíduo e/ou podemincluir detecção de polipeptídeos e polinucleotídeos de Mtb específicos. Osensaios descritos podem ser usados individualmente ou em combinação. Ainfecção com Mycobacterium tuberculosis pode ser uma infecção latente ouativa.
Em várias modalidades, são providos métodos para detecção deMycobacterium tuberculosis em um indivíduo. Esses métodos incluem conta-to de uma amostra biológica do indivíduo compreendendo células T, tal co-mo células T CD8+ e/ou células T CD4+, com um ou mais polipeptídeos deMycobacterium, ou uma célula apresentando antígeno apresentando o umou mais polipeptídeos de Mycobacterium. O um ou mais polipeptídeos deMycobacterium incluem uma seqüência de aminoácido mostrada como (a)uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ IDNO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11 ou SEQID NO: 12; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelomenos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10,SEQ ID N0:11 ou SEQ ID N0:12, onde os nove a vinte aminoácidos conse-cutivos especificamente se ligam a complexo de histocompatibilidade princi-pai (MHC) classe I. É determinado se as células T reconhecem especifica-mente o polipeptídeo de Mycobacterium.
Em modalidades adicionais, são providos métodos para detec-ção de Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo, onde os métodos in-cluem administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptí-deo de Mycobacterium à pele, subcutaneamente ou intradermalmente. Opolipeptídeo de Mycobacterium inclui uma seqüência de aminoácido mostra-da como (a) uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ IDNO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10, SEQ IDNO:11 ou SEQ ID N0:12; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos con-secutivos de pelo menos uma das seqüências de aminoácido mostradascomo SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ IDΝ0:5, SEQ ID Ν0:6, SEQ ID Ν0:7, SEQ ID Ν0:7, SEQ ID N 0:8, SEQ IDΝ0:9, SEQ ID Ν0:10, SEQ ID Ν0:11 ou SEQ ID Ν0:12, onde os nove a vin-te aminoácidos consecutivos especificamente se ligam a complexo de histo-compatibilidade principal (MHC) classe I. A presença de células T que espe-cificamente reconhecem o polipeptídeo de Mycobacterium é detectada noindivíduo.
Em modalidades adicionais, são descritos métodos para detec-ção de uma infecção com Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo, on-de os métodos incluem detecção da presença de um polipeptídeo ou umpolinucleotídeo de Mycobacterium codificando o polipeptídeo em uma amos-tra do indivíduo. O polipeptídeo de Mycobaeterium inclui uma seqüência deaminoácido mostrada como uma das seqüências de aminoácido mostradascomo SEQ ID N0:1, SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID N0:4, SEQ IDNO:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID N0:9, SEQ IDN0:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID N0:12.
Adicionalmente, reagentes para a detecção de uma infecçãocom Myeobaeterium em um indivíduo são descritos.
O acima e outras características e vantagens se tornarão maisaparentes a partir da descrição detalhada que segue de várias modalidades,que acontece com referência às figuras acompanhantes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 são dois gráficos mostrando a determinação de fre-qüências de célula efetora humana ex vivo usando o ensaio ELISPOT IFN-γ.Células T CD8+ purificadas com conta magnética foram culturadas com DC(20.000/cavidade) ou infectada com Mtb (H37Rv, MOT=SO) ou pulsada com"pool" de peptídeo representando CFP10 (5 pg/ml cada peptídeo; 15-merssobreposição 11a) em um ensaio ELISPOT IFN-γ. Cada população de célulaT respondedora foi testada em duplicata em quatro concentrações de céluladiferentes. Para determinar a freqüência de célula efetora de células T espe-cíficas de antígeno, o número médio de manchas por cavidade para cadaduplicata foi posto em gráfico contra o número de células respondedoras porcavidade. Análise de regressão linear foi usada para determinar a inclinaçãoda linha, que representa a freqüência de células T específicas de antígeno.O ensaio seria considerado positivo (refletindo a presença de uma respostade célula T iniciada), se a probabilidade binominal para o número de man-chas fosse significantemente diferente através de ensaios experimentais econtrole.
A Figura 2 é um conjunto de gráficos mostrando freqüências decélula T CD8+ ex vivo para antígenos de Mtb que estão associados com in-fecção com Mtb. Conforme acima descrito (vide Figura), para determinarfreqüências de célula T CD8+ ex vivo, DC autóloga ou infectada com Mtb oupulsada com grupos de peptídeo cognato foi incubada com células T CD8+em um ensaio ELISPOT IFN-γ. Indivíduos sem evidência de infecção comMtb, aqueles com LTBI, e aqueles com TB ativa (cultura confirmou tubercu-lose pulmonar) foram avaliados. "Infectados com Mtb" inclui aqueles comLTBI e tuberculose ativa. Valores P são registrados onde P = <0,05 (Wilco-xon/Kruskal-Wallis).
As Figuras 3a a 3d são um conjunto de imagens digitais mos-trando a definição de Especificidade Antigênica e Restrição de HLA (a carac-terização de clone de célula T D466 D6). Para os resultados mostrados nasFiguras 3a-3c, para identificar o antígeno e epítopo mínimo reconhecidospelo clone de célula T, D466 D6, células T (5000 células/cavidade) foramincubadas com LCL autólogo (20.000/cavidade) e 5 pg/ml de antígeno. IFN-γfoi avaliado através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Para osresultados apresentados na Figura 3a, antígenos consistiam em "pool" depeptídeo representando antígenos de CD4+ conhecidos, feitos de peptídeosde até 15 aminoácidos (aa) se sobrepondo em 11 aa. Para os resultadosapresentados na Figura 3b, antígenos consistiam em peptídeos CFP10 de15 aa individuais que juntos constituíam o "pool" de peptídeo. Para os resul-tados apresentados na Figura 3c, antígenos consistiam em peptídeosCFPIO1-15 aninhados individuais (10 aa, 9 aa ou 8 aa), usados para mapearmais o epítopo. Para os resultados apresentados na Figura 3d, o alelo derestrição foi identificado usando LCL (20.000/cavidade) expressando alelosHLA igualando D466 em um ou dois alelos, pulsada com CFP102--io(5 pg/ml)como APC. Após 2 horas, células foram lavadas e incubadas com células T(500 células/cavidade) em um ensaio ELISPOT IFN-γ.
A Figura 4 é um gráfico em linha mostrando a confirmação demapeamento de epítopo mínimo de D466 D6. Para confirmar o epítopo mí-nimo, LCL autóloga (20.000/cavidade) foi pulsada com peptídeo na concen-tração indicada e co-culturada com células T (1000 células/cavidade). IFN-γfoi avaliado através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cadaponto representa a média de determinações em duplicata.
A Figura 5 é um conjunto de gráficos em barra mostrando o perfilde padrão de imunodominância para CFP10. Para determinar as freqüênciasde célula efetora, DC autólogas (20.000/cavidade) foram pulsadas ou comcada peptídeo de 15-mer individual (5 pg/ml), o "pool" de peptídeo (PP; 5pg/cada peptídeo) ou o epítopo mínimo (ME) determinado de clones de célu-la T derivados de cada doador (D466:CFP102-11; D480:CFP103-11;D481 ;CFP1075-83; 5 Mg/ml) e testadas contra 250.000 células T CD8+ puri-ficadas com conta magnética. Liberação de IFN-γ foi avaliada através de E-LISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representa a médiade determinações em duplicata.
A Figura 6 é um grupo de gráficos resumindo os dados de ma·peamento de epítopo mínimo. Para determinar o epítopo mínimo, LCL autó-loga (20.000/cavidade) foi pulsada com peptídeo na concentração indicada eco-cultura com células T (1000 células/cavidade). IFN-γ foi avaliado atravésde ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representa a mé-dia de determinações em duplicata.
A Figura 7 é um gráfico em linha mostrando o mapeamento deEpítopo Mínimo para Clones D504. Para determinar o epítopo mínimo, LCLautóloga (20.000/cavidade) foi co-culturada com clones de célula T (1.000células/cavidade) e o peptídeo na concentração indicada. IFN-γ foi avaliadoatravés de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto represen-ta a média de determinações em duplicata.
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA
As seqüências de ácido nucléico e aminoácido listadas na lista-gem de seqüência acompanhante são mostradas usando abreviações deletra padrão para bases de nucleotídeo, e código de três letras para aminoá-cidos, conforme definido em 37 C.F.R. 1.822. Apenas um filamento de cadaseqüência de ácido nucléico é mostrado, mas o filamento complementar écompreendido como incluído por qualquer referência ao filamento mostrado.Na listagem de seqüência acompanhante:
SEQ ID NOs: 1-12 são a seqüência de aminoácido de polipeptí-deos de Mtb.
SEQ ID NOs: 13-14 são aminoácidos de peptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 15-25 são as seqüências de ácido nucléico de po-linucleotídeos codificando os polipeptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 26-38 são as seqüências de aminoácido de epíto-pos de Mtb específicos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Métodos para detecção de uma infecção com Mycobacteriumtuberculosis em um indivíduo são descritos. Os métodos incluem detecçãoda presença de células T, tal como, mas não limitado a, células T CD8+, quereconhecem especificamente um polipeptídeo de Mycobacterium tuberculo-sis (Mtb). Os métodos incluem ensaios in vitro para detecção da presença decélulas T CD8+ em uma amostra biológica, e ensaios in vivo que detectamuma reação de hipersensibilidade do tipo retardada. Os métodos podemtambém incluir detecção de polipeptídeos e polinucleotídeos de Mtb. Rea-gentes para a detecção de uma infecção com Mtb são também descritos.Termos
A menos que de outro modo mencionado, termos técnicos sãousados aqui de acordo com uso convencional. Definições de termos comunsem biologia molecular podem ser encontrados em Benjamin Lewin, Genes V,publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Ken-drew e outros (Eds.), The Eneyeiopedia of Molecular Bioiogy, publicada pelaBlackwell Science, Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers(ed.), Molecular Bioiogy and Biotechnology: a Comprehensive Desk Refe-rence, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).A fim de facilitar revisão das várias modalidades da presentedescrição, as explicações que seguem de termos específicos são providas:
Adiuvante: Um veículo usado para aumentar antigenicidade. Ad-juvantes incluem uma suspensão de minerais (alume, hidróxido de alumínioou fosfato) onde antígeno é absorvido; ou emulsão água-em-óleo onde solu-ção de antígeno é emulsificada em óleo mineral (adjuvante incompleto deFreund), algumas vezes com a inclusão de micobactérias mortas (adjuvantecompleto de Freund) para aumentar mais a antigenicidade (inibe degradaçãode antígeno e/ou causa influxo de macrófago). Oligonucleotídeos imunoes-timuladores (tal como aqueles incluindo um motivo CpG) podem ser tambémusados como adjuvantes (por exemplo, vide Patente U.S. N- 6.194.388; Pa-tente U.S. N5 6.207.646; Patente U.S. 6.214.806; Patente U.S. Nq 6.218.371;Patente U.S. Nq 6.239.116; Patente U.S. Ns 6.339.068; Patente U.S. Nq6.406.705; e Patente U.S. N2 6.429.199). Adjuvantes incluem moléculas bio-lógicas (um "adjuvante biológico"), tal como moléculas co-estimuladoras.Adjuvantes exemplares incluem IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-γ, G-CSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L e 41 BBL.
Amplificacão: De uma molécula de ácido nucléico (por exemplo,uma molécula de DNA ou RNA) refere-se ao uso de uma técnica que au-menta o numero de cópias de uma molécula de ácido nucléico em um espé-cime. Um exemplo de amplificação é a reação em cadeia de polimerase,onde uma amostra biológica coletada de um indivíduo é contatada com umpar de iniciadores de oligonucleotídeo, sob condições que permitem a hibri-dização dos iniciadores em um molde de ácido nucléico na amostra. Os ini-ciadores são estendidos sob condições adequadas, dissociados do molde eentão reanelados, estendidos e dissociados para amplificar o número de có-pias do ácido nucléico. O produto de amplificação pode ser caracterizado poreletroforese, padrões de clivagem de endonuclease de restrição, hibridiza-ção ou ligação de oligonucleotídeo; e/ou sequenciamento de ácido nucléicousando técnicas padrão. Outros exemplos de amplificação incluem amplifi-cação por deslocamento de filamento, conforme descrito na Patente U.S. N-5.744.311; amplificação isotérmica livre de transcrição, conforme descrito naPatente U.S. Nq 6.033.881; amplificação por reação em cadeia de reparo,conforme descrito no WO 90/01069; amplificação por reação em cadeia daligase, conforme descrito na EP-A-320 308; amplificação por reação em ca-deia da ligase de preenchimento de lacuna, conforme descrito na PatenteU.S. Nq 5.427.930; e amplificação livre de transcrição de RNA NASBA®, con-forme descrito na Patente U.S. Nq 6.025.134.
Antíqeno: Um composto, composição ou substância que podeestimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um a-nimal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas no animal.
Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celular espe-cífica, incluindo aqueles induzidos por imunógenos heterólogos. O termo"antígeno" inclui todos os epítopos antigênicos relacionados. "Epítopo" ou"determinante antigênico" refere-se a um sítio no antígeno ao qual células Be/ou T respondem. Em uma modalidade, células T respondem ao epítopo,quando o epítopo está presente em conjunto com uma molécula de MHC.
Epítopos podem ser formados ambos de aminoácidos contíguos ou aminoá-cidos não-contíguos justapostos pela estrutura terciária de uma proteína.
Epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos naexposição a solventes desnaturantes enquanto epítopos formados por do-bramento terciário são tipicamente perdidos em tratamento com solventesdesnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e, mais comu-mente, pelo menos 5, cerca de 9 ou cerca de 8-10 aminoácidos em umaconformação espacial única. Métodos de determinação de conformação es-pacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raio X e ressonân-cia magnética nuclear 2-dimensional.
Um antígeno pode ser um antígeno específico de tecido, ou umantígeno específico de doença. Esses termos não são exclusivos, um antí-geno específico de tecido pode ser um antígeno específico de doença. Umantígeno específico de tecido é expresso em um número limitado de tecidos,tal como um tecido único. Um antígeno específico de tecido pode ser ex-presso por mais de um tecido, tal como, mas não limitado a, um antígenoque é expresso em mais de um tecido reprodutivo, tal como em tecido deambos próstata e útero. Um antígeno específico de doença é expresso coin-cidentemente com um processo de doença. Exemplos não-limitantes especí-ficos de um antígeno específico de doença são um antígeno cuja expressãose relaciona com, ou é previsiva de, tuberculose. Um antígeno específico dedoença pode ser um antígeno reconhecido por células T ou células B.
Anticorpo: Moléculas de imunoglobulina e porções imunologica-mente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêmum sítio de ligação de antígeno que especificamente liga (imunorreage com)um antígeno, tal como polipeptídeo de Mtb.
Um anticorpo de ocorrência natural (por exemplo, IgG, IgM, IgD)inclui quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas ca-deias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. No entanto, foi mos-trado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realiza-da por fragmentos de um anticorpo de ocorrência natural. Então, essesfragmentos de ligação de antígeno pretendem ser também designados pelotermo "anticorpo". Exemplos não-limitantes, específicos, de fragmentos deligação compreendidos dentro do termo anticorpo incluem (i) um fragmentoFab consistindo nos domínios VL, VH, Cl e Ch; (ii) um fragmento Fd consistin-do nos domínios Vh e CH; (iii) um fragmento Fv consistindo nos domínios Vle Vh de um braço único de um anticorpo, (iv) um fragmento dAb (Ward e ou-tros, Nature 341:544-546, 1989) que consiste em um domínio Vh; (v) umaregião de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (vi) umfragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentosFab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça.
Imunoglobulinas e certas variantes delas são conhecidas e po-dem ter sido preparadas em cultura de célula recombinante (por exemplo,vide Patente U.S. Nq 4.745.055; Patente U.S. N9 4.444.487; WO 88/03565;EP 256.654; EP 120.694; EP 125.023; Faoulkner e outros, Nature 298:286,1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison e outros, Ann. Rev.Immunol. 2:239, 1984).
Animal: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma cate-goria que inclui, por exemplo, mamíferos e aves. O termo mamífero incluiambos mamíferos humanos em não-humanos. Similarmente, o termo "indi-víduo" inclui ambos indivíduos humanos e veterinários.
Anticorpo: Moléculas de imunoglobulina e porções imunologica-mente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêmum sítio de ligação de antígeno que especificamente liga (imunorreage com)um antígeno.
Um anticorpo de ocorrência natural (por exemplo, IgG, IgM, IgD)inclui quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas ca-deias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. No entanto, foi mos-trado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realiza-da por fragmentos de um anticorpo de ocorrência natural. Então, essesfragmentos de ligação de antígeno pretendem ser também designados pelotermo "anticorpo". Exemplos não-limitantes, específicos, de fragmentos deligação compreendidos dentro do termo anticorpo incluem (i) um fragmentoFab consistindo nos domínios VL, VH, Cl e Ch; (ii) um fragmento Fd consis-tindo nos domínios Vh e Ch; (iii) um fragmento Fv consistindo nos domíniosVl e Vh de um braço único de um anticorpo, (iv) um fragmento dAb (Ward eoutros, Nature 341:544-546, 1989) que consiste em um domínio Vh; (v) umaregião de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (vi) umfragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentosFab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça.
Imunoglobulinas e certas variantes delas são conhecidas e po-dem ter sido preparadas em cultura de célula recombinante (por exemplo,vide Patente U.S. Ns 4.745.055; Patente U.S. Nq 4.444.487; WO 88/03565;EP 256.654; EP 120.694; EP 125.023; Faoulkner e outros, Nature 298:286,1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison e outros, Ann. Rev.Immunol. 2:239, 1984).
Célula apresentando antígeno (APC): Uma célula que pode a-presentar um antígeno para célula T, de modo que as células T são ativa-das. Células dendríticas são as células apresentando antígeno principais(APCs) envolvidas em respostas imunes primárias. A sua principal função éobter antígeno em tecidos, migrar para órgãos linfóides e apresentar o antí-geno a fim de ativar células T.
Quando um sinal de maturação apropriado é recebido, célulasdendríticas são sinalizadas para sofrer mudanças morfológicas e fisiológicasrápidas que facilitam o início e desenvolvimento de respostas imunes. Den-tre essas estão a supra-regulagem de moléculas envolvidas em apresenta-ção de antígeno; produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-12,chave para a geração de respostas Th 1; e secreção de quimiocinas que aju-dam a dirigir diferenciação, expansão e migração de células Th puras cir-cundantes. Coletivamente, essas moléculas supra-reguladas facilitam a ha-bilidade de células dendríticas em coordenar a ativação e função efetora deoutros linfócitos circundantes que por fim provêem proteção para o hospedeiro.
cDNA (DNA complementar): Um pedaço de DNA sem segmen-tos de não-codificação, internos, (introns) e seqüências reguladoras que de-terminam transcrição. cDNA é sintetizado no laboratório através de transcri-ção reversa de RNA mensageiro extraído de células.
CD4: Grupo de fator de diferenciação 4, uma proteína de super-fície de célula T que faz a mediação da interação com a molécula do MHCClasse II. CD4 também serve como um sítio receptor primário para HIV emcélulas T durante infecção com HIV. Células que expressam CD4 são fre-qüentemente células T auxiliares.
CD8: Grupos de fator de diferenciação 8, uma proteína de super-fície de célula T que faz a mediação da interação com a molécula do MHCClasse II. Células que expressam CD8 são freqüentemente células T citotó-xicas. "Imunidade mediada por célula T CD8+" é uma resposta imune imple-mentada pela apresentação de antígenos a células T CD8+.
cDNA (DNA complementar): Um pedaço de DNA sem segmen-tos de não-codificação, internos, (introns) e seqüências reguladoras que de-terminam transcrição. cDNA é sintetizado no laboratório através de transcri-ção reversa de RNA mensageiro extraído de células.
Variantes conservativas: Substituições de aminoácido "conserva-tivas" são aquelas substituições que não afetam substancialmente ou dimi-nuem uma atividade ou antigenicidade do polipeptídeo de Mycobacterium.Exemplos não-limitantes, específicos, de uma substituição conservativa in-cluem os exemplos que seguem:
<table>table see original document page 14</column></row><table>
O termo variação conservativa também inclui o uso de um ami-noácido substituído no lugar de um aminoácido de origem não-substituído,contanto que anticorpos criados para o polipeptídeo substancial também i-munorreajam com o polipeptídeo não-substituído, ou que uma resposta imu-ne possa ser gerada contra o polipeptídeo substituído que é similar à respos-ta imune contra e polipeptídeo não-substituído, tal como um antígeno de My-cobacterium. Então, em uma modalidade, substituições não-conservativassão aquelas que reduzem uma atividade ou antigenicidade.
Consiste essencialmente em/Consiste em: Com relação a umpolipeptídeo, um polipeptídeo que consiste essencialmente em uma seqüên-cia de aminoácido especificada se ele não incluir quaisquer resíduos de a-minoácidos adicionais. No entanto, o polipeptídeo pode incluir componentesde não-peptídeo adicionais, tal como marcadores (por exemplo, marcadoresfluorescentes, radioativos ou em partícula sólida), açúcares ou lipídeos. Umpolipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoácido especificadanão inclui quaisquer resíduos de aminoácido adicionais, nem inclui compo-nentes de não-peptídeo adicionais, tal como lipídeos, açúcares ou marcadores.
Contato: O processo de incubação de um agente na presençade outro. Então, quando uma célula é contatada com um agente, a célula éincubada com o agente por um período de tempo suficiente para o agente ea célula interagirem.
Molécula co-estimuladora: Embora envolvimento do TCR compeptídeo-MHC libere um sinal para a célula T, este sinal sozinho pode serinsuficiente para ativar a célula T. Moléculas co-estimuladoras são moléculasque, quando ligadas a seu ligante, aplicam um segundo sinal requerido paraa célula T se tornar ativada. A molécula co-estimuladora mais bem-conhecida na célula T é CD28, que se liga a ou B7-1 (também chamadaCD80) ou B7-2 (também conhecida como CD86). Uma molécula co-estimuladora adicional é B7-3. Moléculas acessório que também provêemum segundo sinal para a ativação de células T incluem molécula de adesãointracelular (ICAM-1 e ICAM-2), antígeno associado a funcionamento de Ieu-cócito (LFA-1, LFA-2 e LFA-3). Integrinas e membros da superfamília de fa-tor de necrose de tumor (TNF) podem também servir como moléculas co-estimuladoras.
Citocina: Proteínas feitas pelas células que afetam o comporta-mento de outras células, tal como linfócitos. Em uma modalidade, uma cito-cina é uma quimiocina, uma molécula que afeta tráfego celular. Exemplosnão-limitantes, específicos, de citocinas incluem as interleucinas (IL-2, IL-4,IL-6, IL-10, IL-21, etc) e interferon (IFN)-y.
Variante de degeneracão: Um polinucleotídeo codificando umepítopo de um polipeptídeo de Mtb que inclui uma seqüência que é degene-rada como um resultado do código genético. Existem 20 aminoácidos natu-rais, a maioria dos quais é especificada por mais de um códon. Então, todasas seqüências de nucleotídeo de degeneração estão incluídas nesta descri-ção contanto que a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de Mtb codifi-cada pela seqüência de nucleotídeo seja não-modificada.
Célula dendrítica (PC): Células dendríticas são as principais cé-lulas apresentando antígeno (APCs) envolvidas em respostas imunes primá-rias. Células dendríticas incluem células dendríticas plasmocitóides e célulasdendríticas mielóides. Sua função principal é obter antígeno em tecidos, mi-grar para órgãos linfóides e apresentar o antígeno a fim de ativar células T.Células dendríticas imaturas se originam na medula óssea e residem na pe-riferia como células imaturas.
Diagnóstico: Identificação da presença ou natureza de uma con-dição patológica, tal como, mas não limitado a, tuberculose. Métodos de di-agnóstico diferem em sua sensibilidade e especificidade. A "sensibilidade"de um ensaio de diagnóstico é a porcentagem de indivíduos doentes quetestam positivo (porcentagem de verdadeiros positivos). A "especificidade"de um ensaio de diagnóstico é 1 menos ã taxa de falso positivo, onde a taxade falso positivo é definida como a proporção daqueles sem a doença quetestaram positivo. Embora um método de diagnóstico particular possa nãoprover um diagnóstico definido de uma condição, é suficiente se o métodoprover uma indicação positiva que auxilie em diagnóstico. "Prognóstico" sig-nifica previsão da probabilidade de desenvolvimento (por exemplo, severida-de) de uma condição patológica, tal como tuberculose.
Mostra: O processo de localização de um complexo peptí-deo:antígeno, ou um peptídeo, na superfície externa de uma célula onde ocomplexo peptídeo:antígeno ou peptídeo é acessível a uma segunda célula,moléculas mostradas por uma segunda célula, ou fatores solúveis. Um pep-tídeo, ou um complexo de peptídeo:antígeno, é "mostrado" por uma célulaquando ele está presente na superfície externa da célula e é acessível auma segunda célula, a moléculas mostradas pela segunda célula, ou a fato-res solúveis.Epítopo: Um determinante antigênico. Esses são grupos quími-cos ou seqüências de peptídeo particulares em uma molécula que são anti-gênicos, isto é, que elicitam uma resposta imune específica. Um anticorpo seliga especificamente a um epítopo antigênico particular em um polipeptídeo,tal como um polipeptídeo de Mycobacterium.
Seqüências de Controle de Expressão: Seqüências de ácido nu-cléico que regulam a expressão de uma seqüência de ácido nucléico heteró-loga à qual elas estão operativamente ligadas. Seqüências de controle deexpressão são operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléicoquando as seqüências de controle de expressão controlam e regulam atranscrição e, conforme apropriado, tradução da seqüência de ácido nucléi-co. Então seqüências de controle de expressão podem incluir promotores,aumentadores, terminadores de transcrição, um códon de início (isto é, ATG)em frente de um gene de codificação de proteína, sinal de união para in-trons, manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitirtradução apropriada de mRNA e códons de parada apropriados. O termo"seqüências de controle" pretende incluir, no mínimo, componentes cuja pre-sença pode influenciar expressão, e pode também incluir componentes adi-cionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüên-cias de contraparte de fusão. Seqüências de controle de expressão podemincluir um promotor.
Um promotor é uma seqüência mínima suficiente para direcionartranscrição. Também incluídos estão aqueles elementos promotores que sãosuficientes para fazer expressão de gene dependente de promotor controlá-vel para específico de tipo de célula, específico de tecido ou induzível porsinais ou agentes externos; tais elementos podem estar localizados na regi-ão 5' ou 3' do gene. Ambos promotores constitutivos e induzíveis estão inclu-ídos (vide, por exemplo, Bitter e outros, Methods in Enzymology 153:516-544, 1987). Por exemplo, quando clonando em sistemas bacterianos, promo-tores induzíveis tal como pL de bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promo-tor híbrido ptrp-lac) e similar podem ser usados. Em uma modalidade, quan-do clonando em sistemas de célula de mamífero, promotores derivados dogenoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína)ou de vírus de mamífero (por exemplo, repetição terminal longa de retroví-rus; o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus vaccínia 7,5K) po-dem ser usados. Promotores produzidos através de técnicas de DNA re-combinante ou sintéticas podem ser também usados para prover transcriçãodas seqüências de ácido nucléico. Em uma modalidade, o promotor é umpromotor de citomegalovírus.
Fracionamento: Submissão de uma amostra a condições ou pro-cedimentos que separam os componentes da amostra com base em propri-edades físicas ou químicas, mas não limitado a, tamanho, carga, solubilida-de ou composição. Exemplos de procedimento de fracionamento incluem,mas não estão limitados a, precipitação seletiva, extração orgânica, diálisede exclusão de tamanho ou cromatografia, tal como cromatografia de trocade íon. Em uma modalidade, uma fração é um extrato solúvel ou um extratoorgânico de um organismo, tal como uma Mycobacterium.
Funcionalmente Equivalente: Alterações de seqüência, tal comoem um epítopo de um antígeno, que dão os mesmos resultados conformeaqui descrito. Tais alterações de seqüências podem incluir, mas não estãolimitadas a, substituições conservativas, deleções, mutações, frameshifts einserções.
Heteróloqo: Originando de fontes ou espécies genéticas separa-das. Um polipeptídeo que é heterólogo a um polipeptídeo de Mtb se originade um ácido nucléico que não codifica o polipeptídeo de Mtb. Em um exem-plo não-limitante, específico, um polipeptídeo compreendendo nove aminoá-cidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, ou no máximo 20 aminoáci-dos consecutivos do polipeptídeo de Mtb, e uma seqüência de aminoácidoheteróloga inclui uma β-galactosidase, uma proteína de ligação de maltose ealbumina, antígeno de superfície B de hepatite ou uma seqüência de amino-ácido de imunoglobulina. Em geral, um anticorpo que especificamente seliga a uma proteína de interesse não vai especificamente se ligar a uma pro-teína heteróloga.
Células hospediras: Células onde um vetor pode ser propagadoe seu DNA expresso. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. A célulapode ser mamífero, tal como uma célula humana. O termo também incluiqualquer progênie da célula hospedeira objeto. É compreendido que toda aprogênie pode não ser idêntica à célula de origem uma vez que pode havermutações que acontecem durante replicação. No entanto, tal progênie estáincluída quando o termo "célula hospedeira" é usado.
Antíqeno de Leucócito Humano (HLA): Uma designação genéti-ca do complexo de histocompatibilidade principal humano (MHC). Locaisindividuais são designados por letras maiúsculas, como em HLA-E, e alelossão designados pelos números, como em HLA-A*0201. Os três genes doMHC classe I principais são chamados HLA-A, HLA-B e HLA-C. No entanto,existem muitos genes que codificam moléculas de superfície de célula asso-ciadas com microglobulina β2 que estão ligados aos genes do MHC classe I.
A expressão desses genes é variável, ambos na distribuição de tecido e naquantidade expressa em células; esses genes foram chamados genes doMHC classe IB.
Resposta imune: Uma resposta de uma célula do sistema imune,tal como uma célula B, célula assassina natural, ou uma célula T, a um estí-mulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno parti-cular (uma "resposta específica de antígeno"). Em uma modalidade, umaresposta imune é uma resposta de célula T, tal como uma resposta Th1; Th2ou Th3. Em outra modalidade, uma resposta imune é uma resposta de umacélula T supressora.
Peptídeo imunoqênico: Um peptídeo que compreende um motivoespecífico de alelo ou outra seqüência de modo que o peptídeo vai ligar umamolécula do MHC e induzir uma resposta de célula T, tal como uma respostade célula T CD8+, ou uma resposta de célula B (tal como produção de anti-corpo) contra o antígeno do qual o peptídeo imunogênico é derivado.
Em uma modalidade, peptídeos imunogênicos são identificadosusando motivos de seqüência ou outros métodos, tal como determinaçõesde rede neural ou polinomial, conhecidos na técnica. Tipicamente, algoritmossão usados para determinar o "limiar de ligação" de peptídeos para selecio-nar aqueles com scores que dão a eles uma alta probabilidade de ligaçãoem uma certa afinidade e serão imunogênicos. Os algoritmos são baseadosou nos efeitos sobre ligação de MHC de um aminoácido particular em umaposição particular, nos efeitos sobre ligação de anticorpo de um aminoácidoparticular em uma posição particular, ou nos efeitos sobre ligação de umasubstituição particular em um peptídeo contendo motivo. Dentro do contextode um peptídeo imunogênico, um "resíduo conservado" é um que apareceem uma freqüência significantemente maior do que seria esperado por dis-tribuição aleatória em uma posição particular em um peptídeo. Em uma mo-dalidade, um resíduo conservado é um onde a estrutura do MHC pode pro-ver um ponto de contato com o peptídeo imunogênico.
Peptídeos imunogênicos podem ser também identificados me-dindo sua ligação a uma proteína do MHC específica e pela sua habilidadeem estimular CD4 e/ou CD8 quando apresentados no contexto da proteínado MHC. Em um exemplo, um "peptídeo de Mtb" imunogênico é uma sériede resíduos de aminoácido contíguos da proteína de Mtb geralmente entre 9e 20 aminoácidos de comprimento, tal como cerca de 8 a 11 resíduos decomprimento. Polipeptídeos imunogênicos específicos são descritos aquique são resíduos de 9 ou 10 aminoácidos de comprimento, ou no máximo 12aminoácidos de comprimento.
Geralmente, polipeptídeos de Mtb imunogênicos podem ser usa-dos para induzir uma resposta imune em um indivíduo, tal como uma respos-ta de célula B ou uma resposta de célula T. Em um exemplo, um polipeptí-deo de Mtb imunogênico, quando ligado a uma molécula do Complexo deHistocompatibilidade Principal Classe I, ativa células T CD8+, tal como linfó-citos T citotóxicos (CTLs) contra Mtb. Indução de CTL usando peptídeos sin-téticos e ensaios citotóxicos de CTL conhecidos na técnica, vide patenteU.S. 5.662.907, que é aqui incorporada a título de referência. Em um exem-plo, um peptídeo imunogênico inclui um motivo específico de alelo ou outraseqüência de modo que o peptídeo ligará uma molécula do MHC e induzuma resposta CD8+ contra o antígeno do qual o peptídeo imunogênico é de-rivado. Uma célula T CD8+ que reconhece especificamente um polipeptídeode Mtb é ativada, prolifera e/ou secreta citocinas em resposta àquele poli-peptídeo específico, e não para outros, polipeptídeos não-relacionados.
Composição imunogênica: Uma composição compreendendo umpolipeptídeo de Mtb imunogênico ou um ácido nucléico codificando o poli-peptídeo de Mtb imunogênico que induz uma resposta T mensurável contraMtb, tal como uma resposta de célula T CD8+, ou induz uma resposta decélula B mensurável (tal como produção de anticorpos que especificamenteligam um polipeptídeo de Mtb). Para uso in vitro, a composição imunogênicapode consistir no ácido nucléico isolado, vetor incluindo o ácido nucléico/oupeptídeo imunogênico. Para uso in vivo, a composição imunogênica vai tipi-camente compreender o ácido nucléico, vetor incluindo o ácido nucléico e/oupolipeptídeo imunogênico, em veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ououtros agentes. Uma composição imunogênica pode opcionalmente incluirum adjuvante, uma molécula co-estimuladora ou um ácido nucléico codifi-cando uma molécula co-estimuladora. Um polipeptídeo de Mtb, ou ácido nu-cléico codificando o polipeptídeo, pode ser prontamente testado quanto àsua habilidade em induzir uma resposta de célula T CD8+.
Inibição ou tratamento de uma doença: Inibição de uma doença,tal como tuberculose, refere-se à inibição do desenvolvimento integral deuma doença. Em vários exemplos, inibição de uma doença refere-se à dimi-nuição dos sintomas de uma tuberculose. "Tratamento" refere-se a uma in-tervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença oucondição patológica relacionada com a doença, tal como tuberculose.
Interferon gama (γ): IFN-γ é uma proteína dimérica com subuni-dades de 146 aminoácidos. A proteína é glicosilada em dois sítios, e o pl é8,3-8,5. IFN-γ é sintetizado como uma proteína precursora de 166 aminoáci-dos incluindo uma seqüência de sinal secretora de 23 aminoácidos. Duasformas moleculares da proteína biologicamente ativa de 20 e 25 kDa foramdescritas. Ambas são glicosiladas na posição 25. A forma de 25 kDa é tam-bém glicosilada na posição 97. As diferenças observadas de IFN-γ naturalcom relação à massa molecular e carga são devido a padrões de glicosila-ção variáveis. Formas de 40-60 kDa observadas sob condições de não-desnaturação são dímeros e tetrâmeros de IFN-γ. O gene humano tem umcomprimento de aproximadamente 6 kb. Ele contém quatro exons e mapeiapara cromossomo 12q24.1.
IFN-γ pode ser detectado através de imunoensaios sensíveis, talcomo um teste ELISA que permite detecção de células individuais produzin-do IFN-γ. Quantidades pequenas de IFN-γ podem ser detectadas indireta-mente através da medição de proteínas induzidas por IFN-γ ta! como proteí-na Mx. A indução da síntese de IP-10 tem sido usada para medir concentra-ções de IFN-γ. Ainda, bioensaios podem ser usados para detectar IFN-γ, talcomo um ensaio que emprega indução de atividade de indolamina 2,3-dioxigenase em células 2D9. A produção de IFN^pode ser usada para ava-liar a ativação de célula T, tal como ativação de uma célula T por um antíge-no de Mycobacterium apresentado em HLA-E.
Isolado: Um ácido nucléico "isolado" foi substancialmente sepa-rado ou purificado de outras seqüências de ácido nucléico na célula dos or-ganismos onde o ácido nucléico acontece naturalmente, isto é, outros DNA eRNA cromossomais e extracromossomais. O termo "isolado" então compre-ende ácidos nucléicos purificados por métodos de purificação de ácido nu-cléico padrão. O termo também compreende ácidos nucléicos preparadosatravés da expressão recombinante em uma célula hospedeira bem comoácidos nucléicos quimicamente sintetizados.
Marcador: Um composto ou composição detectável que é conju-gado diretamente ou indiretamente a outra molécula para facilitar detecçãodaquela molécula. Exemplos não-limitantes, específicos, de marcadores in-cluem tags fluorescentes, ligações enzimáticas e isótopos radioativos.
Seqüência liqante: Uma seqüência Iigante é uma seqüência deaminoácido que liga covalentemente dois domínios de polipeptídeo. Se-qüências Iigantes podem ser incluídas entre os epítopos de Mtb descritosaqui para prover liberdade rotacional aos domínios de polipeptídeo ligados eentão promover dobra de domínio apropriada e apresentação ao MHC. Atítulo de exemplo, em um polipeptídeo recombinante compreendendo doisdomínios de Mtb, seqüências Iigantes podem ser providas entre eles, tal co-mo um polipeptídeo compreendendo polipeptídeo de Mtb-Iigante-polipeptídeo de Mtb. Seqüências ligantes, que são geralmente entre 2 e 25aminoácidos de comprimento, são bem-conhecidas na técnica e incluem,mas não estão limitadas a, o espaçador glicina(4)-serina (GGGGSx3) descri-to por Chaudhary e ouros, Nature 339:394-397, 1989.
Linfócitos: Um tipo de célula sangüínea branca que está envolvi-da nas defesas imunes do corpo. Existem dois tipos principais de linfócitos:células B e células T.
Mamífero: Este termo inclui ambos mamíferos humanos e não-humanos. Similarmente, o termo "paciente" ou "indivíduo" inclui ambos indi-víduos humanos e veterinários.
Micobactérias: Um gênero de organismos bacterianos intracelu-lares. Quando da invasão de um hospedeiro, esses organismos sobrevivemdentro de compartimentos endossomais dos monócitos e macrófagos. Do-enças micobacterianas humanas incluem tuberculose (causada por M. tu-berculosis), Leprose (causada por M. leprae), úlceras de Barinsdale (causa-das por M. ulcerans) e outras infecções que podem ser causadas por M. ma-rinum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M.haemophilum, M. chelonei e M. intracelluare. Cepas de Mycobacterium queforam anteriormente consideradas ser não-patogênicas (tal como M. avium)são também agora conhecidas ser assassinas principais de pacientes comAIDS imunossuprimidos.
