BRPI0708912B1 - Métodos in vitro para detecção de mycobacterium tuberculosis e de células t expressando cd8 que especificamente reconhecem seq id no: 11 em um indivíduo - Google Patents

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Abstract

métodos para detecção de uma infecção por mycobacterium tuberculosis. a presente invenção refere-se a métodos para detecção de uma infecção com mycobacterium tuberculosis (mtb) em um indivíduo que são descritos. os métodos incluem detecção da presença de células tcd8+ que especificamente reconhecem polipeptídio de mtb. os métodos incluem ensaios in vivo para detecção da presença de células t cd8+ em uma amostra biológica, e ensaios in vivo que detectam uma reação de hipersensibilidade do tipo retardado. os métodos podem também incluir detecção de polipeptídios e polinucleotídeos de mtb. reagentes para detecção de uma infecção por mtb são também descritos.

Description

(54) Título: MÉTODOS IN VITRO PARA DETECÇÃO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E DE CÉLULAS T EXPRESSANDO CD8 QUE ESPECIFICAMENTE RECONHECEM SEQ ID NO: 11 EM UM INDIVÍDUO (51) Int.CI.: G01N 33/569 (30) Prioridade Unionista: 14/03/2006 US 60/782,364 (73) Titular(es): THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA D.B.A THE DEPARTMENT OF VETERANS AFFAIRS. OREGON HEALTH & SCIENCE UNIVERSITY (72) Inventor(es): DAVID LEWINSOHN; DEBORAH LEWINSOHN
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODOS IN VITRO PARA DETECÇÃO DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS E DE CÉLULAS T EXPRESSANDO CD8 QUE ESPECIFICAMENTE RECONHECEM SEQ ID NO: 11 EM UM INDIVÍDUO.
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
O presente pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. N° 60/782.364 depositado em 14 de março de 2006, que é aqui incorporado a título de referência.
DECLARAÇÃO DE APOIO DO GOVERNO
A presente invenção foi feita com o apoio do governo dos Estados Unidos sob a Concessão N° NIH-R01-AI48090 e Concessão N° NIH NIAID HHSN266200400081 N01-AI-40081 do National Institutes of Health; o governo dos Estados Unidos tem certos direitos na invenção. A presente invenção foi também feita com apoio do Department of Veterans Affairs. CAMPO
O presente pedido refere-se ao campo de diagnóstico, especificamente a métodos para detecção de uma infecção com Mycobacterium tuberculosis (Mtb) em um indivíduo.
ANTECEDENTES
Micobactérias são um gênero de organismos bacterianos intracelulares aeróbicos que, quando da infecção de um hospedeiro, sobrevivem dentro de compartimentos endossomais de monócitos e macrófagos. Doenças micobacterianas humanas incluem tuberculose (causada por M. tuberculosis), lepra (causada por M. leprae), úlceras de Bairnsdale (causadas por M. ulcerans) e várias infecções causadas por M. marinum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M. chenolei, M. haemophilum e M. intracellulare (vide Wolinsky, E., capítulo 37 em Microbiology: Including Immunology and Molecular Genetics, 3a Ed., Harper & Row, Filadélfia, 1980).
Um terço da população do mundo carrega M. tuberculosis e está sob risco de desenvolver tuberculose (TB). Em pacientes imunocomprometidos, tuberculose está aumentando em uma taxa quase logarítmica, e cepas resistentes a multifármaco estão aparecendo. Ainda, cepas micobacterianas
11/10/2017, pág. 35/43 que foram previamente consideradas ser cepas não-patogênicas (por exemplo, M. avium) se tornaram agora matadoras principais de pacientes com AIDS imunocomprometidos. Além disso, vacinas Micobacterianas atuais são ou inadequadas (tal como a vacina BCG para M. tuberculosis) ou não5 disponíveis (tal como para M. leprae) (Kaufmann, S., Microbiol., 4:324-328, 1987; U.S. Congress, Office of Technology Assessment, The Continuing Challenge of Tuberculosis, PP. 62-67, OTA-H-574, U.S. Government Printing Office, Washington, D.C., 1993).
Inibição do espalhamento de tuberculose requer vacinação efi10 caz e diagnóstico precoce, eficaz, da doença. Atualmente, vacinação com bactérias vivas é o método mais eficiente para indução de imunidade protetora. A Micobactéria mais comum empregada para este propósito é Baciilus J Calmette-Guerin (BCG), uma cepa avirulenta de Mycobacteríum bovis. No entanto, a segurança e eficácia de BCG são uma fonte de controvérsia e alguns países, tal como os Estados Unidos, que não vacinam o público geral.
Diagnóstico de tuberculose é geralmente obtido usando um teste de pele; que envolve exposição transdermal à tuberculina PPD (derivado purificado de proteína) de tuberculina. Respostas de célula T específicas de antígeno resultam em endurecimento mensurável no sítio de injeção por 48 a 72 horas após injeção, o que indica exposição a antígenos Micobacterianos. No entanto, a sensibilidade e a especificidade deste teste não são ideais; indivíduos vacinados com BCG não podem ser distinguidos de indivíduos infectados. Deste modo, há uma necessidade na técnica de métodos de diagnóstico aperfeiçoados para detecção de tuberculose.
SUMÁRIO
Métodos para diagnóstico de uma infecção com Mycobacteríum tuberculosis (Mtb) são descritos aqui. Os métodos podem incluir detecção de células T CD8+ e/ou CD4+ que se ligam especificamente a um polipeptídeo de Mtb de interesse. Os métodos podem também incluir detecção de uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada em um indivíduo e/ou podem incluir detecção de polipeptídeos e polinucleotídeos de Mtb específicos. Os ensaios descritos podem ser usados individualmente ou em combinação. A infecção com Mycobacterium tuberculosis pode ser uma infecção latente ou ativa.
Em várias modalidades, são providos métodos para detecção de 5 Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo. Esses métodos incluem contato de uma amostra biológica do indivíduo compreendendo células T, tal como células T CD8+ e/ou células T CD4+, com um ou mais polipeptídeos de Mycobacterium, ou uma célula apresentando antígeno apresentando o um ou mais polipeptídeos de Mycobacterium. O um ou mais polipeptídeos de
Mycobacterium incluem uma seqüência de aminoácido mostrada como (a) uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID 1 NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO:11 ou SEQ
ID NO:12; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelo menos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, onde os nove a vinte aminoácidos consecutivos especificamente se ligam a complexo de histocompatibilidade princi20 pal (MHC) classe I. É determinado se as células T reconhecem especificamente o polipeptídeo de Mycobacterium.
Em modalidades adicionais, são providos métodos para detecção de Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo, onde os métodos incluem administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de um polipeptí25 deo de Mycobacterium à pele, subcutaneamente ou intradermalmente. O polipeptídeo de Mycobacterium inclui uma seqüência de aminoácido mostrada como (a) uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID
NO:11 ou SEQ ID NO: 12; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelo menos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID
N0:5, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID N0:11 ou SEQ ID Ν0.Ί2, onde os nove a vinte aminoácidos consecutivos especificamente se ligam a complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I. A presença de células T que espe5 cificamente reconhecem o polipeptídeo de Mycobacterium é detectada no indivíduo.
Em modalidades adicionais, são descritos métodos para detecção de uma infecção com Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo, onde os métodos incluem detecção da presença de um polipeptídeo ou um polinucleotídeo de Mycobacterium codificando o polipeptídeo em uma amostra do indivíduo. O polipeptídeo de Mycobacterium inclui uma seqüência de aminoácido mostrada como uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID N0:9, SEQ ID
NO:10, SEQIDN0:11 ou SEQ ID NO:12.
Adicionalmente, reagentes para a detecção de uma infecção com Mycobacterium em um indivíduo são descritos.
O acima e outras características e vantagens se tornarão mais aparentes a partir da descrição detalhada que segue de várias modalidades, que acontece com referência às figuras acompanhantes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A Figura 1 são dois gráficos mostrando a determinação de freqüências de célula efetora humana ex vivo usando o ensaio ELISPOT IFN-γ. Células T CD8+ purificadas com conta magnética foram culturadas com DC (20.000/cavidade) ou infectada com Mtb (H37Rv, MOT=50) ou pulsada com pool de peptídeo representando CFP10 (5 pg/ml cada peptídeo; 15-mers sobreposição 11a) em um ensaio ELISPOT IFN-γ. Cada população de célula T respondedora foi testada em duplicata em quatro concentrações de célula diferentes. Para determinar a freqüência de célula efetora de células T espe30 cíficas de antígeno, o número médio de manchas por cavidade para cada duplicata foi posto em gráfico contra o número de células respondedoras por cavidade. Análise de regressão linear foi usada para determinar a inclinação da linha, que representa a freqüência de células T específicas de antígeno. O ensaio seria considerado positivo (refletindo a presença de uma resposta de célula T iniciada), se a probabilidade binominal para o número de manchas fosse significantemente diferente através de ensaios experimentais e controle.
A Figura 2 é um conjunto de gráficos mostrando freqüências de célula T CD8+ ex vivo para antígenos de Mtb que estão associados com infecção com Mtb. Conforme acima descrito (vide Figura), para determinar freqüências de célula T CD8+ ex vivo, DC autóloga ou infectada com Mtb ou pulsada com grupos de peptídeo cognato foi incubada com células T CD8+ em um ensaio ELISPOT IFN-γ. Indivíduos sem evidência de infecção com Mtb, aqueles com LTBI, e aqueles com TB ativa (cultura confirmou tuberculose pulmonar) foram avaliados. Infectados com Mtb inclui aqueles com LTBI e tuberculose ativa. Valores P são registrados onde P = <0,05 (Wilco15 xon/Kruskal-Wallis).
As Figuras 3a a 3d são um conjunto de imagens digitais mostrando a definição de Especificidade Antigênica e Restrição de HLA (a caracterização de clone de célula T D466 D6). Para os resultados mostrados nas Figuras 3a-3c, para identificar o antígeno e epítopo mínimo reconhecidos pelo clone de célula T, D466 D6, células T (5000 células/cavídade) foram incubadas com LCL autólogo (20.000/cavidade) e 5 pg/ml de antígeno. IFN-γ foi avaliado através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Para os resultados apresentados na Figura 3a, antígenos consistiam em pool de peptídeo representando antígenos de CD4+ conhecidos, feitos de peptídeos de até 15 aminoácidos (aa) se sobrepondo em 11 aa. Para os resultados apresentados na Figura 3b, antígenos consistiam em peptídeos CFP10 de 15 aa individuais que juntos constituíam o pool de peptídeo. Para os resultados apresentados na Figura 3c, antígenos consistiam em peptídeos CFPICh-15 aninhados individuais (10 aa, 9 aa ou 8 aa), usados para mapear mais o epítopo. Para os resultados apresentados na Figura 3d, o alelo de restrição foi identificado usando LCL (20.000/cavidade) expressando alelos HLA igualando D466 em um ou dois alelos, pulsada com CFP1O2-io(5 pg/ml) como APC. Após 2 horas, células foram lavadas e incubadas com células T (500 células/cavidade) em um ensaio ELISPOT IFN-γ.
A Figura 4 é um gráfico em linha mostrando a confirmação de mapeamento de epítopo mínimo de D466 D6. Para confirmar o epítopo mí5 nimo, LCL autóloga (20.000/cavidade) foi pulsada com peptídeo na concentração indicada e co-culturada com células T (1000 células/cavidade). IFN-γ foi avaliado através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representa a média de determinações em duplicata.
A Figura 5 é um conjunto de gráficos em barra mostrando o perfil 10 de padrão de imunodominância para CFP10. Para determinar as freqüências de célula efetora, DC autólogas (20.000/cavidade) foram pulsadas ou com cada peptídeo de 15-mer individual (5 pg/ml), o pool de peptídeo (PP; 5 1 pg/cada peptídeo) ou o epítopo mínimo (ME) determinado de clones de célula T derivados de cada doador (D466:CFP102-11; D480:CFP103-11;
D481 ;CFP1075-83; 5 pg/ml) e testadas contra 250.000 células T CD8+ purificadas com conta magnética. Liberação de IFN-γ foi avaliada através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representa a média de determinações em duplicata.
A Figura 6 é um grupo de gráficos resumindo os dados de ma20 peamento de epítopo mínimo. Para determinar o epítopo mínimo, LCL autóloga (20.000/cavidade) foi pulsada com peptídeo na concentração indicada e co-cultura com células T (1000 células/cavidade). IFN-γ foi avaliado através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto representa a média de determinações em duplicata.
A Figura 7 é um gráfico em linha mostrando o mapeamento de
Epítopo Mínimo para Clones D504. Para determinar o epítopo mínimo, LCL autóloga (20.000/cavidade) foi co-culturada com clones de célula T (1.000 células/cavidade) e o peptídeo na concentração indicada. IFN-γ foi avaliado através de ELISPOT após dezoito horas de co-cultura. Cada ponto represen30 ta a média de determinações em duplicata.