A resposta principal a micobactérias envolve reações de hiper-sensibilidade mediada por célula (DTH) com células T e macrófagos desem-penhando papéis principais na morte intracelular e enclausuramento (oucontenção) do organismo (formação de granuloma). Uma resposta de célulaT principal envolve linfócitos CD4+ que reconhecem proteínas de choquetérmico micobacterianas e antígenos imunodominantes.
Operavelmente ligado: Uma primeira seqüência de ácido nucléi-co está operavelmente ligada com uma segunda seqüência de ácido nucléi-co quando a primeira seqüência de ácido nucléico é posta em uma relaçãofuncional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, umpromotor está operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se opromotor realizar a transcrição ou expressão da seqüência de codificação.Em geral, seqüências de DNA operavelmente ligadas são contíguas e, ondenecessário unir duas regiões de codificação de proteína, as estruturas deleitura aberta são alinhadas.
ORF (estrutura de leitura aberta): Uma série de tripletos de nu-cleotídeo (códons) codificando aminoácidos sem quaisquer códons de termi-nação. Essas seqüências são geralmente traduzíveis em um polipeptídeo.
Modificações de peptídeo: Polipeptídeos de Mycobacterium in-cluem modalidades sintéticas de peptídeos descritos aqui. Ainda, análogos(moléculas orgânicas de não-peptídeo), derivados (moléculas de peptídeoquimicamente funcionalizadas obtidas começando com as seqüências depeptídeo descritas) e variantes (homólogos) dessas proteínas podem serutilizados nos métodos descritos aqui. Cada polipeptídeo da invenção écompreendido de uma seqüência de aminoácidos, que podem ser ou L- e/ouD-aminoácidos, de ocorrência natural ou outro.
Peptídeos podem ser modificados por uma variedade de técni-cas químicas para produzir derivados tendo essencialmente a mesma ativi-dade que os peptídeos não-modificados, e opcionalmente tendo outras pro-priedades desejáveis. Por exemplo, grupos de ácido carboxílico da proteína,sejam carboxila-terminais ou cadeia lateral, podem ser providos na forma deum sal de um cátions farmaceuticamente aceitável ou esterificados paraformar um C1-C16 éster, ou convertidos em uma amida de fórmula NR1R2onde Ri e R2 são cada um independentemente H ou CrCi6 alquila, ou com-binados para formar um anel heterocíclico, tal como um anel de 5 ou 6membros. Grupos amino do peptídeo, sejam amino terminais ou de cadeialateral, podem estar na forma de um sal de adição farmaceuticamente acei-tável, tal como os sais de HCI, HBr, acético, benzóico, toluenossulfônico,maléico, tartárico e outros orgânicos, ou podem ser modificados para umaC1-C16 alquila ou dialquil amino ou convertidos mais em uma amida.
Grupos hidroxila das cadeias laterais de peptídeo podem serconvertidos em Ci-Ci6 alcóxi ou em um CrC16 éster usando técnicas bem-reconhecidas. Anéis fenila e fenólicos das cadeias laterais de peptídeo po-dem ser substituídos com um ou mais átomos de halogênio, tal como flúor,cloro, bromo ou iodo, ou com C1-C16 alquila, C1-C16 alcóxi, ácidos carboxíli-cos e seus ésteres, ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Grupos metilenodas cadeias laterais de peptídeo podem ser estendidos para C2-C4 alquile-nos homólogos. Tióis podem ser protegidos com qualquer um de vários gru-pos de proteção bem-reconhecidos, tal como grupos acetamida. Aquelesversados na técnica vão também reconhecer métodos para introdução deestruturas cíclicas nos peptídeos da presente invenção para selecionar eprover restrições conformacionais à estrutura que resultam em estabilidadeaumentada.
Modalidades peptidomiméticas e organomiméticas são previstas,com o que a disposição tridimensional dos constituintes químicos de taispeptido- e organomiméticos imita a disposição tridimensional da estruturaprincipal de peptídeo e cadeias laterais de aminoácido componente, resul-tando em tais peptido- e organomiméticos de um polipeptídeo de Mycobacte-rium tendo habilidade mensurável ou aumentada em gerar uma respostaimune. Para aplicações de modelagem por computador, um farmacóforo éuma definição tridimensional, idealizada, das necessidades estruturais paraatividade biológica. Peptido- e organomiméticos podem ser projetados paraajustar cada farmacóforo com software de modelagem por computador atual(usando projeto de fármaco auxiliado por computador ou CADD). Vide Wal-ters, "Computer-Assisted Modeling of Drugs", em Klegerman & Groves, Eds.,1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove; IL,pp. 165-174 e Principies of Pharmacology Muson (ed.) 1995, Cap. 102, paradescrições de técnicas usadas em CADD. Também incluídos estão miméti-cos preparados usando tais técnicas.
Agente farmacêutico ou fármaco: Um composto químico oucomposição capaz de indução de um efeito terapêutico ou profilático deseja-do quando apropriadamente administrado a um indivíduo.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Os veículos farmaceuti-camente aceitáveis úteis com os polipeptídeos e ácidos nucléicos descritosaqui são convencionais. Remington1S Pharmaceutical Sciences, de E.W.Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15- Edição (1975), descreve com-posições e formulações adequadas para aplicação farmacêutica das proteí-nas de fusão aqui descritas.
Em geral, a natureza do veículo vai depender do modo de admi-nistração particular sendo empregado. Por exemplo, formulações parenteraisgeralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuti-camente e fisiologicamente aceitáveis tal como água, solução salina fisioló-gica, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou similar co-mo um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílu-la, comprimido ou cápsula), veículos sólidos não-tóxicos convencionais po-dem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ouestearato de magnésio. Em adição a veículos biologicamente neutros, com-posições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidadespequenas de substâncias auxiliares não-tóxicas, tal como agentes umectan-tes ou emulsificantes, preservantes e agentes de tamponamento de pH esimilar, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato sorbitano.
Polinucleotídeo: Uma seqüência de nucleotídeo linear incluindoseqüências de mais do que 100 bases de nucleotídeo de comprimento.
Polipeptídeo: Qualquer cadeia de aminoácidos, sem importar ocomprimento ou modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação oufosforilação). Um "peptídeo" é uma cadeia de aminoácidos que é menos doque 100 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, um "peptídeo"é uma porção de um polipeptídeo, tal como cerca de 10, 20, 30, 40, 50 ou100 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo que é maior do que 100 ami-noácidos de comprimento.
Porção de uma seqüência de ácido nucléico: Pelo menos 10, 20,30 ou 40 nucleotídeos contíguos da seqüência relevante, tal como uma se-qüência codificando um antígeno. Em alguns casos seria vantajoso usaruma porção consistindo em 50 ou mais nucleotídeos. Por exemplo, quandodescrevendo uma porção de um antígeno (tal como um epítopo antigênico),pode ser vantajoso remover uma porção da seqüência relevante compreen-dendo pelo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 nucleotídeos até um comprimento.
Sondas e iniciadores: Sondas e iniciadores de ácido nucléicopodem ser prontamente preparados com base nos ácidos nucléicos providospela presente invenção. Uma sonda compreende um ácido nucléico isoladoligado a um marcador detectável ou molécula repórter. Marcadores típicosincluem isótopos radioativos, ligantes, agentes quimioluminescentes e enzi-mas. Métodos para marcação e orientação na escolha de marcadores apro-priados para vários propósitos são discutidos, por exemplo, em Sambrook eoutros (1989) e Ausubel e outros (1987).
Iniciadores são ácidos nucléicos curtos, de preferência oligonu-cleotídeos de DNA de 15 nucleotídeos ou mais de comprimento. Iniciadorespodem ser anelados para um filamento de DNA alvo complementar atravésde hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciadoreum filamento de DNA alvo, e então estendido ao longo do filamento de DNAalvo por uma enzima de polimerase de DNA. Pares de iniciador podem serusados para amplificação de uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo,através da reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos deamplificação de ácido nucléico conhecidos na técnica.
Métodos para preparação e uso de sondas e iniciadores sãodescritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed.,vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY, 1989, e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Au-subel e outros, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nova York, 1987(com atualizações periódicas). Pares de iniciador de PCR podem ser deriva-dos de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de com-putador pretendidos para este propósito tal como Iniciador (Versão 0.5, ©1991, Whitehead Insitute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Prevenção ou tratamento de uma doença: "Prevenção" de umadoença refere-se à inibição do desenvolvimento integral de uma doença, porexemplo, em uma pessoa que sabe estar sob risco de infecção com M. tu-berculosis ou M. Ieprae. Um exemplo de uma pessoa com uma predisposi-ção conhecida é alguém vivendo com uma pessoa diagnosticada com tuber-culose, profissionais de cuidado de saúde, ou alguém da família, ou que foiexposta a M. tuberculosis. "Tratamento" refere-se a uma intervenção tera-pêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição pato-lógica, tal como tuberculose, após ela ter começado a se desenvolver.
Promotor: Um promotor é uma disposição de seqüências de con-trole de ácido nucléico que direciona transcrição de um ácido nucléico. Umpromotor inclui seqüências de ácido nucléico necessárias próximo do sítio deinício de transcrição, no caso de um promotor tipo polimerase II, um elemen-to TATA. Um promotor também opcionalmente inclui elementos aumentado-res ou repressores distais que podem estar localizados mais de milhares depares de base do sítio de início de transcrição. O promotor pode ser umpromotor constitutivo ou induzível. Um exemplo não-limitante, específico, deum promotor é o promotor HCMV IE.
Purificado: O termo purificado não requer pureza absoluta; pelocontrário, ele é pretendido ser um termo relativo. Então, por exemplo, umapreparação de antígeno purificada é uma onde o antígeno é mais puro doque a proteína em seu ambiente original dentro de uma célula. Uma prepa-ração de um antígeno é tipicamente purificada de modo que o antígeno re-presenta pelo menos 50% do teor de proteína total da preparação. No entan-to, preparações mais altamente purificadas podem ser requeridas para cer-tas aplicações. Por exemplo, para tais aplicações, preparações onde o antí-geno compreende pelo menos 75% o pelo menos 90% do teor de proteínatotal podem ser empregadas.
Recombinante: Um ácido nucléico ou polipeptídeo recombinanteé um que tem uma seqüência que não é de ocorrência natural ou tem umaseqüência que é feita através de uma combinação artificial de dois ou maissegmentos de seqüência de outro modo separados. Esta combinação artifi-cial é freqüentemente conseguida através de síntese química ou, mais ge-ralmente, através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidosnucléicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética.
Identidade de seqüência: A similaridade entre seqüências de a-minoácido é expressa em termos da similaridade entre as seqüências, deoutro modo referida como identidade de seqüência. Identidade de seqüênciaé freqüentemente medida em termos de identidade percentual (ou similari-dade ou homologia); quanto maior a porcentagem, mais similares são asduas seqüências. Variantes de polipeptídeos de antígeno vão possuir umgrau relativamente alto de identidade de seqüência quando alinhadas usan-do métodos padrão.
Métodos de alinhamento de seqüências para comparação sãobem-conhecidos na técnica. Altschul e outros (1994) apresentam uma consi-deração detalhada de métodos de alinhamento de seqüência e cálculos dehomologia. A NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul eoutros, 1990) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center forBiotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) e na internet, para uso emconexão com os programas de análise de seqüência blastp, blastn, blastx,tblastn e tblastx. Ele pode ser acessado no website da NCBI. Uma descriçãode como determinar identidade de seqüência usando este programa estádisponível no website da NCBI, como estão os parâmetros default.
Variantes de polipeptídeos antigênicos, tal como polipeptídeo deMycobacterium, são tipicamente caracterizadas por possuírem pelo menos50% de identidade de seqüência contada em todo o alinhamento de com-primento completo com a seqüência de aminoácido de uma seqüência deantígeno nativa usando o NCBI Blast 2.0, conjunto gapped blastp para pa-râmetros default. Proteínas com similaridade ainda maior com as seqüênciasde referência vão mostrar identidades de porcentagem altas quando avalia-das através deste método, tal como pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelomenos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelomenos 95% de identidade de seqüência. Quando menos do que a seqüênciainteira está sendo comparado quanto à identidade de seqüência, variantesvão tipicamente possuir pelo menos 75% de identidade de seqüência na ja-nela curta de 10-20 aminoácidos, e podem possuir identidades de seqüênciade pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou 95% dependendo de sua simila-ridade com a seqüência de referência. Métodos para determinação de iden-tidade de seqüência em tais janelas curtas são mostrados no website daNCBI. Variantes de polipeptídeos de domínio do MHC também retêm a ativi-dade biológica do polipeptídeo nativo. Para os propósitos da presente inven-ção, esta atividade é convenientemente avaliada através da incorporação dodomínio variante no polipeptídeo β1α1 ou α1α2 e determinação da habilida-de do polipeptídeo resultante em inibir proliferação de célula T específica deantígeno in vitro, ou induzir células supressoras T ou a expressão de IL-10conforme descrito em detalhes abaixo.
Polipeptídeo terapeuticamente ativo: Um agente, tal como umepítopo de Mtb que causa indução de uma resposta imune, conforme medi-do através de resposta clínica (por exemplo, aumento em uma população decélulas imunes, atividade citolítica aumentada contra Mtb ou redução mensu-rável de um sintoma de uma infecção). Moléculas terapeuticamente ativaspodem ser também feitas de ácidos nucléicos. Exemplos de uma moléculaterapeuticamente ativa baseada em ácido nucléico é uma seqüência de áci-do nucléico que codifica um epítopo de Mtb, onde a seqüência de ácido nu-cléico está operavelmente ligada a um elemento de controle tal como umpromotor.
Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficazde um polipeptídeo de Mtb é uma quantidade usada para gerar uma respos-ta imune. Em vários exemplos, "tratamento" refere-se a uma intervenção te-rapêutica que melhora um sinal ou sintoma de tuberculose.
Dose terapeuticamente eficaz: Uma dose suficiente para preve-nir avanço ou causar regressão da doença ou que é capaz de aliviar sinto-mas causados pela doença. Em uma modalidade, uma dose terapeutica-mente eficaz é uma dose suficiente para prevenir avanço ou aliviar sintomasde tuberculose.
Transduzido e Transformado: Um vírus ou vetor "transduz" umacélula quando ele transfere ácido nucléico para a célula. Uma célula é"transformada" por um ácido nucléico transduzido na célula quando o DNAse torna estavelmente replicada pela célula, ou através da incorporação deácido nucléico no genoma celular, ou através de replicação epissomal. Con-forme aqui usado, o termo transformação compreende todas as técnicas a-través das quais uma molécula de ácido nucléico seria introduzida em talcélula, incluindo transfecção com vetores virais, transformação com vetoresde plasmídeo e introdução de DNA nu através de eletroporação, lipofecção eaceleração de pistola de partícula.
Tuberculose (TB): Uma doença que é geralmente causada porMycobacterium tuberculosis que geralmente infecta os pulmões. No entanto,outras micobactérias "atípicas" tal como K. kansasii podem produzir um apa-recimento clínico e patológico similar de doença.
Transmissão de M. tuberculosis acontece por via oral em áreasfechadas com pouca ventilação. Em mais de 90% dos casos, seguindo in-fecção com M. tuberculosis, o sistema imune previne desenvolvimento dedoença a partir de M. tuberculosis, freqüentemente chamada tuberculoseativa. No entanto, nem todos os M. tuberculosis são mortos, e então cápsu-las duras, minúsculas, são formadas. "Tuberculose primária" é vista doençaque se desenvolve seguindo uma infecção inicial, geralmente em crianças. Ofoco inicial de infecção é um granuloma subpleural pequeno acompanhadopor infecção do nó linfático hilar granulomatoso. Juntos, esses formam ocomplexo Ghon. Em quase todos os casos, esses granulomas se decom-põem e não há nenhum espalhamento adicional da infecção. "Tuberculosesecundária" é vista principalmente em adultos como uma reativação de in-fecção anterior (ou reinfecção), particularmente quando o estado de saúdedeclina. A inflamação granulomatosa é muito mais de coloração vermelho-brilhante e espalhada. Tipicamente, os lóbulos do pulmão superior são maisafetados, e cavitação pode acontecer. Disseminação de tuberculose fora dospulmões pode levar ao aparecimento de várias constatações incomuns compadrões características que incluem tuberculose esqueletal, tuberculose dotrato genital, tuberculose do trato urinário, tuberculose do sistema nervosocentral (SNC), tuberculose gastrintestinal, tuberculose adrenal, escrófula etuberculose cardíaca. Tuberculose "latente" é uma infecção com Mtb em umindivíduo que pode ser detectada através de um ensaio de diagnóstico, talcomo, mas não limitado a, teste de pele de tuberculina (TST) onde a infec-ção não produz sintomas naquele indivíduo. Tuberculose "ativa" é uma in-fecção com Mtb sintomática em um indivíduo.
Microscopicamente, a inflamação produzida com infecção comTB é granulomatosa, com macrófagos epitelióides e células gigantes Lan-ghans junto com linfócitos, células de plasma, talvez algumas células poli-morfonucleares, fibroblastos com colágeno e necrose caseosa característicano centro. A resposta inflamatória é mediada por uma reação de hipersensi-bilidade do tipo IV, e teste de pele é baseado nesta reação. Em alguns e-xemplos, tuberculose pode ser diagnosticada por um teste de pele, um tin-gimento rápido com ácido, um tingimento com auramina ou uma combinaçãodeles. O espécime mais comum avaliado é esputo, mas os tingimentos histo-lógicos podem ser também realizados em tecidos ou outros fluidos do corpo.
TB é uma complicação freqüente da infecção com HIV. Infecçãocom TB em indivíduos infectados com um vírus da imunodeficiência humana(HIV) pode ser espalhar prontamente e progredir rapidamente para doençaativa. Sintomas específicos de doença pulmonar devido à infecção com Mtbincluem tosse crônica e cuspir sangue. Outros sintomas da doença TB inclu-em fadiga, perda de apetite, perda de peso, febre e suores noturnos de en-charcar.
Vetor: Uma molécula de ácido nucléico é introduzida em uma cé-lula hospedeira, deste modo produzindo uma célula hospedeira transforma-da. Um vetor pode incluir seqüências de ácido nucléico que permitem queele replique em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação.Um vetor pode também incluir um ou mais genes marcadores selecionável eoutros elementos genéticos conhecidos na técnica. Vetores incluem vetoresde plasmídeo, incluindo plasmídeos para expressão em célula bacterianagram negativa e gram positiva. Vetores exemplares incluem aqueles paraexpressão em E. coli e Salmonella. Vetores também incluem vetores viraistão como, mas não limitado a, vetores de retrovírus, ortopox, avipox, fowl-pox, capripox, suipox, adenoviral, herpes vírus, alfa vírus, baculovírus, vírusSindbis, vírus vaccínia e poliovírus. Vetores também incluem vetores paraexpressão em células de levedura.
A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicose científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente com-preendido por um versado na técnica à qual a presente descrição pertence.
Os termos no singular "um", "uma" e "o, a" incluem referentes no plural amenos que o contexto claramente indique de outro modo. Similarmente, apalavra "ou" pretende incluir "e" a menos que o contexto claramente indiquede outro modo. Deve ser ainda compreendido que todos os tamanhos debase ou tamanhos de aminoácido, e todos valores de peso molecular oumassa molecular, dados para ácidos nucléicos ou polipeptídeos são aproxi-mados, e são providos para descrição. Embora métodos e materiais simila-res ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática outeste da presente descrição, métodos e materiais adequados são descritosabaixo. O termo "compreende" significa "inclui". Todas as publicações, pedi-dos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incor-porados a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o pre-sente relatório, incluindo explicações de termos, vai prevalecer. Ainda, osmateriais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem serlimitantes.
Polipeptídeos de Mycobacterium
É aqui descrito que vários polipeptídeos de Mycobacterium po-dem ser usados para induzir uma resposta imune a Mtb, tal como uma res-posta de célula T. Os polipeptídeos de Myeobaeterium podem ser usadosem ensaios de diagnóstico para identificar indivíduos infectados com umaMyeobaeterium tal como Mtb. Em várias modalidades, o polipeptídeo com-preende ou consiste na seqüência de aminoácido mostrada como:
1. MX1SRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMX2X3MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILS, (SEQ ID N0:1, onde Xi é A ou T, X2 é T ou A e X3 é qualqueraminoácido, tal como Q ou nenhum aminoácido
Em vários exemplos, o polipeptídeo compreende ou consiste nas3seqüências de aminoácido mostradas como:
a. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILS (SEQ ID NO: 2) (Vide também TUBERCULIST N9 Rv1038c, con-forme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de re-ferência, conhecido como EsxJ, ES6_2, TB11.0, QILSS)
b. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 3, TUBERCULIST N9 Rv1197, conforme dispo-nível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, co-nhecido como EsxK, ES6_3, TB11.0, QILSS)
c. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMT+MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 4, TUBERCULIST N9 Rv1992, conforme disponí-vel em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, co-nhecido como EsxM, TB11.0, QILSS)
d. MATRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 5, TUBERCULIST N9 Rv2347C, conforme dis-ponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência,conhecido como EsxP, ES6_7, QILSS)
e. MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS (SEQ ID NO: 6, TUBERCULIST N9 Rv3620, conforme dispo-nível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, co-nhecido como EsxW, ES6_10, QILSS)
Em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende ou con-siste na seqüência de aminoácido mostrada como:
2. MSYMIATPAALTAAATDIDGIGSAVSVANAAAVAATTGVLAAGGDEVLAAIARLFNANAEEYHALSAQVAAFQTLFVRTLTGGCGVFRRRRGRQCVTAAEHRAAGAGRRQRRRRSGDGQWRLRQQRHFGCGGQPEFRQHSEHRR (SEQ ID NO: 7, TUBERCULIST N9 Rv1088, conforme disponível em 1de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido co-mo PE9).
3. VSLVIATPQLLATAALDLASIGSQVSAANAAAAMPTTEVVAAAADEVSAAIAGLFGAHARQYQALSVQVAAFHEQFVQALTAAAGRYASTEAAVERSLLGAVNAPTEALLGRPLIGNGADGTAPGQPGAAGGLLFGNGGNGAAGGFGQTGGSGGAAGLIGNGGNGGAGGTGAAGGAGGNG GWLWGNGGNGGVGGTSVAAGIGGAGGNGGNAGLFGHGGAGGTGGAGLAGANGVNPTPGPAASTGDSPADVSGIGDQTGGDGGTGGHGTAGTPTGGTGGDGATATAGSGKATGGAGGDGGTAAAGGGGGNGGDGGVAQGDIASAFGGDGGNGSDGVAAGSGGGSGGAGGGAFVHIATATSTGGSGGFGGNGAASAASGADGGAGGAGGNGGAGGLLFGDGGNGGAGGAGGIGGDGATGGPGGSGGNAGIARFDSPDPEAEPDVVGGKGGDGGKGGSGLGVGGAGGTGGAGGNGGAGGLLFGNGGNGGNAGAGGDGGAGVAGGVGGNGGGGGTATFHEDPVAGVWAVGGVGGDGGSGGSSLGVGGVGGAGGVGGKGGASGMLIGNGGNGGSGGVGGAGGVGGAGGDGGNGGSGGNASTFGDENSIGGAGGTGGNGGNGANGGNGGAGGIAGGAGGSGGFLSGAAGVSGADGIGGAGGAGGAGGAGGSGGEAGAGGLTNGPGSPGVSGTEGMAGAPG (SEQ ID NO: 8, TUBERCULIST N5 Rv2487, conforme disponívelem 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conheci-do como PE_PGRS42)
MHQVDPNLTRRKGRLAALAIAAMASASLVTVAVPATANADPEPAPPVPTTAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANTPNAQPGDPNAAPPPADPNAPPPPVIAPNAPQPVRIDNPVGGFSFALPAGWVESDAAHFDYGSALLSKTTGDPPFPGQPPPVANDTRIVLGRLDQKLYASAEATDSKAAARLGSDMGEFYMPYPGTRINQETVSLDANGVSGSASYYEVKFSDPSKPNGQIWTGVIGSPAANAPDAGPPQRWFVVWLGTANNPVDKGAAKALAESIRPLVAPPPAPAPAPAEP APAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA (SEQ ID NO: 9, TU-BERCULIST N5 Rv1860, conforme disponível em 1 de março de 2007,incorporado aqui a título de referência, conhecido como Apa1 modD;mpt32)
MLLALLRQHIRPYRRLVAMLMMLQLVSTLASLYLPTVNAAIVDDGVAKG
DTATIVRLGAVMLGVTGLQVLCAIGAVYLGSRTGAGFGRDLRSAMFEHII
TFSERETARFGAPTLLTRSTNDVRQILFLVQMTATVLVTAPIMCVGGIIMA
IHQEAALTWLLLVSVPILAVANYWIISHMLPLFRRMQSLIDGINRVMRDQL
SGVRVVRAFTREGYERDKFAQANTALSNAALSAGNWQALMLPVTTLTINASSVALIWFGGLRIDSGQMQVGSLIAFLSYFAQILMAVLMATMTLAVLPRASVCAERITEVLSTPAALGNPDNPKFPTDGVTGVVRLAGATFTYPGADCPVLQDISLTARPGTTTAIVGSTGSGKSTLVSLICRLYDVTAGAVLVDGIDVREYHTERLWSAIGLVPQRSYLFSGTVADNLRYGGGPDQVVTEQEMWEALRVAAADGFVQTDGLQTRVAQGGVNFSGGQRQRLAIARAVIRRPAIYVFDDAFSALDVHTDAKVHASLRQVSGDATIIVVTQRISNAAQADQVIVVDNGKIVGTGTHETLLADCPTYAEFAASQSLSATVGGVG (SEQ ID NO: 10,TUBERCULIST N9 Rv1273c, conforme disponível em 1 de março de2007, incorporado aqui a título de referência.
MSYVIAAPEMLATTAADVDGIGSAIRAASASAAGPTTGLLAAAADEVSSA
AAALFS EYA R ECQ E VLKQA AA FH G E FTR ALAAAG AA YAQA EAS NTAAM
SGTAGSSGALGSVGMLSGNPLTALMMGGTGEPILSDRVLAIIDSAYIRPI
FGPNNPVAQYTPEQWWPFIGNLSLDQSIAQGVTLLNNGINAELQNGHD
VVVFGYSQSAAVATNEIRALMALPPGQAPDPSRLAFTLIGNINNPNGGV
LERYVGLYLPFLDMSFNGATPPDSPYQTYMYTGQYDGYAHNPQYPLNI
LSDLNAFMGIRWVHNAYPFTAAEVANAVPLPTSPGYTGNTHYYMFLTQ
DLPLLQPIRAIPFVGTPIAELIQPDLRVLVDLGYGYGYADVPTPASLFAPIN
PIAVASALATGTVQGPQAALVSIGLLPQSALPNTYPYLPSANPGLMFNFG
QSSVTELSVLSGALGSVARLIPPIA (SEQ ID NO: 11, TUBERCULIST Nq
Rv0159c, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui
a título de referência, conhecido como PE3 ou PE).
MEFPVLPPEINSVLMYSGAGSSPLLAAAAAWDGLAEELGSAA VSFGQV
TSGLTAGVWQGAAAAAMAAAAAPYAGWLGSVAAAAEAVAGQARVVV
GVFEAALAATVDPALVAANRARLVALAVSNLLGQNTPAIAAAEAEYELM
WAADVAAMAGYHSGASAAAAALPAFSPPAQALGGGVGAFLTALFASPA
KALSLNAGLGNVGNYNVGLGNVGVFNLGAGNVGGQNLGFGNAGGTNV
GFGNLGNGNVGFGNSGLGAGLAGLGNIGLGNAGSSNYGFANLGVGNI
GFGNTGTNNVGVGLTGNHLTGIGGLNSGTGNIGLFNSGTGNVGFFNSG
TGNFGVFNSGNYNTGVGNAGTASTGLFNAGNFNTGVVNVGSYNTGSF
NAGDTNTGGFNPGGVNTGWLNTGNTNTGIANSGNVNTGAFISGNFNN
GVLWVGDYQGLFGVSAGSSIPAIPIGLVLNGDIGPITIQPIPILPTIPLSIHQ
TVNLGPLVVPDIVIPAFGGGIGIPINIGPLTITPITLFAQQTFVNQLPFPTFSLGKITIPQIQTFDSNGQLVSFIGPIVIDTTIPGPTNPQIDLTIRWDTPPITLFPNGISAPDNPLGLLVSVSISNPGFTIPGFSVPAQPLPLSIDIEGQIDGFSTPPITIDRIPLTVGGGVTIGPITIQGLHIPAAPGVGNTTTAPSSGFFNSGAGGVSGFGNVGAGSSGWWNQAPSALLGAGSGVGNVGTLGSGVLNLGSGISGFYNTSVLPFGTPAAVSGIGNLGQQLSGVSAAGTTLRSMLAGNLGLANVGNFNTGFGNVGDVNLGAANIGGHNLGLGNVGDGNLGLGNIGHGNLGFANLGLTAGAAGVGNVGFGNAGiNNYGLANMGVGNIGFANTGTGNIGiGLVGDHRTGIGGLNSGIGNIGLFNSGTGNVGFFNSGTGNFGIGNSGRFNTGIGNSGTASTGLFNAGSFSTGIANTGDYNTGSFNAGDTNTGGFNPGGINTGWFNTGHANTGLANAGTFGTGAFMTGDYSNGLLWRGGYEGLVGVRVGPTISQFPVTVHAIGGVGPLHVAPVPVPAVHVEITDATVGLGPFTVPPISIPSLPIASITGSVDLAANTISPIRALDPLAGSIGLFLEPFRLSDPFITIDAFQVVAGVLFLENIIVPGLTVSGQILVTPTPIPLTLNLDTTPWTLFPNGFTIPAQTPVTVGMEVANDGFTFFPGGLTFPRASAGVTGLSVGLDAFTLLPDGFTLDTVPATFDGTILIGDIPIPIIDVPAVPGFGNTTTAPSSGFFNTGGGGGSGFANVGAGTSGWWNQGHDVLAGAGSGVANAGTLSSGVLNVGSGISGWYNTSTLGAGTPAVVSGIGNLGQQLSGFLANGTVLNRSPIVNIGWADVGAFNTGLGNVGDLNWGAANIGAQNLGLGNLGSGNVGFGNIGAGNVGFANSGPA VGLAGLGNVGLSNAGSNNWGLANLGVGNIGLANTGTGNIGIGLVGDYQTGIGGLNSGSGNIGLFNSGTGNVGFFNTGTGNFGLFNSGSFNTGIGNSGTGSTGLFNAGNFNTGIANPGSYNTGSFNVGDTNTGGFNPGDINTGWFNTGIMNTGTRNTGALMSGTDSNGMLWRGDHEGLFGLSYGITIPQFPIRITTTGGIGPIVIPDTTILPPLHLQITGDADYSFTVPDIPIPAIHIGINGVVTVGFTAPEATLLSALKNNGSFISFGPITLSNIDIPPMDFTLGLPVLGPITGQLGPIHLEPIVVAGIGVPLEIEPIPLDAISLSESIPIRIPVDIPASVIDGISMSEVVPIDASVDIPAVTITGTTISAIPLGFDIRTSAGPLNIPIIDIPAAPGFGNSTQMPSSGFFNTGAGGGSGIGNLGAGVSGLLNQAGAGSLVGTLSGLGNAGTLASGVLNSGTAISGLFNVSTLDATTPAVISGFSNLGDHMSGVSIDGLIAILTFPPAESVFDQIIDAAIAELQHLDIGNALALGNVGGVNLGLANVGEFNLG AG N VG NIN VG AG N LG G S N LG LG N VGTG N LG FG NIG AG N FG FG N AGLTAGAGGLGNVGLGNAGSGSWGLANVGVGNIGLANTGTGNIGIGLTGDYRTGIGGLNSGTGNLGLFNSGTGNIGFFNTGTGNFGLFNSGSYSTGVGNAGTASTGLFNAGNFNTGLANAGSYNTGSLNVGSFNTGGVNPGTVNTGWFNTGHTNTGLFNTGNVNTGAFNSGSFNNGALWTGDYHGLVGFSFSIDIAGSTLLDLNETLNLGPIHIEQIDIPGMSLFDVHEIVEIGPFTIPQVDVPAIPLEIHESIHMDPIVLVPATTIPAQTRTIPLDIPASPGSTMTLPLISMRFEGEDWILGSTAAIPNFGDPFPAPTQGITIHTGPGPGTTGELKISIPGFEIPQIATTRFLLDVNISGGLPAFTLFAGGLTIPTNAIPLTIDASGALDPITIFPGGYTIDPLPLHLALNLTVPDSSIPIIDVPPTPGFGNTTATPSSGFFNSGAGGVSGFGNVGSNLSGWWNQAASALAGSGSGVLNVGTLGSGVLNVGSGVSGIYNTSVLPLGTPAVLSGLGNVGHQLSGVSAAGTALNQIPILNIGLADVGNFNVGFGNVGDVNLGAANLGAQNLGLGNVGTGNLGFANVGHGNIGFGNSGLTAGAAGLGNTGFGNAGSANYGFANQGVRNIGLANTGTGNIGIGLVGDNLTGIGGLNSGAGNIGLFNSGTGNIGFFNSGTGNFGIGNSGSFNTGIGNSGTGSTGLFNAGSFNTGVANAGSYNTGSFNAGDTNTGGFNPGTINTGWFNTGHTNTGIANSGNVGTGAFMSGNFSNGLLWRGDHEGLFSLFYSLDVPRITIVDAHLDGGFGPVVLPPIPVPAVNAHLTGNVAMGAFTIPQIDIPALTPNITGSAAFRIVVGSVRIPPVSVIVEQIINASVGAEMRIDPFEMWTQGTNGLGITFYSFGSADGSPYATGPLVFGAGTSDGSHLTISASSGAFTTPQLETGPITLGFQVPGSVNAITLFPGGLTFPATSLLNLDVTAGAGGVDIPAITWPEIAASADGSVYVLASSIPLINIPPTPGIGNSTITPSSGFFNAGAGGGSGFGNFGAGTSGWWNQAHTALAGAGSGFANVGTLHSGVLNLGSGVSGIYNTSTLGVGTPALVSGLGNVGHQLSGLLSGGSAVNPVTVLNIGLANVGSHNAGFGNVGEVNLGAANLGAHNLGFGNIGAGNLGFGNIGHGNVGVGNSGLTAG V PG LG N VG LG N AGG N N WG LAN VG VG NIG LANTGTG NIGIG LTG DYQTGIGGLNSGAGNLGLFNSGAGNVGFFNTGTGNFGLFNSGSFNTGVGNSGTGSTGLFNAGSFNTGVANAGSYNTGSFNVGDTNTGGFNPGSINTGWLNAG N ANTG VAN AG N VNTG A FVTG N FS N GILW RG DYQG LAG FAVGYTLPLFPAVGADVSGGIGPITVLPPIHIPPIPVGFAAVGGIGPIAIPDISVPSIHLGLDPAVHVGSITVNPITVRTPPVLVSYSQGAVTSTSGPTSEIWVKPSFFPGIRIAPSSGGGATSTQGAYFVGPISIPSGTVTFPGFTIPLDPIDIGLPVSLTIPG FTIPGGTLIPTLPLGLALSNGIPPVDIPAIVLDRILLDLHADTTIGPINVPIAGFGGAPGFGNSTTLPSSGFFNTGAGGGSGFSNTGAGMSGLLNAMSDPLLGSASGFANFGTQLSGILNRGAGISGVYNTGALGVVTAAVVSGFGNVGQQLSGLLFTGVGP (SEQ ID NO: 12, TUBERCULIST N9 3350c,conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título dereferência, também conhecido como PPE56 ou PPE.
Em uma segunda modalidade, o polipeptídeo de Mtb de uso nosmétodos descritos aqui tem uma seqüência pelo menos 75%, 85%, 90%,95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga à seqüência de aminoácido mos-trada em uma das SEQ ID NOs: 1-12. Por exemplo, o polipeptídeo pode teruma seqüência de aminoácido pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%ou 99% homóloga a uma das seqüências de aminoácido mostradas nasSEQ ID NOs: 1-12. Seqüências exemplares podem ser obtidas usando pro-gramas de computador que estão prontamente disponíveis na internet e asseqüências de aminoácido mostradas aqui. Em um exemplo, o polipeptídeoretém uma função da proteína de Mtb, tal como ligação a um anticorpo queespecificamente liga o epítopo de Mtb.
Modificações pequenas de uma seqüência de aminoácido primá-ria de polipeptídeo de Mtb podem resultar em peptídeos que têm atividadesubstancialmente equivalente comparado com o polipeptídeo contrapartenão-modificado descrito aqui. Tais modificações podem ser deliberadas, co-mo através de mutagênese direcionada a sítio, ou podem ser espontâneas.Todos os polipeptídeos produzidos por essas modificações estão incluídosaqui. Então, um exemplo não-limitante, específico, de um polipeptídeo deMtb é uma variante conservativa do polipeptídeo de Mtb. Uma tabela desubstituições conservativas é provida aqui. Substituições da seqüência deaminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-12 podem ser feitas com basenesta tabela.
Polipeptídeos de Mtb são descritos aqui que podem ser usadospara detectar uma resposta imune a Mtb. Esses peptídeos incluem ou con-sistem em pelo menos nove aminoácidos, tal como nove a vinte aminoáci-dos, aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb mostrado acima.Exemplos não-limitantes, específicos, são doze, onze, dez aminoácidos, ounove aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb mostrado acima.Nesses exemplos, o polipeptídeo de Mtb não inclui as seqüências de amino-ácido de comprimento completo mostradas como SEQ ID NOs: 1-12.
Um polipeptídeo isolado é descrito que inclui nove a doze ami-noácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, onde o polipeptídeo iso-lado compreende a seqüência de aminoácido mostrada como QTVEDEAR-RMW (SEQ ID NO:13). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é de nove,dez ou onze aminoácidos de comprimento. Em modalidades adicionais, opolipeptídeo consiste na seqüência de aminoácido mostrada como SEQ IDNO: 13. Um polipeptídeo isolado é descrito que inclui nove a doze aminoáci-dos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, onde o polipeptídeo isoladocompreende a seqüência de aminoácido mostrada como VSAAIAGLF (SEQ- ID NO: 14). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é de nove, dez ou on-ze aminoácidos de comprimento. Em modalidades adicionais, o polipeptídeoconsiste na seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NO: 14.
Em várias modalidades, o polipeptídeo de Mtb isolado é incluídoem uma proteína de fusão. Então, a proteína de fusão pode incluir o polipep-tídeo de Mtb (vide acima) e uma segunda porção heteróloga, tal como umaproteína myc, uma enzima ou um veículo (tal como uma proteína carreadorada hepatite ou albumina de soro bovino) covalentemente ligado ao polipeptí-deo de Mtb. Em vários exemplos, um polipeptídeo consistindo em nove adoze aminoácidos de uma das seqüências de aminoácido mostradas comoSEQ ID NOs: 1-14 que liga MHC classe I é covalentemente ligado a um veí-culo. Em exemplo adicional, um polipeptídeo consistindo em uma das se-qüências de aminoácido mostradas como uma das SEQ ID NOs: 1-14 é co-valentemente ligado a um veículo.
Em exemplos adicionais, o polipeptídeo pode ser uma proteínade fusão e pode também incluir seqüências heterólogas a Mtb (tal como se-qüências de aminoácido de pelo menos nove aminoácidos de comprimentoque não estão incluídas na SEQ ID NO:1). Então, em vários exemplos não-limitantes específicos, o peptídeo imunogênico é um polipeptídeo de fusão,por exemplo, o polipeptídeo inclui seis resíduos de histidina seqüenciais,uma seqüência de aminoácido de β-galactosidase ou uma seqüência de a-minoácido de imunoglobulina. O polipeptídeo pode também ser covalente-mente ligado a um veículo. Em modalidades adicionais, a proteína consisteno polipeptídeo de Mtb.
O polipeptídeo pode opcionalmente incluir repetições de um oumais dos polipeptídeos de Mtb descritos aqui. Em um exemplo não-limitante,específico, o polipeptídeo inclui duas, três, quatro, cinco ou até dez repeti-ções de um dos polipeptídeos de Mtb descritos acima. Alternativamente,mais de um polipeptídeo pode ser incluído em um polipeptídeo de fusão.Então, em vários exemplos, o polipeptídeo pode incluir pelo menos dois, pe-lo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis dasseqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NOs: 1-14. Uma se-qüência Iigante pode ser opcionalmente incluída entre os polipeptídeos deMtb.
Os polipeptídeos de Mtb descritos aqui podem ser quimicamentesintetizados através de métodos padrão ou podem ser produzidos recombi-nantemente. Um processo exemplar para produção de polipeptídeo é descri-to em Lu e outros, Federation of European Biochemical Societies Letters.429:31-35, 1998. Eles podem ser também isolados através de métodos in-cluindo cromatografia preparativa e separações imunológicas.
Se desejado, polipeptídeos podem ser também quimicamentesintetizados através de tecnologias emergentes. Um tal processo é descritoem W. Lu e outros, Federation of European Biochemieal Soeieties Letters.429:31-35, 1998. Polipeptídeos podem ser também produzidos usando téc-nicas genéticas moleculares, tal como através de inserção de um ácido nu-cléico codificando Mtb ou um epítopo dele em um vetor de expressão, intro-dução do vetor de expressão em uma célula hospedeira e isolamento dopolipeptídeo (vide abaixo).
Polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de Mtb descritosaqui são também providos. Seqüências de ácido nucléico exemplares sãomostradas abaixo:
ESXJ (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 2)
atggcctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgaggtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatctcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatgaatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgcgacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga(SEQ ID NO: 15)
ESXK (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 3)
atggcctcacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgaggtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatttccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatgaatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgcgacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa(SEQ ID NO: 16)
ESXM (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 ESXM)
atggcctcacgttttatgacggatccgcatgcgatgcgggacatggcgggccgttttgaggtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatttccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacctagatgaatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgcgacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctgagcagctag(SEQ ID NO: 17)
ESXP (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 7)atggcaacacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgaggtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatctcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatgaatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgcgacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa(SEQ ID NO: 18)
ESXW (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 10)
atgacctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgaggtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatttccggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatgaatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgcgacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga(SEQ ID NO: 19)ΡΕ9 (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE)
atgtcatacatgattgccacaccagcggcgttgacggcggcggcaacggatatcgacgggattggctcggcggttagcgttgcgaacgccgcggcggtcgccgcgacaaccggagtgctggccgccggtggcgatgaagtgttggcggccatcgctaggctgttcaacgcaaacgccgaggaatatcacgccctcagcgcgcaggtggcggcgtttcaaaccctgtttgtgcgcaccttgactggggggtgcggagtctttcgccggcgccgaggccgccaatgcgtcacagctgcagagcatcgcgcggcaggtgcggggcgccgtcaacgccgtcgccggtcaggtgacgggcaatggcggctccggcaacagcggcacttcggctgcggcggccaacccgaattccgacaacacagcGagcatcgccgatag(SEQ ID NO: 20)- PE_PGRS42 (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE-PGRS)
gtgtcgttggtgatcgcgacgccgcagctgctggcaactgcggctttggatttagcgagtattggttcgcaggtgagcgcggctaatgcggccgcggcgatgccgacgacggaagtggtggctgcggctgccgatgaagtgtcggcggcgattgcggggttgttcggggcccatgctcggcagtatcaggcgctcagcgtacaggtggcagcgtttcacgagcagtttgtgcaggcgttgactgcggccgcgggtcggtatgccagcactgaggccgctgttgagcggagtctgctgggtgcggtgaatgcgcccaccgaggcgcttttggggcgcccgttgatcggaaacggcgccgacgggacggcacccgggcagcctggcgcggccggcgggttgctgtttggcaacggtggcaacggcgcggctggcgggttcggtcaaaccggcggcagcggaggcgcggccgggttgatcggcaacggcggcaacggcggggccggtggtaccggcgcggecggcggtgccggtgggaacggggggtggttgtggggcaacggcggcaacggcggtgtcggcggcaccagcgtggccgcaggcatcgggggtgcgggcggtaacggcggcaacgccgggctgttcggccatggcggcgccggtggtaccggcggcgccggcctcgccggggcaaacggggtcaatcccacgcccggccccgcggccagcaccggggacagcccggcagatgtgtccggcatcggtgatcaaaccggcggcgacggcggcacgggcggccatggcactgccggcacgccgaccggtggcaccggcggcgacggtgccaccgcgacggcaggctcgggcaaggccaccggcggtgccggtggtgacggcggtaccgccgctgccggtggcggcggcggcaacggcggcgacggcggagtcgcgcagggcgacattgcgagcgcctttggcggtgatggtggcaacgggtccgacggtgtagccgccggcagtgggggtggtagcggcggcgccggaggcggcgctttcgtacacatcgccactgccacctctaccggtggtagcggcggtttcggtggtaacggggctgccagtgccgcctccggcgccgacggtggcgcagggggagctggcggcaatggtggcgccggcgggttgctattcggtgatggcggcaacggtggcgccggtggcgcgggtggtatcggtggtgacggcgccacgggggggcccgggggaagcggcggcaacgctggcatcgcgaggtttgacagcccagaccccgaggcagaacccgatgtggtcggcggcaagggtggtgatggcggcaagggcggcagcggccttggcgtcggcggcgccggcgggaccggcggcgcgggcggcaacggcggcgccggcgggttgttgttcggcaacggcggcaacggcggcaacgccggggccggcggggatggcggcgccggcgttgccggtggggttggcggtaacggcggcggtggtggcaccgcgacgtttcacgaagacccggtcgctggtgtctgggcggtcggtggcgtaggtggtgatggtggctccggcggcagctcgcttggtgtcggcggggtgggcggagccggtggcgtgggtggcaagggtggcgccagcggcatgttgatcggcaacggcggcaacggtggcagcggcggagtcggtggggccggtggagtcggcggggctggcggtgacggcggcaacggcggctccggtggcaacgccagtacttttggcgatgagaactccatcggcggggccggcgggacgggcggcaacgggggcaacggcgcaaacggcggtaacggtggcgctggcggtattgccggcggtgcgggtgggtccggagggttcctcagcggtgccgcaggagtcagcggcgctgacggtatcggtggcgcgggcggcgcaggcggtgccggtggcgcgggcggtagcggcggtgaggcaggcgcggggggcctcaccaacggccccgggtcccctggcgtttccggcaccgaaggcatggccggcgcgcccggctag(SEQ ID NO: 21)
Rv1860 (PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE FIBRONECTINAatgcatcaggtggaccccaacttgacacgtcgcaagggacgattggcggcactggctatcgcggcgatggccagcgccagcctggtgaccgttgcggtgcccgcgaccgccaacgccgatccggagccagcgcccccggtacccacaacggccgcctcgccgccgtcgaccgctgcagcgccacccgcaccggcgacacctgttgcccccccaccaccggccgccgccaacacgccgaatgcccagccgggcgatcccaacgcagcacctccgccggccgacccgaacgcaccgccgccacctgtcattgccccaaacgcaccccaacctgtccggatcgacaacccggttggaggattcagcttcgcgctgcctgctggctgggtggagtctgacgccgcccacttcgactacggttcagcactcctcagcaaaaccaccggggacccgccatttcccggacagccgccgccggtggccaatgacacccgtatcgtgctcggccggctagaccaaaagctttacgccagcgccgaagccaccgactccaaggccgcggcccggttgggctcggacatgggtgagttctatatgccctacccgggcacccggatcaaccaggaaaccgtctcgctcgacgccaacggggtgtctggaagcgcgtcgtattacgaagtcaagttcagcgatccgagtaagccgaacggccagatctggacgggcgtaatcggctcgcccgcggcgaacgcaccggacgccgggccccctcagcgctggtttgtggtatggctcgggaccgccaacaacccggtggacaagggcgcggccaaggcgctggccgaatcgatccggcctttggtcgccccgccgccggcgccggcaccggctcctgcagagcccgctccggcgccggcgccggccggggaagtcgctcctaccccgacgacaccgacaccgcagcggaccttaccggcctga(SEQ ID NO: 22)
Rv1273c (TRANSPORTADOR ABC DE PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ATPDE TRANSMEMBRANA DE TRANSPORTE DE FÁRMACOS PROVÁVEL)atgctcctggccctgctgcgccagcacatccgaccgtaccgccggctggtcgcgatgctgatgatgctgcagctggtcagcaccctggcttcgctatacctcccgacggtcaacgccgcaatcgtcgacgacggcgtcgccaagggcgacaccgccaccatcgtacggctgggtgcggtgatgcttggggtgaccggattgcaggtgctgtgcgcgatcggggcggtctatctgggctcccggaccggggcgggtttcggccgtgacctgcgctcggcaatgttcgaacacatcatcaccttctcggaacgcgagaccgcccgattcggcgctccgacgttgttgacccgcagcaccaacgacgtccggcagatcctgttcctggtccagatgaccgccaccgtgctggtcaccgcaccgatcatgtgcgtcggcggaatcatcatggccatccaccaggaggccgcgctgacatggctgctgctggtcagcgttccgattctggccgtagcaaactactggatcatctcccacatgctgccgctcttccgccgcatgcagagcctgatcgacggcatcaaccgggtgatgcgcgatcagctgtccggggtgcgagtggtccgcgccttcacccgcgaaggctatgaacgcgacaagttcgcgcaggccaatacggcgctgtcgaatgccgcactgagcgccggcaactggcaagcactgatgctgccggtgaccacgctgaccatcaacgcatccagcgtcgcactgatctggttcggtgggctacgcatcgacagcggccagatgcaggtcggctccctgatcgccttcctgtcctacttcgcccagatcctgatggcggtgttgatggcgaccatgacgctggccgtgctgccacgagcgtcggtctgcgccgaacgcatcaccgaggtgctttccacgcccgccgcactcggtaaccccgacaatcccaagttcccgacggacggggtcacgggcgtagtgcgcttggctggcgcaacctttacctatcctggcgccgactgcccggtgctgcaggacatttcgttgactgcgcggcccggtaccaccaccgcgatcgtcggcagtaccggttcgggcaagtcgacactggtgtcgttgatctgccggctctacgacgtcaccgctggcgcggtcttggttgacggtatcgacgtccgcgagtaccacaccgagcggctctggtcagcgatcgggctggtgccccagcgcagctacctcttctccggaaccgtcgcggacaacctgcgctacggcgggggcccagaccaggtagtcaccgagcaggagatgtgggaggcgctgcgggtcgccgcggccgacggctttgtacaaacagacgggctgcagacgcgtgtcgcccaaggtggtgtcaacttctccggcgggcagcgccaacggctggcgatagcccgagcggtcatccgacgtccggccatctatgtgttcgacgacgcgttctccgcacttgacgtgcacaccgacgccaaagtccacgcatcgctgcgacaggtatctggtgatgcaaccatcattgttgttacacaacggatttcgaatgccgctcaggccgaccaggtcatcgttgtcgataacggtaagatcgtcggcacgggcacccacgaaacgctgctggccgattgccccacctatgccgaattcgccgcctcacaatcgctgagcgccacggtcgggggt
gtagggtga
(SEQ ID NO: 23)
Rv0159C (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE)atgtcctacgtcatcgcggccccggagatgttggcaacgacggccgcggacgtggacgggatcggttcggcgatacgagcggccagcgcgtccgctgcgggtccaacgaccggactgctggccgcggccgccgatgaggtgtcgtcggccgctgcagcgctgttcagcgaatacgcgcgcgaatgtcaagaggtcctaaagcaggctgcggcgttccatggcgagttcacccgggcgctggctgccgccggggccgcctatgcccaggctgaagccagcaacaccgctgctatgtcgggcaccgccgggtccagcggcgccctcggttctgtcgggatgctgtcaggcaacccgctaaccgcgttgatgatgggcggcaccggggaaccgatccttagtgaccgcgtcttggcgatcattgacagcgcatacattcggcccattttcgggcccaacaacccggtcgcccagtacacgcccgagcagtggtggccgtttatcgggaacctgtcactggaccaatccatcgcccagggtgtcacgctgctgaacaacggcatcaacgcggaactacaaaatgggcatgacgtcgtcgttttcggctactcgcaaagcgccgcggtagcgaccaatgaaatacgcgctcttatggcgttaccaccgggccaagccccagatccaagccggctggctttcacgttgatcggtaatatcaataaccccaacggcggcgtcctcgagcgttacgtgggcctttacctcccgttcttggatatgtcgttcaacggtgcgactccaccggattccccctaccagacctacatgtacaccggccaatacgacggctacgcccacaacccgcagtacccgctcaatatcttgtcggacctcaacgccttcatgggcatcagatgggtgcacaacgcgtaccccttcaccgcggccgaggttgccaatgccgtgccgttgcccacgtctccgggctacaccggcaacacccattactacatgtttctgacccaggacctgccgctgttgcagccgattcgcgccatccccttcgtagggaccccaatagccgagctgattcagcccgacctacgggtgctagtcgacttgggctatggctacggctacgccgacgtacccaccccggccagcctgttcgcgccaatcaacccgatcgccgtggcctcggccctggcgaccgggaccgtgcaaggcccccaagccgccctagtaagcatcggattgttaccgcagtccgcgctacccaatacgtatccgtatcttccgtcggcgaatccgggcctgatgttcaacttcggtcaatccagtgtgacggagttgtcggtgctcagtggcgccctcgggtccgtagcgagattgattccaccgatcgcgtga
(SEQ ID NO: 24)Rv3350C (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PPE)
atggagtttccggtgttgccaccggaaatcaactccgtgctgatgtattcgggtgcggggtcgagcccgttgctggcggcggccgcggcgtgggatgggctggctgaggagttggggtcggcggcggtgtcgtttgggcaggtgacgtcgggcctgacggcgggggtgtggcagggtgcggcggcggcggcgatggcggccgcggcggcgccgtatgcggggtggttgggttcggtggcggccgcggccgaggcggtggccgggcaggcgcgggtggtggtgggggtctttgaggcggcgttggcggcgacggtggatccggcgctggtggcggccaaccgggcgcggctggtggcgttggcggtgtcgaatctgttggggcagaacacgccggcgatcgcggccgccgaggccgagtacgagctgatgtgggccgccgatgtggcggcgatggccggctaccattccggcgcgtcggctgctgccgcggcgttgccggcgttcagcccaccggcgcaggcgctggggggaggtgtcggcgcgttccttaccgccctgttcgccagccctgcgaaggcgctgagcctgaatgcgggtttgggcaatgtcggcaattacaacgtcgggttgggcaatgtcggggtgttcaacctgggcgcgggcaatgtgggtgggcagaatctgggtttcgggaatgccggtggcaccaatgtcgggttcggcaacctcggtaacgggaatgtcgggttcggcaactccggtctgggggcgggcctggccggcttgggcaatatcgggttgggcaatgcgggcagcagcaactatggtttcgcaaacctgggtgtgggcaacatcggtttcggcaacaccggcaccaacaacgtcggcgtcgggctcaccggcaaccacctgacgggtatcgggggcctgaattcgggcaccgggaatatcgggttgttcaactccggcaccgggaatgtggggttcttcaattcggggaccgggaacttcggggtgttcaactcgggtaattacaacaccggtgtcggtaatgcggggacggccagcacggggttgttcaatgccggcaatttcaacaccggcgtggtgaacgtgggcagttacaacaccggcagtttcaacgccggcgacaccaacaccggtggcttcaaccccggcggtgtgaacaccggctggctgaacaccggcaacaccaacaccggcatcgccaactcgggcaacgtcaacaccggcgcgttcatctcgggcaacttcaacaacggcgtgctgtgggtgggtgactaccagggcctgttcggcgtctccgccggctcgtcgatccccgcaattcccatcggcctggtgctcaacggcgacatcggcccgatcaccatccagcccatcccgatcctgcccaccatcccgctcagcattcaccaaaccgtcaacttgggcccgctggtggttcccgacatcgtgatccccgccttcggcggcggtatcggcatacccatcaacatcggcccgctgaccatcacacccatcaccctgtttgcccaacagacatttgtcaaccaattgccctttcccaccttcagtttagggaaaatcacaattccacaaatccaaacctttgattctaacggtcagcttgtcagctttatcggccctatcgttatcgacaccaccattcccggacccaccaatccacagattgatttaacgatcagatgggatacccctccgatcacgctgttcccgaatggcatcagtgctcccgataatcctttggggttgctggtgagtgtgtcgatcagtaacccgggctttaccatcccgggatttagtgttcccgcgcagccgttgccgttgtcgatcgatatcgagggccagatcgacgggttcagcaccccgccgatcacgatcgatcgcatccccctgaccgtggggggcggggtcacgatcggccccatcacgatccagggccttcatatcccggcggcgccgggagtggggaacaccaccacggccccgtcgtcgggattcttcaactccggtgcgggtggggtgtcgggtttcggcaacgtcggcgcgggcagctcgggctggtggaaccaggcgccgagcgcgctgttgggggccggttcgggtgttggcaacgtgggcaccctgggctcgggtgtgctcaacctgggctcagggatctcggggttctacaacaccagcgtgttgcctttcgggacaccggcggcggtgtcgggcatcggcaacctgggccagcagctgtcgggggtgtcggcggcgggaaccacgctgcgctcgatgctcgccggcaacctcgggttggccaatgtgggcaacttcaacaccgggttcggaaatgtcggggacgtcaacctgggtgcggccaacatcggtgggcacaacctgggcctgggcaatgtcggggacggcaacctggggttgggcaacatcggccatggcaacctggggtttgccaacttgggcctgaccgccggcgcggcgggggtgggcaatgttggttttggcaatgccggcatcaacaactatggcttggcgaacatgggtgtgggcaatattgggtttgccaacaccggcacgggcaacatcgggatcgggctggtcggggaccatcggaccgggatcgggggcttgaactccggcatcggcaatatcgggttgttcaactccggcaccggcaacgtcgggttcttcaattccgggaccggcaacttcggcatcgggaactccggccgcttcaacaccgggatcggtaatagcggaacggccagcaccgggctcttcaatgccggcagcttcagcaccggcatcgccaacactggtgactacaacacgggcagcttcaacgccggcgacaccaacaccggtggcttcaacccgggcggcatcaacaccggctggttcaacaccgggcatgccaacaccgggttggccaacgcgggcaccttcggcaccggcgccttcatgacgggcgactacagcaacggcctgttgtggcggggcggctacgagggcctggtcggcgtccgcgtcgggcccacgatctcccaattcccggtcaccgtgcacgcgatcggcggggtgggcccgctgcatgtggcgcccgtcccggtacccgccgtgcacgtcgagatcaccgacgccaccgtcggcctgggtccgttcaccgtcccaccgatcagcattccctcacttcccatcgccagcatcaccggaagcgtggacctggccgcaaacaccatctcgccgattcgcgctcttgacccgctcgccggttcgatagggctttttctcgagccgttccgcctcagtgacccatttatcaccattgatgcgttccaagttgttgccggtgtcttgttcctagagaacatcattgtgcccggcctcacggttagcggtcagatattggtcaccccgacaccaattcccctaaccctcaacttggacaccaccccgtggacgcttttcccgaatggtttcaccattcccgcgcaaacccccgtgacggtgggtatggaggtcgccaacgacgggttcaccttcttcccgggtgggctgacctttccgcgggcctccgccggggtcaccggactgtccgtggggctggacgcgttcacgctgttgcccgacgggttcaccctcgacaccgtgccggcgaccttcgacggcaccatcctcatcggcgatatcccgatcccgatcatcgatgtgccggcggtgccggggttcggcaacaccaccacggccccatcgtcggggttcttcaacaccggcggcggcggtggatcggggttcgccaacgtcggcgcgggcacgtcgggctggtggaaccaggggcacgacgtgttagcaggggcgggctcgggagttgccaatgccggcacgctgagctcgggcgtgctgaacgtcggctcggggatctccgggtggtacaacaccagcaccctgggagcgggcaccccggcggtggtctcgggcatcggcaacctcggccagcagctgtcggggttcttggcaaatgggaccgtgctcaaccggagccccattgtcaatatcgggtgggccgatgtgggcgcgttcaacaccgggttgggcaatgtgggggacctcaactggggtgcggccaacatcggcgcgcagaacctgggcctgggcaatctcggcagcgggaacgtcgggttcggcaacatcggtgccggcaacgtcgggttcgccaactcgggtccggcggtgggcctggccggcctgggcaacgtggggttgagcaatgccggcagcaacaactgggggctggccaacctgggtgtgggcaacatcgggttggccaacaccggcacgggcaacatcgggatcgggctggtcggcgactaccagaccggcatcggcggcctcaactcgggtagtggcaatatcggattgttcaattccggcaccggcaatgtcgggttcttcaacaccggcaccggcaacttcggactgttcaactccggtagtttcaacaccggcatcggtaatagcggaaccggcagtactgggctcttcaatgccggcaatttcaacaccggcatcgccaaccccgggtcgtacaacacgggcagcttcaatgtcggtgataccaacaccggtggtttcaacccgggcgacatcaacaccggctggttcaacaccggcattatgaatacgggcacccgcaacaccggcgccctcatgtcggggaccgacagcaacggcatgctgtggcgcggcgaccacgagggcctgttcggcctgtcctatggcatcacgatcccgcaattcccgatccgcatcaccacgactggcggtatcggccccatcgtcatcccggacaccacgatccttccgccgctgcacctgcagatcaccggcgacgcggactacagcttcaccgtgcccgacatccccatccccgccatccacatcggcatcaatggcgtcgtcaccgtcggcttcaccgccccggaagccaccctgctgtccgccctgaagaataacggtagcttcatcagcttcggccccatcacgctctcgaatatcgatattccgcccatggatttcacgttaggcctgcccgttcttggtcctatcacgggccaactcggaccaattcatcttgagccaatcgtggtggccgggatcggtgtgcccctggagatcgagcccatccccctggatgcgatttcgttgagtgagtcgattcctatccgcatacctgttgatattccggcctcggtcatcgatgggatttcaatgtcggaagtggtgccgatcgatgcgtccgtggacatcccggcggtcacgatcacaggcaccaccatttccgcgatcccgctgggcttcgacattcgcaccagtgccggacccctcaacatcccgatcatcgacatcccggcggcgccgggcttcgggaactcgacccagatgccgtcgtcggggttcttcaacaccggtgccggcggcggatcgggcatcggcaacttgggtgcgggcgtgtcgggcctgctcaaccaggccggcgcggggtcactggtggggacactctcggggctgggcaatgccggcaccctggcctcgggtgtgctgaactccggcaccgccatctccgggctgttcaacgtgagcacgctggacgccaccaccccggcggtgatctcggggttcagcaacctcggcgaccatatgtcgggggtgtccatcgatggcctgatcgcgatcctcaccttcccacctgccgagtccgtgttcgatcagatcatcgacgcggccatcgccgagctgcagcacctcgacatcggcaacgctttggccttgggcaatgtcggcggggtgaacctcggtttggctaacgtcggtgagttcaacctgggtgcgggcaacgtcggcaacatcaacgtcggcgccggcaacctcggcggcagcaacttggggttgggcaacgtcgggaccggcaacctcgggttcggcaacatcggtgccggcaatttcggattcggcaacgcgggcctgaccgcgggcgcggggggcctgggcaatgtggggttgggtaacgccggcagcggcagctgggggttggccaacgtgggtgtgggcaatatcgggttggccaacaccggcaccggcaacatcgggatcgggctgaccggggactatcggaccgggatcggcggcctgaactcgggcaccgggaacctcgggttgttcaactcgggcaccggcaacatcgggttcttcaacaccgggaccgggaacttcgggctgttcaactcgggcagttacagcaccggtgtggggaatgcgggcacggccagcaccgggttgttcaacgcggggaacttcaacaccggtctggccaatgccggctcctacaacaccggcagcctcaacgtgggcagcttcaacaccggcggcgtcaacccgggcaccgtcaacaccggctggttcaacaccggccacaccaacaccggcctgttcaacaccggcaacgtcaacaccggcgcgttcaactccggcagcttcaacaacggggcgctgtggaccggtgactaccacgggctggtcggcttctccttcagcatcgacatcgccggcagcaccctgctggacctcaacgaaaccctcaacctgggccccatccacatcgagcagatcgacatccccggcatgtcgctgttcgacgtccacgaaatcgtcgagatcggacccttcaccatcccgcaggtcgatgttcccgcgataccgctagagatccacgaatcgatccacatggatcccatcgtcctggtgcccgccaccacaattcccgcacagacgagaaccattccgctggacatccccgcctcacccgggtcaaccatgacgcttccgctcatcagcatgcgcttcgaaggcgaggactggatcctcgggtcgaccgcggcgattcccaatttcggagaccccttcccggcgcccacccagggcatcaccattcacaccggccctggccccggaacgaccggcgagctcaagatatctattccgggtttcgagattccgcaaatcgctaccacgagattcctgttggacgtgaacatcagcggtggtctgccggccttcaccttgttcgcgggtggcctgacgatccccacgaacgccatcccgttaacgatcgatgcgtccggcgcgctggatccgatcacgattttcccgggtgggtacacgatcgacccgctgccgctgcacctggcgctgaatctcaccgtgcccgacagcagcatcccgatcatcgatgtcccgccgacgccagggttcggcaacaccacggcgaccccgtcgtcggggttcttcaactccggcgccggtggggtgtcggggttcggaaacgtcgggtcgaacctgtcgggctggtggaaccaggcggcgagcgcgctggcggggtcgggatcgggggtgttgaatgtcggcacgctgggctcgggtgtgctcaacgtcggctcgggtgtctcggggatctacaacaccagcgtgttgccgctcgggacgccggcggtgctgtcgggcctcggcaacgtcggccatcagctgtcgggcgtgtctgcggccgggaccgcgttgaaccagatccccatcctcaacatcgggttggcggatgtgggcaacttcaacgtcgggttcggcaacgtcggggacgttaacctgggcgcggccaacctcggtgcgcaaaacctggggctgggcaacgtcggcaccggcaacctcggcttcgccaacgtcggccacggcaatatcggtttcggcaattcgggtctgaccgccggcgcggccggcctgggcaacacggggttcggcaatgccggcagcgccaactatggtttcgccaaccagggcgtgcgcaacatcgggttggccaacaccggcaccggcaacatcgggatcgggctggtgggggacaacctcaccggcatcgggggcctgaactccggtgccggcaatatcggcttgttcaactccggcaccggcaacatcgggttcttcaactccgggaccggcaacttcggcatcggtaactcgggcagcttcaacaccggcatcggcaatagcggaacgggcagcactgggctcttcaatgccggcagcttcaacaccggcgtggccaacgccggcagctacaacaccggcagcttcaatgccggcgacaccaacaccggggggttcaacccgggcaccatcaacaccggctggttcaacaccggccacaccaataccggcatcgccaactcgggcaacgtcggcaccggcgcgttcatgtcgggcaacttcagcaacggcctgttgtggcggggtgatcacgagggcctgttcagcctgttctacagcctcgacgtgccccggatcaccatcgtggacgcccacctcgacggcggcttcggacccgtggtcctcccgcccatcccggtgccggccgttaatgcgcacctgaccggaaacgtcgcgatgggcgcattcaccattccgcagatcgacatccccgcactcaccccaaacatcaccggaagcgccgccttccgcatcgttgtggggtccgtgcgcattccgccggtgagtgtcattgtggagcaaataatcaacgcctcggttggggcggagatgaggatagatcccttcgaaatgtggactcaaggcactaatggccttggtataaccttctattcattcggatcggccgacggttcgccctacgccaccggcccactcgttttcggcgccggcacgagcgacggaagccatctcaccatttccgcgtccagcggggcgtttaccactccgcagctcgaaactggcccgatcacgttgggcttccaggtgcccggcagcgtcaacgcgatcaccctcttccccggtggtttgacgttcccggcgacctcgctgctgaacctggacgtgaccgccggcgccggcggcgtggacatcccggccatcacctggcccgagatcgcggcgagcgccgacggctcggtgtatgtcctcgccagcagcatcccgctgatcaacatcccgcccaccccgggcattgggaacagcaccatcaccccgtcgtcgggcttcttcaacgccggcgcgggcgggggatcgggcttcggcaacttcggcgcgggcacctcgggctggtggaaccaggcgcacaccgcgctggcgggggcgggctcgggttttgccaacgttggcacgctgcattccggtgtgctcaacctgggctcgggtgtctcggggatctacaacaccagcacgctgggggtggggaccccggcgctggtctcaggcctgggcaacgtcggccaccaactgtcggggctgctttccggcgggtccgcggtgaacccggtgaccgttctgaatatcgggttggccaacgtcggcagccacaacgccggtttcggcaatgtcggggaggtcaacctgggcgcggccaacctcggcgcgcacaacctgggcttcggaaatatcggcgccggcaacctggggttcggcaatattggccacggcaatgtcggagtcggcaactcgggtctgaccgcgggcgtgccgggcctgggcaatgtggggttgggcaatgccggcggcaacaactgggggttggccaacgtgggcgtgggcaatatcgggttggccaacaccggcaccggcaacattgggatcgggctgaccggcgactaccagaccggcatcggcggcctaaattccggtgccggcaacctggggttgttcaactccggcgccggcaacgtcgggttcttcaacaccgggaccggcaacttcgggttgttcaactccggcagcttcaacaccggcgtcggcaatagcggaacgggcagcactgggctcttcaatgccggcagtttcaacaccggtgtggccaacgccggcagctacaacacgggcagcttcaatgtcggtgacaccaacaccgggggcttcaacccgggcagcatcaacaccggctggctcaacgccggcaacgccaacaccggggtggccaacgcgggcaatgtcaacaccggcgccttcgtcaccggcaacttcagcaacggcatcctgtggcgcggcgactaccagggcctggccggcttcgccgtgggctacaccctcccgctgttccccgcggtgggcgccgacgtcagcggcgggatcggcccgattaccgtgctgccgcccatccac atcccgcccattccggtcggcttcgccgcggtcggtggcatcggcccgatcgccatcccggacatctctgttccatccattcacttgggcctcgaccccgccgtccatgtcggctccatcaccgtcaaccccattaccgtcaggaccccgcccgtgctcgtcagttactcccaaggagccgtcaccagcacgtccggaccaacctcagagatttgggtcaagcccagcttcttccccggaatccggatcgcgccctctagcggcgggggtgcaacgtccacgcaaggggcatactttgtggggcccatctccatcccctccggcacggtgaccttcccgggattcaccatccccctcgacccgatcgacatcggcctgccggtgtcgctgaccatcccggggttcaccatcccgggcggcaccctgatccccaccctcccgctgggcctcgcgttgtccaatggcatcccgcccgtcgacatcccggccatcgttctcgaccggatcttgctggacctgcacgccgacaccactatcggcccgatcaacgtcccgatcgccgggttcggcggggcgccgggtttcgggaactcgaccacgctgccgtcgtcgggcttcttcaacaccggagctggcggcggttcgggctttagcaacaccggcgcgggcatgtcgggattgctcaacgcgatgtcggatccgctgctcgggtcggcgtcgggcttcgccaacttcggcacccagctctccggcatcctcaaccgcggcgccggcatctcgggcgtgtacaacaccggcgcgctgggtgttgtcaccgcggccgtcgtctcgggtttcggcaacgtcggccagcaactgtcgggcttgctcttcaccggcgtcgggccctaa(SEQ ID NO: 26)
Esses polinucleotídeos incluem seqüências de DNA, cDNA eRNA que codificam o polipeptídeo de interesse. Mutações silenciosas naseqüência de codificação resultam da degeneração (isto é, redundância) docódigo genético, com o que mais de um códon pode codificar o mesmo resí-duo de aminoácido. Então, por exemplo, Ieucina pode ser codificada porCTT, CTC1 CTA, CTG, TTA ou TTG; serina pode ser codificada por TCT,TCC, TCA1 TCG, AGT ou AGC; asparagina pode ser codificada por AAT ouAAC; ácido aspártico pode ser codificado por GAT ou GAC; cisteína podeser codificada por TGT ou TGC; alanina pode ser codificada por GCT, GCC1GCA ou GCG; glutamina pode ser codificada por CAA ou CAG; tirosina podeser codificada por TAT ou TAC; e isoleucina pode ser codificada por ATT,ATC ou ATA. Tabelas mostrando o código genético padrão podem ser en-contradas em várias fontes (por exemplo, L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3-Edição, W.H. 5 Freeman e Co., NY).
Um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de Mtb pode serclonado ou amplificado através de métodos in vitro, tal como a reação emcadeia de polimerase (PCR), a reação em cadeia da Iigase (LCR), o sistemade amplificação baseado em transcrição (TAS), o sistema de replicação deseqüência auto-sustentado (3SR) e o sistema de amplificação da Οβ replica-se (QB). Por exemplo, um polinucleotídeo codificando a proteína pôde serisolado através de reação em cadeia de polimerase de cDNA usando inicia-dores com base na seqüência de DNA da molécula. Uma ampla variedadede metodologias de clonagem e amplificação in vitro é bem-conhecida dapessoa versada na técnica. Métodos de PCR são descritos na, por exemplo,Patente U.S. N9 4.683.195; Mullis e outros, Cold Spring Harbor Symp.Quant. Biol. 51:263, 1987; e Erlich, ed., PCR Technology {Stockton Press,NY, 1989). Polinucleotídeos podem ser também isolados através de bibliote-cas genômicas ou de cDNA com sondas selecionadas das seqüências dopolinucleotídeo desejado sob condições de hibridização estringentes.
Os polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de Mtb incluemum DNA recombinante que é incorporado em um vetor em um plasmídeo ouvírus autonomamente replicante ou no DNA genômico de um procarionte oueucarionte, ou que exista como uma molécula separada (tal como um cD-NA). Os nucleotídeos da invenção podem ser ribonucleosídeos, desoxirribu-nucleotídeos ou formas modificadas de qualquer nucleotídeo. O termo incluiformas simples ou duplas de DNA.
Em uma modalidade, vetores são usados para expressão emlevedura tal como S. cerevisiae ou Kluyveromyces lactis. Vários promotoressão conhecidos ser de utilidade em sistemas de expressão de levedura talcomo os promotores constitutivos da membrana de plasma H+-ATPase(PMA1), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD)1 fosfogIicerato cinase-1 (PGK1), álcool desidrogenase-1 (ΑΟΗλ) e bomba resistente a fármacopleitrópica (PDR5). Ainda, promotores induzíveis podem ser de utilidade, talcomo GAL1-10 (induzido por galactose), PH05 (induzido por pouco fosfatoinorgânico extracelular) e elementos HSE de choque térmico em tandem(induzidos por elevação da temperatura para 37- C). Promotores que dire-cionam expressão variável em resposta a indutor titulável incluem os promo-tores MET3 e MET25 responsivos à metionina e promotores CUP1 depen-dentes de cobre. Qualquer um desses promotores pode ser clonado emplasmídeos de multicópia (2μ) ou cópia única (CEN) para dar um nível adi-cional de controle em nível de expressão. Os plasmídeos podem incluir mar-cadores nutricionais (tal como URA3, ADE3, HIS1 e outros) para seleção emlevedura e resistência a antibiótico (AMP) para propagação em bactérias.Plasmídeos para expressão de K. Iactis são conhecidos, tal como pKLACI.
Então, em um exemplo, após amplificação em bactérias, plasmídeos podemser introduzidos nos auxótrofos de levedura correspondentes através de mé-todos similares à transformação bacteriana.
Os polipeptídeos de Mtb podem ser expressos em uma varieda-de de cepas de levedura. Por exemplo, sete transportadores resistentes afármaco pleiotrópicos, Y0R1, SNQ2, PDR5, YCF1, PDR10, PDR11 e P-DR15, junto com seus fatores de transcrição de ativação, PDR1 e PDR3,foram simultaneamente deletados em células hospediras de levedura, torna-do a cepa resultante sensível a fármacos. Cepas de levedura com composi-ção de lipídeo alterada da membrana do plasma, tal como o mutante erg6defeituoso em biossíntese de ergosterol, podem ser também utilizadas. Pro-teínas que são altamente sensíveis à proteólise podem ser expressas emuma levedura sem a endopeptidase vacuolar máster Pep4, que controla aativação de outras hidrolases vacuolares. Expressão heteróloga em cepascarregando alelos de genes sensíveis à temperatura (te) pode ser emprega-da se o mutante nulo correspondente for inviável.
Vetores virais podem ser também preparados codificando ospolipeptídeos de Mtb descritos aqui. Vários vetores virais foram construídos,incluindo polioma, SV40 (Madzak e outros, 1992, J. Gen. Virol.,73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol.,158:39-6; Beriiner e outros, 1988, Bio Techniques, 6:616- 629; Gorzigiia eoutros, 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin e outros, 1992, Proc. Natl. A-cad. Sei. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld e outros, 1992, Cell, 68:143-155;Wilkinson e outros, 1992, NucL Acids Res., 20:2233-2239; Stratford-Perricaudet e outros, 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), vírus vaccínia(Mackett e outros, 1992, Bioteehnology, 24:495-499), vírus adenoassociado(Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On e outros,1990, Gene, 89:279-282), herpes víruses including HSV e EBV (Margolskee,1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson e outros, 1992, J.Virol., 66:29522965; Fink e outros, 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfi-eld e outros, 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse e outros, 1990, Bio-chem. Pharmacol., 40:2189-2199), Sindbis vírus (H. Herweijer e outros,1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Patente U.S. Nq 5.091.309 e Pa-tente U.S. N- 5.2217.879), alfavírus(S. Schlesinger, 1993, Trends BiotechnoL11: 18-22; I. Frolov e outros, 1996, Proc. NatL Acad. Sei. USA 93:11371-11377) e retrovírus de ave (Brandyopadhyay e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:749-754; Petropouplos e outros, 1992, J. Virol., 66:3391-3397), murino(Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol Immunol., 158:1-24; Miller e outros, 1985,Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:1730-1737; Mann e outros, 1985, J. ViroL, 54:401-407) e origem humana (Page eoutros, 1990, J. ViroL, 64:5370-5276; Buchschalcher e outros, 1992, J. ViroL,66:2731-2739). Vetores de baculovírus (vírus de poliedrose multinuclear deAutographa californica; AcMNPV) também são conhecidos na técnica, e po-dem ser obtidos de fontes comerciais (tal como PharMingen, São Diego, Ca-Lif.; Protein Sciences Corp., Meriden1 Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.).
Vetores virais, tal como vetores poxvirais, que codificam um po-lipeptídeo de Mtb incluem pelo menos um elemento de controle de expres-são operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucléico codificando opolipeptídeo Mtb. Os elementos de controle de expressão são inseridos novetor viral para controlar e regular a expressão da seqüência de ácido nu-cléico. Exemplos de elementos de controle de expressão de utilidade nessesvetores incluem, mas não estão limitados a, sistema lac, regiões operadorase promotoras de fago lambda, promotores de levedura e promotores deriva-dos de polioma, adenovírus, retrovírus ou SV40. Elementos operacionaisadicionais incluem, mas não estão limitados a, seqüência líder, códons determinação, sinais de poliadenilação e quaisquer outras seqüências neces-sárias para a transcrição apropriada e tradução subseqüente das seqüênciasde ácido nucléico codificando o polipeptídeo de Mtb no sistema hospedeiro.
O vetor de expressão pode conter elementos adicionais necessários para atransferência e subseqüente replicação do vetor de expressão contendo aseqüência de ácido nucléico no sistema hospedeiro. Exemplos de tais ele-mentos incluem, mas não estão limitados a, origens de replicação e marca-dores selecionáveis. Será ainda compreendido por um versado na técnicaque tais vetores são facilmente construídos usando métodos convencionais(Ausubel e outros (1987) e "Current Protocols in Molecular Biology", JohnWiley and Sons, Nova York, N.Y.) e estão comercialmente disponíveis.
Seqüências de DNA codificando um polipeptídeo de Mtb podemser expressas in vitro através de transferência de DNA para uma célula hos-pedeira adequada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termotambém inclui qualquer progênie da célula hospedeira objeto. É compreen-dido que toda a progênie pode não ser idêntica à célula de origem uma vezque pode haver mutações que acontecem durante replicação. Métodos detransferência estável, significando que o DNA estrangeiro é continuamentemantido no hospedeiro, são conhecidos na técnica.
Conforme acima mencionado, uma seqüência de polinucleotídeocodificando um polipeptídeo de Mtb pode ser operativamente ligada a se-qüências de controle de expressão. Uma seqüência de controle de expres-são operativamente ligada a uma seqüência de codificação é ligada de modoque expressão da seqüência de codificação é conseguida sob condiçõescompatíveis com as seqüências de controle de expressão. As seqüências decontrole de expressão incluem, mas não estão limitadas a, promotores, au-mentadores, terminadores de transcrição, um códon curto (isto é, ATG) emfrente a um gene de codificação de proteína, sinal de união para introns,manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitir tradu-ção apropriada de mRNA e códons de parada.
Células hospedeiras podem incluir células hospediras microbia-nas, de levedura, inseto e mamífero. Métodos de expressão de seqüênciasde DNA tendo seqüências eucarióticas ou virais em procariontes são bem-conhecidos na técnica. Exemplos não-limitantes de células hospediras ade-quadas incluem células de bactérias, archea, inseto, fungos (por exemplo,levedura), micobactéria (tal como M. smegmatis), planta e células animais(por exemplo, células de mamífero, tal como humano). Células exemplaresde uso incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyees eerevisiae,Salmonella typhimurium, células SF9, células C129, células 293, Neurospo-ra, e cepas de células mielóide e linfóide de mamífero imortalizadas. Técni-cas para a propagação de células de mamífero em cultura são bem-conhecidas (vide Jakoby e Pastan (Eds.), 1979, Cell Culture. Methods inEnzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich,N.Y.). Exemplos de cepas de célula hospedeira de mamífero geralmenteusadas são células VERO e HeLa, células CHO, e WI38, BHK, e cepas decélula COS, embora cepas de célula possam ser usadas, tal como célulasplanejadas para prover padrões de glicosilação desejáveis maiores, ou ou-tras características. Conforme acima discutido, técnicas para a transforma-ção de células de levedura, tal como transformação de polietileno glicol,transformação de protoplasto e as pistolas de gene são também conhecidasna técnica (vide Gietz e Woods, Methods in Enzymology 350:87-96, 2002).
Transformação de uma célula hospedeira com DNA recombinan-te pode ser realizada através de técnicas convencionais como são bem-conhecidas daqueles versados na técnica. Onde o hospedeiro for procarióti-co, tal como, mas não limitado a, E. coli, células competentes que são capa-zes de absorção de DNA podem ser preparadas a partir de células coletadasapós fase de crescimento exponencial e subseqüentemente tratadas atravésdo método de CaCI2 usando procedimentos bem-conhecidos na técnica. Al-ternativamente, MgCl3 ou RbCI pode ser usado. Transformação pode sertambém realizada após formação de um protoplasto da célula hospedeira sedesejado, ou através de eletroporação.
Quando o hospedeiro é um eucarionte, tais métodos de trans-fecção de DNA como co-precipitados de fosfato de cálcio, procedimentosmecânicos convencionais tal como microinjeção, eletroporação, inserção ouplasmídeo envolvido em lipossomas, ou vetores virais podem ser usados.Células eucarióticas podem também ser co-transformadas com seqüênciasde polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Mtb1 e uma segunda mo-lécula de DNA estrangeiro codificando um fenótipo selecionável, tal comogene timidina cinase de herpes simplex. Outro método é usar um vetor viraleucariótico, tal como vírus símio 40 (SV40) ou vírus papiloma bovino, paratransientemente infectar ou transformar células eucarióticas e expressar aproteína (vide, por exemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring HarborLaboratory, Gluzman ed., 1982).
Método para Detecção de uma Infecção com Mtb: Detecção de Células T
Métodos para detecção de uma infecção com Mycobacteriumem um indivíduo são descritos aqui. Em várias modalidades, uma infecçãocom Mycobacterium pode ser detectada com base ha presença de células Tem uma amostra biológica, onde as células T especificamente reagem comum polipeptídeo de Mtb descrito aqui (vide acima).
Em várias modalidades, uma amostra biológica compreendendocélulas T é obtida de um indivíduo de interesse. Amostras biológicas ade-quadas incluem, mas não estão limitadas a, amostras de sangue, célulasmononucleares de sangue periférico, esputo, saliva, fluido do cordão espi-nhal ou amostras de célula T isoladas (tal como células T CD8+ e/ou célulasCD4+), tecido de nó linfático, tecido pulmonar ou outra amostra de tecido.
Em um exemplo, a amostra é incubada com um polipeptídeo de Myeobaete-rium, conforme aqui descrito, um polinucleotídeo codificando o polipeptídeode Mtb e uma APC que expressa o polipeptídeo de Mtb ou um fragmentodele que se liga a MHC. A presença ou ausência de ativação específica dascélulas T é detectada.As células T CD8+ e/ou células T CD4+ que reconhecem o peptí-deo no método de detecção foram geralmente pré-sensibilizadas in vivo parao polipeptídeo de Mtb de interesse. Em várias modalidades, essas células Texperientes em peptídeo estão geralmente presentes no sangue periféricode um hospedeiro que foi exposto ao antígeno em uma freqüência de 1 a106 a 1 em 103 células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
Em um exemplo, a amostra são células T isoladas. Por exemplo,células T podem ser isoladas de um indivíduo de interesse através de técni-cas de rotina (tal como através de centrifugação de gradiente de densidadeFicoll/Hypaque de linfócitos de sangue periférico ou através de seleção decélula ativada por fluorescência). Em uma modalidade, as células T usadasno ensaio estão na forma de amostras não-processadas ou diluídas, ou sãocélulas T recém-isoladas (tal como na forma de células mononucleares re-cém-isoladas (MCs) ou células mononucleares de sangue periférico(PBMCs) que são usadas diretamente ex vivo, de modo que elas não sãoculturadas antes de serem usadas no método. No entanto, as células T po-dem ser culturadas antes do uso, por exemplo, na presença de um ou maisdos peptídeos, e geralmente também citocinas de promoção de crescimentoexógenas. Durante cultura os peptídeos são tipicamente apresentados nasuperfície de células tal como APCs. Pré-cultura das células T pode levar aum aumento na sensibilidade do método. Então, as células T podem serconvertidas em cepas celulares, tal como cepas de célula de curto prazo.
Em várias modalidades, as células T são incubadas in vitro pordois a nove dias, tal como cerca de quatro dias, a 379 C com um polipeptí-deo de Mtb ou fragmento dele que liga MHC. Em vários exemplos, o polipep-tídeo de Mtb ou fragmento dele que liga MHC está incluído (em uma concen-tração de, por exemplo, cerca de 5 a cerca de 25 pg/ml, tal como cerca de 5,cerca de 10, cerca de 15 ou cerca de 20 Mg/ml). Em vários exemplos, outraalíquota de uma amostra de célula T pode ser incubada na ausência do poli-peptídeo de Mtb como um controle.
Em uma modalidade, células mononucleares (MCs) são separa-das da amostra. As MCs incluem as células T e células apresentando antí-geno (APCs). Então no método as APCs presentes nas MCs separadas po-dem apresentar o peptídeo às células T. Em outra modalidade apenas célu-las T, tal como apenas células T CD8+, apenas células T CD4+ ou apenascélulas T CD3+, podem ser purificadas da amostra.
A APC usada no método pode ser qualquer célula que tenhamoléculas do MHC Classe I em sua superfície. Ela pode ou não ser umacélula apresentando antígeno especializada, tal como uma célula B, céluladendrítica ou macrófago. A APC usada no método pode ser do mesmo hos-pedeiro que a célula T. Em geral, a APC é capaz de apresentar o peptídeo auma célula Τ. A APC pode ser uma célula ex vivo recém-isolada ou uma cé-lula culturada tal como a célula de uma cepa de célula.
Células T derivadas de uma amostra do indivíduo de interessepodem ser postas em um ensaio com todos os polipeptídeos de Mtb (ou umgrupo dos polipeptídeos de Mtb, ou um polipeptídeo de Mtb específico) queé pretendido testar o painel relevante ou as células T podem ser divididas epostas em ensaios separados cada um dos quais contém um ou mais dospeptídeos. Em uma modalidade, um ou mais dos polipeptídeos com umaseqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NOs: 1-12, ou um frag-mento de um ou mais desses polipeptídeos que ligam MHC, são utilizados.Dois ou mais de qualquer um dos peptídeos de Mtb descritos aqui podemser usados para uso simultâneo,separado ou seqüencial de células T quereconhecem esses polipeptídeos. Combinações adicionais de qualquer umdos polipeptídeos de MTb descritas aqui podem ser utilizadas.
Em uma modalidade o um ou mais polipeptídeo(s) é(são) provi-do(s) a células apresentando na ausência da célula T. Esta célula é entãoprovida a células T isoladas do indivíduo, tipicamente após serem deixadasapresentar o peptídeo em sua superfície.
A duração que o peptídeo é contatado com as células vai variardependendo do método usado para determinação do reconhecimento dopeptídeo. Tipicamente 105 a 107, tal como 5 χ 105 a 106 PBMCs são adicio-nadas a cada ensaio. No caso onde peptídeo é adicionado diretamente aoensaio sua concentração é tipicamente de a partir de 10-1 a 103 pg/ml, talcomo cerca de 0,5 a cerca de 50 pg/ml ou cerca de 1 a cerca de 10 pg/ml. Aduração de tempo pela qual as células T são incubadas com o peptídeo po-de ser de a partir de cerca de 4 a cerca de 24 horas, tal como de a partir decerca de 6 a cerca de 16 horas, ou por cerca de 12 horas.
A determinação do reconhecimento específico do peptídeo pelascélulas T pode ser feita medindo a ligação do peptídeo às células T. Tipica-mente células T que ligam o peptídeo podem ser selecionadas com basenesta ligação, por exemplo, usando uma técnica de seleção de célula ativa-da por fluorescência (FACS). A detecção da presença de células T que re-conhecem o peptídeo será considerada ocorrer se a freqüência de célulasselecionadas usando o peptídeo for acima de um valor controle.
Determinação de se as células T reconhecem o peptídeo podeser também feita através da detecção de uma mudança no estado das célu-las T na presença do peptídeo ou determinação de se as células T ligam opeptídeo. A mudança em estado é geralmente causada por atividade funcio-nal específica de antígeno da célula T após o receptor de célula T ligar opeptídeo. Em geral quando ligando o receptor de célula T o peptídeo é liga-do a uma molécula do MHC classe I, que pode estar presente na superfíciede uma PBMC ou uma célula apresentando antígeno (APC).
A ativação de célula T pode ser detectada através de quaisquermeios conhecidos de um versado na técnica. Em um exemplo, ativação decélula T CD8+ é detectada através da varredura da atividade citolítica. Emoutro exemplo, ativação de célula T CD8+ e/ou ativação de célula T CD4+ édetectada através de proliferação. Em vários exemplos, um nível de prolife-ração que é pelo menos duas vezes maior e/ou um nível de atividade citolíti-ca que é pelo menos 20% maior do que em indivíduos não-infectados indicaa presença de uma infecção com Mycobacterium no indivíduo de interesse.
A mudança em estado da célula T pode ser o início de ou au-mento em secreção de uma substância da célula T, tal como uma citocina,tal como interferon (IFN)-y, IL-2 ou TNF-α. Em um exemplo, a substânciapode ser detectada permitindo que ela se ligue a um agente de ligação es-pecífico e então medição da presença do complexo agente de ligação espe-cífico/substância. O agente de ligação específico é tipicamente um anticorpo,tal como anticorpos policlonais ou monoclonais que ligam a substância, talcomo a citocina. Anticorpos para citocinas estão comercialmente disponí-veis, ou podem ser feitos usando técnicas padrão.
Tipicamente o agente de ligação específico tal como o anticorpoé imobilizado em um apoio sólido. Após a citocina ser deixada ligar o apoiosólido pode opcionalmente ser lavado para remover material que não estáespecificamente ligado ao anticorpo. O complexo anticorpo/citocina pode serdetectado usando um segundo agente de ligação que ligará o complexo, talcomo um anticorpo que é marcado (ou diretamente ou indiretamente) comum marcador. Geralmente, o segundo agente liga a substância em um sítioque é diferente do sítio que liga o primeiro agente.
Em vários exemplos, o segundo agente de ligação pode ser de-tectado por um terceiro agente que é marcado diretamente ou indiretamentepor um marcador detectável. Por exemplo, o segundo agente pode incluiruma biotina, permitindo detecção de um terceiro agente que compreendeuma estreptavidina e um marcador, tal como um marcador enzimático, ra-dioativo ou fluorescente.
Em uma modalidade o sistema de detecção é um ensaio ELIS-POT, tal como um ensaio descrito na publicação PCT N9 WO 98/23960, in-corporada aqui a título de referência. Em um exemplo, IFN-γ secretado dacélula T é ligado por um primeiro anticorpo específico de IFN-γ que é imobili-zado em um apoio sólido. O IFN-γ ligado é então detectado usando um se-gundo anticorpo específico de IFN-γ que é marcado com um marcador de-tectável. Anticorpos marcados exemplares estão comercialmente disponí-veis, tal como da MABTECH® (Estocolmo, Suécia). Um ensaio ELISPOT e-xemplar é descrito na seção de Exemplos abaixo.
A mudança em estado da célula T que pode ser também medidapode ser o aumento na absorção de substâncias pela célula T, tal como aabsorção de timidina. A mudança em estado pode ser também medida porum aumento no tamanho das células T, ou proliferação das células T, ouuma mudança nos marcadores de superfície celular na célula T.Reagentes são providos aqui para a detecção de células ex-pressando CD8(CD8+) que especificamente ligam um polipeptídeo de Mtbconforme aqui descrito. Esses reagentes são complexos I do MHC Clas-se/polipeptídeo de TARP imunogênico tetraméricos. Esses complexos te-traméricos incluem um polipeptídeo de Mtb, tal como um polipeptídeo denove a vinte aminoácidos de comprimento que especificamente liga MHCclasse I.
Complexos de MHC Classe l/peptídeo tetraméricos podem sersintetizados usando métodos bem-conhecidos na técnica (Altmann e outros,Science 274:94, 1996, que é aqui incorporado a título de referência). Em umexemplo não-limitante específico, polipeptídeo de cadeia pesada HLA purifi-cado e p2-microglobulina (β2ιτι) podem ser sintetizados por meio de um sis-tema de expressão procariótico. Um exemplo não-limitante, específico, deum sistema de expressão de utilidadeé o sistema pET (R&D Systems, Mine-apolis, MN). A cadeia pesada é modificada através de deleção da trans-membrana e filamento citosólico e adição de terminal COOH de uma se-qüência contendo o sítio de biotinilação enzimático de biotina proteína Iigase(Bir-A). Cadeia pesada, β2ίη, e peptídeo são então redobrados. O produtoredobrado pode ser isolado através de quaisquer meios conhecidos na téc-nica, e então biotinilados por Bir-A. Um tetrâmero é então produzido atravésde contato do produto biotinilado com estreptavidina.