LISTAGEM DE SEOÜÊNCIA
As seqüências de ácido nucléico e aminoácido listadas na listagem de seqüência acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, e código de três letras para aminoácidos, conforme definido em 37 C.F.R. 1.822. Apenas um filamento de cada seqüência de ácido nucléico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como incluído por qualquer referência ao filamento mostrado. Na listagem de seqüência acompanhante:
SEQ ID NOs: 1-12 são a seqüência de aminoácido de polipeptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 13-14 são aminoácidos de peptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 15-25 são as seqüências de ácido nucléico de polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de Mtb.
SEQ ID NOs: 26-38 são as seqüências de aminoácido de epítopos de Mtb específicos.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Métodos para detecção de uma infecção com Mycobacterium tuberculosis em um indivíduo são descritos. Os métodos incluem detecção da presença de células T, tal como, mas não limitado a, células T CD8+, que reconhecem especificamente um polipeptídeo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Os métodos incluem ensaios in vitro para detecção da presença de células T CD8+ em uma amostra biológica, e ensaios in vivo que detectam uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada. Os métodos podem também incluir detecção de polipeptídeos e polinucleotídeos de Mtb. Reagentes para a detecção de uma infecção com Mtb são também descritos. Termos
A menos que de outro modo mencionado, termos técnicos são usados aqui de acordo com uso convencional. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontrados em Benjamin Lewin, Genes V, publicado pela Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e outros (Eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicada pela Blackwell Science, Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk fíeference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
A fim de facilitar revisão das várias modalidades da presente descrição, as explicações que seguem de termos específicos são providas:
Adjuvante: Um veículo usado para aumentar antigenicidade. Adjuvantes incluem uma suspensão de minerais (alume, hidróxido de alumínio ou fosfato) onde antígeno é absorvido; ou emulsão água-em-óleo onde solução de antígeno é emulsificada em óleo mineral (adjuvante incompleto de Freund), algumas vezes com a inclusão de micobactérias mortas (adjuvante completo de Freund) para aumentar mais a antigenicidade (inibe degradação de antígeno e/ou causa influxo de macrófago). Oligonucleotídeos imunoestimuladores (tal como aqueles incluindo um motivo CpG) podem ser também usados como adjuvantes (por exemplo, vide Patente U.S. Ns 6.194.388; Patente U.S. N9 6.207.646; Patente U.S. 6.214.806; Patente U.S. N9 6.218.371; Patente U.S. N9 6.239.116; Patente U.S. N9 6.339.068; Patente U.S. N9 6.406.705; e Patente U.S. N9 6.429.199). Adjuvantes incluem moléculas biológicas (um adjuvante biológico), tal como moléculas co-estimuladoras. Adjuvantes exemplares incluem IL-2, RANTES, GM-CSF, TNF-a, IFN-γ, GCSF, LFA-3, CD72, B7-1, B7-2, OX-40L e 41 BBL.
Amplificação: De uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, uma molécula de DNA ou RNA) refere-se ao uso de uma técnica que aumenta o número de cópias de uma molécula de ácido nucléico em um espécime. Um exemplo de amplificação é a reação em cadeia de polimerase, onde uma amostra biológica coletada de um indivíduo é contatada com um par de iniciadores de oligonucleotídeo, sob condições que permitem a hibridização dos iniciadores em um molde de ácido nucléico na amostra. Os iniciadores são estendidos sob condições adequadas, dissociados do molde e então reanelados, estendidos e dissociados para amplificar o número de cópias do ácido nucléico. O produto de amplificação pode ser caracterizado por eletroforese, padrões de divagem de endonuclease de restrição, hibridização ou ligação de oligonucleotídeo; e/ou sequenciamento de ácido nucléico usando técnicas padrão. Outros exemplos de amplificação incluem amplificação por deslocamento de filamento, conforme descrito na Patente U.S. N9 5.744.311; amplificação isotérmica livre de transcrição, conforme descrito na
Patente U.S. Ne 6.033.881; amplificação por reação em cadeia de reparo, conforme descrito no WO 90/01069; amplificação por reação em cadeia da ligase, conforme descrito na EP-A-320 308; amplificação por reação em cadeia da ligase de preenchimento de lacuna, conforme descrito na Patente
U.S. Ns 5.427.930; e amplificação livre de transcrição de RNA NASBA®, conforme descrito na Patente U.S. Ne 6.025.134.
Antígeno: Um composto, composição ou substância que pode estimular a produção de anticorpos ou uma resposta de célula T em um animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas no animal.
Um antígeno reage com os produtos de imunidade humoral ou celular específica, incluindo aqueles induzidos por imunógenos heterólogos. O termo antígeno inclui todos os epítopos antigênicos relacionados. Epítopo ou determinante antigênico refere-se a um sítio no antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Em uma modalidade, células T respondem ao epítopo, quando o epítopo está presente em conjunto com uma molécula de MHC. Epítopos podem ser formados ambos de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não-contíguos justapostos pela estrutura terciária de uma proteína. Epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes desnaturantes enquanto epítopos formados por do20 bramento terciário são tipicamente perdidos em tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo tipicamente inclui pelo menos 3, e, mais comumente, pelo menos 5, cerca de 9 ou cerca de 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação de conformação espacial de epítopos incluem, por exemplo, cristalografia de raio X e ressonân25 cia magnética nuclear 2-dimensional.
Um antígeno pode ser um antígeno específico de tecido, ou um antígeno específico de doença. Esses termos não são exclusivos, um antígeno específico de tecido pode ser um antígeno específico de doença. Um antígeno específico de tecido é expresso em um número limitado de tecidos, tal como um tecido único. Um antígeno específico de tecido pode ser expresso por mais de um tecido, tal como, mas não limitado a, um antígeno que é expresso em mais de um tecido reprodutivo, tal como em tecido de ambos próstata e útero. Um antígeno específico de doença é expresso coincidentemente com um processo de doença. Exemplos não-limitantes específicos de um antígeno específico de doença são um antígeno cuja expressão se relaciona com, ou é previsiva de, tuberculose. Um antígeno específico de doença pode ser um antígeno reconhecido por células T ou células B.
Anticorpo: Moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que especificamente liga (imunorreage com) um antígeno, tal como polipeptídeo de Mtb.
Um anticorpo de ocorrência natural (por exemplo, IgG, IgM, IgD) inclui quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. No entanto, foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de ocorrência natural. Então, esses fragmentos de ligação de antígeno pretendem ser também designados pelo termo anticorpo. Exemplos não-limitantes, específicos, de fragmentos de ligação compreendidos dentro do termo anticorpo incluem (i) um fragmento Fab consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH; (ii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e Ch; (iii) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (iv) um fragmento dAb (Ward e outros, Nature 341:544-546, 1989) que consiste em um domínio VH; (v) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (vi) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça.
Imunoglobulinas e certas variantes delas são conhecidas e podem ter sido preparadas em cultura de célula recombinante (por exemplo, vide Patente U.S. Ne 4.745.055; Patente U.S. Ne 4.444.487; WO 88/03565; EP 256.654; EP 120.694; EP 125.023; Faoulkner e outros, Nature 298:286, 1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison e outros, Ann. fíev. Immunol. 2:239, 1984).
Animal: Organismos vertebrados multicelulares vivos, uma categoria que inclui, por exemplo, mamíferos e aves. O termo mamífero inclui ambos mamíferos humanos em não-humanos. Similarmente, o termo indivíduo inclui ambos indivíduos humanos e veterinários.
Anticorpo: Moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação de antígeno que especificamente liga (imunorreage com) um antígeno.
Um anticorpo de ocorrência natural (por exemplo, IgG, IgM, IgD) inclui quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. No entanto, foi mos10 trado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de ocorrência natural. Então, esses fragmentos de ligação de antígeno pretendem ser também designados pelo termo anticorpo. Exemplos não-limitantes, específicos, de fragmentos de ligação compreendidos dentro do termo anticorpo incluem (i) um fragmento
Fab consistindo nos domínios VL, Vh, Cl e Ch; (ii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e Ch; (iii) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (iv) um fragmento dAb (Ward e outros, Nature 341:544-546, 1989) que consiste em um domínio VH; (v) uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (vi) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma ponte dissulfeto na região de dobradiça.
Imunoglobulinas e certas variantes delas são conhecidas e podem ter sido preparadas em cultura de célula recombinante (por exemplo, vide Patente U.S. Ns 4.745.055; Patente U.S. Ne 4.444.487; WO 88/03565;
EP 256.654; EP 120.694; EP 125.023; Faoulkner e outros, Nature 298:286, 1982; Morrison, J. Immunol. 123:793, 1979; Morrison e outros, Ann. Rev. Immunol. 2:239, 1984).
Célula apresentando antígeno (APC): Uma célula que pode apresentar um antígeno para célula T, de modo que as células T são ativa30 das. Células dendríticas são as células apresentando antígeno principais (APCs) envolvidas em respostas imunes primárias. A sua principal função é obter antígeno em tecidos, migrar para órgãos linfóides e apresentar o antí12 geno a fim de ativar células T.
Quando um sinal de maturação apropriado é recebido, células dendríticas são sinalizadas para sofrer mudanças morfológicas e fisiológicas rápidas que facilitam o início e desenvolvimento de respostas imunes. Den5 tre essas estão a supra-regulagem de moléculas envolvidas em apresentação de antígeno; produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo IL-12, chave para a geração de respostas Th1; e secreção de quimiocinas que ajudam a dirigir diferenciação, expansão e migração de células Th puras circundantes. Coletivamente, essas moléculas supra-reguladas facilitam a ha10 bilidade de células dendríticas em coordenar a ativação e função efetora de outros linfócitos circundantes que por fim provêem proteção para o hospedeiro.
cDNA (DNA complementar): Um pedaço de DNA sem segmentos de não-codificação, internos, (introns) e seqüências reguladoras que de15 terminam transcrição. cDNA é sintetizado no laboratório através de transcrição reversa de RNA mensageiro extraído de células.
CD4: Grupo de fator de diferenciação 4, uma proteína de superfície de célula T que faz a mediação da interação com a molécula do MHC Classe II. CD4 também serve como um sítio receptor primário para HIV em células T durante infecção com HIV. Células que expressam CD4 são freqüentemente células T auxiliares.
CD8: Grupos de fator de diferenciação 8, uma proteína de superfície de célula T que faz a mediação da interação com a molécula do MHC Classe II. Células que expressam CD8 são freqüentemente células T citotó25 xicas. Imunidade mediada por célula T CD8+ é uma resposta imune implementada pela apresentação de antígenos a células T CD8+.
cDNA (DNA complementar): Um pedaço de DNA sem segmentos de não-codificação, internos, (introns) e seqüências reguladoras que determinam transcrição. cDNA é sintetizado no laboratório através de transcri30 ção reversa de RNA mensageiro extraído de células.
Variantes conservativas: Substituições de aminoácido conservativas são aquelas substituições que não afetam substancialmente ou dimi13 nuem uma atividade ou antigenicidade do polipeptídeo de Mycobacterium. Exemplos não-limitantes, específicos, de uma substituição conservativa incluem os exemplos que seguem:
Resíduo Original Substituições Conservativas
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gin, His
Asp Glu
Cys Ser
Gin Asn
Glu Asp
His Asn; Gin
lie Leu, Vai
Leu lie; Vai
Lys Arg; Gin; Glu
Met Leu; lie
Phe Met; Leu; Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp; Phe
Vai lie; Leu
O termo variação conservativa também inclui o uso de um ami5 noácido substituído no lugar de um aminoácido de origem não-substituído, contanto que anticorpos criados para o polipeptídeo substancial também imunorreajam com o polipeptídeo não-substituído, ou que uma resposta imune possa ser gerada contra o polipeptídeo substituído que é similar à resposta imune contra e polipeptídeo não-substituído, tal como um antígeno de My10 cobacterium. Então, em uma modalidade, substituições não-conservativas são aquelas que reduzem uma atividade ou antigenicidade.
Consiste essencialmente em/Consiste em: Com relação a um polipeptídeo, um polipeptídeo que consiste essencialmente em uma seqüên14 cia de aminoácido especificada se ele não incluir quaisquer resíduos de aminoácidos adicionais. No entanto, o polipeptídeo pode incluir componentes de não-peptídeo adicionais, tal como marcadores (por exemplo, marcadores fluorescentes, radioativos ou em partícula sólida), açúcares ou lipídeos. Um polipeptídeo que consiste em uma seqüência de aminoácido especificada não inclui quaisquer resíduos de aminoácido adicionais, nem inclui componentes de não-peptídeo adicionais, tal como lipídeos, açúcares ou marcadores.
Contato: O processo de incubação de um agente na presença de outro. Então, quando uma célula é contatada com um agente, a célula é incubada com o agente por um período de tempo suficiente para o agente e a célula interagirem.
Molécula co-estimuladora: Embora envolvimento do TCR com peptídeo-MHC libere um sinal para a célula T, este sinal sozinho pode ser insuficiente para ativar a célula T. Moléculas co-estimuladoras são moléculas que, quando ligadas a seu ligante, aplicam um segundo sinal requerido para a célula T se tornar ativada. A molécula co-estimuladora mais bemconhecida na célula T é CD28, que se liga a ou B7-1 (também chamada CD80) ou B7-2 (também conhecida como CD86). Uma molécula coestimuladora adicional é B7-3. Moléculas acessório que também provêem um segundo sinal para a ativação de células T incluem molécula de adesão intracelular (ICAM-1 e ICAM-2), antígeno associado a funcionamento de leucócito (LFA-1, LFA-2 e LFA-3). Integrinas e membros da superfamília de fator de necrose de tumor (TNF) podem também servir como moléculas coestimuladoras.
Citocina: Proteínas feitas pelas células que afetam o comportamento de outras células, tal como linfócitos. Em uma modalidade, uma citocina é uma quimiocina, uma molécula que afeta tráfego celular. Exemplos não-limitantes, específicos, de citocinas incluem as interleucinas (IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-21, etc) e interferon (IFN)-y.
Variante de degeneração: Um polinucleotídeo codificando um epítopo de um polipeptídeo de Mtb que inclui uma seqüência que é degene15 rada como um resultado do código genético. Existem 20 aminoácidos naturais, a maioria dos quais é especificada por mais de um códon. Então, todas as seqüências de nucleotídeo de degeneração estão incluídas nesta descrição contanto que a seqüência de aminoácido do polipeptídeo de Mtb codifi5 cada pela seqüência de nucleotídeo seja não-modificada.
Célula dendrítica (DC): Células dendríticas são as principais células apresentando antígeno (APCs) envolvidas em respostas imunes primárias. Células dendríticas incluem células dendríticas plasmocitóides e células dendríticas mielóides. Sua função principal é obter antígeno em tecidos, mi10 grar para órgãos linfóides e apresentar o antígeno a fim de ativar células T. Células dendríticas imaturas se originam na medula óssea e residem na periferia como células imaturas.
Diagnóstico: Identificação da presença ou natureza de uma condição patológica, tal como, mas não limitado a, tuberculose. Métodos de di15 agnóstico diferem em sua sensibilidade e especificidade. A sensibilidade de um ensaio de diagnóstico é a porcentagem de indivíduos doentes que testam positivo (porcentagem de verdadeiros positivos). A especificidade de um ensaio de diagnóstico é 1 menos a taxa de falso positivo, onde a taxa de falso positivo é definida como a proporção daqueles sem a doença que testaram positivo. Embora um método de diagnóstico particular possa não prover um diagnóstico definido de uma condição, é suficiente se o método prover uma indicação positiva que auxilie em diagnóstico. Prognóstico significa previsão da probabilidade de desenvolvimento (por exemplo, severidade) de uma condição patológica, tal como tuberculose.
Mostra: O processo de localização de um complexo peptídeo:antígeno, ou um peptídeo, na superfície externa de uma célula onde o complexo peptídeo:antígeno ou peptídeo é acessível a uma segunda célula, moléculas mostradas por uma segunda célula, ou fatores solúveis. Um peptídeo, ou um complexo de peptídeo:antígeno, é mostrado por uma célula quando ele está presente na superfície externa da célula e é acessível a uma segunda célula, a moléculas mostradas pela segunda célula, ou a fatores solúveis.
Epítopo: Um determinante antigênico. Esses são grupos químicos ou seqüências de peptídeo particulares em uma molécula que são antigênicos, isto é, que elicitam uma resposta imune específica. Um anticorpo se liga especificamente a um epítopo antigênico particular em um polipeptídeo, tal como um polipeptídeo de Mycobacteríum.
Seqüências de Controle de Expressão: Seqüências de ácido nucléico que regulam a expressão de uma seqüência de ácido nucléico heteróloga à qual elas estão operativamente ligadas. Seqüências de controle de expressão são operativamente ligadas a uma seqüência de ácido nucléico quando as seqüências de controle de expressão controlam e regulam a transcrição e, conforme apropriado, tradução da seqüência de ácido nucléico. Então seqüências de controle de expressão podem incluir promotores, aumentadores, terminadores de transcrição, um códon de início (isto é, ATG) em frente de um gene de codificação de proteína, sinal de união para introns, manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitir tradução apropriada de mRNA e códons de parada apropriados. O termo seqüências de controle pretende incluir, no mínimo, componentes cuja presença pode influenciar expressão, e pode também incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, seqüências líder e seqüências de contraparte de fusão. Seqüências de controle de expressão podem incluir um promotor.
Um promotor é uma seqüência mínima suficiente para direcionar transcrição. Também incluídos estão aqueles elementos promotores que são suficientes para fazer expressão de gene dependente de promotor controlável para específico de tipo de célula, específico de tecido ou induzível por sinais ou agentes externos; tais elementos podem estar localizados na região 5' ou 3' do gene. Ambos promotores constitutivos e induzíveis estão incluídos (vide, por exemplo, Bitter e outros, Methods in Enzymology 153:516544, 1987). Por exemplo, quando clonando em sistemas bacterianos, promotores induzíveis tal como pL de bacteriófago lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido ptrp-lac) e similar podem ser usados. Em uma modalidade, quando clonando em sistemas de célula de mamífero, promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotioneína) ou de vírus de mamífero (por exemplo, repetição terminal longa de retrovírus; o promotor tardio de adenovírus; o promotor do vírus vaccínia 7,5K) podem ser usados. Promotores produzidos através de técnicas de DNA re5 combinante ou sintéticas podem ser também usados para prover transcrição das seqüências de ácido nucléico. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de citomegalovírus.
Fracionamento: Submissão de uma amostra a condições ou procedimentos que separam os componentes da amostra com base em propri10 edades físicas ou químicas, mas não limitado a, tamanho, carga, solubilidade ou composição. Exemplos de procedimento de fracionamento incluem, mas não estão limitados a, precipitação seletiva, extração orgânica, diálise de exclusão de tamanho ou cromatografia, tal como cromatografia de troca de íon. Em uma modalidade, uma fração é um extrato solúvel ou um extrato orgânico de um organismo, tal como uma Mycobacteríum.
Funcionalmente Equivalente: Alterações de seqüência, tal como em um epítopo de um antígeno, que dão os mesmos resultados conforme aqui descrito. Tais alterações de seqüências podem incluir, mas não estão limitadas a, substituições conservativas, deleções, mutações, frameshifts e inserções.
Heterólogo: Originando de fontes ou espécies genéticas separadas. Um polipeptídeo que é heterólogo a um polipeptídeo de Mtb se origina de um ácido nucléico que não codifica o polipeptídeo de Mtb. Em um exemplo não-limitante, específico, um polipeptídeo compreendendo nove aminoá25 cidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, ou no máximo 20 aminoácidos consecutivos do polipeptídeo de Mtb, e uma seqüência de aminoácido heteróloga inclui uma β-galactosidase, uma proteína de ligação de maltose e albumina, antígeno de superfície B de hepatite ou uma seqüência de aminoácido de imunoglobulina. Em geral, um anticorpo que especificamente se liga a uma proteína de interesse não vai especificamente se ligar a uma proteína heteróloga.
Células hospediras: Células onde um vetor pode ser propagado e seu DNA expresso. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. A célula pode ser mamífero, tal como uma célula humana. O termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira objeto. É compreendido que toda a progênie pode não ser idêntica à célula de origem uma vez que pode haver mutações que acontecem durante replicação. No entanto, tal progênie está incluída quando o termo célula hospedeira é usado.
Antígeno de Leucócito Humano (HLA): Uma designação genética do complexo de histocompatibilidade principal humano (MHC). Locais individuais são designados por letras maiúsculas, como em HLA-E, e alelos são designados pelos números, como em HLA-A*0201. Os três genes do MHC classe I principais são chamados HLA-A, HLA-B e HLA-C. No entanto, existem muitos genes que codificam moléculas de superfície de célula associadas com microglobulina β2 que estão ligados aos genes do MHC classe I. A expressão desses genes é variável, ambos na distribuição de tecido e na quantidade expressa em células; esses genes foram chamados genes do MHC classe IB.
Resposta imune: Uma resposta de uma célula do sistema imune, tal como uma célula B, célula assassina natural, ou uma célula T, a um estímulo. Em uma modalidade, a resposta é específica para um antígeno parti20 cular (uma resposta específica de antígeno). Em uma modalidade, uma resposta imune é uma resposta de célula T, tal como uma resposta Th1; Th2 ou Th3. Em outra modalidade, uma resposta imune é uma resposta de uma célula T supressora.
Peptídeo imunogênico: Um peptídeo que compreende um motivo específico de alelo ou outra seqüência de modo que o peptídeo vai ligar uma molécula do MHC e induzir uma resposta de célula T, tal como uma resposta de célula T CD8+, ou uma resposta de célula B (tal como produção de anticorpo) contra o antígeno do qual o peptídeo imunogênico é derivado.
Em uma modalidade, peptídeos imunogênicos são identificados usando motivos de seqüência ou outros métodos, tal como determinações de rede neural ou polinomial, conhecidos na técnica. Tipicamente, algoritmos são usados para determinar o limiar de ligação de peptídeos para selecio19 nar aqueles com scores que dão a eles uma alta probabilidade de ligação em uma certa afinidade e serão imunogênicos. Os algoritmos são baseados ou nos efeitos sobre ligação de MHC de um aminoácido particular em uma posição particular, nos efeitos sobre ligação de anticorpo de um aminoácido particular em uma posição particular, ou nos efeitos sobre ligação de uma substituição particular em um peptídeo contendo motivo. Dentro do contexto de um peptídeo imunogênico, um resíduo conservado é um que aparece em uma freqüência significantemente maior do que seria esperado por distribuição aleatória em uma posição particular em um peptídeo. Em uma mo10 dalidade, um resíduo conservado é um onde a estrutura do MHC pode prover um ponto de contato com o peptídeo imunogênico.
Peptídeos imunogênicos podem ser também identificados medindo sua ligação a uma proteína do MHC específica e pela sua habilidade em estimular CD4 e/ou CD8 quando apresentados no contexto da proteína do MHC. Em um exemplo, um peptídeo de Mtb imunogênico é uma série de resíduos de aminoácido contíguos da proteína de Mtb geralmente entre 9 e 20 aminoácidos de comprimento, tal como cerca de 8 a 11 resíduos de comprimento. Polipeptídeos imunogênicos específicos são descritos aqui que são resíduos de 9 ou 10 aminoácidos de comprimento, ou no máximo 12 aminoácidos de comprimento.
Geralmente, polipeptídeos de Mtb imunogênicos podem ser usados para induzir uma resposta imune em um indivíduo, tal como uma resposta de célula B ou uma resposta de célula T. Em um exemplo, um polipeptídeo de Mtb imunogênico, quando ligado a uma molécula do Complexo de
Histocompatibilidade Principal Classe I, ativa células T CD8+, tal como linfócitos T citotóxicos (CTLs) contra Mtb. Indução de CTL usando peptídeos sintéticos e ensaios citotóxicos de CTL conhecidos na técnica, vide patente U.S. 5.662.907, que é aqui incorporada a título de referência. Em um exemplo, um peptídeo imunogênico inclui um motivo específico de alelo ou outra seqüência de modo que o peptídeo ligará uma molécula do MHC e induz uma resposta CD8+ contra o antígeno do qual o peptídeo imunogênico é derivado. Uma célula T CD8+ que reconhece especificamente um polipeptídeo de Mtb é ativada, prolifera e/ou secreta citocinas em resposta àquele polipeptídeo específico, e não para outros, polipeptídeos não-relacionados.
Composição imunogênica: Uma composição compreendendo um polipeptídeo de Mtb imunogênico ou um ácido nucléico codificando o polipeptídeo de Mtb imunogênico que induz uma resposta T mensurável contra Mtb, tal como uma resposta de célula T CD8+, ou induz uma resposta de célula B mensurável (tal como produção de anticorpos que especificamente ligam um polipeptídeo de Mtb). Para uso in vitro, a composição imunogênica pode consistir no ácido nucléico isolado, vetor incluindo o ácido nucléico/ou peptídeo imunogênico. Para uso in vivo, a composição imunogênica vai tipicamente compreender o ácido nucléico, vetor incluindo o ácido nucléico e/ou polipeptídeo imunogênico, em veículos farmaceuticamente aceitáveis e/ou outros agentes. Uma composição imunogênica pode opcionalmente incluir um adjuvante, uma molécula co-estimuladora ou um ácido nucléico codificando uma molécula co-estimuladora. Um polipeptídeo de Mtb, ou ácido nucléico codificando o polipeptídeo, pode ser prontamente testado quanto à sua habilidade em induzir uma resposta de célula T CD8+.
Inibição ou tratamento de uma doença: Inibição de uma doença, tal como tuberculose, refere-se à inibição do desenvolvimento integral de uma doença. Em vários exemplos, inibição de uma doença refere-se à diminuição dos sintomas de uma tuberculose. Tratamento refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica relacionada com a doença, tal como tuberculose.