Em uma modalidade, a estreptavidina é marcada. Marcadoresadequados incluem, mas não estão limitados a, enzimas, contas magnéti-cas, contas magnéticas coloidais, haptenos, fluorcromos, compostos de me-tal, compostos radioativos ou fármacos. As enzimas que podem ser conju-gadas à estreptavidina incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcali-na, peroxidase, urease e β-galactosidase. Os fluorcromos que pode ser con-jugados à estreptavidina incluem, mas não estão limitados a, fluoresceínaisotiocianato, tetrametilrodamina isotiocianato, ficoeritrina, aloficocianinas eTexas Red. Para fluorcromos adicionais que podem ser conjugados à es-treptavidina, vide Haugland, R.P. Molecular Probes: Handbook of Fluores-cent Probes and Research Chemicals (1992-1994). Os compostos de metalque podem ser conjugados à estreptavidina incluem, mas não estão limita-dos a, ferritina, ouro coloidal, e, particularmente, contas superparamagnéti-cas coloidais. Os haptenos que podem ser conjugados à estreptavidina in-cluem, mas não estão limitados a, biotina, digoxigenina, oxazalona e nitrofe-nol. Os compostos radioativos que podem ser conjugados à estreptavidinasão conhecidos na técnica, e incluem, mas não estão limitados a, tecnécio99m ("Tc), 125I e aminoácidos compreendendo quaisquer radionuclídeos,incluindo, mas não limitado a, 14C1 3H e 35S. Em geral, estreptavidina marca-da com um fluorcromo é utilizada nos métodos descritos aqui.
Em uma modalidade suspensão de células incluindo células Tque especificamente reconhecem um polipeptídeo de Mtb é produzida, e ascélulas são reagidas com o tetrâmero em suspensão. Em uma modalidade,esses reagentes são usados para marcar células, que são então analisadasatravés de seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). Uma máqui-na para FACS emprega uma pluralidade de canais de cor, canais de detec-ção de pouco ângulo e espalhamento de luz obtuso, e canais de impedância,dentre outros níveis de detecção mais sofisticados, para separar ou selecio-nar células. Qualquer técnica FACS pode ser empregada contanto que elanão seja prejudicial para a detecção das células desejadas. (Quanto a méto-dos exemplares de FACS vide Patente U.S. N9 5.061.620, incorporada aquia título de referência).
Método para Detecção de Infecção com Mtb: Testes de Pele
Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para usode um ou mais dos polipeptídeos descritos acima para diagnosticar infecçãocom Mycobacterium, e em particular tuberculose, usando um teste de pele.Um "teste de pele" é um ensaio realizado diretamente em um paciente ondeuma reação de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) (tal como enrije-cimento, inchaço, vermelhidão ou dermatite) é medida seguindo administra-ção à pele, tal como a injeção intradermal de um ou mais polipeptídeos des-critos acima. Tal injeção pode ser feita usando qualquer dispositivo adequa-do suficiente para contatar o polipeptídeo ou polipeptídeos com células der-mais do paciente, tal como uma seringa tuberculina ou seringa de 1 ml. Emvários exemplos, a reação é medida pelo menos 48 horas após injeção, talcomo entre cerca de 48 e cerca de 72 horas após injeção.
Uma reação DTH é uma resposta imune mediada por célula queé maior em indivíduos que foram expostos previamente ao antígeno de testeo polipeptídeo de Mtb, seu fragmento que liga MHC ou sua proteína de fu-são). A resposta pode ser medida visualmente, tal como usando uma régua.Em vários exemplos, uma resposta que é maior do que cerca de 0,5 cm dediâmetro, tal como maior do que cerca de 1,0 de diâmetro, é uma respostapositiva, e é indicativa de infecção com Mycobacterium.
Os polipeptídeos de Mtb descritos aqui podem ser formuladospara uso em um teste de pele como composições farmacêuticas contendoum polipeptídeo e um veículo fisiologicamente aceitável. Essas composiçõestipicamente contêm um ou mais dos polipeptídeos de Mtb descritos (ou umfragmento dele que liga MHC ou uma proteína de fusão dele) em uma quan-tidade variando de a partir de cerca de 1 pg a cerca de 100 pg, tal como de apartir de cerca de 10 pg a cerca de 50 pg em um volume de 0,1 ml. O veícu-lo empregado em uma composição farmacêutica pode ser uma solução sali-na com preservativos apropriados, tal como fenol e/ou TWEEN80®.
Geralmente, o polipeptídeo empregado em um teste de pele éde tamanho suficiente de modo que ele permanece no sítio de injeção portoda a duração do período de reação. Em vários exemplos, um polipeptídeoque é pelo menos de nove aminoácidos de comprimento é suficiente. Semser limitado pela teoria, o polipeptídeo é quebrado por macrófagos dentro dehoras de injeção para permitir apresentação a células T. Tais polipeptídeospodem conter repetições de uma ou mais das seqüências acima descritase/ou outras seqüências imunogênicas ou não-imunogênicas.
Então, a determinação do reconhecimento do peptídeo pelascélulas T pode ser medida in vivo. Em vários exemplos, o peptídeo é admi-nistrado ao indivíduo e então uma resposta que indica reconhecimento dopeptídeo pode ser medida. Em uma modalidade o peptídeo é administradointradermalmente, tipicamente de uma maneira similar ao teste Mantoux. Opeptídeo pode ser administrado epidermalmente. O peptídeo é tipicamenteadministrado através de agulha, tal como através de injeção, mas pode seradministrado através de outros métodos tal como balística, por exemplo, astécnicas de balística que têm sido usadas para aplicar ácidos nucléicos. Opedido EPC Publicado Ng EP-A-0693119 descreve técnicas que podem tipi-camente ser usadas para administrar o peptídeo. Em vários exemplos, de apartir de 0,001 a 1000 pg, por exemplo, de a partir de 0,01 a 100 pg ou 0,1 a10 pg de peptídeo são administrados. Alternativamente um agente pode seradministrado que é capaz de prover o peptídeo in vivo. Então um polinucleo-tídeo capaz de expressar o polipeptídeo pode ser administrado. O polinucle-otídeo tipicamente tem qualquer uma das características do polinucleotídeoque é discutido abaixo. Polipeptídeo é expresso do polinucleotídeo in vivo ereconhecimento do peptídeo in vivo pode ser medido. Tipicamente de a par-tir de 0,001 a 1000 pg, por exemplo, de a partir de 0,01 a 100 pg a 10 pg depolinucleotídeo são administrados.
Método para Detecção de uma Infecção com Mtb: Detecção de AnticorposSão aqui descritos métodos onde os polipeptídeos descritos a-cima são usados para diagnosticar infecção com Mycobacterium, e, em par-ticular, tuberculose. Nessas modalidades, são providos métodos para detec-ção de infecção com Mycobacterium em uma amostra biológica, usando umou mais dos polipeptídeos acima, sozinhos ou em combinação. Em váriasmodalidades polipeptídeos múltiplos são empregados. O(s) polipeptídeo(s)é(são) usado(s) em um ensaio para determinar a presença ou ausência deanticorpos para o(s) polipeptídeo(s) em uma amostra biológica (tal como,mas não limitado a, sangue integral, esputo, soro, plasma, saliva ou fluidocerebroespinhal) com relação a um controle. A presença de tais anticorposindica sensibilização prévia a antígenos micobacterianos que pode ser indi-cativo de infecção Micobacteriana, e em particular tuberculose.
Em uma modalidade onde mais de um polipeptídeo é emprega-do, os polipeptídeos podem ser complementares, de modo que um polipep-tídeo componente vai detectar infecção em amostras onde a infecção nãoseria detectada por outro polipeptídeo componente). Polipeptídeos comple-mentares podem ser geralmente identificados usando cada polipeptídeo in-dividualmente para avaliar amostras de soro obtidas de uma série de pacien-tes conhecidos estar infectados com Mycobacterium. Após determinação dequais amostras são corretamente identificadas como positivo com cada poli-peptídeo, combinações de dois ou mais polipeptídeos podem ser formuladasque são capazes de detectar infecção na maioria, ou todas, as amostras tes-tadas. Polipeptídeos complementares são de utilidade para melhorar sensibi-lidade de um teste de diagnóstico. Então, mais de um dos polipeptídeos deMtb acima descritos pode ser incluído em um ensaio. Polipeptídeos adicio-nais de Mtb (aqueles não descritos aqui) opcionalmente podem ser incluídosno ensaio.
Existe uma variedade de formatos de ensaio que podem ser u-sados para detectar anticorpos em uma amostra (vide, por exemplo, Harlowe Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988), que é incorporado aqui a título de referência). Em geral, a presençaou ausência de uma infecção com Mtb em um paciente pode ser determina-da por (a) contato de uma amostra biológica obtida de um paciente com umou mais polipeptídeos de Mtb; (b) detecção na amostra da presença (ou au-sência) de um anticorpo que se liga ao(s) polipeptídeo(s); e (c) comparaçãodo nível de anticorpo com um controle. O controle pode ser um valor padrão,tal como um valor de corte predeterminado. O controle pode ser a quantida-de de anticorpos em um indivíduo conhecido estar infectado com Mtb, ou aquantidade de anticorpos que especificamente liga o(s) polipeptídeo(s) emum indivíduo conhecido estar infectado com Mtb.
Em várias modalidades, o ensaio envolve o uso de um polipeptí-deo imobilizado em um apoio sólido. Anticorpos que especificamente ligamo(s) polipeptídeo(s) de interesse se ligam ao apoio sólido. O anticorpo ligadopode ser então detectado usando um reagente de detecção que inclui ummarcador detectável. Reagentes de detecção adequados incluem anticorpomarcados que se ligam ao complexo anticorpo/polipeptídeo. Reagentes dedetecção adequados também incluem segundos anticorpos não-marcadosque se ligam ao complexo anticorpo peptídeo e um terceiro anticorpo queliga especificamente o segundo anticorpo. Reagentes de detecção adequa-dos também incluem polipeptídeo não-ligado marcado com um grupo repór-ter (tal como em um ensaio semicompetitivo).
Alternativamente, um ensaio competitivo pode ser utilizado, ondeum anticorpo que se liga ao polipeptídeo de interesse é marcado com umgrupo repórter é incubado com a amostra. Seguindo incubação, o anticorpoé então deixado se ligar ao antígeno imobilizado após incubação do antíge-no com a amostra. O ponto até o qual os componentes da amostra inibem aligação do anticorpo marcado ao polipeptídeo imobilizado é indicativo da rea-tividade da amostra com o polipeptídeo imobilizado.
Um apoio sólido usado em um ensaio descrito aqui pode serqualquer material sólido ao qual o antígeno pode ser ligado. Por exemplo, oapoio sólido pode ser uma cavidade de teste em uma placa de microtitulaçãoou uma membrana de nitrocelulose ou outra adequada. Alternativamente, oapoio sólido pode ser uma conta ou disco, tal como um vidro, fibra de vidro,látex ou um material plástico tal como um poliestireno ou cloreto de polivinila.O apoio pode ser também uma partícula magnética ou um sensor óptico defibra, tal como aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. Ns5.359.681.
Os polipeptídeos podem ser ligados ao apoio sólido usando umavariedade de técnicas. A ligação dos polipeptídeos pode ser realizada atra-vés de uma associação não-covalente, tal como adsorção, ou ligação cova-lente, tal como uma ligação direta entre o antígeno e grupos funcionais noapoio ou uma ligação através de um agente de reticulação.
Para ligação através de adsorção, ligação pode ser conseguidaatravés de contato de um ou mais polipeptídeo(s) de Mtb (geralmente em umtampão) com o apoio sólido por uma quantidade de tempo adequada. Otempo de contato para ligação é tipicamente entre cerca de 1 hora e 1 dia.Em geral, ligação é conseguida através de contato de um apoio sólido depoliestireno ou cloreto de polivinila com uma quantidade de um ou mais poli-peptídeo(s) de Mtb variando de a partir de cerca de 10 mg a cerca de 1 pg,tal como cerca de 100 ng de antígeno.
Ligação covalente dos polipeptídeo(s) de Mtb de interesse a umapoio sólido pode ser geralmente conseguida reagindo o apoio com um rea-gente bifuncional que reage com ambos o apoio e um grupo funcional, talcomo um grupo hidroxila ou amino, no polipeptídeo. Por exemplo, um poli-peptídeo de Mtb pode ser ligado a apoios tendo um revestimento de políme-ro apropriado usando benzoquinona ou através de condensação de um gru-po aldeído no apoio com uma amina e um hidrogênio ativo no polipeptídeo(Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, em A12 A13,1991).
Em certas modalidades, o ensaio é um ensaio imunoabsorventeligado à enzima (ELISA). Este ensaio pode ser realizado primeiro contatandoum antígeno de polipeptídeo que foi imobilizado em um apoio sólido (tal co-mo na cavidade de uma placa de microtitulação) com a amostra de uma ma-neira de modo que os anticorpos presentes dentro da amostra que especifi-camente liga o polipeptídeo de interesse ligam o polipeptídeo imobilizado.Amostra não-ligada é então removida e um reagente de detecção capaz deligação ao complexo anticorpo-polipeptídeo imobilizado é adicionado. Aquantidade de reagente de detecção que permanece ligada é determinadausando um método apropriado para o reagente de detecção específico. Porexemplo, o método de detecção pode detectar fluorescência ou a presençade uma atividade enzimática.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo é imobilizado no apoio;quaisquer sítios de ligação de proteína restantes no apoio são tipicamentebloqueados. Qualquer agente de bloqueio adequado pode ser usado parabloquear os sítios de ligação de proteína não-ligada, de modo que albuminade soro bovino ou TWEEN 20® pode ser empregado. O polipeptídeo imobili-zado é então incubado com a amostra, e o anticorpo é deixado se ligar aoantígeno. A amostra pode ser diluída com um diluente adequado, por exem-plo, um tampão tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) antesda incubação. Em geral, um tempo de contato apropriado (tempo de incuba-ção) é um período de tempo que é suficiente para detectar a presença deanticorpo em uma amostra infectada por Mycobacterium. Em um exemplonão-limitante, específico, o tempo de contato é suficiente para atingir um ní-vel de ligação que é pelo menos 95% daquele atingido em equilíbrio entreanticorpo ligado e não-ligado. O tempo necessário para atingir equilíbrio po-de ser determinado ensaiando o nível de ligação que acontece durante umperíodo de tempo. Em temperatura ambiente, um tempo de incubação decerca de 30 minutos é geralmente suficiente.
Amostra não-ligada pode ser então removida através de lava-gem do apoio sólido com um tampão apropriado, tal como PBS contendoTWEEN 20® a 0,1%. Um reagente de detecção pode ser então adicionadoao apoio sólido. Um reagente de detecção pode ser qualquer composto quese ligue ao complexo anticorpo imobilizado-polipeptídeo e possa ser detec-tado. Em várias modalidades, o reagente de detecção contém um agente deligação (tal como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, Iec-tina ou antígeno livre) conjugado a um marcador. Marcadores de utilidadeincluem enzimas (tal como peroxidase de rábano silvestre), substratos, co-fatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos luminescentes, gruposfluorescentes e biotina. A conjugação de um agente de ligação a um marca-dor pode ser conseguida usando métodos conhecidos na técnica; agentesde ligação conjugados são também comercialmente disponíveis (tal como daZymed Laboratories, São Francisco, Calif. e Pierce, Rockford, Ill.).
O reagente de detecção é incubado com o complexo de anticor-po imobilizado-polipeptídeo por uma quantidade de tempo suficiente paradetectar o anticorpo ligado. Uma quantidade apropriada de tempo pode ge-ralmente ser determinada a partir das instruções do fabricante ou avaliandoo nível de ligação que acontece durante um período de tempo. Reagente dedetecção não-ligado é então removido e reagente de detecção ligado é de-tectado usando o marcador. Para marcadores radioativos, métodos de con-tagem por cintilação ou autorradiográficos podem ser usados para detecção.Métodos espectroscópicos podem ser usados para detectar corantes, gruposluminescentes e grupos fluorescentes usados como marcadores. Biotina po-de ser detectada usando uma avidina acoplada a um marcador diferente, talcomo um marcador radioativo, marcador fluorescente ou um marcador enzi-mático. Marcadores enzimáticos podem ser detectados através da adição desubstrato (geralmente por um período de tempo específico), seguido por a-nálise espectroscópica ou outra dos produtos de reação.
Para determinar a presença ou ausência de anticorpos anti-Micobacterianos na amostra, o sinal detectado do marcador que se liga aoapoio sólido é geralmente comparado com um controle. Em uma modalida-de, o controle é um valor padrão, tal como o sinal médio obtido quando oantígeno imobilizado é incubado com amostras de um paciente não-infectado. Em geral, uma amostra gerando um sinal que está dois ou trêsdesvios padrão acima do controle é considerada positiva para infecção comMycobacterium. Em outra modalidade, o valor controle é determinado usan-do uma Receiver Operator Curve, de acordo com o método de Sackett e ou-tros, Clinicai Epidemiology: A Basic Science for Clinicai Medicine, LittleBrown and Co., pp. 106-107 (1985). Resumidamente, nesta modalidade, ovalor controle é determinado a partir de um gráfico de pares de taxas de ver-dadeiro positivo (sensibilidade) e taxas de falso positivo (100% de especifici-dade) que correspondem a cada valor controle possível para o resultado deteste de diagnóstico. O valor controle no gráfico que inclui a área maior é ovalor de corte mais preciso, e uma amostra gerando um sinal que é maior doque o valor de corte determinado através deste método é considerado positi-vo. Alternativamente, o valor de corte pode ser mudado para minimizar ataxa de falso positivo, ou para minimizar a taxa de falso negativo. Em geral,uma amostra gerando um sinal que é maior do que o valor de corte determi-nado através deste método é considerada positiva para tuberculose.
Em uma modalidade relacionada, o ensaio é realizado em umrápido escoamento ou em formato de teste de tiras ("strip test'), onde o antí-geno é imobilizado em uma membrana, tal como, mas não limitado a, nitro-celulose. Em um teste rápido por imunoconcentração, anticorpos dentro daamostra se ligam ao polipeptídeo imobilizado conforme a amostra passa pe-la membrana. Um reagente de detecção (por exemplo, proteína Α-ouro co-loidal) se liga ao complexo anticorpo-peptídeo conforme a solução contendoo reagente de detecção flui através da membrana. A detecção de reagentede detecção ligado pode ser realizada conforme acima descrito.
Em um exemplo do formato de teste de tira, uma extremidade damembrana à qual o polipeptídeo é ligado é imersa em uma solução contendoa amostra. A amostra migra ao longo da membrana através de uma regiãocontendo o reagente de detecção e para a área de polipeptídeo imobilizado.A concentração do reagente de detecção no polipeptídeo indica a presençade anticorpos anti-Mycobacterium na amostra. Tipicamente, a concentraçãode reagente de detecção neste estágio gera um padrão, tal como uma linha,que pode ser visualmente lido. A ausência de tal padrão indica um resultadonegativo. Em geral, a quantidade de polipeptídeo imobilizado na membranaé selecionada para gerar um padrão visualmente discernível quando a a-mostra biológica contém um nível de anticorpos que seria suficiente paragerar um sinal positivo em um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (E-LISA). Em várias modalidades, a quantidade de polipeptídeo imobilizado namembrana varia de a partir de cerca de 25 ng a cerca de 1 pg, tal como de apartir de cerca de 50 ng a cerca de 500 ng. Tais testes podem tipicamenteser realizados com um volume muito pequeno de soro ou sangue do pacien-te.
Método para Detecção de uma Infecção com Mtb: Detecção de Polinucleotí-deos
Reagentes de diagnóstico incluem o uso de seqüências de poli-nucleotídeo codificando um ou mais dos polipeptídeos de Mtb acima descri-tos. Infecção com Mycobacterium pode ser detectada através da detecçãoda presença, ausência ou nível de mRNA codificando um polipeptídeo deMycobacterium em uma amostra biológica. Em vários exemplos, ensaios dehibridização são utilizados, tal como ensaios Northern blot ou dot blot. Emexemplos adicionais, ensaios baseados em PCR são utilizados.
Métodos gerais para extração de mRNA são bem-conhecidos natécnica e são descritos em livros padrão de biologia molecular, incluindo Au-subel e outros, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons(1997). Métodos para extração de RNA de tecidos embebidos em parafinasão descritos, por exemplo, em Rupp e Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987) eDe Andres e outros, BioTechniques 18:42044 (1995). Em particular, isola-mento de RNA pode ser realizado usando estojo de purificação, conjunto detampão e protease de fabricantes comerciais, tal como QIAGEN®, de acordocom as instruções do fabricante. Por exemplo, RNA total de células em cul-tura (tal como aquelas obtidas de um indivíduo) pode ser isolado usandominicolunas QIAGEN® RNeasy. Outros estojos de isolamento de RNA co-mercialmente disponíveis incluem MASTERPURE®. Complete DNA andRNA Purification Kit (EPICENTRE® Madison1 Wis.) e Paraffin Block RNAIsolation Kit (Ambion, Inc.). RNA total de amostras de tecido pode ser isoladousando RNA Stat-60 (Tel-Test). RNA preparado uma amostra biológica podeser isolado, por exemplo, através de centrifugação de gradiente de densida-de de cloreto de césio.
Métodos para quantificação de mRNA são bem-conhecidos natécnica. Em um exemplo, o método utiliza reação em cadeia de polimerasede transcriptase reversa (RT-PCR). Geralmente, a primeira etapa em traça-do de perfil de expressão de gene através de RT-PCR é a transcrição rever-sa do molde de RNA em cDNA, seguido por sua amplificação exponencialem uma reação PCR. As duas transcriptases reversas mais comumente u-sadas são transcriptase reversa do vírus de mieloblastose de ave (AMV-RT)e transcriptase reversa do vírus da leucemia de murino Moloney (MMLV-RT).
A etapa de transcrição reversa é tipicamente iniciada usando iniciadores es-pecíficos, hexâmeros aleatórios ou iniciadores oligo-dT, dependendo dascircunstâncias e do objetivo de traçado de perfil. Por exemplo, RNA extraídopode ser transcrito reverso usando um GeneAmp RNA PCR Kit (Perkin El-mer, Calif., USA), seguindo as instruções do fabricante. O cDNA derivadopode ser então usado como um molde na reação PCR subseqüente.
Embora a etapa de PCR possa usar uma variedade de polime-rases de DNA dependentes de DNA termoestável, ela tipicamente empregaa Taq DNA polimerase, que tem uma atividade de 5'-3' nuclease mas nãotem uma atividade de 3'-5' endonuclease revisora. Então, TaqMan® PCRtipicamente utiliza a atividade de 5'-nuclease de Taq ou Tth polimerase parahidrolisar uma sonda de hibridização ligada a seu amplicon alvo, mas qual-quer enzima com atividade de 5' nuclease equivalente pode ser usada. Doisiniciadores de oligonucleotídeo são usados para gerar um amplicon típico deuma reação PCR. Um terceiro oligonucleotídeo, ou sonda, é projetado paradetectar seqüência de nucleotídeo localizada entre os dois iniciadores dePCR. A sonda é não-extensível através da enzima Taq DNA polimerase, e émarcada com um corante fluorescente repórter e um corante fluorescente deextinção. Qualquer emissão induzida por laser do corante repórter é extintapelo corante de extinção quando os dois corantes estão localizados próxi-mos como eles estão na sonda. Durante a reação de amplificação, a enzimaTaq DNA polimerase cliva a sonda de uma maneira dependente do molde.Os fragmentos de sonda resultantes dissociam em solução, e sinal do coran-te repórter liberado é livre do efeito de extinção do segundo fluorforo. Umamolécula de corante repórter é liberada para cada nova molécula sintetizada,e detecção do corante repórter não-extinto provê a base para interpretaçãoquantitativa dos dados.
TAQMAN® RT-PCR pode ser realizada usando equipamentocomercialmente disponível, tal como, por exemplo, ABI PRISM 7700® Se-quence Detection System. TM. (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, FosterCity, Calif., USA), ou Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Manne-heim, Alemanha). Em uma modalidade, o procedimento de 5' nuclease érealizado em um dispositivo de PCR quantitativa de tempo real tal como oABI PRISM 7700®. Sequence Detection System®. O sistema inclui termoci-clizador, laser, dispositivo acoplado à carga (CCD), câmera e computador. Osistema amplifica amostras em um formato de 96 cavidades em um termoci-clizador. Durante amplificação, sinal fluorescente induzido por laser é coleta-do em tempo real através de cabos de fibra óptica para todas as 96 cavida-des, e detectado no CCD. O sistema inclui software para ativar o instrumentoe para análise dos dados.
Em alguns exemplos, dados de ensaio de 5'-nuclease são inici-almente expressos como Ct, ou o ciclo limiar. Conforme acima discutido,valores de fluorescência são registrados durante cada ciclo e representam aquantidade de produto amplificado para aquele ponto na reação de amplifi-cação. O ponto quando o sinal fluorescente é primeiro registrado como esta-tisticamente significante é o ciclo limiar (Ct).Para minimizar erros e o efeito de variação amostra-para-amostra, RT-PCR pode ser realizada usando um padrão interno. O padrãointerno ideal é expresso em um nível constante dentre tecidos diferentes, e énão-afetado pelo tratamento experimental. RNAs mais freqüentemente usa-dos para normalizar padrões de expressão de gene são mRNAs para os ge-nes de manutenção gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), beta-actina e RNA ribossomal 18S.
Uma variação mais recente da técnica de RT-PCR é a PCRquantitativa em tempo real, que mede o acúmulo de produto de PCR atravésde uma sonda fluorigênica duplamente marcada (isto é, sonda TAQMAN®).PCR em tempo real é compatível com ambas PCR competitiva quantitativa,onde competidor interno para cada seqüência alvo é usado para normaliza-ção, e com PCR comparativa quantitativa usando um gene de normalizaçãocontido dentro da amostra, ou um gene de manutenção para RT-PCR (videHeld e outros, Genome Research 6:986 994, 1996). PCR quantitativa é tam-bém descrita na Patente U.S. Ne 5.538.848, cuja descrição é aqui incorpora-da a título de referência. Sondas e procedimentos de amplificação quantitati-vos relacionados são descritos na Patente U.S. Nq 5.716.784 e Patente U.S.N9 5.723.591, cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência.Instrumentos para realização de PCR quantitativa em placas de microtitula-ção estão disponíveis da PE Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive,Foster City, Calif. 94404 sob a marca registrada ABI PRISM® 7700.
As etapas de um protocolo representativo para quantificação deexpressão de gene usando tecidos embebidos em parafina, fixados, comouma fonte de RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão eamplificação de iniciador são dadas em vários artigos de jornal publicados(vide Godfrey e outros, J. Molec. Diagnostics 2:84 91, 2000; K. Specht e ou-tros, Am. J. Pathol. 158:419 29, 2001). Resumidamente, um processo repre-sentativo começa com corte de seções de cerca de 10 pm de espessura deamostra de tecido embebido em parafina. O RNA é então extraído, e proteí-na e DNA são removidos. Após análise da concentração de RNA, etapas dereparo e/ou amplificação de RNA podem ser incluídas, se necessário, e RNAé transcrito reverso usando promotores específicos de gene seguido por RT-PCR.
Um procedimento de amplificação de ácido nucléico quantitativoalternativo é descrito na Patente U.S. Nq 5.219.727, que é aqui incorporadaa título de referência. Neste procedimento, a quantidade de uma seqüênciaalvo em uma amostra é determinada através de amplificação simultânea daseqüência alvo e um segmento de ácido nucléico de padrão interno. A quan-tidade de DNA amplificado de cada segmento é determinada e comparadacom uma curva padrão para determinar a quantidade de segmento de ácidonucléico alvo que estava presente na amostra antes da amplificação.
Em algumas modalidades deste método, a expressão de um ge-ne "de manutenção" ou "controle interno" pode ser também avaliada. Essestermos pretendem incluir qualquer gene constitutivamente ou globalmenteexpresso cuja presença permite uma varredura de níveis de mRNA de cito-cina. Tal varredura compreende uma determinação do nível constitutivo ge-ral de transcrição de gene e um controle para variações em recuperação deRNA.
Monitoramento da Progressão de uma Infeccão e/ou Eficácia de Terapia
Em várias modalidades, os métodos de diagnóstico descritos aqui são usados para monitoramento da progressão de uma infecção comMycobacterium. Nesta modalidade, ensaios conforme acima descrito para odiagnóstico de uma infecção com Mycobacterium podem ser realizados como tempo, e a mudança no nível de polipeptídeo(s) reativo(s) avaliada. Porexemplo, os ensaios podem ser realizados mais ou menos a cada 12, 24,36, 48, 60 ou 72 horas durante um período especificado, tal como durantemeses ou semanas, e em seguida realizado conforme necessário.
Em alguns exemplos, a presença de um polipeptídeo de Mtb, ouum polinucleotídeo codificando o polipeptídeo, é ensaiada. Geralmente, ainfecção com Mycobacterium está progredindo naqueles pacientes em que onível de polipeptídeo (tal como detectado usando um agente de ligação), onível de polinucleotídeo, o nível de anticorpos ou o nível de células T aumen-ta com o tempo. Em contraste, a infecção com Mycobacterium não está pro-gredindo quando o nível de polipeptídeo reativo, o nível de polinucleotídeo, onível de anticorpos ou o nível de células T ou permanece constante ou dimi-nui com o tempo. Desta maneira, a eficácia de um regime terapêutico parti-cular pode ser avaliada.
Em uma modalidade, a presença de um polipeptídeo de Mtb éavaliada em um indivíduo. O indivíduo é administrado com um protocolo te-rapêutico. A presença do polipeptídeo de Mtb é então avaliada. Um aumentoou nenhuma mudança na quantidade do polipeptídeo de Mtb (ou polinucleo-tídeo) conforme comparado com a quantidade do polipeptídeo de Mtb antesda administração do protocolo terapêutico indica que o protocolo terapêuticonão é eficaz, e a infecção com Mtb está progredindo. Uma diminuição naquantidade do polipeptídeo de Mtb (ou polinucleotídeo) conforme comparadocom a quantidade de polipeptídeo de Mtb (ou polinucleotídeo) antes da ad-ministração do protocolo terapêutico indica que o protocolo terapêutico éeficaz, e que a infecção com Mtb não está progredindo.
Em outra modalidade, a presença de células T, tal como célulasT CD8+ e/ou células T CD4+, que especificamente reconhecem um polipeptí-deo de Mtb é avaliada em um indivíduo. O indivíduo é administrado com umprotocolo terapêutico. A presença das células T que especificamente reco-nhecem o polipeptídeo de Mtb é então avaliada. Uma diminuição ou nenhu-ma mudança na quantidade de células T CD 8+ e/ou células T CD4+ que es-pecificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb conforme comparado coma quantidade de células T CD8+ e/ou células T CD4+, respectivamente, queespecificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb antes da administraçãodo protocolo terapêutico indica que o protocolo terapêutico não é eficaz. Umaumento na quantidade de células T CD8+ e/ou células T CD4+ que especifi-camente reconhecem o polipeptídeo de Mtb conforme comparado com aquantidade das células T CD8+ e/ou células T CD4+ que especificamentereconhecem o polipeptídeo de Mtb antes da administração do protocolo te-rapêutico indica que o protocolo terapêutico é eficaz.
Deve ser notado que para qualquer um dos ensaios acima des-critos, para melhorar sensibilidade, marcadores de Mycobacterium múltiplospodem ser avaliados dentro de uma dada amostra. Ficará aparente que osensaios descritos aqui podem ser usados em combinação. Então, conjuntosde polipeptídeos de Mycobacterium e combinações de ensaios podem serpara sensibilidade e especificidade ótimas.
Vários outros protocolos de ensaio existem que são adequadospara uso com os polipeptídeos da presente invenção. As descrições acimapretendem ser exemplares apenas.
A descrição é ilustrada pelos Exemplos não-limitantes que seguem.
EXEMPLOS
Para muitas infecções, o repertório da resposta de CD8 é mol-dado pela entrada de antígeno no curso de processamento de MHC-I, liga-ção de antígenos de peptídeos e/ou não-peptídeo a moléculas do MHC-I1 ereconhecimento dessas estruturas pelas células T. Por fim, um subconjuntorelativamente limitado de células T específicas de patógeno emerge. Emboravários antígenos de Mtb de CD4 geralmente reconhecidos tenham sido des-critos (Reed e outros, Microbes Infect. 7:922-931, 2005) (ESAT-6, CFP10,Ag85, etc), surpreendentemente pouco se sabe sobre antígenos de Mtb co-muns reconhecidos por células T CD8+ humanas. A maioria dos epítopos deCD8 que foram identificados foi definida pelo teste de peptídeos de Mtb se-lecionado quanto à ligação de alta afinidade a moléculas do MHC Classe Ia(HLA-2 na maioria dos casos (vide, por exemplo, Lalvania, Microbes Infect.7:922-931, 1998)). Em quase todos desses, no entanto, a freqüência ex vivodessas células T em indivíduos infectados com Mtb é baixa ou indetectável,sugerindo que essas especificidades podem não representar respostas imu-nodominantes. Em contraste, nos casos limitados onde células T foram usa-das para definir epítopos contidos em antígenos de Mtb selecionados, fre-qüências ex vivo altas foram demonstradas (vide Lewinsohn e outros. Am. J.Respir. Cirt. Care Med. 166:843-848, 2002), sugerindo que uma abordagemcentrada em célula T pode identificar epítopos imunodominantes. Além dis-so, respostas de célula T CD8 a alguns antígenos de Mtb que representambons antígenos de CD4 (CFP10, ESAT-6, Ag85 e Mtb39) foram detectadasem alta freqüência em pessoas infectadas com Mtb. Então, uma bibliotecalimitada de peptídeos sintéticos de sobreposição representando vários antí-genos de Mtb de CD4 foi usada para determinar a magnitude da resposta deCD8 a esses antígenos em pessoas com tuberculose (TB) ativa e infecçãocom tuberculose latente (LTBI) bem como indivíduo não-infectados. Ainda,um painel de clones de célula T CD8+ específica de Mtb foi utilizado paradefinir epítopos mínimos reconhecidos dentro desses antígenos e determi-nou a contribuição desses novos epítopos para a resposta de CD8 específi-ca de Mtb.
Exemplo 1
Materiais e Métodos
Indivíduos humanos. Indivíduos não-infectados foram definidoscomo indivíduos saudáveis com um teste de pele de tuberculina negativo(TST) e quaisquer fatores de risco conhecidos para infecção com Mtb. Indi- víduos com LTBI foram definidos como pessoas saudáveis com um TST po-sitivo e quaisquer sintomas e sinais de TB ativa. Em todos os casos de TBativa, TB pulmonar foi diagnosticada pelo TB Controller da região e confir-mada por cultura de esputo positiva para Mycobacterium tuberculosis. Célu-las mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas de sangueintegral obtido através de venipunção e aférese.
Meios e Reagentes. Meio de cultura consistia em RPMI 1640suplementado com Soro bovino fetal a 10% (FBS; Bio Whittaker), 5 X 10"5M2 ME (Sigma-AIdrich) e glutamina a 2 mM (GIBCO BRL). Para o cultivo eensaio de clones de célula T reativa a Mtb, RMPI 1640 foi suplementadocom soro humano a 10%. Cepa de Mtb H37Rv foi obtida da American TypeCulture Collection (Rockville, MD) e preparada conforme previamente descri-to (Lewinsohn e outros, J. Immunol., 165:925-930, 2000). Peptídeos foramsintetizados através da Genemed Synthesis, Inc., (São Francisco, CA). Gru-pos de peptídeo sintético consistiam em 15 mers se sobrepondo em 11 ami-noácidos (aa) representando proteínas de Mtb demonstradas ser antígenosde CD4 potentes. Grupos de peptídeo representando CDP-10 (Berthet e ou-tros, Microbiology 144:3195-3203, 1998; Dillon e outros, J. Clin. Microbioi38:3285-3290, 2000), ESAT-6 (Sorenson e outros, Infect. Immun. 63:171 Ο-Ι 717, 1995), Mtb39a (dois grupos, A&B, referência) (Dillon e outros, Infect.Immun. 67:2941-2950, 1999), Mtb8.4 (Coler e outros, J. Immunol. 161:2356-2364, 1998), Mtb 9.9 (Alderson e outros, J. Exp. Med. 191:551-560, 2000),(Coler e outros, J. Immunol. 161:2356-2364, 1998), Mtb 9.9 (Alderons e ou-tros, J. Exp. Med. 191:551-560, 2000), EsxG (Rosenkrands e outros, Elec-trophoresis 21:3740-3756, 2002), antígeno de 19 kDa (Collins e outros, J.Gen. Mlcrobiol. 136:1429-1436, 1990), antígeno 85b (Borremans e outros,Infect. Immun. 57:3132-3130, 1989) (dois grupos, A&B, referência) foramsintetizados. Peptídeos foram ressuspensos em DMSO e até 50 peptídeosforam combinados em um grupo de modo que cada peptídeo no grupo esta-va em uma concentração de 1 mg/ml. Grupos de peptídeo foram armazena-dos a-809C.
Cepas de Célula e Clones de Célula T. Cepas de célula B trans-formadas com EBV, LCL, ou foram geradas usando sobrenadantes da cepade célula 9B5-8 (American Type Cultura Collection) ou obtidas do NationalMarrow Donor Program (NMDP; Mineápolis, MN). LCL foram mantidas atra-vés de passagem contínua conforme previamente descrito (Heinzel e outros,J. Exp. Med. 196:1437-1481, 2002). Clones de célula T específica de Mtbforam isolados de indivíduos com LTBI ou tuberculose ativa, usando DCsinfectadas com Mtb e metodologia de clonagem de diluição Iimitante confor-me previamente descrito (Lewinsohn e outros, J. Immunol. 165:925-930,2000). Rapidamente, células T CD8+ foram isoladas de PBMC usando sele-ção negativa usando contas revestidas com anticorpo CD4 e então seleçãopositiva usando contas magnéticas revestidas com anticorpo CD8 pelas ins-truções do fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn CA) ou através de citometriade fluxo. Neste caso, (BD Bioscience Nq Cat. 555347) células negativasCD4-PE, positivas CD8-APC (BD Bioscience, N9 Cat. 555369) (pureza>99%) foram selecionadas em um Becton Dickenson LSR II. Células T foramsemeadas em várias concentrações na presença de uma CD infectada comMtb autóloga irradiada 1 χ 105, gerada conforme descrito abaixo, e rlL-2 (5ng/ml) em meio de cultura celular consistindo em 200 μΙ de RPMI 1640 su-plementado com soro humano a 10%. Cavidades exibindo crescimento entre10-14 dias foram avaliadas quanto à especificidade de Mtb usando ELISPOTe DC infectadas com Mtb como uma fonte de APCs. Células T retendo es-pecificidade de Mtb foram fenotipadas adicionalmente quanto à expressãodo receptor de célula T αβ e expressão de CD8 através de FACS e expandi-das conforme descrito abaixo. Uso de Vβ foi determinado usando o IOTestBeta Mark Kit da Beckman Coulter.
Expansão de clones de célula T. Para expandir os clones de cé-lulas T CD8+, um protocolo de expansão rápida usando estimulação de mABanti-CD3 foi usado conforme anteriormente descrito (Heinzel e outros, J.- Exp. Med. 196:1473-1481, 2002).
Geração e Infecção de DC de Sangue Periférico. DCs derivadasde monócito foram preparadas (Heinzel e outros, supra-, Romani e outros, J.Exp. Med. 180:83-93, 1994). Para gerar DC infectada com Mtb, células (1 χ106) foram culturadas da noite para o dia na presença de Mtb (multiplicidadede infecção [MOI] = 50:1). Após 18 horas, as células foram colhidas e res-suspensas em RPMI/soro humano a 10%.
Ensaios de ligação de MHC. O ensaio de ligação de MHC-peptídeo utilizado mede a habilidade de Iigantes de peptídeo em inibir a Iiga-ção de um peptídeo radiomarcado a moléculas de MHC purificadas, e foidescrito em detalhes em outro lugar (Sidney e outros, 1999. "UNIT 18.3 Me-asurement of MHC/peptide interactions by gel filtration". In Current Protocolsin Immunology. Coligan e outros, eds., John Wiley & Sons, Inc., 1996). Rapi-damente, moléculas de MHC purificadas, peptídeos de teste e um peptídeode sonda radiomarcado foram incubados em temperatura ambiente na pre-sença de microglobulina B2 humana e um coquetel de inibidores de protea-se. Após uma incubação de dois dias, ligação do peptídeo radiomarcado àmolécula do MHC classe I correspondente foi determinada através da captu-ra de complexos de MHC/peptídeo em placas revestidas com anticorpoW6/32 (anti-HLA A, B e C) ou B123.2 (anti-HLA B, C e um pouco de A), econtagens ligadas por minuto (cpm) foram medidas usando um contador demicrocintilação. Para ensaios de competição, a concentração de peptídeodando 50% de inibição da ligação do peptídeo radiomarcado foi calculada.Peptídeos foram tipicamente testados em seis concentrações diferentes co-brindo uma faixa de dose de 100.000 vezes, e em três ou mais ensaios in-dependentes. Sob as condições utilizadas, onde [marcador]<[MHC] e IC50 ^[MHC], os valores de IC5o medidos são aproximações razoáveis dos valoresKd verdadeiros.