Interferon gama (γ): IFN-γ é uma proteína dimérica com subunidades de 146 aminoácidos. A proteína é glicosilada em dois sítios, e o pl é 8,3-8,5. IFN-γ é sintetizado como uma proteína precursora de 166 aminoácidos incluindo uma seqüência de sinal secretora de 23 aminoácidos. Duas formas moleculares da proteína biologicamente ativa de 20 e 25 kDa foram descritas. Ambas são glicosiladas na posição 25. A forma de 25 kDa é também glicosilada na posição 97. As diferenças observadas de IFN-γ natural com relação à massa molecular e carga são devido a padrões de glicosilação variáveis. Formas de 40-60 kDa observadas sob condições de não21 desnaturação são dímeros e tetrâmeros de IFN-γ. O gene humano tem um comprimento de aproximadamente 6 kb. Ele contém quatro exons e mapeia para cromossomo 12q24.1.
IFN-γ pode ser detectado através de imunoensaios sensíveis, tal como um teste ELISA que permite detecção de células individuais produzindo IFN-γ. Quantidades pequenas de IFN-γ podem ser detectadas indiretamente através da medição de proteínas induzidas por IFN-γ tal como proteína Mx. A indução da síntese de IP-10 tem sido usada para medir concentrações de IFN-γ. Ainda, bioensaios podem ser usados para detectar IFN-γ, tal como um ensaio que emprega indução de atividade de indolamina 2,3dioxigenase em células 2D9. A produção de IFN-γ pode ser usada para avaliar a ativação de célula T, tal como ativação de uma célula T por um antígeno de Mycobacterium apresentado em HLA-E.
Isolado: Um ácido nucléico isolado foi substancialmente sepa15 rado ou purificado de outras seqüências de ácido nucléico na célula dos organismos onde o ácido nucléico acontece naturalmente, isto é, outros DNA e RNA cromossomais e extracromossomais. O termo isolado então compreende ácidos nucléicos purificados por métodos de purificação de ácido nucléico padrão. O termo também compreende ácidos nucléicos preparados através da expressão recombinante em uma célula hospedeira bem como ácidos nucléicos quimicamente sintetizados.
Marcador: Um composto ou composição detectável que é conjugado diretamente ou indiretamente a outra molécula para facilitar detecção daquela molécula. Exemplos não-limitantes, específicos, de marcadores in25 cluem tags fluorescentes, ligações enzimáticas e isótopos radioativos.
Seqüência ligante: Uma seqüência ligante é uma seqüência de aminoácido que liga covalentemente dois domínios de polipeptídeo. Seqüências ligantes podem ser incluídas entre os epítopos de Mtb descritos aqui para prover liberdade rotacional aos domínios de polipeptídeo ligados e então promover dobra de domínio apropriada e apresentação ao MHC. A título de exemplo, em um polipeptídeo recombinante compreendendo dois domínios de Mtb, seqüências ligantes podem ser providas entre eles, tal co22 mo um polipeptídeo compreendendo polipeptídeo de Mtb-ligantepolipeptídeo de Mtb. Seqüências ligantes, que são geralmente entre 2 e 25 aminoácidos de comprimento, são bem-conhecidas na técnica e incluem, mas não estão limitadas a, o espaçador glicina(4)-serina (GGGGSx3) descri5 to por Chaudhary e ouros, Nature 339:394-397, 1989.
Linfócitos: Um tipo de célula sanguínea branca que está envolvida nas defesas imunes do corpo. Existem dois tipos principais de linfócitos: células B e células T.
Mamífero: Este termo inclui ambos mamíferos humanos e não10 humanos. Similarmente, o termo paciente ou indivíduo inclui ambos indivíduos humanos e veterinários.
Micobactérias: Um gênero de organismos bacterianos intracelulares. Quando da invasão de um hospedeiro, esses organismos sobrevivem dentro de compartimentos endossomais dos monócitos e macrófagos. Do15 enças micobacterianas humanas incluem tuberculose (causada por M. tuberculosis), Leprose (causada por M. leprae), úlceras de Barinsdale (causadas por M. ulcerans) e outras infecções que podem ser causadas por M. marinum, M. kansasii, M. scrofulaceum, M. szulgai, M. xenopi, M. fortuitum, M. haemophilum, M. chelonei e M. intracelluare. Cepas de Mycobacterium que foram anteriormente consideradas ser não-patogênicas (tal como M. avium) são também agora conhecidas ser assassinas principais de pacientes com AIDS imunossuprimidos.
A resposta principal a micobactérias envolve reações de hipersensibilidade mediada por célula (DTH) com células T e macrófagos desem25 penhando papéis principais na morte intracelular e enclausuramento (ou contenção) do organismo (formação de granuloma). Uma resposta de célula T principal envolve linfócitos CD4+ que reconhecem proteínas de choque térmico micobacterianas e antígenos imunodominantes.
Operavelmente ligado: Uma primeira seqüência de ácido nucléi30 co está operavelmente ligada com uma segunda seqüência de ácido nucléico quando a primeira seqüência de ácido nucléico é posta em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácido nucléico. Por exemplo, um promotor está operavelmente ligado a uma seqüência de codificação se o promotor realizar a transcrição ou expressão da seqüência de codificação. Em geral, seqüências de DNA operavelmente ligadas são contíguas e, onde necessário unir duas regiões de codificação de proteína, as estruturas de leitura aberta são alinhadas.
ORF (estrutura de leitura aberta): Uma série de tripletos de nucleotídeo (códons) codificando aminoácidos sem quaisquer códons de terminação. Essas seqüências são geralmente traduzíveis em um polipeptídeo.
Modificações de peptídeo: Polipeptídeos de Mycobacterium incluem modalidades sintéticas de peptídeos descritos aqui. Ainda, análogos (moléculas orgânicas de não-peptídeo), derivados (moléculas de peptídeo quimicamente funcionalizadas obtidas começando com as seqüências de peptídeo descritas) e variantes (homólogos) dessas proteínas podem ser utilizados nos métodos descritos aqui. Cada polipeptídeo da invenção é compreendido de uma seqüência de aminoácidos, que podem ser ou L- e/ou D-aminoácidos, de ocorrência natural ou outro.
Peptídeos podem ser modificados por uma variedade de técnicas químicas para produzir derivados tendo essencialmente a mesma atividade que os peptídeos não-modificados, e opcionalmente tendo outras propriedades desejáveis. Por exemplo, grupos de ácido carboxílico da proteína, sejam carboxila-terminais ou cadeia lateral, podem ser providos na forma de um sal de um cátions farmaceuticamente aceitável ou esterificados para formar um Ci-Ci6 éster, ou convertidos em uma amida de fórmula NR^ onde Ri e R2 são cada um independentemente H ou C1-C16 alquila, ou combinados para formar um anel heterocíclico, tal como um anel de 5 ou 6 membros. Grupos amino do peptídeo, sejam amino terminais ou de cadeia lateral, podem estar na forma de um sal de adição farmaceuticamente aceitável, tal como os sais de HCI, HBr, acético, benzoico, toluenossulfônico, maléico, tartárico e outros orgânicos, ou podem ser modificados para uma C1-C16 alquila ou dialquil amino ou convertidos mais em uma amida.
Grupos hidroxila das cadeias laterais de peptídeo podem ser convertidos em C1-C16 alcóxi ou em um C1-C16 éster usando técnicas bem24 reconhecidas. Anéis fenila e fenólicos das cadeias laterais de peptídeo podem ser substituídos com um ou mais átomos de halogênio, tal como flúor, cloro, bromo ou iodo, ou com CrCi6 alquila, C1-C16 alcoxi, ácidos carboxílicos e seus ésteres, ou amidas de tais ácidos carboxílicos. Grupos metileno das cadeias laterais de peptídeo podem ser estendidos para C2-C4 alquilenos homólogos. Tióis podem ser protegidos com qualquer um de vários grupos de proteção bem-reconhecidos, tal como grupos acetamida. Aqueles versados na técnica vão também reconhecer métodos para introdução de estruturas cíclicas nos peptídeos da presente invenção para selecionar e prover restrições conformacionais à estrutura que resultam em estabilidade aumentada.
Modalidades peptidomiméticas e organomiméticas são previstas, com o que a disposição tridimensional dos constituintes químicos de tais peptido- e organomiméticos imita a disposição tridimensional da estrutura principal de peptídeo e cadeias laterais de aminoácido componente, resultando em tais peptido- e organomiméticos de um polipeptídeo de Mycobacterium tendo habilidade mensurável ou aumentada em gerar uma resposta imune. Para aplicações de modelagem por computador, um farmacóforo é uma definição tridimensional, idealizada, das necessidades estruturais para atividade biológica. Peptido- e organomiméticos podem ser projetados para ajustar cada farmacóforo com software de modelagem por computador atual (usando projeto de fármaco auxiliado por computador ou CADD). Vide Walters, Computer-Assisted Modeling of Drugs, em Klegerman & Groves, Eds., 1993, Pharmaceutical Biotechnology, Interpharm Press: Buffalo Grove; IL, pp. 165-174 e Principies of Pharmacology Muson (ed.) 1995, Cap. 102, para descrições de técnicas usadas em CADD. Também incluídos estão miméticos preparados usando tais técnicas.
Agente farmacêutico ou fármaco: Um composto químico ou composição capaz de indução de um efeito terapêutico ou profilático deseja30 do quando apropriadamente administrado a um indivíduo.
Veículos farmaceuticamente aceitáveis: Os veículos farmaceuticamente aceitáveis úteis com os polipeptídeos e ácidos nucléicos descritos aqui são convencionais. PemingtorYs Pharmaceutical Sciences, de E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15ã Edição (1975), descreve composições e formulações adequadas para aplicação farmacêutica das proteínas de fusão aqui descritas.
Em geral, a natureza do veículo vai depender do modo de administração particular sendo empregado. Por exemplo, formulações parenterais geralmente compreendem fluidos injetáveis que incluem fluidos farmaceuticamente e fisiologicamente aceitáveis tal como água, solução salina fisiológica, soluções salinas equilibradas, dextrose aquosa, glicerol ou similar como um veículo. Para composições sólidas (por exemplo, formas em pó, pílula, comprimido ou cápsula), veículos sólidos não-tóxicos convencionais podem incluir, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido ou estearato de magnésio. Em adição a veículos biologicamente neutros, composições farmacêuticas a serem administradas podem conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares não-tóxicas, tal como agentes umectantes ou emulsificantes, preservantes e agentes de tamponamento de pH e similar, por exemplo, acetato de sódio ou monolaurato sorbitano.
Polinucleotídeo: Uma seqüência de nucleotídeo linear incluindo seqüências de mais do que 100 bases de nucleotídeo de comprimento.
Polipeptídeo: Qualquer cadeia de aminoácidos, sem importar o comprimento ou modificação pós-traducional (por exemplo, glicosilação ou fosforilação). Um peptídeo é uma cadeia de aminoácidos que é menos do que 100 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, um peptídeo é uma porção de um polipeptídeo, tal como cerca de 10, 20, 30, 40, 50 ou 100 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo que é maior do que 100 aminoácidos de comprimento.
Porção de uma seqüência de ácido nucléico: Pelo menos 10, 20, 30 ou 40 nucleotídeos contíguos da seqüência relevante, tal como uma seqüência codificando um antígeno. Em alguns casos seria vantajoso usar uma porção consistindo em 50 ou mais nucleotídeos. Por exemplo, quando descrevendo uma porção de um antígeno (tal como um epítopo antigênico), pode ser vantajoso remover uma porção da seqüência relevante compreen26 dendo pelo menos 10, 20, 30, 40 ou 50 nucleotídeos até um comprimento.
Sondas e iniciadores: Sondas e iniciadores de ácido nucléico podem ser prontamente preparados com base nos ácidos nucléicos providos pela presente invenção. Uma sonda compreende um ácido nucléico isolado ligado a um marcador detectável ou molécula repórter. Marcadores típicos incluem isótopos radioativos, ligantes, agentes quimioluminescentes e enzimas. Métodos para marcação e orientação na escolha de marcadores apropriados para vários propósitos são discutidos, por exemplo, em Sambrook e outros (1989) e Ausubel e outros (1987).
Iniciadores são ácidos nucléicos curtos, de preferência oligonucleotídeos de DNA de 15 nucleotídeos ou mais de comprimento. Iniciadores podem ser anelados para um filamento de DNA alvo complementar através de hibridização de ácido nucléico para formar um híbrido entre o iniciador e um filamento de DNA alvo, e então estendido ao longo do filamento de DNA alvo por uma enzima de polimerase de DNA. Pares de iniciador podem ser usados para amplificação de uma seqüência de ácido nucléico, por exemplo, através da reação em cadeia de polimerase (PCR) ou outros métodos de amplificação de ácido nucléico conhecidos na técnica.
Métodos para preparação e uso de sondas e iniciadores são descritos, por exemplo, em Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2- ed., vol. 1-3, ed. Sambrook e outros, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, e Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel e outros, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, Nova York, 1987 (com atualizações periódicas). Pares de iniciador de PCR podem ser deriva25 dos de uma seqüência conhecida, por exemplo, usando programas de computador pretendidos para este propósito tal como Iniciador (Versão 0.5, © 1991, Whitehead Insitute for Biomedical Research, Cambridge, MA).
Prevenção ou tratamento de uma doença: Prevenção de uma doença refere-se à inibição do desenvolvimento integral de uma doença, por exemplo, em uma pessoa que sabe estar sob risco de infecção com M. tuberculosis ou M. leprae. Um exemplo de uma pessoa com uma predisposição conhecida é alguém vivendo com uma pessoa diagnosticada com tuber27 culose, profissionais de cuidado de saúde, ou alguém da família, ou que foi exposta a M. tuberculosis. Tratamento refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinal ou sintoma de uma doença ou condição patológica, tal como tuberculose, após ela ter começado a se desenvolver.
Promotor: Um promotor é uma disposição de seqüências de controle de ácido nucléico que direciona transcrição de um ácido nucléico. Um promotor inclui seqüências de ácido nucléico necessárias próximo do sítio de início de transcrição, no caso de um promotor tipo polimerase II, um elemento TATA. Um promotor também opcionalmente inclui elementos aumentado10 res ou repressores distais que podem estar localizados mais de milhares de pares de base do sítio de início de transcrição. O promotor pode ser um promotor constitutivo ou induzível. Um exemplo não-limitante, específico, de um promotor é o promotor HCMV IE.
Purificado: O termo purificado não requer pureza absoluta; pelo contrário, ele é pretendido ser um termo relativo. Então, por exemplo, uma preparação de antígeno purificada é uma onde o antígeno é mais puro do que a proteína em seu ambiente original dentro de uma célula. Uma preparação de um antígeno é tipicamente purificada de modo que o antígeno representa pelo menos 50% do teor de proteína total da preparação. No entan20 to, preparações mais altamente purificadas podem ser requeridas para certas aplicações. Por exemplo, para tais aplicações, preparações onde o antígeno compreende pelo menos 75% o pelo menos 90% do teor de proteína total podem ser empregadas.
Recombinante: Um ácido nucléico ou polipeptídeo recombinante é um que tem uma seqüência que não é de ocorrência natural ou tem uma seqüência que é feita através de uma combinação artificial de dois ou mais segmentos de seqüência de outro modo separados. Esta combinação artificial é freqüentemente conseguida através de síntese química ou, mais geralmente, através da manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucléicos, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética.
Identidade de seqüência: A similaridade entre seqüências de aminoácido é expressa em termos da similaridade entre as seqüências, de outro modo referida como identidade de seqüência. Identidade de seqüência é freqüentemente medida em termos de identidade percentual (ou similaridade ou homologia); quanto maior a porcentagem, mais similares são as duas seqüências. Variantes de polipeptídeos de antígeno vão possuir um grau relativamente alto de identidade de seqüência quando alinhadas usando métodos padrão.
Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem-conhecidos na técnica. Altschul e outros (1994) apresentam uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de homologia. A NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul e outros, 1990) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) e na internet, para uso em conexão com os programas de análise de seqüência blastp, blastn, blastx, tblastn e tblastx. Ele pode ser acessado no website da NCBI. Uma descrição de como determinar identidade de seqüência usando este programa está disponível no website da NCBI, como estão os parâmetros default.
Variantes de polipeptídeos antigênicos, tal como polipeptídeo de Mycobacterium, são tipicamente caracterizadas por possuírem pelo menos 50% de identidade de seqüência contada em todo o alinhamento de comprimento completo com a seqüência de aminoácido de uma seqüência de antígeno nativa usando o NCBI Blast 2.0, conjunto gapped blastp para parâmetros default. Proteínas com similaridade ainda maior com as seqüências de referência vão mostrar identidades de porcentagem altas quando avaliadas através deste método, tal como pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de seqüência. Quando menos do que a seqüência inteira está sendo comparado quanto à identidade de seqüência, variantes vão tipicamente possuir pelo menos 75% de identidade de seqüência na janela curta de 10-20 aminoácidos, e podem possuir identidades de seqüência de pelo menos 85% ou pelo menos 90% ou 95% dependendo de sua similaridade com a seqüência de referência. Métodos para determinação de identidade de seqüência em tais janelas curtas são mostrados no website da
NCBI. Variantes de polipeptídeos de domínio do MHC também retêm a atividade biológica do polipeptídeo nativo. Para os propósitos da presente invenção, esta atividade é convenientemente avaliada através da incorporação do domínio variante no polipeptídeo β1α1 ou α1α2 e determinação da habilida5 de do polipeptídeo resultante em inibir proliferação de célula T específica de antígeno in vitro, ou induzir células supressoras T ou a expressão de IL-10 conforme descrito em detalhes abaixo.
Polipeptídeo terapeuticamente ativo: Um agente, tal como um epítopo de Mtb que causa indução de uma resposta imune, conforme medi10 do através de resposta clínica (por exemplo, aumento em uma população de células imunes, atividade citolítica aumentada contra Mtb ou redução mensurável de um sintoma de uma infecção). Moléculas terapeuticamente ativas podem ser também feitas de ácidos nucléicos. Exemplos de uma molécula terapeuticamente ativa baseada em ácido nucléico é uma seqüência de áci15 do nucléico que codifica um epítopo de Mtb, onde a seqüência de ácido nucléico está operavelmente ligada a um elemento de controle tal como um promotor.
Em uma modalidade, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de Mtb é uma quantidade usada para gerar uma respos20 ta imune. Em vários exemplos, tratamento refere-se a uma intervenção terapêutica que melhora um sinai ou sintoma de tuberculose.
Dose terapeuticamente eficaz: Uma dose suficiente para prevenir avanço ou causar regressão da doença ou que é capaz de aliviar sintomas causados pela doença. Em uma modalidade, uma dose terapeutica25 mente eficaz é uma dose suficiente para prevenir avanço ou aliviar sintomas de tuberculose.
Transduzido e Transformado: Um vírus ou vetor transduz uma célula quando ele transfere ácido nucléico para a célula. Uma célula é transformada por um ácido nucléico transduzido na célula quando o DNA se torna estavelmente replicada pela célula, ou através da incorporação de ácido nucléico no genoma celular, ou através de replicação epissomal. Conforme aqui usado, o termo transformação compreende todas as técnicas a30 través das quais uma molécula de ácido nucléico seria introduzida em tal célula, incluindo transfecção com vetores virais, transformação com vetores de plasmídeo e introdução de DNA nu através de eletroporação, lipofecção e aceleração de pistola de partícula.
Tuberculose (TB): Uma doença que é geralmente causada por
Mycobacteríum tuberculosis que geralmente infecta os pulmões. No entanto, outras micobactérias atípicas tal como K. kansasii poóem produzir um aparecimento clínico e patológico similar de doença.
Transmissão de M. tuberculosis acontece por via oral em áreas 10 fechadas com pouca ventilação. Em mais de 90% dos casos, seguindo infecção com M. tuberculosis, o sistema imune previne desenvolvimento de doença a partir de M. tuberculosis, freqüentemente chamada tuberculose ativa. No entanto, nem todos os M. tuberculosis são mortos, e então cápsulas duras, minúsculas, são formadas. Tuberculose primária é vista doença que se desenvolve seguindo uma infecção inicial, geralmente em crianças. O foco inicial de infecção é um granuloma subpleural pequeno acompanhado por infecção do nó linfático hilar granulomatoso. Juntos, esses formam o complexo Ghon. Em quase todos os casos, esses granulomas se decompõem e não há nenhum espalhamento adicional da infecção. Tuberculose secundária é vista principalmente em adultos como uma reativação de infecção anterior (ou reinfecção), particularmente quando o estado de saúde declina. A inflamação granulomatosa é muito mais de coloração vermelhobrilhante e espalhada. Tipicamente, os lóbulos do pulmão superior são mais afetados, e cavitação pode acontecer. Disseminação de tuberculose fora dos pulmões pode levar ao aparecimento de várias constatações incomuns com padrões características que incluem tuberculose esqueletal, tuberculose do trato genital, tuberculose do trato urinário, tuberculose do sistema nervoso central (SNC), tuberculose gastrintestinal, tuberculose adrenal, escrófula e tuberculose cardíaca. Tuberculose latente é uma infecção com Mtb em um indivíduo que pode ser detectada através de um ensaio de diagnóstico, tal como, mas não limitado a, teste de pele de tuberculina (TST) onde a infecção não produz sintomas naquele indivíduo. Tuberculose ativa é uma in31 fecção com Mtb sintomática em um indivíduo.
Microscopicamente, a inflamação produzida com infecção com
TB é granulomatosa, com macrófagos epitelióides e células gigantes Langhans junto com linfócitos, células de plasma, talvez algumas células poli5 morfonucleares, fibroblastos com colágeno e necrose caseosa característica no centro. A resposta inflamatória é mediada por uma reação de hipersensibilidade do tipo IV, e teste de pele é baseado nesta reação. Em alguns exemplos, tuberculose pode ser diagnosticada por um teste de pele, um tingimento rápido com ácido, um tingimento com auramina ou uma combinação deles. O espécime mais comum avaliado é esputo, mas os fingimentos histológicos podem ser também realizados em tecidos ou outros fluidos do corpo.
TB é uma complicação freqüente da infecção com HIV. Infecção com TB em indivíduos infectados com um vírus da imunodeficiência humana (HIV) pode ser espalhar prontamente e progredir rapidamente para doença ativa. Sintomas específicos de doença pulmonar devido à infecção com Mtb incluem tosse crônica e cuspir sangue. Outros sintomas da doença TB incluem fadiga, perda de apetite, perda de peso, febre e suores noturnos de encharcar.
Vetor: Uma molécula de ácido nucléico é introduzida em uma cé20 lula hospedeira, deste modo produzindo uma célula hospedeira transformada. Um vetor pode incluir seqüências de ácido nucléico que permitem que ele replique em uma célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Um vetor pode também incluir um ou mais genes marcadores selecionável e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Vetores incluem vetores de plasmídeo, incluindo plasmídeos para expressão em célula bacteriana gram negativa e gram positiva. Vetores exemplares incluem aqueles para expressão em E. coli e Salmonella. Vetores também incluem vetores virais tão como, mas não limitado a, vetores de retrovírus, ortopox, avipox, fowlpox, capripox, suipox, adenoviral, herpes vírus, alfa vírus, baculovírus, vírus
Sindbis, vírus vaccínia e poliovírus. Vetores também incluem vetores para expressão em células de levedura.
A menos que de outro modo explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como geralmente compreendido por um versado na técnica à qual a presente descrição pertence. Os termos no singular um, uma e o, a incluem referentes no plural a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Similarmente, a palavra ou pretende incluir e a menos que o contexto claramente indique de outro modo. Deve ser ainda compreendido que todos os tamanhos de base ou tamanhos de aminoácido, e todos valores de peso molecular ou massa molecular, dados para ácidos nucléicos ou polipeptídeos são aproximados, e são providos para descrição. Embora métodos e materiais simila10 res ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente descrição, métodos e materiais adequados são descritos abaixo. O termo compreende significa inclui. Todas as publicações, pedif dos de patente, patentes e outras referências mencionadas aqui são incorporados a título de referência em sua totalidade. No caso de conflito, o pre15 sente relatório, incluindo explicações de termos, vai prevalecer. Ainda, os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não pretendem ser limitantes.
Polipeptídeos de Mvcobacteríum
É aqui descrito que vários polipeptídeos de Mycobacteríum po20 dem ser usados para induzir uma resposta imune a Mtb, tal como uma resposta de célula T. Os polipeptídeos de Mycobacteríum podem ser usados em ensaios de diagnóstico para identificar indivíduos infectados com uma Mycobacteríum tal como Mtb. Em várias modalidades, o polipeptídeo compreende ou consiste na seqüência de aminoácido mostrada como:
1. MX1SRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGW
SGMAEATSLDTMX2X3MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQ ASQQILS, (SEQ ID NO:1, onde Xi é A ou T, X2 é T ou A e X3 é qualquer aminoácido, tal como Q ou nenhum aminoácido
Em vários exemplos, o polipeptídeo compreende ou consiste nas seqüências de aminoácido mostradas como:
a. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGW
SGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQAS
QQILS (SEQ ID NO: 2) (Vide também TUBERCULIST Ne Rv1038c, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como EsxJ, ES6_2, TB11.0, QILSS)
b. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAG
WSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQ ASQQILSS (SEQ ID NO: 3, TUBERCULIST Ns Rv1197, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como EsxK, ES6_3, TB 11.0, QILSS)
c. MASRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAG
WSGMAEATSLDTMT+MNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQA . SQQILSS (SEQ ID NO: 4, TUBERCULIST Ne Rv1992, conforme disponí• vel em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, coí nhecido como EsxM, TB11.0, QILSS)
d. MATRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAG
WSGMAEATSLDTMAQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQ
ASQQILSS (SEQ ID NO: 5, TUBERCULIST Ns Rv2347C, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como EsxP, ES6_7, QILSS)
e. MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAG
WSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQ
ASQQILSS (SEQ ID NO: 6, TUBERCULIST Ne Rv3620, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como EsxW, ES6_10, QILSS)
Em modalidades adicionais, o polipeptídeo compreende ou con25 siste na seqüência de aminoácido mostrada como:
2. MSYMIATPAALTAAATDIDGIGSAVSVANAAAVAATTGVLAAGGDEVLAA IARLFNANAEEYHALSAQVAAFQTLFVRTLTGGCGVFRRRRGRQCVTA AEHRAAGAGRRQRRRRSGDGQWRLRQQRHFGCGGQPEFRQHSEHR R (SEQ ID NO: 7, TUBERCULIST Ne Rv1088, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como PE9).