Ensaio ELISPOT IFN-γ. O ensaio ELISPOT IFN-γ foi realizadoconforme previamente descrito (Beckman e outros, J. Immunol. 157:2795-2803, 1996). Para determinação de freqüências ex vivo de células T CD4+ou CD8+ respondendo à infecção com Mtb ou antígenos de Mtb, células TCD4+ ou CD8+ foram positivamente selecionadas de PBMC usando contasmagnéticas (Miltenyi Biotec, Auburn CA) como uma fonte de células T res-pondedoras e testadas em duplicata em quatro concentrações diferentes.DC autólogas (20.000 células/cavidade) foram usadas como APC e DC fo-ram ou infectadas com Mtb ou pulsadas com grupos de peptídeo (5 pg/ml,concentração final de cada peptídeo) e então adicionadas ao ensaio. Paraensaio usando clones de célula T, células T (1000 ou 5000 células/cavidade)foram incubadas com LCL autóloga (20.000 células/cavidade) na presençaou ausência de antígeno.
Análise de dados: Para determinar a freqüência ex vivo de célu-las T específicas de antígeno, o número médio de manchas por cavidadepara cada duplicata foi posto em gráfico contra o número de células respon-dedoras por cavidade. Análise de regressão linear foi usada para determinara inclinação da linha, que representa a freqüência de células T específicasde antígeno. O ensaio é considerado positivo, isto é, refletindo a presençade uma resposta de célula T iniciada, se a probabilidade binominal (Lewin-shon e outros, Microbes Infect. 8:2587-2598, 2006) para o número de man-chas for significantemente diferente através de ensaios experimentais e decontrole. Para determinar diferenças em freqüências de célula T ex vivo en-tre grupos análise Wilcoxon/Kruskal foi usada.Exemplo 2
Definição de Antíqenos de CD8+ Específicos de Mtb Imunodominantes
Para definir antígenos de CD8+ específicos de Mtb imunodomi-nantes, e para determinar se ou não essas respostas resultam da infecçãocom Mtb, células T CD8+ foram usadas de doadores não-infectados, comLTBI, ou ativamente infectados com Mtb. Respostas foram determinadas oudiretamente ex vivo ou usando clones de célula T CD8+ obtidos através declonagem de diluição Iimitante em DC autóloga infectada com Mtb (Lewing-sohn e outros, J. Immunol. 165:925-930, 2000). Como muito é conhecidosobre antígeno de Mtb de CD4+, um painel desses antígenos geralmenteconhecidos foi selecionado para varredura adicional. Esses foram: Mtb39,CPF10 e Mtb8.4, Mtb9.9, ESAT-6, Ag85b, 19 KDa e EsxG. Para evitar influ-ência introduzida usando peptídeos de especificidade de ligação de HLAprevista, foram sintetizados peptídeos de sobreposição (15 aa, sobreposição11 aa) para representar as proteínas de interesse (Lewinshon e outros, J.Immunol. 166:439-446, 2001).
Para determinar precisamente as freqüências de célula efetoraex vivo de células T CD8+, análise de regressão linear foi usada. Conformemostrado na Figura 1, células T CD8+ purificadas com conta magnética fo-ram testadas contra DC pulsada com peptídeo em uma faixa de números decélulas T CD8+ em um ensaio ELISPOT IFN-γ. Um ensaio positivo foi deter-minado conforme descrito abaixo e, se positivo, a freqüência específica deantígeno seria determinada usando regressão linear.
Indivíduos não-infectados (n = 14), aqueles com LTBI (n = 20) eaqueles com TB ativa (n = 12) foram avaliados quanto a respostas de CD8+para um painel de antígenos de célula T CD4+ Mtb, bem como DC infectadacom Mtb. Todos os indivíduos testados tinham respostas de célula T CD8+robustas para DC infectada com Mtb e eram de magnitude maior em indiví-duos com TB ativa do que naqueles com TLBI (p = 0,01; Figura 2, Tabela I).No entanto, respostas de célula T CD8+ para o painel de antígenos de Mtbforam encontradas quase exclusivamente naqueles infectados com Mtb peloque diferenças estatisticamente significantes entre indivíduos não-infectadose infectados com Mtb foram notadas para sete de dez antígenos para ambasa magnitude da resposta (Figura 2) e a proporção de ensaios positivos (Ta-bela I).
Tabela I.
Respostas de célula T CD8+a antígenos de TB conhecidos
<table>table see original document page 84</column></row><table>
aEnsaio positivo definido no texto.
No entanto diferenças em respostas de célula T CD8+ entre indi-víduos com TB ativa e LTBI não foram estatisticamente diferentes. Emborarespostas de célula T CD8+ fortes fossem observadas contra muitos dos an-tígenos testados, é igualmente notado que vários indivíduos com respostasde célula T CD8+ direcionadas a Mtb fortes não tiveram respostas demons-tráveis a muitos dos antígenos testados.
Esses dados de freqüência ex vivo demonstram a presença derespostas de alta freqüência a vários antígenos de Mtb conhecidos, mas nãoesclarece alelo de restrição, epítopo mínimo ou hierarquia de dominânciadentro do gene de interesse. Para se direcionar a esta questão, clonagem dediluição Iimitante de células T CD8+ humanas usando DC infectada com Mtbfoi realizada (vide Lewinsohn e outros, J. Immunol. 166:439-446, 2001) epainéis de ambos clones de célula T CD8+ classicamente e não-classica-mente restritos a HLA foram gerados. Usando grupos de peptídeo represen-tando antígenos de CD4+ conhecidos, a especificidade antigênica dos clonesrestritos a HLA-Ia pode ser definida em mais da metade dos clones (Tabela I).
Tabela II.
Muitos clones de célula T CD8+ reconhecem antígenos decélula T CD4+ conhecidos
<table>table see original document page 85</column></row><table>
aNúmero de clones derivados de doador.bNúmero de clones para os quais antígeno cognato foi identificado.cNúmero total de antígenos distintos identificados do conjunto de clone.dNúmero total de epítopos distintos identificados do conjunto de clone.
Esta abordagem é mostrada em detalhes para um clone repre-sentativo único, D466 D6, derivado de um indivíduo com TB ativa. Conformemostrado na Figura 3A, teste do clone contra DC autóloga pulsada com umpainel de grupos de peptídeo definiu sem ambigüidade a especificidade anti-gênica como CFP10. O clone foi então testado contra cada um dos peptí-deos de 15 mer que compreende o grupo CFP10, revelando que o epítopoestava contido dentro de CFP101-15 (Figura 3B). Cada peptídeo 8 aa, 9 aa,10 aa e 11 aa possível foi então sintetizado e testado quanto à reatividade,revelando atividade antigênica entre aa 2-11 (Figura 3C). Similarmente, cadaclone foi testado contra cepas de célula linfoblastóide (LCL) compartilhandopelo menos um tipo de HLA com o doador (Figura 3D).
LCL autóloga e LCL IHW 9058, que compartilham B4501 eC1601, apresentam o epítopo para o clone, identificando ambos B4501 eC1601 como possíveis alelos de restrição. No entanto, CLC C1601+ D433não apresentam o epítopo, eliminando C1601 como um alelo de restriçãocandidato. Deste modo D466 D6 é restrito por HLA-B4501. Conforme de-monstrado na Figura 4, através do teste de cada epítopo plausível em umaampla faixa de concentrações, o epítopo mínimo foi definido como CFP10-210 para D466 D6. Dados experimentais apoiando a designação do epítopomínimo são providos para cada clone na Figura suplementar. Um sumário daespecificidade antigênica, epítopo mínimo e alelo de restrição de HLA é a-presentado na Tabela III. Inesperadamente, todos exceto um dos clones decélula T foram restritos por alelos de HLA-B. Ainda, uma minoria daquelesobservados eram 9 aa de comprimento.<table>table see original document page 87</column></row><table>Devido ao fato de que cada um dos clones de célula T CD8+ in-dividuais foi derivado com base em cultivo de DC infectada com Mtb1 foi de-terminado se ou não o antígeno e epítopos identificados refletiam epítoposimunodominantes ex vivo. Duas abordagens independentes foram seguidas,a primeira para determinar se a resposta estava presente em alta freqüênciae a segunda para determinar qual proporção da resposta total ao antígeno éconstituída pelo antígeno. Para determinar a freqüência de célula efetora exvivo, conforme descrito na Figura 1, cada epítopo foi testado usando DC au-tóloga e células T CD8+ purificadas com conta magnética do doador do qualos clones de célula T foram isolados. Um sumário das freqüências de célulaefetora é apresentado na Tabela III. Para a maioria, os epítopos refletemrespostas de alta freqüência, e então poderiam ser considerados uma res-posta que foi iniciada pela exposição a Mtb. Notavelmente, clones de célulaT isolados de quatro doadores reconhecidos CFP10. Para determinar se osepítopos definidos refletiam uma proporção substancial da resposta total áoantígeno de interesse, células T CD8+ purificadas com conta magnética detrês doadores com células mononucleares de sangue periférico (PMBC) dis-poníveis suficientes foram testadas quanto à reatividade a cada peptídeo de15-mer individual, o grupo de peptídeo e peptídeo representando o epítopomínimo. Como é demonstrado na Figura 5, as freqüências ex vivo para oepítopo mínimo, peptídeo(s) de 15-mer contendo o epítopo mínimo e grupode peptídeo foram notavelmente concordantes. Esses dados sugerem quepara cada doador a hierarquia de dominância foi claramente estabelecida, eé refletida nos clones originais. Finalmente, como é notado na Tabela III,clones filhas de especificidade idêntica foram freqüentemente identificadas,um resultado que seria previsto com base em uma hierarquia de imunodo-minância. Tingimento com TCR V beta foi usado para confirmar a relaçãoclonal entre clones filhas. Interessantemente, em dois casos, o epítopo mí-nimo idêntico e restrição por HLA foram representados por dois clones distin-tos (Tabela III).
Devido ao fato de que muito trabalho em respostas de célula TCD8+ humana para Mtb se apoiou no uso de algoritmos de previsão de HLA,conforme cada epítopo era definido era perguntado se ou não os epítoposteriam sido previstos através dessas abordagens. Muitos desses epítopos nãoforam classificados fortemente. Isto poderia destacar as limitações desses algo-ritmos no momento em que eles foram usados. Para se endereçar a esta ques-tão experimentalmente, a IC5o de cada peptídeo que tinha sido sintetizado nocurso da definição do epítopo mínimo foi determinada contra um painel de mo-léculas de HLA humana. É mostrada na Tabela III a IC5o para o epítopo mínimocom o alelo de restrição cognato. Os dados demonstraram que os epítopos decélula T ligaram avidamente a HLA1 e mostram um alto grau de concordânciaentre os dados de epítopo de célula T e dados de ligação de HLA.
Os dados demonstraram que respostas de célula T CD8+ estãopresentes em pessoas infectadas com Mtb em freqüências que são compa-ráveis com aqueles vistas seguindo muitas infecções virais comuns tal comovaccínia, influenza e CMV. Todos exceto um dos epítopos que foram mape-ados foram restritos por moléculas de HLA-B. Os dados sugerem que usan-do uma abordagem guiada por célula T para identificação de epítopo, epíto-pos dominantes podem ser definidos em humanos infectados com Mtb.
Exemplo 3
Varredura de clones de célula T contra uma biblioteca de peptídeo genômico
Os clones de célula T classicamente restritos e não-classica-mente restritos (vide Tabela II acima) que não reconheceram um dos gruposde peptídeo de antígeno de Mtb conhecidos (Rv3875, Rv3874, Rv1886c,Rv0287, Rv3763, Rv1174, Rv1196, Rv1793, Rv2346c, Rv1037c, Rv3619c eRv1198) foram avaliados contra uma biblioteca de peptídeo genômico. Estabiblioteca de peptídeo representa 389 genes, representando aproximada-mente 10% do genoma de Mtb. Os peptídeos são de 15 mers se sobrepondo11 para cada produto de gene. 50 nmols de cada peptídeo foram sintetiza-dos individualmente e então agrupados em 777 grupos de 50 peptídeos emum formato de 96 cavidades (nove placas). Cinco cavidades vazias e umacavidade de um grupo de peptídeo irrelevante, SIV gag, foram incluídas emcada uma das nove placas. Para avaliar os clones contra a biblioteca depeptídeo genômico, os clones são primeiro expandidos e testados contraDCs infectadas com Mtb para assegurar que cada clone desta expansãoparticular dê um sinal específico de Mtb robusto no ensaio ELISPOT. Entãoaté seis clones de célula T são agrupados. Para a varredura, clones de célu-la T (5.000 células/cavidade de cada clone), DCs autólogas (20.000 célu-Ias/cavidade), IL-2 (0,5 ng/ml) e os grupos de peptídeo (5 ug/ml, peptídeosindividuais) foram incubados da noite para o dia a 379 C no ensaio ELISPOT.
Apenas uma réplica técnica é feita por grupo porque 5000 clones de célula Tpor cavidade com um antígeno de peptídeo produziram uma resposta positi-va esmagadora, resultando em um resultado definitivo. Seis clones clássicosde D504 foram avaliados contra a biblioteca de peptídeo genômica, levandoao encontro de um novo epítopo. Este epítopo era da família de quatro pro-teínas que inclui EsxJ, EsxW, EsxK e EsxP. Essas proteínas compartilham98% de homologia e diferem em apenas 3 aminoácidos. Há um quinto mem-bro desta família, EsxM (Rv1792), que não estava incluído na biblioteca depeptídeo genômico.
Os clones foram avaliados contra os quinze mers individuais pa-ra esses grupos de peptídeo. Todos os seis clones clássicos reconheceramEsxJ 21-35. Esta é uma região de EsxJ que é idêntica as outros quatromembros desta família. Em seguida, peptídeos de 9, 10 e 11 mers foramfeitos destes 15 mers e avaliados contra cada clone. O epítopo mínimo foideterminado ser EsxJ 24-34. Em adição, a restrição por HLA foi verificadaser B5701.
Exemplo 4
Varredura adicional de clones de célula T contra uma biblioteca de peptídeogenômico
Onze clones clássicos de D432B foram avaliados contra a bibliote-ca de peptídeo genômico descrita acima. O antígeno foi determinado para doisclones, que levaram à identificação de dois novos epítopos, PE_PGRS4247.55ePE953-67- O epítopo mínimo para um clone foi determinado ser PE_PGRS4247.55e a restrição por HLA foi verificada ser B3514.0 epítopo mínimo para o outroclone não é ainda determinado, mas está contido no PE953-67 de 15 mer. A res-trição por HLA para este clone foi verificada ser B3905.<table>table see original document page 91</column></row><table><table>table see original document page 92</column></row><table>Exemplo 5
Varredura de células T CD8+ ex vivo contra uma biblioteca de peptídeo qe-nômica
Células T CD8+ de doador LTBI, D610 (SE Asian), foram avalia-das contra a biblioteca de peptídeo genômica descrita acima. Cada placa dabiblioteca de peptídeo genômica foi avaliada em duplicata, para um total de18 placas ELISPOT por varredura. Células T CD8+ foram preparadas dePBMC criopreservadas por seleção de CD8+ usando separação de contamagnética. Populações de célula resultantes continham □ 96% de células TCD8+. Células T CD8+ (250.000 células/cavidade), DC autólogas (20.000células/cavidade) e IL-2 (0,5 ng/ml) foram adicionadas a peptídeo (final 5ug/ml, peptídeos individuais) em placas ELISPOT. Cinco cavidades de con-trole médias são incluídas em cada placa. Para cada placa, a média dessascinco cavidades foi subtraída de cada cavidade daquela placa para normali-zar entre as placas. Cada replicação técnica em cada placa foi então scored.Uma cavidade foi marcada positiva se as unidades de formação de mancha(SFU), menos a média das cavidades médias, fosse maior do que ou igual adez e a SFU fosse maior do que ou igual a duas vezes a média da média(Hudgens e outros, J. Immunol. Methods. 288:19-34, 2004). Este doadorrespondeu às quatro cavidades de peptídeo contendo EsxJ, EsxW, EsxK eEsxP. Células T CD8+ foram então avaliadas contra cada 15 mer dessesgrupos de peptídeo e verificadas responder a apenas EsxJ 21-35, a mesmaregião de EsxJ, EsxW, EsxK e EsXP que é descrita no exemplo 3 acima.
Sete doadores adicionais foram avaliados contra a biblioteca depeptídeo genômico. As 10 primeiras respostas são detalhadas na Tabela 7.Os quatro grupos de peptídeo destacados em amarelo contêm peptídeos deapenas um gene. Esses quatro genes contêm quatro nove epítopos.Tabela 7.
10 Principais Respostas de Varreduras de Grupo de Peptídeo de Sete Doa-dores. Unidades de Formação de Mancha são para 250.000 Células T CD8+
<table>table see original document page 94</column></row><table>
Exemplo 6
Modelos animais
Em pesquisa de tuberculose, o modelo de camundongo foi usa-do extensivamente para modelo de vários aspectos da doença. Camundon-gos podem ser infectados por uma variedade de vias incluindo intravenosa,intraperitoneal e traqueal. Uma via é aerossolização do organismo para in-fecção respiratória. Os camundongos são expostos ao aerossol em umacâmara (corpo inteiro enfraquecido ou infecção apenas no nariz). A dose dainvenção pode ser variada manipulando a concentração de Mtb no nebuliza-dor ou tempo de exposição. Uma infecção de dose baixa, tal como cerca de50 unidades de formação de colônia (UFC) através de aerossol resulta emum aumento lento e uniforme em números bacterianos nos pulmões, geral-mente atingido um pico em quatro semanas, que coincide com o número depico de células T nos pulmões. O período inicial é considerado o estágio a-gudo de infecção. Seguindo infecção, há uma disseminação de bactériaspara os nós linfáticos mediastinais. Inicialização de célula T é geralmentedetectável entre duas e três semanas. Após cerca de quatro semanas osnúmeros bacterianos estabilizam, e há uma resposta patológica progressivalenta. Este sistema é de uso para modelagem da infecção ativa.
A habilidade de uma composição de interesse em prevenir infec-ção em um modelo animal pode ser avaliada usando o método descrito aqui.A eficácia da composição de interesse pode ser monitorada através da me-dição da resposta de célula T, tal como o número de células T CD8+ ouCD4+ respondendo a um polipeptídeo de Mtb em uma amostra biológica.Para esses ensaios células T com um são contatadas com pelo menos umpolipeptídeo de Mycobacterium, e uma célula apresentando antígeno apre-sentando o um ou mais polipeptídeos de Mycobacterium. Os polipeptídeosde Mycobacterium incluem a seqüência de aminoácido mostrada como (a)uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ IDNO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ IDNO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID N0:10, SEQ ID NO:11 ou SEQID NO: 12; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelomenos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID N0:10,SEQ ID N0:11 ou SEQ ID N0:12, onde os nove a vinte aminoácidos conse-cutivos especificamente se ligam a complexo de histocompatibilidade princi-pal (MHC) classe I. É determinado se as células T reconhecem especifica-mente o polipeptídeo de Mycobacterium. Um aumento no número de célulasT que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb indica que a com-posição é eficaz.
Modelos animais exemplares são descritos abaixo (vide tambémRepique e outros, lnfec. Immunol. 70:3318-3323, 2002, incorporado aqui atítulo de referência para um protocolo adicional).
A. Modelo de Camundonao de Curto Prazo:
Camundongos C57BL/6 são vacinados com uma composição de acordo como protocolo apropriado e então descansados por 4 a 6 semanas. Camun-dongos imunizados são infectados com um aerossol de dose baixa (50-100UFC) de M. tuberculosis virulento e proteção é avaliada estimando o númerode bacilos viáveis 30 dias pós-provocação.
Contagens viáveis são realizadas no pulmão e baço de camun-dongos através de homogeneização dos órgãos e plaqueamento de dilui-ções de 10 vezes seriais em placas de ágar 7H11. As placas são incubadaspor até 21 dias e o número de unidades de formação de colônia por órgãodeterminado.
Camundongos vacinados com BCG têm aproximadamente pro-teção de 1 LogIO em seus pulmões e baços quando comparado com camun-dongos tratados com PBS.
Uma amostra biológica é obtida antes da administração da com-posição de interesse e após administração da composição de interesse. Al-ternativamente, amostras biológicas são obtidas de animais tratados comveículo e de animais tratados com a composição de interesse. Um aumentono número de células T que ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aquidescrito indica que a composição é eficaz.
B. Modelo de porguinho-da-índia de curto prazo
Porquinhos-da-índia Hartley exogâmicos são vacinados com uma composi-ção incluindo um ou mais polipeptídeo de Mtb, ou um polinucleotídeo codifi-cando esses um ou mais polipeptídeos e então descansados por 8 a 10 se-manas. Porquinhos-da-índia imunizados são infectados com uma dose deaerossol baixa (10-30 UFC) de M. tuberculosis virulento e proteção é avalia-da estimando o número de bacilos viáveis 30 dias pós-provocação.
Contagens viáveis são realizadas no pulmão e baço de porqui-nhos-da-índia através de homogeneização dos órgãos e plaqueamento dediluições 10 vezes seriais em placas de ágar 7H11. Placas são incubadaspor até 21 dias e o número de unidades de formação de colônia por órgãodeterminado. Segmentos do pulmão e baço são também tomados para aná-lises histológicas.
Porquinhos-da-índia vacinados com BCG têm proteção de apro-ximadamente 2-3Log10 em seus pulmões e baço quando comparado comporquinhos-da-índia tratados com PBS. Ainda, porquinhos-da-índia vacina-dos com BCG têm granulomas bem definidos quando comparado com ani-mais não-vacinados.
Uma amostra biológica é obtida antes da administração da com-posição de interesse e após administração da composição de interesse. Al-ternativamente, amostras biológicas são obtidas de animais tratados comveículo e de animais tratados com a composição de interesse. Um aumentono número de células T que ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aquidescrito indica que a composição é eficaz.
C. Modelo de porguinho-da-índia de longo prazo
O modelo de porquinho-da-índia é similar ao modelo de camun-dongo, mas os experimentos são do tipo sobrevivência abertos e podem du-rar até 2 anos. Porquinhos-da-índia desenvolvem granulomas 'clássicos' si-milares a humanos com tuberculose ativa (TB), e conforme necrose do teci-do pulmonar progride, eles começam a perder peso e morrem de TB similara humanos. O número de unidades de formação de colônia nos pulmões ebaço pode ser avaliado. Exame histológico pode ser também realizado paradeterminar o grau de envolvimento do pulmão e destruição de tecido. Apósexposição a aerossol de baixa dose no porquinho-da-índia o número de or-ganismos aumenta progressivamente durante as três primeiras semanas eentão atinge um platô em um estado crônico. Durante os últimos estágios deinfecção há carga bacteriana aumentada no pulmão e isto está associadocom uma piora da condição patológica. Sem tratamento, há um aumentoconcomitante em ambas células CD4 e CD8 nos pulmões de porquinhos-da-índia infectados.
Porquinhos-da-índia Hartley exogâmicos são vacinados com avacina do experimento de acordo com o protocolo apropriado e então des-cansados por 8 a 10 semanas. Porquinhos-da-índia imunizados são entãoinfectados com um aerossol de dose baixa (10-30 UFC) de M. tuberculosisvirulento. Os porquinhos-da-índia são pesados semanalmente e monitoradosdiariamente quanto a sinais de doença (tal como respiração aumentada efalha em se desenvolver). Porquinhos-da-índia não-vacinados sucumbem àinfecção de 20 a 25 semanas pós-provocação, enquanto porquinhos-da-índia vacinados com BCG sobrevivem por 50 a 55 semanas pós-provo-cação.
Na necropsia, o pulmão e baço são avaliados quanto ao númerode UFC e a extensão de patologia. A proteção relativa da composição expe-rimental é comparada com animais vacinados com BCG.
Uma amostra biológica é obtida antes da administração da com-posição de interesse e após administração da composição de interesse. Al-ternativamente, amostras biológicas são obtidas de animais tratados comveículo e de animais tratados com a composição de interesse. Um aumentono número de células T que ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aquidescrito indica que a composição é eficaz.
Será aparente que os detalhes precisos dos métodos ou compo-sições descritos podem ser variados ou modificados sem se afastar do espí-rito da invenção descrita. Todas tais modificações e variações que se encai-xarem no escopo e espírito das reivindicações abaixo são reivindicadas.<110><120><130><150><151><160><170><210><211><212><213><220><221><222><223><220><221><222><223><220><221><222><223><400>Met Xaa1
Gly Arg
LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAOregon Health and Science UniversityDavi d, Lewinsohn M.Deborah, Lewinsohn A.
MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE UMA INFECÇÃO POR MYCOBACTERI-
UM TUBERCULOSIS
899-77364-03
US 60/782,364
2006-03-14
38
Patentln version 3.31
97PRT
Mycobacterium tuberculosis
MISC_FEATURE(2)..(2)
Xaa can be A ou T
MISC_FEATURE
(58)..(58)
Xaa can be T ou A
MISC_FEATURE
(59)..(59)
Xaa qualquer aminoácido ou não aminoácido1
Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala
5 10 15
Phe Glu Val His Ala Gln Thr vai Glu Asp Glu Ala Arg Arg20 25 30Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp ser Gly Met
35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Xaa Xaa Met Asn Gln Ala Phe50 55 60
Arg Asn Ile vai Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu85 90 95
Ser <210> 2 <211> 97 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 Met Ala Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala 1 5 10 15 Gly Arg Phe Glu vai His Ala Gln Thr vai Glu Asp Glu Ala Arg Arg 20 25 30 Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met 35 40 45 Ala Glu Ala Thr ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe 50 55 60 Arg Asn Ile vai Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg 65 70 75 80 Asp Ala Ser Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu 85 90 95 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 3Met Ala Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala1 5 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Ala Gln Met Asn Gln Ala Phe
50 55 60
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly vai Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu85 90 95
Ser Ser<210> 4<211> 97<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 4Met Ala Ser1
Gly Arg Phe
Met Trp Ala35
Ala Glu Ala50
Asn lie vai65
Ala Asn Asn
30
Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala
5 10 15
Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg20 25 30
Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met
40 45
Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Met Asn Gln Ala Phe Arg
55 60
Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg Asp70 75 80
Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu Ser85 90 95
Ser<210>
5<211> 98<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 5
Met Ala Thr Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala1 5 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Ala Gln Met Asn Gln Ala Phe
50 55 60
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80
Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu
85 90 95
Ser Ser
<210> 6<211> 98<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 6
Met Thr Ser Arg Phe Met Thr Asp Pro His Ala Met Arg Asp Met Ala1 5 10 15
Gly Arg Phe Glu Val His Ala Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg
20 25 30
Met Trp Ala Ser Ala Gln Asn Ile Ser Gly Ala Gly Trp Ser Gly Met
35 40 45
Ala Glu Ala Thr Ser Leu Asp Thr Met Thr Gln Met Asn Gln Ala Phe50 55 60
Arg Asn Ile Val Asn Met Leu His Gly Val Arg Asp Gly Leu Val Arg65 70 75 80Asp Ala Asn Asn Tyr Glu Gln Gln Glu Gln Ala Ser Gln Gln Ile Leu 85 90 95 Ser Ser <210> 7 <211> 144 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 7 Met Ser Tyr Met Ile Ala Thr Pro Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 Asp Ile Asp Gly Ile Gly Ser Ala Val Ser Val Ala Asn Ala Ala Ala 20 25 30 Val Ala Ala Thr Thr Gly Val Leu Ala Ala Gly Gly Asp Glu Val Leu 35 40 45 Ala Ala Ile Ala Arg Leu Phe Asn Ala Asn Ala Glu Glu Tyr His Ala 50 55 60 Leu ser Ala Gln Val Ala Ala Phe Gln Thr Leu Phe vai Arg Thr Leu 65 70 75 80 Thr Gly Gly Cys Gly vai Phe Arg Arg Arg Arg Gly Arg Gln Cys Val 85 90 95 Thr Ala Ala Glu His Arg Ala Ala Gly Ala Gly Arg Arg Gln Arg Arg 100 105 110 Arg Arg Ser Gly Asp Gly Gln Trp Arg Leu Arg Gln Gln Arg His Phe 115 120 125 Gly Cys Gly Gly Gln Pro Glu Phe Arg Gln His Ser Glu His Arg Arg 130 135 140 <210> 8 <211> 694 <212> PRT
<213> Mycobacteri um tuberculosis<400> 8
Val Ser Leu Val Ile Ala Thr Pro Gln Leu Leu Ala Thr Ala Ala Leu15 10 15
Asp Leu Ala ser lie Gly Ser Gln vai Ser Ala Ala Asn Ala Ala Ala
20 25 30
Ala Met Pro Thr Thr Glu Val Val Ala Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser35 40 45
Ala Ala Ile Ala Gly Leu Phe Gly Ala His Ala Arg Gln Tyr Gln Ala
50 55 60
Leu Ser vai Gln Val Ala Ala Phe His Glu Gln Phe Val Gln Ala Leu65 70 75 80
Thr Ala Ala Ala Gly Arg Tyr Ala Ser Thr Glu Ala Ala Val Glu Arg
85 90 95
Ser Leu Leu Gly Ala vai Asn Ala Pro Thr Glu Ala Leu Leu Gly Arg
100 105 110
Pro Leu Ile Gly Asn Gly Ala Asp Gly Thr Ala Pro Gly Gln Pro Gly115 120 125
Ala Ala Gly Gly Leu Leu Phe Gly Asn Gly Gly Asn Gly Ala Ala Gly
130 135 140
Gly Phe Gly Gln Thr Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ala Gly Leu Ile Gly145 150 155 160
Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala
165 170 175
Gly Gly Asn Gly Gly Trp Leu Trp Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Val
180 185 190
Gly Gly Thr ser Val Ala Ala Gly Ile Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly195 200 205
Gly Asn Ala Gly Leu Phe Gly His Gly Gly Ala Gly Gly Thr Gly Gly
210 215 220
Ala Gly Leu Ala Gly Ala Asn Gly Val Asn Pro Thr Pro Gly Pro Ala225 230 235 240
Ala Ser Thr Gly Asp Ser Pro Ala Asp vai Ser Gly Ile Gly Asp Gln
245 250 255
Thr Gly Gly Asp Gly Gly Thr Gly Gly His Gly Thr Ala Gly Thr Pro260 265 270
Thr Gly Gly Thr Gly Gly Asp Gly Ala Thr Ala Thr Ala Gly Ser Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Gly Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Thr Ala Ala Ala Gly290 295 300
Gly Gly Gly Gly Asn Gly Gly Asp Gly Gly Val Ala Gln Gly Asp Ile305 310 315 320
Ala ser Ala Phe Gly Gly Asp Gly Gly Asn Gly Ser Asp Gly Val Ala325 330 335
Ala Gly Ser Gly Gly Gly ser Gly Gly Ala Gly Gly Gly Ala Phe Val
340 345 350
His Ile Ala Thr Ala Thr Ser Thr Gly Gly Ser Gly Gly Phe Gly Gly
355 360 365
Asn Gly Ala Ala Ser Ala Ala ser Gly Ala Asp Gly Gly Ala Gly Gly370 375 380
Ala Gly Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu Phe Gly Asp Gly Gly385 390 395 400
Asn Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ile Gly Gly Asp Gly Ala Thr405 410 415
Gly Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Asn Ala Gly Ile Ala Arg Phe Asp
420 425 430
Ser Pro Asp Pro Glu Ala Glu Pro Asp Val vai Gly Gly Lys Gly Gly
435 440 445
Asp Gly Gly Lys Gly Gly Ser Gly Leu Gly Val Gly Gly Ala Gly Gly450 455 460
Thr Gly Gly Ala Gly Gly Asn Gly Gly Ala Gly Gly Leu Leu Phe Gly465 470 475 480
Asn Gly Gly Asn Gly Gly Asn Ala Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Ala485 490 495
Gly Val Ala Gly Gly Val Gly Gly Asn Gly Gly Gly Gly Gly Thr Ala
500 505 510
Thr Phe His Glu Asp Pro Val Ala Gly Val Trp Ala vai Gly Gly Val515 520 525
Gly Gly Asp Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Leu Gly Val Gly Gly Val
530 535 540
Gly Gly Ala Gly Gly Val Gly Gly Lys Gly Gly Ala Ser Gly Met Leu545 550 555 560
Ile Gly Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ser Gly Gly Val Gly Gly Ala Gly
565 570 575
Gly vai Gly Gly Ala Gly Gly Asp Gly Gly Asn Gly Gly Ser Gly Gly580 585 590
Asn Ala Ser Thr Phe Gly Asp Glu Asn Ser Ile Gly Gly Ala Gly Gly595 600 605
Thr Gly Gly Asn Gly Gly Asn Gly Ala Asn Gly Gly Asn Gly Gly Ala
610 615 620
Gly Gly Ile Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Phe Leu Ser Gly625 630 635 640
Ala Ala Gly Val ser Gly Ala Asp Gly Ile Gly Gly Ala Gly Gly Ala
645 650 655
Gly Gly Ala Gly Gly Ala Gly Gly Ser Gly Gly Glu Ala Gly Ala Gly660 665 670
Gly Leu Thr Asn Gly Pro Gly Ser Pro Gly Val Ser Gly Thr Glu Gly675 680 685
Met Ala Gly Ala Pro Gly
690<210> 9<211> 325<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 9
Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys Gly Arg Leu Ala1 5 10 15
Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser Ala ser Leu Val Thr Val Ala20 25 30vai Pro Ala Thr Ala Asn Ala Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro
35 40 45
Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro50 55 60
Ala Thr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn Thr Pro Asn65 70 75 80
Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Asn
85 90 95
Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg100 105 110
Ile Asp Asn Pro Val Gly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp
115 120 125
vai Glu Ser Asp Ala Ala His Phe Asp Tyr Gly Ser Ala Leu Leu Ser130 135 140
15 Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln Pro Pro Pro Val Ala145 150 155 160
Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly Arg Leu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala
165 170 175
Ser Ala Glu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp180 185 190
Met Gly Glu Phe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln Glu
195 200 205
Thr vai Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr210 215 220
Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys Pro Asn Gly Gln Ile Trp Thr225 230 235 240
Gly vai lie Gly ser Pro Ala Ala Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro
245 250 255
Gln Arg Trp Phe Val Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp260 265 270
Lys Gly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro Leu Val Ala275 280 285Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ala Pro
290 295 300
Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln305 310 315 320
Arg Thr Leu Pro Ala
325
<210> 10<211> 582<212> PRT<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 10
Met Leu Leu Ala Leu Leu Arg Gln His Ile Arg Pro Tyr Arg Arg Leu1 5 10 15
Val Ala Met Leu Met Met Leu Gln Leu vai Ser Thr Leu Ala ser Leu20 25 30
Tyr Leu Pro Thr Val Asn Ala Ala Ile vai Asp Asp Gly Val Ala Lys
35 40 45
Gly Asp Thr Ala Thr Ile Val Arg Leu Gly Ala Val Met Leu Gly Val50 55 60
Thr Gly Leu Gln Val Leu Cys Ala Ile Gly Ala Val Tyr Leu Gly ser65 70 75 80
Arg Thr Gly Ala Gly Phe Gly Arg Asp Leu Arg Ser Ala Met Phe Glu
85 90 95
His Ile Ile Thr Phe Ser Glu Arg Glu Thr Ala Arg Phe Gly Ala Pro100 105 110
Thr Leu Leu Thr Arg Ser Thr Asn Asp Val Arg Gln Ile Leu Phe Leu
115 120 125
Val Gln Met Thr Ala Thr Val Leu Val Thr Ala Pro Ile Met Cys Val130 135 140
Gly Gly Ile Ile Met Ala Ile His Gln Glu Ala Ala Leu Thr Trp Leu145 150 155 160
Leu Leu vai Ser Val Pro Ile Leu Ala vai Ala Asn Tyr Trp Ile Ile165 170 175
Ser His Met Leu Pro Leu Phe Arg Arg Met Gln Ser Leu Ile Asp Gly
180 185 190
Ile Asn Arg Val Met Arg Asp Gln Leu Ser Gly Val Arg Val Val Arg195 200 205
Ala Phe Thr Arg Glu Gly Tyr Glu Arg Asp Lys Phe Ala Gln Ala Asn
210 215 220
Thr Ala Leu Ser Asn Ala Ala Leu Ser Ala Gly Asn Trp Gln Ala Leu225 230 235 240
Met Leu Pro Val Thr Thr Leu Thr Ile Asn Ala Ser ser Val Ala Leu
245 250 255
Ile Trp Phe Gly Gly Leu Arg Ile Asp ser Gly Gln Met Gln vai Gly
260 265 270
Ser Leu Ile Ala Phe Leu ser Tyr Phe Ala Gln Ile Leu Met Ala Val275 280 285
Leu Met Ala Thr Met Thr Leu Ala vai Leu Pro Arg Ala Ser Val Cys
290 295 300
Ala Glu Arg Ile Thr Glu Val Leu ser Thr Pro Ala Ala Leu Gly Asn305 310 315 320
Pro Asp Asn Pro Lys Phe Pro Thr Asp Gly Val Thr Gly Val Val Arg
325 330 335
Leu Ala Gly Ala Thr Phe Thr Tyr Pro Gly Ala Asp Cys Pro Val Leu
340 345 350
Gln Asp Ile Ser Leu Thr Ala Arg Pro Gly Thr Thr Thr Ala Ile Val355 360 365
Gly Ser Thr Gly Ser Gly Lys Ser Thr Leu Val Ser Leu Ile Cys Arg
370 375 380
Leu Tyr Asp Val Thr Ala Gly Ala Val Leu Val Asp Gly Ile Asp Val385 390 395 400
Arg Glu Tyr His Thr Glu Arg Leu Trp Ser Ala Ile Gly Leu Val Pro
405 410 415
Gln Arg Ser Tyr Leu Phe Ser Gly Thr Val Ala Asp Asn Leu Arg Tyr420 425 430
Gly Gly Gly Pro Asp Gln Val Val Thr Glu Gln Glu Met Trp Glu Ala
435 440 445
Leu Arg Val Ala Ala Ala Asp Gly Phe Val Gln Thr Asp Gly Leu Gln 450 455 460
Thr Arg Val Ala Gln Gly Gly Val Asn Phe Ser Gly Gly Gln Arg Gln465 470 475 480
Arg Leu Ala Ile Ala Arg Ala Val Ile Arg Arg Pro Ala Ile Tyr Val485 490 495
Phe Asp Asp Ala Phe Ser Ala Leu Asp Val His Thr Asp Ala Lys Val
500 505 510
His Ala Ser Leu Arg Gln vai ser Gly Asp Ala Thr Ile Ile Val Val
515 520 525
Thr Gln Arg Ile Ser Asn Ala Ala Gln Ala Asp Gln Val Ile Val Val 530 535 540
Asp Asn Gly Lys Ile vai Gly Thr Gly Thr His Glu Thr Leu Leu Ala545 550 555 560
Asp Cys Pro Thr Tyr Ala Glu Phe Ala Ala ser Gln ser Leu Ser Ala565 570 575
Thr vai Gly Gly Val Gly
580
<210> 11<211> 468<212> PRT<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 11
Met Ser Tyr Val Ile Ala Ala Pro Glu Met Leu Ala Thr Thr Ala Ala1 5 10 15
Asp Val Asp Gly Ile Gly Ser Ala Ile Arg Ala Ala Ser Ala ser Ala 20 25 30
Ala Gly Pro Thr Thr Gly Leu Leu Ala Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser35 40 45ser Ala Ala Ala Ala Leu Phe Ser Glu Tyr Ala Arg Glu Cys Gln Glu
50 55 60
Val Leu Lys Gln Ala Ala Ala Phe His Gly Glu Phe Thr Arg Ala Leu65 70 75 80
Ala Ala Ala Gly Ala Ala Tyr Ala Gln Ala Glu Ala Ser Asn Thr Ala
85 90 95
Ala Met Ser Gly Thr Ala Gly Ser Ser Gly Ala Leu Gly Ser Val Gly
100 105 110
Met Leu Ser Gly Asn Pro Leu Thr Ala Leu Met Met Gly Gly Thr Gly115 120 125
Glu Pro Ile Leu ser Asp Arg Val Leu Ala Ile Ile Asp Ser Ala Tyr
130 135 140
Ile Arg Pro Ile Phe Gly Pro Asn Asn Pro vai Ala Gln Tyr Thr Pro145 150 155 160
Glu Gln Trp Trp Pro Phe Ile Gly Asn Leu Ser Leu Asp Gln Ser Ile
165 170 175
Ala Gln Gly Val Thr Leu Leu Asn Asn Gly Ile Asn Ala Glu Leu Gln
180 185 190
Asn Gly His Asp Val vai Val Phe Gly Tyr ser Gln ser Ala Ala Val195 200 205
Ala Thr Asn Glu Ile Arg Ala Leu Met Ala Leu Pro Pro Gly Gln Ala
210 215 220
Pro Asp Pro Ser Arg Leu Ala Phe Thr Leu Ile Gly Asn Ile Asn Asn225 230 235 240
Pro Asn Gly Gly Val Leu Glu Arg Tyr Val Gly Leu Tyr Leu Pro Phe
245 250 255
Leu Asp Met Ser Phe Asn Gly Ala Thr Pro Pro Asp Ser Pro Tyr Gln
260 265 270
Thr Tyr Met Tyr Thr Gly Gln Tyr Asp Gly Tyr Ala His Asn Pro Gln275 280 285
Tyr Pro Leu Asn Ile Leu Ser Asp Leu Asn Ala Phe Met Gly Ile Arg290 295 300Trp vai His Asn Ala Tyr Pro Phe Thr Ala Ala Glu Val Ala Asn Ala305 310 315 320
Val Pro Leu Pro Thr Ser Pro Gly Tyr Thr Gly Asn Thr His Tyr Tyr325 330 335
Met Phe Leu Thr Gln Asp Leu Pro Leu Leu Gln Pro Ile Arg Ala Ile340 345 350
Pro Phe vai Gly Thr Pro Ile Ala Glu Leu Ile Gln Pro Asp Leu Arg
355 360 365
Val Leu vai Asp Leu Gly Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Asp Val Pro Thr370 375 380
Pro Ala Ser Leu Phe Ala Pro Ile Asn Pro Ile Ala Val Ala Ser Ala385 390 395 400
Leu Ala Thr Gly Thr Val Gln Gly Pro Gln Ala Ala Leu Val ser Ile405 410 415
Gly Leu Leu Pro Gln Ser Ala Leu Pro Asn Thr Tyr Pro Tyr Leu Pro
420 425 430
Ser Ala Asn Pro Gly Leu Met Phe Asn Phe Gly Gln Ser Ser Val Thr
435 440 445
Glu Leu Ser vai Leu Ser Gly Ala Leu Gly Ser vai Ala Arg Leu Ile450 455 460
Pro Pro Ile Ala465
<210> 12<211> 3716<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 12
Met Glu Phe Pro Val Leu Pro Pro Glu Ile Asn ser Val Leu Met Tyr1 5 10 15
Ser Gly Ala Gly Ser Ser Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Ala Trp Asp
20 25 30
Gly Leu Ala Glu Glu Leu Gly Ser Ala Ala vai Ser Phe Gly Gln Val35 40 45
Thr Ser Gly Leu Thr Ala Gly Val Trp Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala
50 55 60
Met Ala Ala Ala Ala Ala Pro Tyr Ala Gly Trp Leu Gly Ser Val Ala65 70 75 80
Ala Ala Ala Glu Ala vai Ala Gly Gln Ala Arg Val Val Val Gly Val
85 90 95
Phe Glu Ala Ala Leu Ala Ala Thr Val Asp Pro Ala Leu Val Ala Ala100 105 110
Asn Arg Ala Arg Leu Val Ala Leu Ala Val ser Asn Leu Leu Gly Gln115 120 125
Asn Thr Pro Ala Ile Ala Ala Ala Glu Ala Glu Tyr Glu Leu Met Trp
130 135 140
Ala Ala Asp vai Ala Ala Met Ala Gly Tyr His Ser Gly Ala Ser Ala145 150 155 160
Ala Ala Ala Ala Leu Pro Ala Phe Ser Pro Pro Ala Gln Ala Leu Gly
165 170 175
Gly Gly Val Gly Ala Phe Leu Thr Ala Leu Phe Ala Ser Pro Ala Lys180 185 190
Ala Leu ser Leu Asn Ala Gly Leu Gly Asn vai Gly Asn Tyr Asn Val195 200 205
Gly Leu Gly Asn vai Gly Val Phe Asn Leu Gly Ala Gly Asn Val Gly
210 215 220
Gly Gln Asn Leu Gly Phe Gly Asn Ala Gly Gly Thr Asn Val Gly Phe225 230 235 240
Gly Asn Leu Gly Asn Gly Asn Val Gly Phe Gly Asn ser Gly Leu Gly
245 250 255
Ala Gly Leu Ala Gly Leu Gly Asn Ile Gly Leu Gly Asn Ala Gly Ser260 265 270
Ser Asn Tyr Gly Phe Ala Asn Leu Gly Val Gly Asn Ile Gly Phe Gly275 280 285
Asn Thr Gly Thr Asn Asn Val Gly Val Gly Leu Thr Gly Asn His Leu290 295 300
Thr Gly Ile Gly Gly Leu Asn Ser Gly Thr Gly Asn Ile Gly Leu Phe305 310 315 320
Asn Ser Gly Thr Gly Asn Val Gly Phe Phe Asn ser Gly Thr Gly Asn325 330 335
Phe Gly Val Phe Asn ser Gly Asn Tyr Asn Thr Gly Val Gly Asn Ala