3. VSLVIATPQLLATAALDLASIGSQVSAANAAAAMPTTEVVAAAADEVSAAI
AGLFGAHARQYQALSVQVAAFHEQFVQALTAAAGRYASTEAAVERSLL GAVNAPTEALLGRPLIGNGADGTAPGQPGAAGGLLFGNGGNGAAGGF GQTGGSGGAAGLIGNGGNGGAGGTGAAGGAGGNG GWLWGNGGNG GVGGTSVAAGIGGAGGNGGNAGLFGHGGAGGTGGAGLAGANGVNPT
PG PAASTG DSPADVSGIG DQTGG DGGTGG HGTAGTPTGGTGG DG AT
ATAGSGKATGGAGGDGGTAAAGGGGGNGGDGGVAQGDIASAFGGD GGNGSDGVAAGSGGGSGGAGGGAFVHIATATSTGGSGGFGGNGAAS AASGADGGAGGAGGNGGAGGLLFGDGGNGGAGGAGGIGGDGATGG PGGSGGNAGIARFDSPDPEAEPDVVGGKGGDGGKGGSGLGVGGAGG
TGGAGGNGGAGGLLFGNGGNGGNAGAGGDGGAGVAGGVGGNGGG GGTATFHEDPVAGVWAVGGVGGDGGSGGSSLGVGGVGGAGGVGGK ' GGASGMLIGNGGNGGSGGVGGAGGVGGAGGDGGNGGSGGNASTFG í DENSIGGAGGTGGNGGNGANGGNGGAGGIAGGAGGSGGFLSGAAGV
SGADGIGGAGGAGGAGGAGGSGGEAGAGGLTNGPGSPGVSGTEGM
AGAPG (SEQ ID NO: 8, TUBERCULIST NQ Rv2487, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como PE_PGRS42)
4. MHQVDPNLTRRKGRLAALAIAAMASASLVTVAVPATANADPEPAPPVPT TAASPPSTAAAPPAPATPVAPPPPAAANTPNAQPGDPNAAPPPADPNA
PPPPVIAPNAPQPVRIDNPVGGFSFALPAGWVESDAAHFDYGSALLSKT TGDPPFPGQPPPVANDTRIVLGRLDQKLYASAEATDSKAAARLGSDMG EFYMPYPGTRINQETVSLDANGVSGSASYYEVKFSDPSKPNGQIWTGVI GSPAANAPDAGPPQRWFVVWLGTANNPVDKGAAKALAESIRPLVAPPP APAPAPAEP APAPAPAGEVAPTPTTPTPQRTLPA (SEQ ID NO: 9, TU25 BERCULIST Ne Rv1860, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como Apa, modD; mpt32)
5. MLLALLRQHIRPYRRLVAMLMMLQLVSTLASLYLPTVNAAIVDDGVAKG DTATIVRLGAVMLGVTGLQVLCAIGAVYLGSRTGAGFGRDLRSAMFEHII
TFSERETARFGAPTLLTRSTNDVRQILFLVQMTATVLVTAPIMCVGGIIMA IHQEAALTWLLLVSVPILAVANYWIISHMLPLFRRMQSLIDGINRVMRDQL SGVRVVRAFTREGYERDKFAQANTALSNAALSAGNWQALMLPVTTLTI
NASSVALIWFGGLRIDSGQMQVGSLIAFLSYFAQILMAVLMATMTLAVLP
RASVCAERITEVLSTPAALGNPDNPKFPTDGVTGVVRLAGATFTYPGAD
CPVLQDISLTARPGTTTAIVGSTGSGKSTLVSLICRLYDVTAGAVLVDGID
VREYHTERLWSAIGLVPQRSYLFSGTVADNLRYGGGPDQVVTEQEMW
EALRVAAADGFVQTDGLQTRVAQGGVNFSGGQRQRLAIARAVIRRPAIY VFDDAFSALDVHTDAKVHASLRQVSGDATIIVVTQRISNAAQADQVIVVD NGKIVGTGTHETLLADCPTYAEFAASQSLSATVGGVG (SEQ ID NO: 10, TUBERCULIST Ne Rv1273c, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência.
6. MSYVIAAPEMLATTAADVDGIGSAIRAASASAAGPTTGLLAAAADEVSSA
AAALFSEYARECQEVLKQAAAFHGEFTRALAAAGAAYAQAEASNTAAM ' SGTAGSSGALGSVGMLSGNPLTALMMGGTGEPILSDRVLAIIDSAYIRPI ** FGPNNPVAQYTPEQWWPFIGNLSLDQSIAQGVTLLNNGINAELQNGHD
VVVFGYSQSAAVATNEIRALMALPPGQAPDPSRLAFTLIGNINNPNGGV
LERYVGLYLPFLDMSFNGATPPDSPYQTYMYTGQYDGYAHNPQYPLNI
LSDLNAFMGIRWVHNAYPFTAAEVANAVPLPTSPGYTGNTHYYMFLTQ DLPLLQPIRAIPFVGTPIAELIQPDLRVLVDLGYGYGYADVPTPASLFAPIN PIAVASALATGTVQGPQAALVSIGLLPQSALPNTYPYLPSANPGLMFNFG QSSVTELSVLSGALGSVARLIPPIA (SEQ ID NO: 11, TUBERCULIST Ns
Rv0159c, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, conhecido como PE3 ou PE).
7. MEFPVLPPEINSVLMYSGAGSSPLLAAAAAWDGLAEELGSAAVSFGQV TSGLTAGVWQGAAAAAMAAAAAPYAGWLGSVAAAAEAVAGQARVVV GVFEAALAATVDPALVAANRARLVALAVSNLLGQNTPAIAAAEAEYELM
WAADVAAMAGYHSGASAAAAALPAFSPPAQALGGGVGAFLTALFASPA KALSLNAGLGNVGNYNVGLGNVGVFNLGAGNVGGQNLGFGNAGGTNV GFGNLGNGNVGFGNSGLGAGLAGLGNIGLGNAGSSNYGFANLGVGNI GFGNTGTNNVGVGLTGNHLTGIGGLNSGTGNIGLFNSGTGNVGFFNSG TGNFGVFNSGNYNTGVGNAGTASTGLFNAGNFNTGVVNVGSYNTGSF
NAGDTNTGGFNPGGVNTGWLNTGNTNTGIANSGNVNTGAFISGNFNN GVLWVGDYQGLFGVSAGSSIPAIPIGLVLNGDIGPITIQPIPILPTIPLSIHQ TVNLGPLVVPDIVIPAFGGGIGIPINIGPLTITPITLFAQQTFVNQLPFPTFS
LGKITIPQIQTFDSNGQLVSFIGPIVIDTTIPGPTNPQIDLTIRWDTPPITLFP
NGISAPDNPLGLLVSVSISNPGFTIPGFSVPAQPLPLSIDIEGQIDGFSTPP
ITIDRIPLTVGGGVTIGPITIQGLHIPAAPGVGNTTTAPSSGFFNSGAGGV
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FGNVGQQLSGLLFTGVGP (SEQ ID NO: 12, TUBERCULIST Ns 3350c, conforme disponível em 1 de março de 2007, incorporado aqui a título de referência, também conhecido como PPE56 ou PPE.
Em uma segunda modalidade, o polipeptídeo de Mtb de uso nos métodos descritos aqui tem uma seqüência pelo menos 75%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga à seqüência de aminoácido mostrada em uma das SEQ ID NOs: 1-12. Por exemplo, o polipeptídeo pode ter uma seqüência de aminoácido pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homóloga a uma das seqüências de aminoácido mostradas nas SEQ ID NOs: 1-12. Seqüências exemplares podem ser obtidas usando programas de computador que estão prontamente disponíveis na internet e as seqüências de aminoácido mostradas aqui. Em um exemplo, o polipeptídeo retém uma função da proteína de Mtb, tal como ligação a um anticorpo que especificamente liga o epítopo de Mtb.
Modificações pequenas de uma seqüência de aminoácido primária de polipeptídeo de Mtb podem resultar em peptídeos que têm atividade substancialmente equivalente comparado com o polipeptídeo contraparte não-modificado descrito aqui. Tais modificações podem ser deliberadas, como através de mutagênese direcionada a sítio, ou podem ser espontâneas. Todos os polipeptídeos produzidos por essas modificações estão incluídos aqui. Então, um exemplo não-limitante, específico, de um polipeptídeo de Mtb é uma variante conservativa do polipeptídeo de Mtb. Uma tabela de substituições conservativas é provida aqui. Substituições da seqüência de aminoácidos mostradas nas SEQ ID NOs: 1-12 podem ser feitas com base nesta tabela.
Polipeptídeos de Mtb são descritos aqui que podem ser usados para detectar uma resposta imune a Mtb. Esses peptídeos incluem ou consistem em pelo menos nove aminoácidos, tal como nove a vinte aminoácidos, aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb mostrado acima. Exemplos não-limitantes, específicos, são doze, onze, dez aminoácidos, ou nove aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb mostrado acima. Nesses exemplos, o polipeptídeo de Mtb não inclui as seqüências de amino39 ácido de comprimento completo mostradas como SEQ ID NOs: 1-12.
Um polipeptídeo isolado é descrito que inclui nove a doze aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, onde o polipeptídeo isolado compreende a seqüência de aminoácido mostrada como QTVEDEAR5 RMW (SEQ ID NO:13). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é de nove, dez ou onze aminoácidos de comprimento. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo consiste na seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NO: 13. Um polipeptídeo isolado é descrito que inclui nove a doze aminoácidos consecutivos de um polipeptídeo de Mtb, onde o polipeptídeo isolado compreende a seqüência de aminoácido mostrada como VSAAIAGLF (SEQ ID NO: 14). Em algumas modalidades, o polipeptídeo é de nove, dez ou onze aminoácidos de comprimento. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo i consiste na seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NO: 14.
Em várias modalidades, o polipeptídeo de Mtb isolado é incluído em uma proteína de fusão. Então, a proteína de fusão pode incluir o polipeptídeo de Mtb (vide acima) e uma segunda porção heteróloga, tal como uma proteína myc, uma enzima ou um veículo (tal como uma proteína carreadora da hepatite ou albumina de soro bovino) covalentemente ligado ao polipeptídeo de Mtb. Em vários exemplos, um polipeptídeo consistindo em nove a doze aminoácidos de uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NOs: 1-14 que liga MHC classe I é covalentemente ligado a um veículo. Em exemplo adicional, um polipeptídeo consistindo em uma das seqüências de aminoácido mostradas como uma das SEQ ID NOs: 1-14 é covalentemente ligado a um veículo.
Em exemplos adicionais, o polipeptídeo pode ser uma proteína de fusão e pode também incluir seqüências heterólogas a Mtb (tal como seqüências de aminoácido de pelo menos nove aminoácidos de comprimento que não estão incluídas na SEQ ID NO:1). Então, em vários exemplos nãolimitantes específicos, o peptídeo imunogênico é um polipeptídeo de fusão, por exemplo, o polipeptídeo inclui seis resíduos de histidina sequenciais, uma seqüência de aminoácido de β-galactosidase ou uma seqüência de aminoácido de imunoglobulina. O polipeptídeo pode também ser covalente40 mente ligado a um veículo. Em modalidades adicionais, a proteína consiste no polipeptídeo de Mtb.
O polipeptídeo pode opcionalmente incluir repetições de um ou mais dos polipeptídeos de Mtb descritos aqui. Em um exemplo não-limitante, específico, o polipeptídeo inclui duas, três, quatro, cinco ou até dez repetições de um dos polipeptídeos de Mtb descritos acima. Alternativamente, mais de um polipeptídeo pode ser incluído em um polipeptídeo de fusão. Então, em vários exemplos, o polipeptídeo pode incluir pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco ou pelo menos seis das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NOs: 1-14. Uma seqüência ligante pode ser opcionalmente incluída entre os polipeptídeos de Mtb.
Os polipeptídeos de Mtb descritos aqui podem ser quimicamente sintetizados através de métodos padrão ou podem ser produzidos recombinantemente. Um processo exemplar para produção de polipeptídeo é descrito em Lu e outros, Federation of European Biochemical Societies Letters. 429:31-35, 1998. Eles podem ser também isolados através de métodos incluindo cromatografia preparativa e separações imunológicas.
Se desejado, polipeptídeos podem ser também quimicamente sintetizados através de tecnologias emergentes. Um tal processo é descrito em W. Lu e outros, Federation of European Biochemical Societies Letters. 429:31-35, 1998. Polipeptídeos podem ser também produzidos usando técnicas genéticas moleculares, tal como através de inserção de um ácido nucléico codificando Mtb ou um epítopo dele em um vetor de expressão, introdução do vetor de expressão em uma célula hospedeira e isolamento do polipeptídeo (vide abaixo).
Polinucleotídeos codificando os polipeptídeos de Mtb descritos aqui são também providos. Seqüências de ácido nucléico exemplares são mostradas abaixo:
ESXJ (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 2) atggcctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatc tcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatg aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga (SEQ ID NO: 15)
ESXK (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 3) atggcctcacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt tccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatg aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc gacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa (SEQ ID NO: 16)
ESXM (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 ESXM) > atggcctcacgttttatgacggatccgcatgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt 15 tccggtgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacctagatg aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctgagcagctag (SEQ ID NO: 17)
ESXP (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 7) atggcaacacgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatc tcgggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatggcccagatg aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc gacgccaacaactacgagcagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctaa (SEQ ID NO: 18)
ESXW (PROTEÍNA TIPO ESAT-6 10) atgacctcgcgttttatgacggatccgcacgcgatgcgggacatggcgggccgttttgag gtgcacgcccagacggtggaggacgaggctcgccggatgtgggcgtccgcgcaaaacatt tccggcgcgggctggagtggcatggccgaggcgacctcgctagacaccatgacccagatg aatcaggcgtttcgcaacatcgtgaacatgctgcacggggtgcgtgacgggctggttcgc gacgccaacaactacgaacagcaagagcaggcctcccagcagatcctcagcagctga (SEQ ID NO: 19)
ΡΕ9 (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE) atgtcatacatgattgccacaccagcggcgttgacggcggcggcaacggatatcgacggg attggctcggcggttagcgttgcgaacgccgcggcggtcgccgcgacaaccggagtgctg gccgccggtggcgatgaagtgttggcggccatcgctaggctgttcaacgcaaacgccgag gaatatcacgccctcagcgcgcaggtggcggcgtttcaaaccctgtttgtgcgcaccttg actggggggtgcggagtctttcgccggcgccgaggccgccaatgcgtcacagctgcagag catcgcgcggcaggtgcggggcgccgtcaacgccgtcgccggtcaggtgacgggcaatgg cggctccggcaacagcggcacttcggctgcggcggccaacccgaattccgacaacacagc
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PE_PGRS42 (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE-PGRS) gtgtcgttggtgatcgcgacgccgcagctgctggcaactgcggctttggatttagcgagt attggttcgcaggtgagcgcggctaatgcggccgcggcgatgccgacgacggaagtggtg gctgcggctgccgatgaagtgtcggcggcgattgcggggttgttcggggcccatgctcgg cagtatcaggcgctcagcgtacaggtggcagcgtttcacgagcagtttgtgcaggcgttg actgcggccgcgggtcggtatgccagcactgaggccgctgttgagcggagtctgctgggt gcggtgaatgcgcccaccgaggcgcttttggggcgcccgttgatcggaaacggcgccgac gggacggcacccgggcagcctggcgcggccggcgggttgctgtttggcaacggtggcaac ggcgcggctggcgggttcggtcaaaccggcggcagcggaggcgcggccgggttgatcggc aacggcggcaacggcggggccggtggtaccggcgcggccggcggtgccggtgggaacggg gggtggttgtggggcaacggcggcaacggcggtgtcggcggcaccagcgtggccgcaggc atcgggggtgcgggcggtaacggcggcaacgccgggctgttcggccatggcggcgccggt ggtaccggcggcgccggcctcgccggggcaaacggggtcaatcccacgcccggccccgcg gccagcaccggggacagcccggcagatgtgtccggcatcggtgatcaaaccggcggcgac ggcggcacgggcggccatggcactgccggcacgccgaccggtggcaccggcggcgacggt gccaccgcgacggcaggctcgggcaaggccaccggcggtgccggtggtgacggcggtacc gccgctgccggtggcggcggcggcaacggcggcgacggcggagtcgcgcagggcgacatt gcgagcgcctttggcggtgatggtggcaacgggtccgacggtgtagccgccggcagtggg ggtggtagcggcggcgccggaggcggcgctttcgtacacatcgccactgccacctctacc ggtggtagcggcggtttcggtggtaacggggctgccagtgccgcctccggcgccgacggt ggcgcagggggagctggcggcaatggtggcgccggcgggttgctattcggtgatggcggc aacggtggcgccggtggcgcgggtggtatcggtggtgacggcgccacgggggggcccggg ggaagcggcggcaacgctggcatcgcgaggtttgacagcccagaccccgaggcagaaccc gatgtggtcggcggcaagggtggtgatggcggcaagggcggcagcggccttggcgtcggc ggcgccggcgggaccggcggcgcgggcggcaacggcggcgccggcgggttgttgttcggc aacggcggcaacggcggcaacgccggggccggcggggatggcggcgccggcgttgccggt ggggttggcggtaacggcggcggtggtggcaccgcgacgtttcacgaagacccggtcgct ggtgtctgggcggtcggtggcgtaggtggtgatggtggctccggcggcagctcgcttggt gtcggcggggtgggcggagccggtggcgtgggtggcaagggtggcgccagcggcatgttg atcggcaacggcggcaacggtggcagcggcggagtcggtggggccggtggagtcggcggg gctggcggtgacggcggcaacggcggctccggtggcaacgccagtacttttggcgatgag aactccatcggcggggccggcgggacgggcggcaacgggggcaacggcgcaaacggcggt aacggtggcgctggcggtattgccggcggtgcgggtgggtccggagggttcctcagcggt gccgcaggagtcagcggcgctgacggtatcggtggcgcgggcggcgcaggcggtgccggt ggcgcgggcggtagcggcggtgaggcaggcgcggggggcctcaccaacggccccgggtcc cctggcgtttccggcaccgaaggcatggccggcgcgcccggctag (SEQ ID NO: 21)
Rv1860 (PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE FIBRONECTINA atgcatcaggtggaccccaacttgacacgtcgcaagggacgattggcggcactggctatc gcggcgatggccagcgccagcctggtgaccgttgcggtgcccgcgaccgccaacgccgat ccggagccagcgcccccggtacccacaacggccgcctcgccgccgtcgaccgctgcagcg ccacccgcaccggcgacacctgttgcccccccaccaccggccgccgccaacacgccgaat gcccagccgggcgatcccaacgcagcacctccgccggccgacccgaacgcaccgccgcca cctgtcattgccccaaacgcaccccaacctgtccggatcgacaacccggttggaggattc agcttcgcgctgcctgctggctgggtggagtctgacgccgcccacttcgactacggttca gcactcctcagcaaaaccaccggggacccgccatttcccggacagccgccgccggtggcc aatgacacccgtatcgtgctcggccggctagaccaaaagctttacgccagcgccgaagcc accgactccaaggccgcggcccggttgggctcggacatgggtgagttctatatgccctac ccgggcacccggatcaaccaggaaaccgtctcgctcgacgccaacggggtgtctggaagc gcgtcgtattacgaagtcaagttcagcgatccgagtaagccgaacggccagatctggacg ggcgtaatcggctcgcccgcggcgaacgcaccggacgccgggccccctcagcgctggttt gtggtatggctcgggaccgccaacaacccggtggacaagggcgcggccaaggcgctggcc gaatcgatccggcctttggtcgccccgccgccggcgccggcaccggctcctgcagagccc gctccggcgccggcgccggccggggaagtcgctcctaccccgacgacaccgacaccgcag cggaccttaccggcctga (SEQ ID NO: 22)
Rv1273c (TRANSPORTADOR ABC DE PROTEÍNA DE LIGAÇÃO DE ATP DE TRANSMEMBRANA DE TRANSPORTE DE FÁRMACOS PROVÁVEL) atgctcctggccctgctgcgccagcacatccgaccgtaccgccggctggtcgcgatgctg atgatgctgcagctggtcagcaccctggcttcgctatacctcccgacggtcaacgccgca atcgtcgacgacggcgtcgccaagggcgacaccgccaccatcgtacggctgggtgcggtg atgcttggggtgaccggattgcaggtgctgtgcgcgatcggggcggtctatctgggctcc cggaccggggcgggtttcggccgtgacctgcgctcggcaatgttcgaacacatcatcacc ttctcggaacgcgagaccgcccgattcggcgctccgacgttgttgacccgcagcaccaac gacgtccggcagatcctgttcctggtccagatgaccgccaccgtgctggtcaccgcaccg atcatgtgcgtcggcggaatcatcatggccatccaccaggaggccgcgctgacatggctg ctgctggtcagcgttccgattctggccgtagcaaactactggatcatctcccacatgctg ccgctcttccgccgcatgcagagcctgatcgacggcatcaaccgggtgatgcgcgatcag ctgtccggggtgcgagtggtccgcgccttcacccgcgaaggctatgaacgcgacaagttc gcgcaggccaatacggcgctgtcgaatgccgcactgagcgccggcaactggcaagcactg atgctgccggtgaccacgctgaccatcaacgcatccagcgtcgcactgatctggttcggt gggctacgcatcgacagcggccagatgcaggtcggctccctgatcgccttcctgtcctac ttcgcccagatcctgatggcggtgttgatggcgaccatgacgctggccgtgctgccacga gcgtcggtctgcgccgaacgcatcaccgaggtgctttccacgcccgccgcactcggtaac cccgacaatcccaagttcccgacggacggggtcacgggcgtagtgcgcttggctggcgca acctttacctatcctggcgccgactgcccggtgctgcaggacatttcgttgactgcgcgg cccggtaccaccaccgcgatcgtcggcagtaccggttcgggcaagtcgacactggtgtcg ttgatctgccggctctacgacgtcaccgctggcgcggtcttggttgacggtatcgacgtc cgcgagtaccacaccgagcggctctggtcagcgatcgggctggtgccccagcgcagctac ctcttctccggaaccgtcgcggacaacctgcgctacggcgggggcccagaccaggtagtc accgagcaggagatgtgggaggcgctgcgggtcgccgcggccgacggctttgtacaaaca gacgggctgcagacgcgtgtcgcccaaggtggtgtcaacttctccggcgggcagcgccaa cggctggcgatagcccgagcggtcatccgacgtccggccatctatgtgttcgacgacgcg ttctccgcacttgacgtgcacaccgacgccaaagtccacgcatcgctgcgacaggtatct ggtgatgcaaccatcattgttgttacacaacggatttcgaatgccgctcaggccgaccag gtcatcgttgtcgataacggtaagatcgtcggcacgggcacccacgaaacgctgctggcc gattgccccacctatgccgaattcgccgcctcacaatcgctgagcgccacggtcgggggt gtagggtga (SEQ ID NO: 23)
RvO159C (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PE) atgtcctacgtcatcgcggccccggagatgttggcaacgacggccgcggacgtggacggg atcggttcggcgatacgagcggccagcgcgtccgctgcgggtccaacgaccggactgctg gccgcggccgccgatgaggtgtcgtcggccgctgcagcgctgttcagcgaatacgcgcgc gaatgtcaagaggtcctaaagcaggctgcggcgttccatggcgagttcacccgggcgctg gctgccgccggggccgcctatgcccaggctgaagccagcaacaccgctgctatgtcgggc accgccgggtccagcggcgccctcggttctgtcgggatgctgtcaggcaacccgctaacc gcgttgatgatgggcggcaccggggaaccgatccttagtgaccgcgtcttggcgatcatt gacagcgcatacattcggcccattttcgggcccaacaacccggtcgcccagtacacgccc gagcagtggtggccgtttatcgggaacctgtcactggaccaatccatcgcccagggtgtc acgctgctgaacaacggcatcaacgcggaactacaaaatgggcatgacgtcgtcgttttc ggctactcgcaaagcgccgcggtagcgaccaatgaaatacgcgctcttatggcgttacca ccgggccaagccccagatccaagccggctggctttcacgttgatcggtaatatcaataac cccaacggcggcgtcctcgagcgttacgtgggcctttacctcccgttcttggatatgtcg ttcaacggtgcgactccaccggattccccctaccagacctacatgtacaccggccaatac gacggctacgcccacaacccgcagtacccgctcaatatcttgtcggacctcaacgccttc atgggcatcagatgggtgcacaacgcgtaccccttcaccgcggccgaggttgccaatgcc gtgccgttgcccacgtctccgggctacaccggcaacacccattactacatgtttctgacc caggacctgccgctgttgcagccgattcgcgccatccccttcgtagggaccccaatagcc gagctgattcagcccgacctacgggtgctagtcgacttgggctatggctacggctacgcc gacgtacccaccccggccagcctgttcgcgccaatcaacccgatcgccgtggcctcggcc ctggcgaccgggaccgtgcaaggcccccaagccgccctagtaagcatcggattgttaccg cagtccgcgctacccaatacgtatccgtatcttccgtcggcgaatccgggcctgatgttc aacttcggtcaatccagtgtgacggagttgtcggtgctcagtggcgccctcgggtccgta gcgagattgattccaccgatcgcgtga (SEQ ID NO: 24)