340 345 350
Gly Thr Ala Ser Thr Gly Leu Phe Asn Ala Gly Asn Phe Asn Thr Gly355 360 365
Val Val Asn Val Gly Ser Tyr Asn Thr Gly Ser Phe Asn Ala Gly Asp370 375 380
Thr Asn Thr Gly Gly Phe Asn Pro Gly Gly Val Asn Thr Gly Trp Leu385 390 395 400
Asn Thr Gly Asn Thr Asn Thr Gly Ile Ala Asn Ser Gly Asn Val Asn405 410 415
Thr Gly Ala Phe Ile Ser Gly Asn Phe Asn Asn Gly Val Leu Trp Val
420 425 430
Gly Asp Tyr Gln Gly Leu Phe Gly Val ser Ala Gly Ser Ser Ile Pro435 440 445
Ala Ile Pro Ile Gly Leu Val Leu Asn Gly Asp Ile Gly Pro Ile Thr450 455 460
Ile Gln Pro Ile Pro Ile Leu Pro Thr Ile Pro Leu Ser Ile His Gln465 470 475 480
Thr Val Asn Leu Gly Pro Leu Val Val Pro Asp Ile Val Ile Pro Ala485 490 495
Phe Gly Gly Gly Ile Gly Ile Pro Ile Asn Ile Gly Pro Leu Thr Ile
500 505 510
Thr Pro Ile Thr Leu Phe Ala Gln Gln Thr Phe Val Asn Gln Leu Pro515 520 525
Phe Pro Thr Phe Ser Leu Gly Lys Ile Thr Ile Pro Gln Ile Gln Thr530 535 540
Phe Asp Ser Asn Gly Gln Leu Val Ser Phe Ile Gly Pro Ile vai Ile545 550 555 560
Asp Thr Thr Ile Pro Gly Pro Thr Asn Pro Gln Ile Asp Leu Thr Ile
565 570 575
Arg Trp Asp Thr Pro Pro Ile Thr Leu Phe Pro Asn Gly Ile Ser Ala580 585 590
Pro Asp Asn Pro Leu Gly Leu Leu Val ser Val ser Ile ser Asn Pro
595 600 605
Gly Phe Thr Ile Pro Gly Phe Ser Val Pro Ala Gln Pro Leu Pro Leu610 615 620
Ser Ile Asp Ile Glu Gly Gln Ile Asp Gly Phe ser Thr Pro Pro Ile625 630 635 640
Thr Ile Asp Arg Ile Pro Leu Thr Val Gly Gly Gly Val Thr Ile Gly
645 650 655
Pro Ile Thr Ile Gln Gly Leu His Ile Pro Ala Ala Pro Gly Val Gly660 665 670
Asn Thr Thr Thr Ala Pro Ser ser Gly Phe Phe Asn Ser Gly Ala Gly
675 680 685
Gly Val ser Gly Phe Gly Asn Val Gly Ala Gly ser ser Gly Trp Trp690 695 700
Asn Gln Ala Pro ser Ala Leu Leu Gly Ala Gly Ser Gly Val Gly Asn705 710 715 720
Val Gly Thr Leu Gly Ser Gly Val Leu Asn Leu Gly Ser Gly Ile Ser
725 730 735
Gly Phe Tyr Asn Thr Ser vai Leu Pro Phe Gly Thr Pro Ala Ala Val740 745 750
Ser Gly Ile Gly Asn Leu Gly Gln Gln Leu Ser Gly Val Ser Ala Ala
755 760 765
Gly Thr Thr Leu Arg ser Met Leu Ala Gly Asn Leu Gly Leu Ala Asn770 775 780
Val Gly Asn Phe Asn Thr Gly Phe Gly Asn Val Gly Asp Val Asn Leu785 790 795 800
Gly Ala Ala Asn Ile Gly Gly His Asn Leu Gly Leu Gly Asn Val Gly805 810 815
Asp Gly Asn Leu Gly Leu Gly Asn Ile Gly His Gly Asn Leu Gly Phe
820 825 8B0
Ala Asn Leu Gly Leu Thr Ala Gly Ala Ala Gly Val Gly Asn Val Gly 835 840 845
Phe Gly Asn Ala Gly Ile Asn Asn Tyr Gly Leu Ala Asn Met Gly Val
850 855 860
Gly Asn Ile Gly Phe Ala Asn Thr Gly Thr Gly Asn Ile Gly Ile Gly865 870 875 880
Leu Val Gly Asp His Arg Thr Gly Ile Gly Gly Leu Asn Ser Gly Ile
885 890 895
Gly Asn Ile Gly Leu Phe Asn Ser Gly Thr Gly Asn vai Gly Phe Phe
900 905 910
Asn Ser Gly Thr Gly Ásn Phe Gly Ile Gly Asn Ser Gly Arg Phe Asn 915 920 925
Thr Gly Ile Gly Asn Ser Gly Thr Ala Ser Thr Gly Leu Phe Asn Ala
930 935 940
Gly Ser Phe Ser Thr Gly Ile Ala Asn Thr Gly Asp Tyr Asn Thr Gly945 950 955 960
Ser Phe Asn Ala Gly Asp Thr Asn Thr Gly Gly Phe Asn Pro Gly Gly
965 970 975
Ile Asn Thr Gly Trp Phe Asn Thr Gly His Ala Asn Thr Gly Leu Ala
980 985 990
Asn Ala Gly Thr Phe Gly Thr Gly Ala Phe Met Thr Gly Asp Tyr Ser 995 1000 1005
Asn Gly Leu Leu Trp Arg Gly Gly Tyr Glu Gly Leu Val Gly Val
1010 1015 1020
Arg Val Gly Pro Thr Ile Ser Gln Phe Pro Val Thr Val His Ala1025 1030 1035
Ile Gly Gly Val Gly Pro Leu His Val Ala Pro Val Pro Val Pro1040 1045 1050
Ala vai His Val Glu Ile Thr Asp Ala Thr vai Gly Leu Gly Pro1055 1060 1065
Phe Thr vai Pro Pro Ile Ser Ile Pro Ser Leu Pro Ile Ala Ser
1070 1075 1080
Ile Thr Gly ser Val Asp Leu Ala Ala Asn Thr Ile Ser Pro Ile 1085 1090 1095
Arg Ala Leu Asp Pro Leu Ala Gly ser Ile Gly Leu Phe Leu Glu
1100 1105 1110
Pro Phe Arg Leu ser Asp Pro Phe Ile Thr Ile Asp Ala Phe Gln1115 1120 1125
Val Val Ala Gly Val Leu Phe Leu Glu Asn Ile Ile Val Pro Gly1130 1135 1140
Leu Thr Val Ser Gly Gln Ile Leu Val Thr Pro Thr Pro Ile Pro
1145 1150 1155
Leu Thr Leu Asn Leu Asp Thr Thr Pro Trp Thr Leu Phe Pro Asn1160 1165 1170
Gly Phe Thr Ile Pro Ala Gln Thr Pro Val Thr vai Gly Met Glu
1175 1180 1185
Val Ala Asn Asp Gly Phe Thr Phe Phe Pro Gly Gly Leu Thr Phe1190 1195 1200
Pro Arg Ala Ser Ala Gly Val Thr Gly Leu Ser Val Gly Leu Asp1205 1210 1215
Ala Phe Thr Leu Leu Pro Asp Gly Phe Thr Leu Asp Thr Val Pro
1220 1225 1230
Ala Thr Phe Asp Gly Thr Ile Leu Ile Gly Asp Ile Pro Ile Pro1235 1240 1245
Ile Ile Asp Val Pro Ala Val Pro Gly Phe Gly Asn Thr Thr Thr
1250 1255 1260
Ala Pro Ser Ser Gly Phe Phe Asn Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ser1265 1270 1275
Gly Phe Ala Asn Val Gly Ala Gly Thr Ser Gly Trp Trp Asn Gln1280 1285 1290
Gly His Asp Val Leu Ala Gly Ala Gly Ser Gly Val Ala Asn Ala1295 1300 1305
Gly Thr Leu ser Ser Gly vai Leu Asn Val Gly Ser Gly Ile ser
1310 1315 1320Gly Trp Tyr Asn Thr Ser Thr Leu Gly Ala Gly Thr Pro Ala Val
1325 1330 1335
vai Ser Gly Ile Gly Asn Leu Gly Gln Gln Leu Ser Gly Phe Leu
1340 1345 1350Ala Asn Gly Thr vai Leu Asn Arg Ser Pro Ile Val Asn Ile Gly
1355 1360 1365
Trp Ala Asp Val Gly Ala Phe Asn Thr Gly Leu Gly Asn Val Gly
1370 1375 1380
Asp Leu Asn Trp Gly Ala Ala Asn Ile Gly Ala Gln Asn Leu Gly
1385 1390 1395
Leu Gly Asn Leu Gly ser Gly Asn Val Gly Phe Gly Asn Ile Gly
1400 1405 1410
Ala Gly Asn Val Gly Phe Ala Asn Ser Gly Pro Ala vai Gly Leu
1415 1420 1425
Ala Gly Leu Gly Asn Val Gly Leu ser Asn Ala Gly Ser Asn Asn
1430 1435 1440
Trp Gly Leu Ala Asn Leu Gly Val Gly Asn Ile Gly Leu Ala Asn
1445 1450 1455
Thr Gly Thr Gly Asn Ile Gly Ile Gly Leu Val Gly Asp Tyr Gln
1460 1465 1470
Thr Gly Ile Gly Gly Leu Asn Ser Gly Ser Gly Asn Ile Gly Leu
1475 1480 1485
Phe Asn Ser Gly Thr Gly Asn Val Gly Phe Phe Asn Thr Gly Thr
1490 1495 1500
Gly Asn Phe Gly Leu Phe Asn Ser Gly Ser Phe Asn Thr Gly Ile
1505 1510 1515
Gly Asn Ser Gly Thr Gly Ser Thr Gly Leu Phe Asn Ala_Gly Asn
1520 1525 1530
Phe Asn Thr Gly Ile Ala Asn Pro Gly Ser Tyr Asn Thr Gly Ser<table>table see original document page 119</column></row><table>1775 1780 1785
Ile Thr Gly Thr Thr lie ser Ala lie Pro Leu Gly Phe Asp Ile
1790 1795 1800
Arg Thr ser Ala Gly Pro Leu Asn Ile Pro Ile Ile Asp Ile Pro 1805 1810 1815
Ala Ala Pro Gly Phe Gly Asn Ser Thr Gln Met Pro Ser ser Gly
1820 1825 1830
Phe Phe Asn Thr Gly Ala Gly Gly Gly ser Gly Ile Gly Asn Leu1835 1840 1845
Gly Ala Gly Val ser Gly Leu Leu Asn Gln Ala Gly Ala Gly Ser1850 1855 1860
Leu Val Gly Thr Leu Ser Gly Leu Gly Asn Ala Gly Thr Leu Ala
1865 1870 1875
Ser Gly Val Leu Asn ser Gly Thr Ala Ile Ser Gly Leu Phe Asn 1880 1885 1890
Val ser Thr Leu Asp Ala Thr Thr Pro Ala Val Ile Ser Gly Phe
1895 1900 1905
Ser Asn Leu Gly Asp His Met Ser Gly Val ser Ile Asp Gly Leu1910 1915 1920
Ile Ala Ile Leu Thr Phe Pro Pro Ala Glu Ser Val Phe Asp Gln1925 1930 1935
Ile Ile Asp Ala Ala Ile Ala Glu Leu Gln His Leu Asp Ile Gly
1940 1945 1950
Asn Ala Leu Ala Leu Gly Asn Val Gly Gly Val Asn Leu Gly Leu 1955 1960 1965
Ala Asn Val Gly Glu Phe Asn Leu Gly Ala Gly Asn Val Gly Asn
1970 1975 1980
Ile Asn Val Gly Ala Gly Asn Leu Gly Gly ser Asn Leu Gly Leu1985 1990 1995
Gly Asn Val Gly Thr Gly Asn Leu Gly Phe Gly Asn Ile Gly Ala2000 2005 2010
Gly Asn Phe Gly Phe Gly Asn Ala Gly Leu Thr Ala Gly Ala Gly2015Gly Leu Gly
2030Gly Leu Ala2045
Gly Thr Gly2060Gly Ile Gly2075
Asn Ser Gly2090Asn Phe Gly
2105Asn Ala Gly
2120
Asn Thr Gly
2135Asn Val Gly2150
Asn Thr Gly2165Asn Thr Gly2180Asn Asn Gly
2195
Phe Ser Phe2210Asn Glu Thr2225
Ile Pro Gly2240Gly Pro Phe
2020Asn Val Gly Leu2035Asn vai Gly Val
2050Asn Ile Gly Ile2065
Gly Leu Asn ser2080Thr Gly Asn Ile2095Leu Phe Asn Ser2110Thr Ala Ser Thr2125
Leu Ala Asn Ala2140Ser Phe Asn Thr2155Trp Phe Asn Thr
2170Asn Val Asn Thr2185Ala Leu Trp Thr2200Ser lie Asp Ile2215Leu Asn Leu Gly2230Met Ser Leu Phe2245Thr Ile Pro Gln
Gly Asn Ala GlyGly Asn Ile GlyGly Leu Thr GlyGly Thr Gly AsnGly Phe Phe AsnGly Ser Tyr serGly Leu Phe AsnGly Ser Tyr AsnGly Gly Val AsnGly His Thr AsnGly Ala Phe AsnGly Asp Tyr HisAla Gly ser ThrPro Ile His IleAsp vai His Gluvai Asp Val Pro
2025
Ser Gly Ser Trp2040
Leu Ala Asn Thr2055
Asp Tyr Arg Thr2070
Leu Gly Leu Phe2085
Thr Gly Thr Gly2100
Thr Gly Val Gly2115
Ala Gly Asn Phe2130
Thr Gly Ser Leu2145
Pro Gly Thr vai2160
Thr Gly Leu Phe2175
Ser Gly Ser Phe2190
Gly Leu vai Gly2205
Leu Leu Asp Leu2220
Glu Gln Ile Asp2235
Ile Val Glu Ile2250
Ala Ile Pro Leu2255 2260 2265
Glu Ile His Glu ser Ile His Met Asp Pro Ile vai Leu vai Pro
2270 2275 2280
Ala Thr Thr Ile Pro Ala Gln Thr Arg Thr Ile Pro Leu Asp Ile
2285 2290 2295
Pro Ala Ser Pro Gly Ser Thr Met Thr Leu Pro Leu Ile Ser Met
2300 2305 2310
Arg Phe Glu Gly Glu Asp Trp Ile Leu Gly Ser Thr Ala Ala Ile
2315 2320 2325
Pro Asn Phe Gly Asp Pro Phe Pro Ala Pro Thr Gln Gly Ile Thr
2330 2335 2340
Ile His Thr Gly Pro Gly Pro Gly Thr Thr Gly Glu Leu Lys Ile
2345 2350 2355
Ser Ile Pro Gly Phe Glu Ile Pro Gln Ile Ala Thr Thr Arg Phe
2360 2365 2370
Leu Leu Asp Val Asn Ile Ser Gly Gly Leu Pro Ala Phe Thr Leu
2375 2380 2385
Phe Ala Gly Gly Leu Thr Ile Pro Thr Asn Ala Ile Pro Leu Thr
2390 2395 2400
Ile Asp Ala Ser Gly Ala Leu Asp Pro Ile Thr Ile Phe Pro Gly
2405 2410 2415
Gly Tyr Thr Ile Asp Pro Leu Pro Leu His Leu Ala Leu Asn Leu
2420 2425 2430
Thr Val Pro Asp Ser Ser Ile Pro Ile Ile Asp Val Pro Pro Thr
2435 2440 2445
Pro Gly Phe Gly Asn Thr Thr Ala Thr Pro Ser Ser Gly Phe Phe
2450 2455 2460
Asn Ser Gly Ala Gly Gly Val Ser Gly Phe Gly Asn Val Gly Ser
2465 2470 2475
Asn Leu ser Gly Trp Trp Asn Gln Ala Ala Ser Ala Leu Ala Gly
2480 2485 2490
ser Gly ser Gly vai Leu Asn Val Gly Thr Leu Gly ser Gly vai2495 2500 2505
Leu Asn vai Gly Ser Gly Val Ser Gly Ile Tyr Asn Thr Ser vai
2510 2515 2520
Leu Pro Leu Gly Thr Pro Ala Val Leu Ser Gly Leu Gly Asn Val
2525 2530 2535
Gly His Gln Leu ser Gly Val Ser Ala Ala Gly Thr Ala Leu Asn
2540 2545 2550
Gln Ile Pro Ile Leu Asn Ile Gly Leu Ala Asp vai Gly Asn Phe2555 2560 2565
Asn Val Gly Phe Gly Asn Val Gly Asp Val Asn Leu Gly Ala Ala2570 2575 2580
Asn Leu Gly Ala Gln Asn Leu Gly Leu Gly Asn Val Gly Thr Gly
2585 2590 2595
Asn Leu Gly Phe Ala Asn Val Gly His Gly Asn Ile Gly Phe Gly2600 2605 2610
Asn Ser Gly Leu Thr Ala Gly Ala Ala Gly Leu Gly Asn Thr Gly
2615 2620 2625
Phe Gly Asn Ala Gly Ser Ala Asn Tyr Gly Phe Ala Asn Gln Gly2630 2635 2640
Val Arg Asn Ile Gly Leu Ala Asn Thr Gly Thr Gly Asn Ile Gly2645 2650 2655
Ile Gly Leu Val Gly Asp Asn Leu Thr Gly Ile Gly Gly Leu Asn
2660 2665 2670
Ser Gly Ala Gly Asn Ile Gly Leu Phe Asn ser Gly Thr Gly Asn2675 2680 2685
Ile Gly Phe Phe Asn Ser Gly Thr Gly Asn Phe Gly Ile Gly Asn
2690 2695 2700
Ser Gly ser Phe Asn Thr Gly Ile Gly Asn Ser Gly Thr Gly Ser2705 2710 2715
Thr Gly Leu Phe Asn Ala Gly ser Phe Asn Thr Gly Val Ala Asn2720 2725 2730
Ala Gly Ser Tyr Asn Thr Gly Ser Phe Asn Ala Gly Asp Thr Asn2735 2740 2745
Thr Gly Gly Phe Asn Pro Gly Thr Ile Asn Thr Gly Trp Phe Asn
2750 2755 2760
Thr Gly His Thr Asn Thr Gly Ile Ala Asn Ser Gly Asn Val Gly2765 2770 2775
Thr Gly Ala Phe Met Ser Gly Asn Phe Ser Asn Gly Leu Leu Trp
2780 2785 2790
Arg Gly Asp His Glu Gly Leu Phe ser Leu Phe Tyr ser Leu Asp2795 2800 2805
Val Pro Arg Ile Thr Ile Val Asp Ala His Leu Asp Gly Gly Phe2810 2815 2820
Gly Pro Val Val Leu Pro Pro Ile Pro Val Pro Ala Val Asn Ala
2825 2830 2835
His Leu Thr Gly Asn vai Ala Met Gly Ala Phe Thr Ile Pro Gln2840 2845 2850
Ile Asp Ile Pro Ala Leu Thr Pro Asn Ile Thr Gly Ser Ala Ala
2855 2860 2865
Phe Arg Ile Val Val Gly Ser vai Arg Ile Pro Pro Val Ser vai2870 2875 2880
Ile Val Glu Gln Ile Ile Asn Ala Ser Val Gly Ala Glu Met Arg2885 2890 2895
Ile Asp Pro Phe Glu Met Trp Thr Gln Gly Thr Asn Gly Leu Gly
2900 2905 2910
Ile Thr Phe Tyr ser Phe Gly Ser Ala Asp Gly Ser Pro Tyr Ala2915 2920 2925
Thr Gly Pro Leu Val Phe Gly Ala Gly Thr Ser Asp Gly Ser His
2930 2935 2940
Leu Thr lie Ser Ala Ser ser Gly Ala Phe Thr Thr Pro Gln Leu2945 2950 2955
Glu Thr Gly Pro Ile Thr Leu Gly Phe Gln Val Pro Gly Ser Val2960 2965 2970
Asn Ala Ile Thr Leu Phe Pro Gly Gly Leu Thr Phe Pro Ala Thr2975 2980 2985
Ser Leu Leu Asn Leu Asp Val Thr Ala Gly Ala Gly Gly Val Asp
2990 2995 3000
Ile Pro Ala Ile Thr Trp Pro Glu Ile Ala Ala Ser Ala Asp Gly
3005 3010 3015
Ser Val Tyr Val Leu Ala Ser Ser Ile Pro Leu Ile Asn Ile Pro
3020 3025 3030
Pro Thr Pro Gly Ile Gly Asn Ser Thr Ile Thr Pro Ser ser Gly
3035 3040 3045
Phe Phe Asn Ala Gly Ala Gly Gly Gly Ser Gly Phe Gly Asn Phe
3050 3055 3060
Gly Ala Gly Thr ser Gly Trp Trp Asn Gln Ala His Thr Ala Leu
3065 3070 3075
Ala Gly Ala Gly Ser Gly Phe Ala Asn Val Gly Thr Leu His ser
3080 3085 3090
Gly Val Leu Asn Leu Gly Ser Gly vai Ser Gly Ile Tyr Asn Thr
3095 3100 3105
Ser Thr Leu Gly vai Gly Thr Pro Ala Leu Val ser Gly Leu Gly
3110 3115 3120
Asn Val Gly His Gln Leu Ser Gly Leu Leu Ser Gly Gly ser Ala
3125 3130 3135
vai Asn Pro Val Thr Val Leu Asn Ile Gly Leu Ala Asn Val Gly
3140 3145 3150
Ser His Asn Ala Gly Phe Gly Asn Val Gly Glu Val Asn Leu Gly
3155 3160 3165
Ala Ala Asn Leu Gly Ala His Asn Leu Gly Phe Gly Asn Ile Gly
3170 3175 3180
Ala Gly Asn Leu Gly Phe Gly Asn Ile Gly His Gly Asn Val Gly
3185 3190 3195
Val Gly Asn Ser Gly Leu Thr Ala Gly Val Pro Gly Leu Gly Asn
3200 3205 3210
Val Gly Leu Gly Asn Ala Gly Gly Asn Asn Trp Gly Leu Ala Asn3215 3220 3225
Val Gly vai Gly Asn lie Gly Leu Ala Asn Thr Gly Thr Gly Asn
3230 3235 3240
Ile Gly Ile Gly Leu Thr Gly Asp Tyr Gln Thr Gly Ile Gly Gly 3245 3250 3255
Leu Asn Ser Gly Ala Gly Asn Leu Gly Leu Phe Asn Ser Gly Ala
3260 3265 3270
Gly Asn Val Gly Phe Phe Asn Thr Gly Thr Gly Asn Phe Gly Leu3275 3280 3285
Phe Asn Ser Gly Ser Phe Asn Thr Gly Val Gly Asn Ser Gly Thr3290 3295 3300
Gly Ser Thr Gly Leu Phe Asn Ala Gly ser Phe Asn Thr Gly Val
3305 3310 3315
Ala Asn Ala Gly Ser Tyr Asn Thr Gly Ser Phe Asn Val Gly Asp 3320 3325 3330
Thr Asn Thr Gly Gly Phe Asn Pro Gly Ser Ile Asn Thr Gly Trp
3335 3340 3345
Leu Asn Ala Gly Asn Ala Asn Thr Gly Val Ala Asn Ala Gly Asn3350 3355 3360
Val Asn Thr Gly Ala Phe Val Thr Gly Asn Phe Ser Asn Gly Ile3365 3370 3375
Leu Trp Arg Gly Asp Tyr Gln Gly Leu Ala Gly Phe Ala Val Gly
3380 3385 3390
Tyr Thr Leu Pro Leu Phe Pro Ala Val Gly Ala Asp Val Ser Gly 3395 3400 3405
Gly Ile Gly Pro Ile Thr Val Leu Pro Pro Ile His Ile Pro Pro
3410 3415 3420
Ile Pro Val Gly Phe Ala Ala vai Gly Gly Ile Gly Pro Ile Ala3425 3430 3435
Ile Pro Asp Ile Ser Val Pro Ser Ile His Leu Gly Leu Asp Pro3440 3445 3450
Ala Val His vai Gly ser Ile Thr Val Asn Pro Ile Thr Val Arg3455 3460 3465
Thr Pro Pro Val Leu vai Ser Tyr Ser Gln Gly Ala vai Thr Ser
3470 3475 3480
Thr Ser Gly Pro Thr ser Glu Ile Trp vai Lys Pro Ser Phe Phe
3485 3490 3495
Pro Gly Ile Arg Ile Ala Pro ser ser Gly Gly Gly Ala Thr Ser
3500 3505 3510
Thr Gln Gly Ala Tyr Phe Val Gly Pro Ile Ser Ile Pro Ser Gly
3515 3520 3525
Thr vai Thr Phe Pro Gly Phe Thr Ile Pro Leu Asp Pro Ile Asp
3530 3535 3540
lie Gly Leu Pro vai ser Leu Thr Ile Pro Gly Phe Thr Ile Pro
3545 3550 3555
Gly Gly Thr Leu Ile Pro Thr Leu Pro Leu Gly Leu Ala Leu Ser
3560 3565 3570
Asn Gly Ile Pro Pro Val Asp Ile Pro Ala Ile Val Leu Asp Arg
3575 3580 3585
Ile Leu Leu Asp Leu His Ala Asp Thr Thr Ile Gly Pro Ile Asn
3590 3595 3600
vai Pro Ile Ala Gly Phe Gly Gly Ala Pro Gly Phe Gly Asn ser
3605 3610 3615
Thr Thr Leü Pro Ser ser Gly Phe Phe Asn Thr Gly Ala Gly Gly
3620 3625 3630
Gly Ser Gly Phe Ser Asn Thr Gly Ala Gly Met Ser Gly Leu Leu
3635 3640 3645
Asn Ala Met Ser Asp Pro Leu Leu Gly Ser Ala Ser Gly Phe Ala
3650 3655 3660
Asn Phe Gly Thr Gln Leu Ser Gly Ile Leu Asn Arg Gly Ala Gly
3665 3670 3675
Ile Ser Gly Val Tyr Asn Thr Gly Ala Leu Gly Val Val Thr Ala
3680 3685 3690
Ala vai Val Ser Gly Phe Gly Asn Val Gly Gln Gln Leu ser Gly3695 3700 3705
Leu Leu Phe Thr Gly Val Gly Pro
3710 3715
<210> 13<211> 11<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 13
Gln Thr Val Glu Asp Glu Ala Arg Arg Met Trp1 5 10
<210> 14<211> 9<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis <400> 14
Val Ser Ala Ala Ile Ala Gly Leu Phe1 5
<210> 15 <211> 297 20 <212> DNA <213> Myeobaeterium tuberculosis <400> 15 atggcctcgc gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60 gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatc 12025 tcgggcgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat gacccagatg 180 aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240 gacgccaaca actacgaaca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctga 297 <210> 16 <211> 297 30 <212> DNA <213> Myeobacterium tuberculosis <400> 16atggcctcac gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60 gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatt 120 tccggtgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat ggcccagatg 180 aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240 gacgccaaca actacgagca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctaa 297 <210> 17 <211> 297 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 17 atggcctcac gttttatgac ggatccgcat gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60 gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatt 120 tccggtgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat gacctagatg 180 aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240 gacgccaaca actacgaaca gcaagagcag gcctcccagc agatcctgag cagctag 297 <210> 18 <211> 297 <212> DNA <21B> Mycobacterium tuberculosis <400> 18 atggcaacac gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgag 60 gtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatc 120 tcgggcgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat ggcccagatg 180 aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240 gacgccaaca actacgagca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctaa 297 <210> 19 <211> 297 <212> DNA <213> Myeobaeterium tuberculosis <400> 19 atgacctcgc gttttatgac ggatccgcac gcgatgcggg acatggcggg ccgttttgaggtgcacgccc agacggtgga ggacgaggct cgccggatgt gggcgtccgc gcaaaacatt 120 tccggcgcgg gctggagtgg catggccgag gcgacctcgc tagacaccat gacccagatg 180 aatcaggcgt ttcgcaacat cgtgaacatg ctgcacgggg tgcgtgacgg gctggttcgc 240 gacgccaaca actacgaaca gcaagagcag gcctcccagc agatcctcag cagctga 297 <210> <211> <212> 20 435 DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 20 atgtcataca tgattgccac accagcggcg ttgacggcgg cggcaacgga tatcgacggg 60 attggctcgg cggttagcgt tgcgaacgcc gcggcggtcg ccgcgacaac cggagtgctg 120 gccgccggtg gcgatgaagt gttggcggcc atcgctaggc tgttcaacgc aaacgccgag 180 gaatatcacg ccctcagcgc gcaggtggcg gcgtttcaaa ccctgtttgt gcgcaccttg 240 actggggggt gcggagtctt tcgccggcgc cgaggccgcc aatgcgtcac agctgcagag 300 catcgcgcgg caggtgcggg gcgccgtcaa cgccgtcgcc ggtcaggtga cgggcaatgg 360 cggctccggc aacagcggca cttcggctgc ggcggccaac ccgaattccg acaacacagc 420 gagcatcgcc gatag 435 <210> 21 <211> 2085 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 21 gtgtcgttgg tgatcgcgac gccgcagctg ctggcaactg cggctttgga tttagcgagt 60 attggttcgc aggtgagcgc ggctaatgcg gccgcggcga tgccgacgac ggaagtggtg 120 gctgcggctg ccgatgaagt gtcggcggcg attgcggggt tgttcggggc ccatgctcgg 180 cagtatcagg cgctcagcgt acaggtggca gcgtttcacg agcagtttgt gcaggcgttg 240 actgcggccg cgggtcggta tgccagcact gaggccgctg ttgagcggag tctgctgggt 300 gcggtgaatg cgcccaccga ggcgcttttg gggcgcccgt tgatcggaaa cggcgccgac 360 gggacggcac ccgggcagcc tggcgcggcc ggcgggttgc tgtttggcaa cggtggcaac 420 ggcgcggctg gcgggttcgg tcaaaccggc ggcagcggag gcgcggccgg gttgatcggc 480 aacggcggca acggcggggc cggtggtacc ggcgcggccg gcggtgccgg tgggaacggg 540 gggtggttgt ggggcaacgg cggcaacggc ggtgtcggcg gcaccagcgt ggccgcaggc 600atcgggggtg cgggcggtaa cggcggcaac gccgggctgt tcggccatgg cggcgccggt 660 ggtaccggcg gcgccggcct cgccggggca aacggggtca atcccacgcc cggccccgcg 720 gccagcaccg gggacagccc ggcagatgtg tccggcatcg gtgatcaaac cggcggcgac 780 ggcggcacgg gcggccatgg cactgccggc acgccgaccg gtggcaccgg cggcgacggt 840 gccaccgcga cggcaggctc gggcaaggcc accggcggtg ccggtggtga cggcggtacc 900 gccgctgccg gtggcggcgg cggcaacggc ggcgacggcg gagtcgcgca gggcgacatt 960 gcgagcgcct ttggcggtga tggtggcaac gggtccgacg gtgtagccgc cggcagtggg 1020 ggtggtagcg gcggcgccgg aggcggcgct ttcgtacaca tcgccactgc cacctctacc 1080 ggtggtagcg gcggtttcgg tggtaacggg gctgccagtg ccgcctccgg cgccgacggt 1140 ggcgcagggg gagctggcgg caatggtggc gccggcgggt tgctattcgg tgatggcggc 1200 aacggtggcg ccggtggcgc gggtggtatc ggtggtgacg gcgccacggg ggggcccggg 1260 ggaagcggcg gcaacgctgg catcgcgagg tttgacagcc cagaccccga ggcagaaccc 1320 gatgtggtcg gcggcaaggg tggtgatggc ggcaagggcg gcagcggcct tggcgtcggc 1380 ggcgccggcg ggaccggcgg cgcgggcggc aacggcggcg ccggcgggtt gttgttcggc 1440 aacggcggca acggcggcaa cgccggggcc ggcggggatg gcggcgccgg cgttgccggt 1500 ggggttggcg gtaacggcgg cggtggtggc accgcgacgt ttcacgaaga cccggtcgct 1560 ggtgtctggg cggtcggtgg cgtaggtggt gatggtggct ccggcggcag ctcgcttggt 1620 gtcggcgggg tgggcggagc cggtggcgtg ggtggcaagg gtggcgccag cggcatgttg 1680 atcggcaacg gcggcaacgg tggcagcggc ggagtcggtg gggccggtgg agtcggcggg 1740 gctggcggtg acggcggcaa cggcggctcc ggtggcaacg ccagtacttt tggcgatgag 1800 aactccatcg gcggggccgg cgggacgggc ggcaacgggg gcaacggcgc aaacggcggt 1860 aacggtggcg ctggcggtat tgccggcggt gcgggtgggt ccggagggtt cctcagcggt 1920 gccgcaggag tcagcggcgc tgacggtatc ggtggcgcgg gcggcgcagg cggtgccggt 1980 ggcgcgggcg gtagcggcgg tgaggcaggc gcggggggcc tcaccaacgg ccccgggtcc 2040 cctggcgttt ccggcaccga aggcatggcc ggcgcgcccg gctag 2085 <210> 22 <211> 978 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 22 atgcatcagg tggaccccaa cttgacacgt cgcaagggac gattggcggc actggctatc 60 gcggcgatgg ccagcgccag cctggtgacc gttgcggtgc ccgcgaccgc caacgccgat 120ccggagccag cgcccccggt acccacaacg gccgcctcgc cgccgtcgac cgctgcagcg 180 ccacccgcac cggcgacacc tgttgccccc ccaccaccgg ccgccgccaa cacgccgaat 240 gcccagccgg gcgatcccaa cgcagcacct ccgccggccg acccgaacgc accgccgcca 300 cctgtcattg ccccaaacgc accccaacct gtccggatcg acaacccggt tggaggattc 360 agcttcgcgc tgcctgctgg ctgggtggag tctgacgccg cccacttcga ctacggttca 420 gcactcctca gcaaaaccac cggggacccg ccatttcccg gacagccgcc gccggtggcc 480 aatgacaccc gtatcgtgct cggccggcta gaccaaaagc tttacgccag cgccgaagcc 540 accgactcca aggccgcggc ccggttgggc tcggacatgg gtgagttcta tatgccctac 600 ccgggcaccc ggatcaacca ggaaaccgtc tcgctcgacg ccaacggggt gtctggaagc 660 gcgtcgtatt acgaagtcaa gttcagcgat ccgagtaagc cgaacggcca gatctggacg 720 ggcgtaatcg gctcgcccgc ggcgaacgca ccggacgccg ggccccctca gcgctggttt 780 gtggtatggc tcgggaccgc caacaacccg gtggacaagg gcgcggccaa ggcgctggcc 840 gaatcgatcc ggcctttggt cgccccgccg ccggcgccgg caccggctcc tgcagagccc 900 gctccggcgc cggcgccggc cggggaagtc gctcctaccc cgacgacacc gacaccgcag 960 cggaccttac <210> <211> <212> cggcctga 23 1749 DNA 978 <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 23 atgctcctgg ccctgctgcg ccagcacatc cgaccgtacc gccggctggt cgcgatgctg 60 atgatgctgc agctggtcag caccctggct tcgctatacc tcccgacggt caacgccgca 120 atcgtcgacg acggcgtcgc caagggcgac accgccacca tcgtacggct gggtgcggtg 180 atgcttgggg tgaccggatt gcaggtgctg tgcgcgatcg gggcggtcta tctgggctcc 240 cggaccgggg cgggtttcgg ccgtgacctg cgctcggcaa tgttcgaaca catcatcacc 300 ttctcggaac gcgagaccgc ccgattcggc gctccgacgt tgttgacccg cagcaccaac 360 gacgtccggc agatcctgtt cctggtccag atgaccgcca ccgtgctggt caccgcaccg 420 atcatgtgcg tcggcggaat catcatggcc atccaccagg aggccgcgct gacatggctg 480 ctgctggtca gcgttccgat tctggccgta gcaaactact ggatcatctc ccacatgctg 540 ccgctcttcc gccgcatgca gagcctgatc gacggcatca accgggtgat gcgcgatcag 600 ctgtccgggg tgcgagtggt ccgcgccttc acccgcgaag gctatgaacg cgacaagttc 660 gcgcaggcca atacggcgct gtcgaatgcc gcactgagcg ccggcaactg gcaagcactg 720atgctgccgg tgaccacgct gaccatcaac gcatccagcg tcgcactgat ctggttcggt 780 gggctacgca tcgacagcgg ccagatgcag gtcggctccc tgatcgcctt cctgtcctac 840 ttcgcccaga tcctgatggc ggtgttgatg gcgaccatga cgctggccgt gctgccacga 900 gcgtcggtct gcgccgaacg catcaccgag gtgctttcca cgcccgccgc actcggtaac 960 cccgacaatc ccaagttccc gacggacggg gtcacgggcg tagtgcgctt ggctggcgca 1020 acctttacct atcctggcgc cgactgcccg gtgctgcagg acatttcgtt gactgcgcgg 1080 cccggtacca ccaccgcgat cgtcggcagt accggttcgg gcaagtcgac actggtgtcg 1140 ttgatctgcc ggctctacga cgtcaccgct ggcgcggtct tggttgacgg tatcgacgtc 1200 cgcgagtacc acaccgagcg gctctggtca gcgatcgggc tggtgcccca gcgcagctac 1260 ctcttctccg gaaccgtcgc ggacaacctg cgctacggcg ggggcccaga ccaggtagtc 1320 accgagcagg agatgtggga ggcgctgcgg gtcgccgcgg ccgacggctt tgtacaaaca 1380 gacgggctgc agacgcgtgt cgcccaaggt ggtgtcaact tctccggcgg gcagcgccaa 1440 cggctggcga tagcccgagc ggtcatccga cgtccggcca tctatgtgtt cgacgacgcg 1500 ttctccgcac ttgacgtgca caccgacgcc aaagtccacg catcgctgcg acaggtatct 1560 ggtgatgcaa ccatcattgt tgttacacaa cggatttcga atgccgctca ggccgaccag 1620 gtcatcgttg tcgataacgg taagatcgtc ggcacgggca cccacgaaac gctgctggcc 1680 gattgcccca cctatgccga attcgccgcc tcacaatcgc tgagcgccac ggtcgggggt 1740 gtagggtga 1749 <210> 24 <211> <212> 1407 DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 24 atgtcctacg tcatcgcggc cccggagatg ttggcaacga cggccgcgga cgtggacggg 60 atcggttcgg cgatacgagc ggccagcgcg tccgctgcgg gtccaacgac cggactgctg 120 gccgcggccg ccgatgaggt gtcgtcggcc gctgcagcgc tgttcagcga atacgcgcgc 180 gaatgtcaag aggtcctaaa gcaggctgcg gcgttccatg gcgagttcac ccgggcgctg 240 gctgccgccg gggccgccta tgcccaggct gaagccagca acaccgctgc tatgtcgggc 300 accgccgggt ccagcggcgc cctcggttct gtcgggatgc tgtcaggcaa cccgctaacc 360 gcgttgatga tgggcggcac cggggaaccg atccttagtg accgcgtctt ggcgatcatt 420 gacagcgcat acattcggcc cattttcggg cccaacaacc cggtcgccca gtacacgccc 480 gagcagtggt ggccgtttat cgggaacctg tcactggacc aatccatcgc ccagggtgtc 540acgctgctga acaacggcat caacgcggaa ctacaaaatg ggcatgacgt cgtcgttttc 600 ggctactcgc aaagcgccgc ggtagcgacc aatgaaatac gcgctcttat ggcgttacca 660 ccgggccaag ccccagatcc aagccggctg gctttcacgt tgatcggtaa tatcaataac 720 cccaacggcg gcgtcctcga gcgttacgtg ggcctttacc tcccgttctt ggatatgtcg 780 ttcaacggtg cgactccacc ggattccccc taccagacct acatgtacac cggccaatac 840 gacggctacg cccacaaccc gcagtacccg ctcaatatct tgtcggacct caacgccttc 900 atgggcatca gatgggtgca caacgcgtac cccttcaccg cggccgaggt tgccaatgcc 960 gtgccgttgc ccacgtctcc gggctacacc ggcaacaccc attactacat gtttctgacc 1020 caggacctgc cgctgttgca gccgattcgc gccatcccct tcgtagggac cccaatagcc 1080 gagctgattc agcccgacct acgggtgcta gtcgacttgg gctatggcta cggctacgcc 1140 gacgtaccca ccccggccag cctgttcgcg ccaatcaacc cgatcgccgt ggcctcggcc 1200 ctggcgaccg ggaccgtgca aggcccccaa gccgccctag taagcatcgg attgttaccg 1260 cagtccgcgc tacccaatac gtatccgtat cttccgtcgg cgaatccggg cctgatgttc 1320 aacttcggtc aatccagtgt gacggagttg tcggtgctca gtggcgccct cgggtccgta 1380 gcgagattga ttccaccgat cgcgtga 1407 <210> 25 <211> 11151 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 25 atggagtttc cggtgttgcc accggaaatc aactccgtgc tgatgtattc gggtgcgggg 60 tcgagcccgt tgctggcggc ggccgcggcg tgggatgggc tggctgagga gttggggtcg 120 gcggcggtgt cgtttgggca ggtgacgtcg ggcctgacgg cgggggtgtg gcagggtgcg 180 gcggcggcgg cgatggcggc cgcggcggcg ccgtatgcgg ggtggttggg ttcggtggcg 240 gccgcggccg aggcggtggc cgggcaggcg cgggtggtgg tgggggtctt tgaggcggcg 300 ttggcggcga cggtggatcc ggcgctggtg gcggccaacc gggcgcggct ggtggcgttg 360 gcggtgtcga atctgttggg gcagaacacg ccggcgatcg cggccgccga ggccgagtac 420 gagctgatgt gggccgccga tgtggcggcg atggccggct accattccgg cgcgtcggct 480 gctgccgcgg cgttgccggc gttcagccca ccggcgcagg cgctgggggg aggtgtcggc 540 gcgttcctta ccgccctgtt cgccagccct gcgaaggcgc tgagcctgaa tgcgggtttg 600 ggcaatgtcg gcaattacaa cgtcgggttg ggcaatgtcg gggtgttcaa cctgggcgcg 660 ggcaatgtgg gtgggcagaa tctgggtttc gggaatgccg gtggcaccaa tgtcgggttc 720ggcaacctcg gtaacgggaa tgtcgggttc ggcaactccg gtctgggggc gggcctggcc 780ggcttgggca atatcgggtt gggcaatgcg ggcagcagca actatggttt cgcaaacctg 840ggtgtgggca acatcggttt cggcaacacc ggcaccaaca acgtcggcgt cgggctcacc 900ggcaaccacc tgacgggtat cgggggcctg aattcgggca ccgggaatat cgggttgttc 960aactccggca ccgggaatgt ggggttcttc aattcgggga ccgggaactt cggggtgttc 1020aactcgggta attacaacac cggtgtcggt aatgcgggga cggccagcac ggggttgttc 1080aatgccggca atttcaacac cggcgtggtg aacgtgggca gttacaacac cggcagtttc 1140aacgccggcg acaccaacac cggtggcttc aaccccggcg gtgtgaacac cggctggctg 1200aacaccggca acaccaacac cggcatcgcc aactcgggca acgtcaacac cggcgcgttc 1260atctcgggca acttcaacaa cggcgtgctg tgggtgggtg actaccaggg cctgttcggc 1320gtctccgccg gctcgtcgat ccccgcaatt cccatcggcc tggtgctcaa cggcgacatc 1380ggcccgatca ccatccagcc catcccgatc ctgcccacca tcccgctcag cattcaccaa 1440accgtcaact tgggcccgct ggtggttccc gacatcgtga tccccgcctt cggcggcggt 1500atcggcatac ccatcaacat cggcccgctg accatcacac ccatcaccct gtttgcccaa 1560cagacatttg tcaaccaatt gccctttccc accttcagtt tagggaaaat cacaattcca 1620caaatccaaa cctttgattc taacggtcag cttgtcagct ttatcggccc tatcgttatc 1680gacaccacca ttcccggacc caccaatcca cagattgatt taacgatcag atgggatacc 1740cctccgatca cgctgttccc gaatggcatc agtgctcccg ataatccttt ggggttgctg 1800gtgagtgtgt cgatcagtaa cccgggcttt accatcccgg gatttagtgt tcccgcgcag 1860ccgttgccgt tgtcgatcga tatcgagggc cagatcgacg ggttcagcac cccgccgatc 1920acgatcgatc gcatccccct gaccgtgggg ggcggggtca cgatcggccc catcacgatc 1980cagggccttc atatcccggc ggcgccggga gtggggaaca ccaccacggc cccgtcgtcg 2040ggattcttca actccggtgc gggtggggtg tcgggtttcg gcaacgtcgg cgcgggcagc 2100tcgggctggt ggaaccaggc gccgagcgcg ctgttggggg ccggttcggg tgttggcaac 2160gtgggcaccc tgggctcggg tgtgctcaac ctgggctcag ggatctcggg gttctacaac 2220accagcgtgt tgcctttcgg gacaccggcg gcggtgtcgg gcatcggcaa cctgggccag 2280cagctgtcgg gggtgtcggc ggcgggaacc acgctgcgct cgatgctcgc cggcaacctc 2340gggttggcca atgtgggcaa cttcaacacc gggttcggaa atgtcgggga cgtcaacctg 2400ggtgcggcca acatcggtgg gcacaacctg ggcctgggca atgtcgggga cggcaacctg 2460gggttgggca acatcggcca tggcaacctg gggtttgcca acttgggcct gaccgccggc 2520gcggcggggg tgggcaatgt tggttttggc aatgccggca tcaacaacta tggcttggcg 2580aacatgggtg tgggcaatat tgggtttgcc aacaccggca cgggcaacat cgggatcggg 2640ctggtcgggg accatcggac cgggatcggg ggcttgaact ccggcatcgg caatatcggg 2700ttgttcaact ccggcaccgg caacgtcggg ttcttcaatt ccgggaccgg caacttcggc 2760atcgggaact ccggccgctt caacaccggg atcggtaata gcggaacggc cagcaccggg 2820ctcttcaatg ccggcagctt cagcaccggc atcgccaaca ctggtgacta caacacgggc 2880agcttcaacg ccggcgacac caacaccggt ggcttcaacc cgggcggcat caacaccggc 2940tggttcaaca ccgggcatgc caacaccggg ttggccaacg cgggcacctt cggcaccggc 3000gccttcatga cgggcgacta cagcaacggc ctgttgtggc ggggcggcta cgagggcctg 3060gtcggcgtcc gcgtcgggcc cacgatctcc caattcccgg tcaccgtgca cgcgatcggc 3120ggggtgggcc cgctgcatgt ggcgcccgtc ccggtacccg ccgtgcacgt cgagatcacc 3180gacgccaccg tcggcctggg tccgttcacc gtcccaccga tcagcattcc ctcacttccc 3240atcgccagca tcaccggaag cgtggacctg gccgcaaaca ccatctcgcc gattcgcgct 3300cttgacccgc tcgccggttc gatagggctt tttctcgagc cgttccgcct cagtgaccca 3360tttatcacca ttgatgcgtt ccaagttgtt gccggtgtct tgttcctaga gaacatcatt 3420gtgcccggcc tcacggttag cggtcagata ttggtcaccc cgacaccaat tcccctaacc 3480ctcaacttgg acaccacccc gtggacgctt ttcccgaatg gtttcaccat tcccgcgcaa 3540acccccgtga cggtgggtat ggaggtcgcc aacgacgggt tcaccttctt cccgggtggg 3600ctgacctttc cgcgggcctc cgccggggtc accggactgt ccgtggggct ggacgcgttc 3660acgctgttgc ccgacgggtt caccctcgac accgtgccgg cgaccttcga cggcaccatc 3720ctcatcggcg atatcccgat cccgatcatc gatgtgccgg cggtgccggg gttcggcaac 3780accaccacgg ccccatcgtc ggggttcttc aacaccggcg gcggcggtgg atcggggttc 3840gccaacgtcg gcgcgggcac gtcgggctgg tggaaccagg ggcacgacgt gttagcaggg 3900gcgggctcgg gagttgccaa tgccggcacg ctgagctcgg gcgtgctgaa cgtcggctcg 3960gggatctccg ggtggtacaa caccagcacc ctgggagcgg gcaccccggc ggtggtctcg 4020ggcatcggca acctcggcca gcagctgtcg gggttcttgg caaatgggac cgtgctcaac 4080cggagcccca ttgtcaatat cgggtgggcc gatgtgggcg cgttcaacac cgggttgggc 4140aatgtggggg acctcaactg gggtgcggcc aacatcggcg cgcagaacct gggcctgggc 4200aatctcggca gcgggaacgt cgggttcggc aacatcggtg ccggcaacgt cgggttcgcc 4260aactcgggtc cggcggtggg cctggccggc ctgggcaacg tggggttgag caatgccggc 4320agcaacaact gggggctggc caacctgggt gtgggcaaca tcgggttggc caacaccggc 4380acgggcaaca tcgggatcgg gctggtcggc gactaccaga ccggcatcgg cggcctcaac 4440tcgggtagtg gcaatatcgg attgttcaat tccggcaccg gcaatgtcgg gttcttcaac 4500accggcaccg gcaacttcgg actgttcaac tccggtagtt tcaacaccgg catcggtaat 4560agcggaaccg gcagtactgg gctcttcaatcccgggtcgt acaacacggg cagcttcaatccgggcgaca tcaacaccgg ctggttcaacaccggcgccc tcatgtcggg gaccgacagc ggcctgttcg gcctgtccta tggcatcacgactggcggta tcggccccat cgtcatcccgcagatcaccg gcgacgcgga ctacagcttccacatcggca tcaatggcgt cgtcaccgtctccgccctga agaataacgg tagcttcatc gatattccgc ccatggattt cacgttaggcctcggaccaa ttcatcttga gccaatcgtggagcccatcc ccctggatgc gatttcgttggatattccgg cctcggtcat cgatgggatttccgtggaca tcccggcggt cacgatcacattcgacattc gcaccagtgc cggacccctcccgggcttcg ggaactcgac ccagatgccgggcggatcgg gcatcggcaa cttgggtgcggcggggtcac tggtggggac actctcgggggtgctgaact ccggcaccgc catctccgggaccccggcgg tgatctcggg gttcagcaacgatggcctga tcgcgatcct caccttcccagacgcggcca tcgccgagct gcagcacctcgtcggcgggg tgaacctcgg tttggctaacgtcggcaaca tcaacgtcgg cgccggcaacgtcgggaccg gcaacctcgg gttcggcaacgcgggcctga ccgcgggcgc ggggggcctgggcagctggg ggttggccaa cgtgggtgtgggcaacatcg ggatcgggct gaccggggacggcaccggga acctcgggtt gttcaactcggggaccggga acttcgggct gttcaactcgggcacggcca gcaccgggtt gttcaacgcgggctcctaca acaccggcag cctcaacgtg
gccggcaatt tcaacaccgg catcgccaac 4620gtcggtgata ccaacaccgg tggtttcaac 4680accggcatta tgaatacggg cacccgcaac 4740aacggcatgc tgtggcgcgg cgaccacgag 4800atcccgcaat tcccgatccg catcaccacg 4860gacaccacga tccttccgcc gctgcacctg 4920accgtgcccg acatccccat ccccgccatc 4980ggcttcaccg ccccggaagc caccctgctg 5040agcttcggcc ccatcacgct ctcgaatatc 5100ctgcccgttc ttggtcctat cacgggccaa 5160gtggccggga tcggtgtgcc cctggagatc 5220agtgagtcga ttcctatccg catacctgtt 5280tcaatgtcgg aagtggtgcc gatcgatgcg 5340ggcaccacca tttccgcgat cccgctgggc 5400aacatcccga tcatcgacat cccggcggcg 5460tcgtcggggt tcttcaacac cggtgccggc 5520ggcgtgtcgg gcctgctcaa ccaggccggc 5580ctgggcaatg ccggcaccct ggcctcgggt 5640ctgttcaacg tgagcacgct ggacgccacc 5700ctcggcgacc atatgtcggg ggtgtccatc 5760cctgccgagt ccgtgttcga tcagatcatc 5820gacatcggca acgctttggc cttgggcaat 5880gtcggtgagt tcaacctggg tgcgggcaac 5940ctcggcggca gcaacttggg gttgggcaac 6000atcggtgccg gcaatttcgg attcggcaac 6060ggcaatgtgg ggttgggtaa cgccggcagc 6120ggcaatatcg ggttggccaa caccggcacc 6180tatcggaccg ggatcggcgg cctgaactcg 6240ggcaccggca acatcgggtt cttcaacacc 6300ggcagttaca gcaccggtgt ggggaatgcg 6360gggaacttca acaccggtct ggccaatgcc 6420ggcagcttca acaccggcgg cgtcaacccg 6480ggcaccgtca acaccggctg gttcaacaccggcaacgtca acaccggcgc gttcaactccggtgactacc acgggctggt cggcttctccctggacctca acgaaaccct caacctgggc ggcatgtcgc tgttcgacgt ccacgaaatcgtcgatgttc ccgcgatacc gctagagatcctggtgcccg ccaccacaat tcccgcacagtcacccgggt caaccatgac gcttccgctcatcctcgggt cgaccgcggc gattcccaatggcatcacca ttcacaccgg ccctggccccccgggtttcg agattccgca aatcgctaccggtggtctgc cggccttcac cttgttcgcgccgttaacga tcgatgcgtc cggcgcgctgacgatcgacc cgctgccgct gcacctggcgccgatcatcg atgtcccgcc gacgccaggggggttcttca actccggcgc cggtggggtgtcgggctggt ggaaccaggc ggcgagcgcggtcggcacgc tgggctcggg tgtgctcaacaccagcgtgt tgccgctcgg gacgccggcg cagctgtcgg gcgtgtctgc ggccgggaccgggttggcgg atgtgggcaa cttcaacgtcggcgcggcca acctcggtgc gcaaaacctgggcttcgcca acgtcggcca cggcaatatcgcggccggcc tgggcaacac ggggttcggcaaccagggcg tgcgcaacat cgggttggccctggtggggg acaacctcac cggcatcgggttgttcaact ccggcaccgg caacatcgggatcggtaact cgggcagctt caacaccggcctcttcaatg ccggcagctt caacaccggcagcttcaatg ccggcgacac caacaccgggtggttcaaca ccggccacac caataccggcgcgttcatgt cgggcaactt cagcaacggc
ggccacacca acaccggcct gttcaacacc 6540ggcagcttca acaacggggc gctgtggacc 6600ttcagcatcg acatcgccgg cagcaccctg 6660cccatccaca tcgagcagat cgacatcccc 6720gtcgagatcg gacccttcac catcccgcag 6780cacgaatcga tccacatgga tcccatcgtc 6840acgagaacca ttccgctgga catccccgcc 6900atcagcatgc gcttcgaagg cgaggactgg 6960ttcggagacc ccttcccggc gcccacccag 7020ggaacgaccg gcgagctcaa gatatctatt 7080acgagattcc tgttggacgt gaacatcagc 7140ggtggcctga cgatccccac gaacgccatc 7200gatccgatca cgattttccc gggtgggtac 7260ctgaatctca ccgtgcccga cagcagcatc 7320ttcggcaaca ccacggcgac cccgtcgtcg 7380tcggggttcg gaaacgtcgg gtcgaacctg 7440ctggcggggt cgggatcggg ggtgttgaat 7500gtcggctcgg gtgtctcggg gatctacaac 7560gtgctgtcgg gcctcggcaa cgtcggccat 7620gcgttgaacc agatccccat cctcaacatc 7680gggttcggca acgtcgggga cgttaacctg 7740gggctgggca acgtcggcac cggcaacctc 7800ggtttcggca attcgggtct gaccgccggc 7860aatgccggca gcgccaacta tggtttcgcc 7920aacaccggca ccggcaacat cgggatcggg 7980ggcctgaact ccggtgccgg caatatcggc 8040ttcttcaact ccgggaccgg caacttcggc 8100atcggcaata gcggaacggg cagcactggg 8160gtggccaacg ccggcagcta caacaccggc 8220gggttcaacc cgggcaccat caacaccggc 8280atcgccaact cgggcaacgt cggcaccggc 8340ctgttgtggc ggggtgatca cgagggcctg 8400ttcagcctgt tctacagcct cgacgtgccc cggatcacca tcgtggacgc ccacctcgac 8460 ggcggcttcg gacccgtggt cctcccgccc atcccggtgc cggccgttaa tgcgcacctg 8520 accggaaacg tcgcgatggg cgcattcacc attccgcaga tcgacatccc cgcactcacc 8580 ccaaacatca ccggaagcgc cgccttccgc atcgttgtgg ggtccgtgcg cattccgccg 8640 gtgagtgtca ttgtggagca aataatcaac gcctcggttg gggcggagat gaggatagat 8700 cccttcgaaa tgtggactca aggcactaat ggccttggta taaccttcta ttcattcgga 8760 tcggccgacg gttcgcccta cgccaccggc ccactcgttt tcggcgccgg cacgagcgac 8820 ggaagccatc tcaccatttc cgcgtccagc ggggcgttta ccactccgca gctcgaaact 8880 ggcccgatca cgttgggctt ccaggtgccc ggcagcgtca acgcgatcac CCtCttCCCC 8940 ggtggtttga cgttcccggc gacctcgctg ctgaacctgg acgtgaccgc cggcgccggc 9000 ggcgtggaca tcccggccat cacctggccc gagatcgcgg cgagcgccga cggctcggtg 9060 tatgtcctcg ccagcagcat cccgctgatc aacatcccgc ccaccccggg cattgggaac 9120 agcaccatca ccccgtcgtc gggcttcttc aacgccggcg cgggcggggg atcgggcttc 9180 ggcaacttcg gcgcgggcac ctcgggctgg tggaaccagg cgcacaccgc gctggcgggg 9240 gcgggctcgg gttttgccaa cgttggcacg ctgcattccg gtgtgctcaa cctgggctcg 9300 ggtgtctcgg ggatctacaa caccagcacg ctgggggtgg ggaccccggc gctggtctca 9360 ggcctgggca acgtcggcca ccaactgtcg gggctgcttt ccggcgggtc cgcggtgaac 9420 ccggtgaccg ttctgaatat cgggttggcc aacgtcggca gccacaacgc cggtttcggc 9480 aatgtcgggg aggtcaacct gggcgcggcc aacctcggcg cgcacaacct gggcttcgga 9540 aatatcggcg ccggcaacct ggggttcggc aatattggcc acggcaatgt cggagtcggc 9600 aactcgggtc tgaccgcggg cgtgccgggc ctgggcaatg tggggttggg caatgccggc 9660 ggcaacaact gggggttggc caacgtgggc gtgggcaata tcgggttggc caacaccggc 9720 accggcaaca ttgggatcgg gctgaccggc gactaccaga ccggcatcgg cggcctaaat 9780 tccggtgccg gcaacctggg gttgttcaac tccggcgccg gcaacgtcgg gttcttcaac 9840 accgggaccg gcaacttcgg gttgttcaac tccggcagct tcaacaccgg cgtcggcaat 9900 agcggaacgg gcagcactgg gctcttcaat gccggcagtt tcaacaccgg tgtggccaac 9960
gccggcagct acaacacggg cagcttcaat gtcggtgaca ccaacaccgg gggcttcaac 10020
ccgggcagca tcaacaccgg ctggctcaac gccggcaacg ccaacaccgg ggtggccaac 10080
gcgggcaatg tcaacaccgg cgccttcgtc accggcaact tcagcaacgg catcctgtgg 10140
cgcggcgact accagggcct ggccggcttc gccgtgggct acaccctccc gctgttcccc 10200
gcggtgggcg ccgacgtcag cggcgggatc ggcccgatta ccgtgctgcc gcccatccac 10260
atcccgccca ttccggtcgg cttcgccgcg gtcggtggca tcggcccgat cgccatcccg 10320gacatctctg ttccatccat tcacttgggc ctcgaccccg ccgtccatgt cggctccatc 10380accgtcaacc ccattaccgt caggaccccg cccgtgctcg tcagttactc ccaaggagcc 10440gtcaccagca cgtccggacc aacctcagag atttgggtca agcccagctt cttccccgga 10500atccggatcg cgccctctag cggcgggggt gcaacgtcca cgcaaggggc atactttgtg 10560gggcccatct ccatcccctc cggcacggtg accttcccgg gattcaccat ccccctcgac 10620ccgatcgaca tcggcctgcc ggtgtcgctg accatcccgg ggttcaccat cccgggcggc 10680accctgatcc ccaccctccc gctgggcctc gcgttgtcca atggcatccc gcccgtcgac 10740atcccggcca tcgttctcga ccggatcttg ctggacctgc acgccgacac cactatcggc 10800ccgatcaacg tcccgatcgc cgggttcggc ggggcgccgg gtttcgggaa ctcgaccacg 10860ctgccgtcgt cgggcttctt caacaccgga Qctggcggcg gttcgggctt tagcaacacc 10920ggcgcgggca tgtcgggatt gctcaacgcg atgtcggatc cgctgctcgg gtcggcgtcg 10980ggcttcgcca acttcggcac ccagctctcc ggcatcctca accgcggcgc cggcatctcg 11040ggcgtgtaca acaccggcgc gctgggtgtt gtcaccgcgg ccgtcgtctc gggtttcggc 11100aacgtcggcc agcaactgtc gggcttgctc ttcaccggcg tcgggcccta a 11151
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 26
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu
1 5 10
<210> 27
<211> 10
<212> PRT
<21Β> Mycobacterium tuberculosis
<400> 27
Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu
1 5 10
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis<400> 28
Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe
1 5 10
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 29
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 30
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 31
Asn Ile Arg Gln Ala Gly vai Gln Tyr
1 5
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 32
Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu
1 5
<210> 33<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 33
Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu
1 5 10
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 34
Leu Leu Asp Ala His Ile Pro Gln Leu
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 35
Ala Ala His Ala Arg Phe Val Ala Ala
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 36
Ala Val Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr Gly Gln
1 5 10
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 37Ala Ser Pro Val Ala Gln Ser Tyr Leu
1 5
<210> 38
<211> 10
<212> PRT
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 38
Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg
1 5 10

Claims (49)

1. Método para detecção de Mycobacterium tuberculosis em umindivíduo compreendendo:contato de uma amostra biológica do indivíduo compreendendocélulas T com um ou mais polipeptídeos de Mycobacterium, e uma célulaapresentando antígeno apresentando o um ou mais polipeptídeos de Myco-bacterium em que o um ou mais polipeptídeos de Mycobacterium compreen-dem uma seqüência de aminoácido mostrada como(a) uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12;(b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelomenos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:-10, SEQ ID NO: 11 OU SEQ ID NO: 12; em que os nove a vinte aminoácidosconsecutivos especificamente se ligam a complexo de histócompatibilidadeprincipal (MHC) classe I; edeterminação de se as células T especificamente reconhecem opolipeptídeo de Mycobacterium, em que a presença de células T que especi-ficamente reconhecem o polipeptídeo de Mycobacterium detecta Mycobacte-rium tuberculosis no indivíduo.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí-deo de Mycobacterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 1.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí-deo de Mycobacterium compreende pelo menos nove aminoácidos consecu-tivos de SEQ ID NO: 1 que especificamente se ligam a MHC classe I ou umpolinucleotídeo codificando o polipeptídeo.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o polipeptí-deo de Mycobacterium compreende a seqüência de aminoácido QTVEDEARRMW (aminoácidos 24 a 34 de SEQ ID NO: 1).
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí-deo de Mycobacterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 2.
6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí-deo de Mycobacterium compreende pelo menos nove aminoácidos consecu-tivos de SEQ ID NO: 2 que especificamente se ligam a HMC classe I.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o polipeptí-deo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido VSAAIAGLF(aminoácidos 47 a 55 de SEQ ID NO: 2).
8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí-deo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 3.
9. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptí-deo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos consecu-tivos de SEQ ID NO: 3 que especificamente se ligam a MHC classe I.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende aminoácidos 53 a 67 de SEQ ID NO: 3.
11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 4.
12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 4 que especificamente se ligam a MHC classe I.
13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 5.
14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 5 que especificamente se ligam a MHC classe I.
15. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 6.
16. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Mycobacterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 6 que especificamente se ligam a MHC classe I.
17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Mycobacterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 7.
18. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 7 que especificamente se ligam a MHC classe I.
19. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 8.
20. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 8 que especificamente se ligam a MHC classe I.
21. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 9.
22. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 9 que especificamente se ligam a MHC classe I.
23. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 10.
24. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 10 que especificamente se ligam a MHC classe I.
25. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 11.
26. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Mycobacterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 11 que especificamente se ligam a MHC classe I.
27. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Mycobacterium compreende a seqüência de aminoácido mostradacomo SEQ ID NO: 12.
28. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o polipep-tídeo de Myeobaeterium compreende pelo menos nove aminoácidos conse-cutivos de SEQ ID NO: 12 que especificamente se ligam a MHC classe I.
29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 --28, em que as células T são células T CD8+.
30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 --29, em que a determinação de se as células T CD8+ especificamente reco-nhecem o polipeptídio de Myeobaeterium é determinada medindo a secreçãode uma citocina a partir das células T CD8+.
31. Método de acordo com a reivindicação 30, em que a citocinaé interferon (IFN)-y.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, em que a medi-ção da secreção de IFN-γ é determinada usando um anticorpo que especifi-camente se liga a I FN-γ.
33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 --32, em que a amostra biológica é sangue, células mononucleares de sangueperiférico isoladas, células mononucleares isoladas
34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--32, em que as células T são culturadas in vitro com o polipeptídeo de Myeo-baeterium.
35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1--33, em que o polipeptídio é administrado ao indivíduo.
36. Método de detecção de Myeobaeterium tubereuiosis em umindivíduo compreendendo:administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptí-deo de Myeobaeterium à pele do indivíduo, em que o polipeptídeo de Myeo-baeterium compreende uma seqüência de aminoácido mostrada como (a)uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO: 1, SEQ IDNO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ IDNO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 ouSEQ ID NO: 12; ou(b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelomenos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO: 1,SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:-10, SEQ ID NO: 11 OU SEQ ID NO: 12; em que os nove a vinte aminoácidosconsecutivos especificamente se ligam a complexo de histocompatibilidadeprincipal (MHC) classe I; edetecção da presença de células T CD8+ que especificamentereconhecem o polipeptídeo de Mycobacterium no indivíduo.
37. Método de acordo com a reivindicação 36, em que a detec-ção da presença de células T CD8+ compreende detecção da presença decélulas T CD8+ in vivo.
38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-37, em que a detecção da presença de células T CD8+ compreende detec-ção de uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada.
39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 35-38, em que o polipeptídeo de Mycobaeterium é administrado intradermal-mente ao indivíduo, e em que a reação de hipersensibilidade do tipo retar-dada é medida através da medição de vermelhidão, inchaço ou endureci-mento da pele.
40. Método de detecção de uma infecção por Myeobaeteriumtubereulosis em um indivíduo compreendendodetecção da presença de um polipeptídeo de Myeobaeterium ouum polinucleotídeo codificando o polipeptídio em uma amostra do indivíduo,em que o polipeptídeo de Myeobaeterium compreende uma seqüência deaminoácido mostrada como uma das seqüências de aminoácido mostradascomo SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ IDNO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ IDNO: 10, SEQ ID NO: 11 ou SEQ ID NO: 12.
41. Método de acordo com a reivindicação 40 compreendendodeterminar a presença do polipeptídeo de Mycobacterium.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, em que a detec-ção da presença do polipeptídeo de Mycobacterium compreende o uso deum anticorpo que especificamente se liga a polipeptídeo de Mycobacterium.
43. Método de acordo com a reivindicação 40 compreendendodeterminar a presença do polinucleotídeo de Mycobacterium.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que a deter-minação da presença do polipeptídeo de Mycobacterium compreende o usode reação de cadeia de polimerase.
45. Método de acordo com a reivindicação 40, em que a amos-tra biológica é sangue, células mononucleares de sangue periférico, esputo,uma biópsia de pulmão, uma biópsia de nó linfático, saliva, fluido espinhalcerebral ou células T isoladas.
46. Método de detecção de células T expressando CD8 que es-pecificamente reconhecem SEQ ID NO: 1 em um indivíduo compreendendo(A) contato de células mononucleares de sangue periférico iso-ladas do indivíduo com um reagente compreendendo(1) um polipeptídeo de Mycobacterium compreendendo pelomenos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelo menos uma das se-qüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:-11 ou SEQ ID NO: 12, em que os nove a vinte aminoácidos consecutivosespecificamente se ligam a complexo de histocompatibilidade principal(MHC) classe I;(2) polipeptídeo de cadeia pesada HLA e p2-microglobulina; e(3) estreptavidina, em que o reagente é marcado ou não-marcado; e(B) detecção da presença do reagente ligado às células mono-nucleares de sangue periférico, deste modo detectando células T expres-sando CD8 que especificamente se ligam ao polipeptídeo de Mycobacteri-um.
47. Método de acordo com a reivindicação 46 compreendendoainda quantificação do número de células T CD8+ que se ligam ao reagente.
48. Método de acordo com a reivindicação 46, em que o reagen-te é marcado.
49. Método de acordo com a reivindicação 48, em que o marca-dor é fluorcromo.
BRPI0708912A 2006-03-14 2007-03-14 métodos in vitro para detecção de mycobacterium tuberculosis e de células t expressando cd8 que especificamente reconhecem seq id no: 11 em um indivíduo BRPI0708912B8 (pt)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US78236406P 2006-03-14 2006-03-14
US60/782,364 2006-03-14
PCT/US2007/006534 WO2007106560A2 (en) 2006-03-14 2007-03-14 Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection

Publications (3)

Publication Number Publication Date
BRPI0708912A2 true BRPI0708912A2 (pt) 2011-06-14
BRPI0708912B1 BRPI0708912B1 (pt) 2018-03-20
BRPI0708912B8 BRPI0708912B8 (pt) 2021-07-27

Family

ID=38208601

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0708865A BRPI0708865A8 (pt) 2006-03-14 2007-03-14 métodos para produzir uma resposta imune à tuberculose
BRPI0708912A BRPI0708912B8 (pt) 2006-03-14 2007-03-14 métodos in vitro para detecção de mycobacterium tuberculosis e de células t expressando cd8 que especificamente reconhecem seq id no: 11 em um indivíduo

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BRPI0708865A BRPI0708865A8 (pt) 2006-03-14 2007-03-14 métodos para produzir uma resposta imune à tuberculose

Country Status (7)

Country Link
US (7) US7842299B2 (pt)
EP (13) EP2207035B1 (pt)
CN (1) CN101438166A (pt)
BR (2) BRPI0708865A8 (pt)
CA (1) CA2649688A1 (pt)
WO (2) WO2007106560A2 (pt)
ZA (2) ZA200808644B (pt)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1486102A (en) 2000-11-07 2002-05-21 Immunovaccine Technologies Inc Vaccines with enhanced immune response and methods for their preparation
BRPI0708865A8 (pt) * 2006-03-14 2019-01-22 Univ Oregon Health & Science métodos para produzir uma resposta imune à tuberculose
ATE504000T1 (de) * 2006-09-05 2011-04-15 Hvidovre Hospital Auf ip-10 basierende immunologische überwachung
BRPI0604958B1 (pt) * 2006-11-23 2022-05-17 Fundação Oswaldo Cruz Kit para distinção de mycobacterium tuberculosis, m. bovis, m. bovis bcg em uma amostra, e, método para distinguir mycobacterium tuberculosis, m. bovis, m. bovis bcg
EP2197497B1 (en) 2007-09-27 2016-06-01 ImmunoVaccine Technologies Inc. Use of liposomes in a carrier comprising a continuous hydrophobic phase for delivery of polynucleotides in vivo
US20100209452A1 (en) * 2007-10-03 2010-08-19 Immunovaccine Technologies, Inc Compositions comprising an antigen, an amphipathic compound and a hydrophobic carrier, and uses thereof
EP2296696B1 (en) 2008-06-05 2014-08-27 ImmunoVaccine Technologies Inc. Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance
AT506819B1 (de) * 2008-06-12 2011-06-15 Affiris Forschungs Und Entwicklungs Gmbh Vakzin zur behandlung von alzheimer-krankheit
EP2353008A2 (en) * 2008-09-22 2011-08-10 Oregon Health and Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
US8486323B2 (en) 2009-08-28 2013-07-16 Dow Global Technologies Llc Rotational molded articles, and method of making the same
EP2501397B1 (en) * 2009-11-20 2017-10-04 Oregon Health and Science University Methods for producing an immune response to tuberculosis
CN103998058B (zh) 2011-10-06 2021-11-05 免疫疫苗技术有限公司 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用
US20140349320A1 (en) * 2011-12-15 2014-11-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Using Adaptive Immunity to Detect Drug Resistance
CN103864907B (zh) * 2012-12-18 2016-12-28 中国医学科学院病原生物学研究所 用于结核病诊断的蛋白以及试剂盒
CN104151411B (zh) * 2013-05-14 2018-03-20 中国医学科学院病原生物学研究所 用于结核病诊断的蛋白以及药物组合物
TWI654200B (zh) 2013-08-30 2019-03-21 環球免疫公司 治療或預防結核病的組合物及方法
US9970062B2 (en) * 2015-08-06 2018-05-15 Roche Molecular Systems, Inc. Compositions and methods for detection of mycobacterium tuberculosis
CN107304231B (zh) * 2016-04-18 2021-01-01 华中农业大学 一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用
US20190293645A1 (en) * 2016-09-22 2019-09-26 Pace Diagnostics, Inc. Mycobacterium tuberculosis proteins in diagnostic assays and devices for tuberculosis detection and diagnosis
EP3555630B1 (en) 2016-12-14 2023-05-31 Becton, Dickinson and Company Methods and compositions for obtaining a tuberculosis assessment in a subject
EP3784275A4 (en) * 2018-04-26 2022-03-30 Children's National Medical Center MYCOBACTERIAL ANTIGEN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
CN112322566A (zh) * 2020-11-17 2021-02-05 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 牛分枝杆菌弱毒株及其应用
CN116284283A (zh) * 2021-12-13 2023-06-23 江苏瑞科生物技术股份有限公司 重组结核分枝杆菌抗原、其制备方法和应用

Family Cites Families (114)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4444487A (en) 1979-07-02 1984-04-24 Xerox Corporation Multiple-flash fuser
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4957735A (en) 1984-06-12 1990-09-18 The University Of Tennessee Research Corporation Target-sensitive immunoliposomes- preparation and characterization
US5019369A (en) 1984-10-22 1991-05-28 Vestar, Inc. Method of targeting tumors in humans
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4745055A (en) 1985-05-07 1988-05-17 California Biotechnology Inc. Fused protein for enzyme immunoassay system
US4895800A (en) 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
US4811254A (en) 1985-12-17 1989-03-07 Nippon Gakki Seizo Kabushiki Kaisha Displacement detector for an encoder
US5091309A (en) 1986-01-16 1992-02-25 Washington University Sindbis virus vectors
CA1340456C (en) 1986-07-07 1999-03-23 Hubert J.P. Schoemaker Chimeric rodent/human immunoglobulins specific for tumor-associated antigens
US4902505A (en) 1986-07-30 1990-02-20 Alkermes Chimeric peptides for neuropeptide delivery through the blood-brain barrier
GB8626412D0 (en) 1986-11-05 1986-12-03 Clark M R Antibodies
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
AP56A (en) 1987-01-30 1989-09-26 Smithkline Biologicals S A Hepatitis B virus surface antigens and hybrid antigehs containing them.
ATE105858T1 (de) 1987-07-17 1994-06-15 Rhein Biotech Ges Fuer Biotech Dna-moleküle, die für fmdh-kontrollabschnitte und strukturgene für ein protein mit fmdh-aktivität kodieren, sowie deren anwendung.
US5004697A (en) 1987-08-17 1991-04-02 Univ. Of Ca Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier
DE10399032I1 (de) 1987-08-28 2004-01-29 Health Research Inc Rekombinante Viren.
CA1340203C (en) 1987-09-16 1998-12-15 Noboru Yanagida Recombinant apivoxvirus
CA1323293C (en) 1987-12-11 1993-10-19 Keith C. Backman Assay using template-dependent nucleic acid probe reorganization
JPH0630628B2 (ja) 1987-12-16 1994-04-27 キング醸造株式会社 生細胞数及び活力の測定方法
US4957795A (en) 1988-05-13 1990-09-18 Minnesota Mining And Manufacturing Company Absorbent elastomeric wound dressing
WO1990001069A1 (en) 1988-07-20 1990-02-08 Segev Diagnostics, Inc. Process for amplifying and detecting nucleic acid sequences
US5093258A (en) 1988-08-26 1992-03-03 Therion Biologics Corporation Recombinant fowlpox virus and recombination vector
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5055303A (en) 1989-01-31 1991-10-08 Kv Pharmaceutical Company Solid controlled release bioadherent emulsions
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5188937A (en) 1989-04-06 1993-02-23 Becton, Dickinson And Company Layered sandwich assay method for chlamydia and materials therefor
US5270202A (en) 1989-11-03 1993-12-14 Syamal Raychaudhuri Anti-idiotypic antibodies to human melanoma-associated proteoglycan antigen
US5271961A (en) 1989-11-06 1993-12-21 Alkermes Controlled Therapeutics, Inc. Method for producing protein microspheres
US5188837A (en) 1989-11-13 1993-02-23 Nova Pharmaceutical Corporation Lipsopheres for controlled delivery of substances
US5427930A (en) 1990-01-26 1995-06-27 Abbott Laboratories Amplification of target nucleic acids using gap filling ligase chain reaction
GB9007024D0 (en) 1990-03-29 1990-05-30 Imperial College Novel vaccine
US5268164A (en) 1990-04-23 1993-12-07 Alkermes, Inc. Increasing blood-brain barrier permeability with permeabilizer peptides
WO1991019803A1 (en) 1990-06-19 1991-12-26 Applied Biotechnology, Incorporated Self assembled, defective, nonself-propagating viral particles
US5709860A (en) 1991-07-25 1998-01-20 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
MX9204376A (es) 1991-07-25 1993-02-01 Idec Pharma Corp Composiciones y metodos para inducir respuestas citotoxicas de los linfocitos t.
US5254342A (en) 1991-09-30 1993-10-19 University Of Southern California Compositions and methods for enhanced transepithelial and transendothelial transport or active agents
US5643578A (en) 1992-03-23 1997-07-01 University Of Massachusetts Medical Center Immunization by inoculation of DNA transcription unit
JPH07507768A (ja) 1992-03-12 1995-08-31 アルカーメス　コントロールド　セラピューティクス，インコーポレイテッド Ａｃｔｈ含有マイクロスフェアの制御放出
US5534496A (en) 1992-07-07 1996-07-09 University Of Southern California Methods and compositions to enhance epithelial drug transport
US5662907A (en) 1992-08-07 1997-09-02 Cytel Corporation Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in humans using synthetic peptide epitopes
CA2142007C (en) 1992-08-11 2007-10-30 Robert Glen Urban Immunomodulatory peptides
FR2698877B1 (fr) 1992-12-04 1995-04-07 Atochem Elf Sa Composition adhésives thermofusibles réticulables à l'humidité.
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US6991797B2 (en) 1993-07-02 2006-01-31 Statens Serum Institut M. tuberculosis antigens
US5514670A (en) 1993-08-13 1996-05-07 Pharmos Corporation Submicron emulsions for delivery of peptides
US5648211A (en) 1994-04-18 1997-07-15 Becton, Dickinson And Company Strand displacement amplification using thermophilic enzymes
US6429199B1 (en) 1994-07-15 2002-08-06 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules for activating dendritic cells
US6207646B1 (en) 1994-07-15 2001-03-27 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
ES2168380T3 (es) 1994-07-15 2002-06-16 Organon Teknika Bv Utilizacion de arn polimerasa para mejorar un procedimiento de amplificacion de acido nucleico.
US6239116B1 (en) 1994-07-15 2001-05-29 University Of Iowa Research Foundation Immunostimulatory nucleic acid molecules
CA2194761C (en) 1994-07-15 2006-12-19 Arthur M. Krieg Immunomodulatory oligonucleotides
US6045802A (en) 1994-10-03 2000-04-04 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Enhanced immune response to an antigen by a composition of a recombinant virus expressing the antigen with a recombinant virus expressing an immunostimulatory molecule
EP1016418B1 (en) 1994-10-03 2009-12-30 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Host cell comprising a recombinant virus expressing an antigen and a recombinant virus expressing an immunostimulatory molecule
US5736524A (en) * 1994-11-14 1998-04-07 Merck & Co.,. Inc. Polynucleotide tuberculosis vaccine
AT402203B (de) 1995-06-13 1997-03-25 Himmler Gottfried Dipl Ing Dr Verfahren zur transkriptionsfreien amplifizierung von nucleinsäuren
US6165460A (en) 1995-07-10 2000-12-26 Therion Biologics Corporation Generation of immune responses to prostate-specific antigen (PSA)
JP2001513776A (ja) 1997-02-28 2001-09-04 ユニバーシティ オブ アイオワ リサーチ ファウンデーション ＬＰＳ関連障害の処置における非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含む核酸の使用
US6406705B1 (en) 1997-03-10 2002-06-18 University Of Iowa Research Foundation Use of nucleic acids containing unmethylated CpG dinucleotide as an adjuvant
AU740545B2 (en) * 1997-04-02 2001-11-08 Statens Serum Institut Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis
US7037510B2 (en) * 1997-04-18 2006-05-02 Statens Serum Institut Hybrids of M. tuberculosis antigens
WO1998052581A1 (en) 1997-05-20 1998-11-26 Ottawa Civic Hospital Loeb Research Institute Vectors and methods for immunization or therapeutic protocols
US6555653B2 (en) 1997-05-20 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use
US6613881B1 (en) 1997-05-20 2003-09-02 Corixa Corporation Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use
EP1484405A1 (en) * 1997-11-10 2004-12-08 Statens Serum Institut Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. Tuberculosis
EP1029053A1 (en) 1997-11-10 2000-08-23 Statens Seruminstitut Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from mycobacterium tuberculosis
CA2323929C (en) 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
US6294328B1 (en) 1998-06-24 2001-09-25 The Institute For Genomic Research DNA sequences for strain analysis in Mycobacterium tuberculosis
US20020131976A1 (en) * 1998-12-23 2002-09-19 Ajit Lalvani Tuberculosis vaccine
EP2087906A1 (en) * 1999-05-04 2009-08-12 The University of Medicine and Dentistry of New Jersey Proteins expressed by Mycobacterium tuberculosis and not by BCG and their use as diagnostic reagents and vaccines
EP1218030A4 (en) 1999-09-10 2004-09-15 Univ Fordham METHODS AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF GRAFT REJECTS USING THERMAL SHOCK PROTEINS
US6861513B2 (en) 2000-01-12 2005-03-01 Schering Corporation Everninomicin biosynthetic genes
WO2001062893A2 (en) 2000-02-25 2001-08-30 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis
JP4852211B2 (ja) 2000-03-21 2012-01-11 メルク アンド カンパニー インコーポレイテッド 原核生物における必須遺伝子の同定
US7657378B1 (en) * 2000-03-30 2010-02-02 Council Of Scientific & Industrial Research Computer based method for identifying peptides useful as drug targets
WO2001079257A2 (en) 2000-04-14 2001-10-25 Phytera, Inc. Multidrug resistance (mdr) efflux pump polypeptides
KR100464485B1 (ko) 2000-11-09 2004-12-31 엘지전자 주식회사 고속무선 패킷 데이터의 전송 장치 및 그 방법
CA2430896A1 (en) 2000-12-13 2002-06-20 Argonex Pharmaceuticals, Inc. Mhc class i associated peptides for prevention and treatment of tuberculosis
WO2002077183A2 (en) * 2001-03-21 2002-10-03 Elitra Pharmaceuticals, Inc. Identification of essential genes in microorganisms
FI116851B (fi) * 2001-05-03 2006-03-15 Fit Biotech Oyj Plc Ilmentämisvektori, sen käyttöjä ja menetelmä sen valmistamiseksi sekä sitä sisältäviä tuotteita
US7067492B2 (en) * 2001-09-06 2006-06-27 Omnio Ab Method of promoting healing of a tympanic membrane perforation
GB0124593D0 (en) * 2001-10-12 2001-12-05 Microbiological Res Authority Mycobacterial antigens expressed under high oxygen tension
US20040029129A1 (en) * 2001-10-25 2004-02-12 Liangsu Wang Identification of essential genes in microorganisms
AU2002347346A1 (en) 2001-12-07 2003-06-17 University Of Liverpool Dna vaccine
JP4229238B2 (ja) 2002-02-08 2009-02-25 ザ ディレクター、オール インディア インスチチュート オブ メディカル サイエンス 結核の治療法と治療薬の開発に使用するための新規標的の同定方法
US7074559B2 (en) * 2002-03-06 2006-07-11 Refents of the University of Minnesota Mycobacterial diagnostics
US20030236393A1 (en) * 2002-03-22 2003-12-25 United States Of America Dept Of Vetrans Affairs Virulence genes of M. marinum and M. tuberculosis
WO2004006952A2 (en) * 2002-07-13 2004-01-22 Statens Serum Institut Therapeutic tuberculosis vaccines
US7364869B2 (en) * 2003-07-29 2008-04-29 The J. David Gladstone Institutes Method of detecting antigen-specific T lymphocytes
ITRM20030411A1 (it) * 2003-08-29 2005-02-28 Consiglio Nazionale Ricerche Uso di sequenze geniche specifiche di mycobacterium tubercolosis ecorrispondenti proteine per la diagnosi e la prevenzione di infezione tubercolare.
EP1518932A1 (en) * 2003-09-29 2005-03-30 GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit GmbH Modified vaccinia virus Ankara (MVA) mutant and use thereof
US7424370B2 (en) 2004-02-06 2008-09-09 Council Of Scientific And Industrial Research Computational method for identifying adhesin and adhesin-like proteins of therapeutic potential
GB0406271D0 (en) * 2004-03-19 2004-04-21 Isis Innovation Diagnostic test
US20090070897A1 (en) * 2006-01-12 2009-03-12 Goldman Barry S Genes and uses for plant improvement
US7566459B2 (en) * 2005-02-28 2009-07-28 New York University Modified mycobacterium tuberculosis strains and uses thereof
SI2457926T1 (sl) * 2005-04-29 2015-01-30 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Nov postopek za preprečevanje ali zdravljenje infekcije z M. tuberculosis
ATE530569T1 (de) 2005-07-01 2011-11-15 Forsyth Dental In Ry For Children Fa Assays zum nachweis von tuberkulose- antigenen, und impfstoffe
BRPI0708865A8 (pt) * 2006-03-14 2019-01-22 Univ Oregon Health & Science métodos para produzir uma resposta imune à tuberculose
KR100756676B1 (ko) 2006-11-23 2007-09-07 제일모직주식회사 실리콘계 미립자, 그 제조 방법, 및 그 미립자가 함유된열가소성 수지 조성물
MX351247B (es) * 2007-04-04 2017-10-05 Infectious Disease Res Institute Star Composiciones inmunogenicas que comprenden polipeptidos de mycobacterium tuberculosis y fusiones de los mismos.
EP2197908A2 (en) * 2007-09-27 2010-06-23 Dako Denmark A/S Mhc multimers in tuberculosis diagnostics, vaccine and therapeutics
PL2315834T3 (pl) * 2008-07-25 2018-12-31 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Białko rv2386c związane z gruźlicą, jego kompozycje i zastosowania
AU2009273128A1 (en) * 2008-07-25 2010-03-11 All India Institute Of Medical Science Constructing a DNA chimera for vaccine development against Leishmaniasis and tuberculosis
EP2353008A2 (en) 2008-09-22 2011-08-10 Oregon Health and Science University Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection
WO2010037402A1 (en) * 2008-10-02 2010-04-08 Dako Denmark A/S Molecular vaccines for infectious disease
US8691502B2 (en) * 2008-10-31 2014-04-08 Tremrx, Inc. T-cell vaccination with viral vectors via mechanical epidermal disruption
EP2501397B1 (en) * 2009-11-20 2017-10-04 Oregon Health and Science University Methods for producing an immune response to tuberculosis
US10703784B2 (en) * 2011-09-30 2020-07-07 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Antigens and epitopes derived from Mycobacterium tuberculosis

Also Published As

Publication number Publication date
US8361707B2 (en) 2013-01-29
BRPI0708912B8 (pt) 2021-07-27
ZA200808643B (en) 2014-03-26
EP2207035B1 (en) 2013-10-16
EP2397854A2 (en) 2011-12-21
CN101438166A (zh) 2009-05-20
US8053181B2 (en) 2011-11-08
WO2007106560A2 (en) 2007-09-20
EP2397855A2 (en) 2011-12-21
WO2007106560A3 (en) 2007-12-13
EP2397852A3 (en) 2012-03-14
EP2397853B1 (en) 2014-01-15
US20120107341A1 (en) 2012-05-03
EP2397855A3 (en) 2012-03-14
EP2397853A2 (en) 2011-12-21
EP2005184A2 (en) 2008-12-24
US20120014881A1 (en) 2012-01-19
EP2397853A3 (en) 2012-03-14
CA2649688A1 (en) 2007-09-20
EP2441493A1 (en) 2012-04-18
EP2397854A3 (en) 2012-03-14
US20130101523A1 (en) 2013-04-25
EP2253957A1 (en) 2010-11-24
US20150219645A1 (en) 2015-08-06
EP2397852B1 (en) 2013-12-04
EP2441493B1 (en) 2014-05-07
EP2428801B1 (en) 2014-05-07
US20090324503A1 (en) 2009-12-31
US9040233B2 (en) 2015-05-26
US20090124549A1 (en) 2009-05-14
US8101192B2 (en) 2012-01-24
EP2397856A3 (en) 2012-03-14
BRPI0708865A2 (pt) 2011-06-14
BRPI0708912B1 (pt) 2018-03-20
EP2397852A2 (en) 2011-12-21
EP1994409A2 (en) 2008-11-26
US7842299B2 (en) 2010-11-30
WO2007106536A3 (en) 2008-01-10
ZA200808644B (en) 2017-08-30
EP2441470B1 (en) 2014-05-07
EP2441470A1 (en) 2012-04-18
US8440206B2 (en) 2013-05-14
EP2397856B1 (en) 2013-11-13
US20110014224A1 (en) 2011-01-20
EP2397856A2 (en) 2011-12-21
EP2441469A1 (en) 2012-04-18
EP2207035A3 (en) 2010-11-17
EP2253957B1 (en) 2013-05-15
EP2397854B1 (en) 2014-06-04
WO2007106536A2 (en) 2007-09-20
BRPI0708865A8 (pt) 2019-01-22
EP2207035A2 (en) 2010-07-14
EP2428801A1 (en) 2012-03-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BRPI0708912A2 (pt) mÉtodos para detecÇço de uma infecÇço por mycobacterium tuberculosis
US8658350B2 (en) Methods for detecting Mycobacterium tuberculosis disease
EP2502076B1 (en) Methods for detecting a mycobacterium tuberculosis infection

Legal Events

Date Code Title Description
B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B06H Technical and formal requirements: requirement cancelled [chapter 6.8 patent gazette]

Free format text: REF. A RPI NO 2155 DE 24/04/2012. ANULACAO DA EXIGENCIA 6.6 POR TER SIDO INDEVIDA. REQUERENTE NAO APRESENTOU RESPOSTA A EXIGENCIA CONFORME DISPOE A RESOLUCAO 207 DE 24/04/2009, ENTRETANTO, A RESPOSTA CONSTA NO FORMULARIO DE DEPOSITO.

B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]
B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]
B07A Technical examination (opinion): publication of technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette]
B09A Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette]
B16A Patent or certificate of addition of invention granted

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 10 (DEZ) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 20/03/2018, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.

B16C Correction of notification of the grant

Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 14/03/2007, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS. PATENTE CONCEDIDA CONFORME ADI 5.529/DF, QUE DETERMINA A ALTERACAO DO PRAZO DE CONCESSAO