Rv3350C (PROTEÍNA DA FAMÍLIA PPE) atggagtttccggtgttgccaccggaaatcaactccgtgctgatgtattcgggtgcgggg tcgagcccgttgctggcggcggccgcggcgtgggatgggctggctgaggagttggggtcg gcggcggtgtcgtttgggcaggtgacgtcgggcctgacggcgggggtgtggcagggtgcg gcggcggcggcgatggcggccgcggcggcgccgtatgcggggtggttgggttcggtggcg gccgcggccgaggcggtggccgggcaggcgcgggtggtggtgggggtctttgaggcggcg ttggcggcgacggtggatccggcgctggtggcggccaaccgggcgcggctggtggcgttg gcggtgtcgaatctgttggggcagaacacgccggcgatcgcggccgccgaggccgagtac gagctgatgtgggccgccgatgtggcggcgatggccggctaccattccggcgcgtcggct gctgccgcggcgttgccggcgttcagcccaccggcgcaggcgctggggggaggtgtcggc gcgttccttaccgccctgttcgccagccctgcgaaggcgctgagcctgaatgcgggtttg ggcaatgtcggcaattacaacgtcgggttgggcaatgtcggggtgttcaacctgggcgcg ggcaatgtgggtgggcagaatctgggtttcgggaatgccggtggcaccaatgtcgggttc ggcaacctcggtaacgggaatgtcgggttcggcaactccggtctgggggcgggcctggcc ggcttgggcaatatcgggttgggcaatgcgggcagcagcaactatggtttcgcaaacctg ggtgtgggcaacatcggtttcggcaacaccggcaccaacaacgtcggcgtcgggctcacc ggcaaccacctgacgggtatcgggggcctgaattcgggcaccgggaatatcgggttgttc aactccggcaccgggaatgtggggttcttcaattcggggaccgggaacttcggggtgttc aactcgggtaattacaacaccggtgtcggtaatgcggggacggccagcacggggttgttc aatgccggcaatttcaacaccggcgtggtgaacgtgggcagttacaacaccggcagtttc aacgccggcgacaccaacaccggtggcttcaaccccggcggtgtgaacaccggctggctg aacaccggcaacaccaacaccggcatcgccaactcgggcaacgtcaacaccggcgcgttc atctcgggcaacttcaacaacggcgtgctgtgggtgggtgactaccagggcctgttcggc gtctccgccggctcgtcgatccccgcaattcccatcggcctggtgctcaacggcgacatc ggcccgatcaccatccagcccatcccgatcctgcccaccatcccgctcagcattcaccaa accgtcaacttgggcccgctggtggttcccgacatcgtgatccccgccttcggcggcggt atcggcatacccatcaacatcggcccgctgaccatcacacccatcaccctgtttgcccaa cagacatttgtcaaccaattgccctttcccaccttcagtttagggaaaatcacaattcca caaatccaaacctttgattctaacggtcagcttgtcagctttatcggccctatcgttatc gacaccaccattcccggacccaccaatccacagattgatttaacgatcagatgggatacc cctccgatcacgctgttcccgaatggcatcagtgctcccgataatcctttggggttgctg gtgagtgtgtcgatcagtaacccgggctttaccatcccgggatttagtgttcccgcgcag ccgttgccgttgtcgatcgatatcgagggccagatcgacgggttcagcaccccgccgatc acgatcgatcgcatccccctgaccgtggggggcggggtcacgatcggccccatcacgatc cagggccttcatatcccggcggcgccgggagtggggaacaccaccacggccccgtcgtcg ggattcttcaactccggtgcgggtggggtgtcgggtttcggcaacgtcggcgcgggcagc tcgggctggtggaaccaggcgccgagcgcgctgttgggggccggttcgggtgttggcaac gtgggcaccctgggctcgggtgtgctcaacctgggctcagggatctcggggttctacaac accagcgtgttgcctttcgggacaccggcggcggtgtcgggcatcggcaacctgggccag cagctgtcgggggtgtcggcggcgggaaccacgctgcgctcgatgctcgccggcaacctc gggttggccaatgtgggcaacttcaacaccgggttcggaaatgtcggggacgtcaacctg ggtgcggccaacatcggtgggcacaacctgggcctgggcaatgtcggggacggcaacctg gggttgggcaacatcggccatggcaacctggggtttgccaacttgggcctgaccgccggc gcggcgggggtgggcaatgttggttttggcaatgccggcatcaacaactatggcttggcg aacatgggtgtgggcaatattgggtttgccaacaccggcacgggcaacatcgggatcggg ctggtcggggaccatcggaccgggatcgggggcttgaactccggcatcggcaatatcggg ttgttcaactccggcaccggcaacgtcgggttcttcaattccgggaccggcaacttcggc atcgggaactccggccgcttcaacaccgggatcggtaatagcggaacggccagcaccggg a
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Esses polinucleotídeos incluem seqüências de DNA, cDNA e RNA que codificam o polipeptídeo de interesse. Mutações silenciosas na seqüência de codificação resultam da degeneração (isto é, redundância) do código genético, com o que mais de um códon pode codificar o mesmo resíduo de aminoácido. Então, por exemplo, leucina pode ser codificada por CTT, CTC, CTA, CTG, TTA ou TTG; serina pode ser codificada por TCT, TCC, TCA, TCG, AGT ou AGC; asparagina pode ser codificada por AAT ou
AAC; ácido aspártico pode ser codificado por GAT ou GAC; cisteína pode ser codificada por TGT ou TGC; alanina pode ser codificada por GCT, GCC, GCA ou GCG; glutamina pode ser codificada por CAA ou CAG; tirosina pode ser codificada por TAT ou TAC; e isoleucina pode ser codificada por ATT, ATC ou ATA. Tabelas mostrando o código genético padrão podem ser encontradas em várias fontes (por exemplo, L. Stryer, 1988, Biochemistry, 3ã Edição, W.H. 5 Freeman e Co., NY).
Um ácido nucléico codificando um polipeptídeo de Mtb pode ser clonado ou amplificado através de métodos in vitro, tal como a reação em cadeia de polimerase (PCR), a reação em cadeia da ligase (LCR), o sistema de amplificação baseado em transcrição (TAS), o sistema de replicação de seqüência auto-sustentado (3SR) e o sistema de amplificação da Οβ replicase (QB). Por exemplo, um polinucleotídeo codificando a proteína pode ser isolado através de reação em cadeia de polimerase de cDNA usando iniciadores com base na seqüência de DNA da molécula. Uma ampla variedade de metodologias de clonagem e amplificação in vitro é bem-conhecida da pessoa versada na técnica. Métodos de PCR são descritos na, por exemplo, Patente U.S. N° 4.683.195; Mullis e outros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; e Erlich, ed., PCR Technology (Stockton Press, NY, 1989). Polinucleotídeos podem ser também isolados através de bibliotecas genômicas ou de cDNA com sondas selecionadas das seqüências do polinucleotídeo desejado sob condições de hibridização estringentes.
Os polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de Mtb incluem um DNA recombinante que é incorporado em um vetor em um plasmídeo ou vírus autonomamente replicante ou no DNA genômico de um procarionte ou eucarionte, ou que exista como uma molécula separada (tal como um cDNA). Os nucleotídeos da invenção podem ser ribonucleosídeos, desoxirribunucleotídeos ou formas modificadas de qualquer nucleotídeo. O termo inclui formas simples ou duplas de DNA.
Em uma modalidade, vetores são usados para expressão em levedura tal como S. cerevisiae ou Kluyveromyces lactis. Vários promotores são conhecidos ser de utilidade em sistemas de expressão de levedura tal como os promotores constitutivos da membrana de plasma H+-ATPase (PMA1), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GPD), fosfoglicerato cinase1 (PGK1), álcool desidrogenase-1 (ADH1) e bomba resistente a fármaco pleitrópica (PDR5). Ainda, promotores induzíveis podem ser de utilidade, tal como GAL1-10 (induzido por galactose), PHO5 (induzido por pouco fosfato inorgânico extracelular) e elementos HSE de choque térmico em tandem (induzidos por elevação da temperatura para 37s C). Promotores que direcionam expressão variável em resposta a indutor titulável incluem os promotores MET3 e MET25 responsivos à metionina e promotores CUP1 dependentes de cobre. Qualquer um desses promotores pode ser clonado em plasmídeos de multicópia (2μ) ou cópia única (CEN) para dar um nível adicional de controle em nível de expressão. Os plasmídeos podem incluir marcadores nutricionais (tal como URA3, ADE3, HIS1 e outros) para seleção em levedura e resistência a antibiótico (AMP) para propagação em bactérias. Plasmídeos para expressão de K. lactis são conhecidos, tal como pKLACI. Então, em um exemplo, após amplificação em bactérias, plasmídeos podem ser introduzidos nos auxótrofos de levedura correspondentes através de métodos similares à transformação bacteriana.
Os polipeptídeos de Mtb podem ser expressos em uma variedade de cepas de levedura. Por exemplo, sete transportadores resistentes a fármaco pleiotrópicos, YOR1, SNQ2, PDR5, YCF1, PDR10, PDR11 e PDR15, junto com seus fatores de transcrição de ativação, PDR1 e PDR3, foram simultaneamente deletados em células hospediras de levedura, tornado a cepa resultante sensível a fármacos. Cepas de levedura com composição de lipídeo alterada da membrana do plasma, tal como o mutante erg6 defeituoso em biossíntese de ergosterol, podem ser também utilizadas. Proteínas que são altamente sensíveis à proteólise podem ser expressas em uma levedura sem a endopeptidase vacuolar máster Pep4, que controla a ativação de outras hidrolases vacuolares. Expressão heteróloga em cepas carregando alelos de genes sensíveis à temperatura (ts) pode ser empregada se o mutante nulo correspondente for inviável.
Vetores virais podem ser também preparados codificando os polipeptídeos de Mtb descritos aqui. Vários vetores virais foram construídos, incluindo polioma, SV40 (Madzak e outros, 1992, J. Geri. Virol., 73:15331536), adenovírus (Berkner, 1992, Cur. Top. Microbiol. Immunol., 158:39-6; Berliner e outros, 1988, Bio Techniques, 6:616- 629; Gorziglia e outros, 1992, J. Virol., 66:4407-4412; Quantin e outros, 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:2581-2584; Rosenfeld e outros, 1992, Cell, 68:143-155; Wilkinson e outros, 1992, Nucl. Acids Res., 20:2233-2239; StratfordPerricaudet e outros, 1990, Hum. Gene Ther., 1:241-256), vírus vaccínia (Mackett e outros, 1992, Biotechnology, 24:495-499), vírus adenoassociado (Muzyczka, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:91-123; On e outros, 1990, Gene, 89:279-282), herpes víruses including HSV e EBV (Margolskee, 1992, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158:67-90; Johnson e outros, 1992, J. Virol., 66:29522965; Fink e outros, 1992, Hum. Gene Ther. 3:11-19; Breakfi♦ eld e outros, 1987, Mol. Neurobiol., 1:337-371; Fresse e outros, 1990, Bio15 chem. Pharmacol., 40:2189-2199), Sindbis vírus (H. Herweijer e outros, 1995, Human Gene Therapy 6:1161-1167; Patente U.S. Ne 5.091.309 e Patente U.S. Ns 5.2217.879), alfavírus(S. Schlesinger, 1993, Trends Biotechnol. 11: 18-22; I. Frolov e outros, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:1137111377) e retrovírus de ave (Brandyopadhyay e outros, 1984, Mol. Cell Biol.,
4:749-754; Petropouplos e outros, 1992, J. Virol., 66:3391-3397), murino (Miller, 1992, Curr. Top. Microbiol Immunol., 158:1-24; Miller e outros, 1985, Mol. Cell Biol., 5:431-437; Sorge e outros, 1984, Mol. Cell Biol., 4:17301737; Mann e outros, 1985, J. Virol., 54:401-407) e origem humana (Page e outros, 1990, J. Virol., 64:5370-5276; Buchschalcher e outros, 1992, J. Virol.,
66:2731-2739). Vetores de baculovírus (vírus de poliedrose multinuclear de
Autographa californica; AcMNPV) também são conhecidos na técnica, e podem ser obtidos de fontes comerciais (tal como PharMingen, São Diego, Calif.; Protein Sciences Corp., Meriden, Conn.; Stratagene, La Jolla, Calif.).
Vetores virais, tal como vetores poxvirais, que codificam um po30 lipeptídeo de Mtb incluem pelo menos um elemento de controle de expressão operacionalmente ligado à seqüência de ácido nucléico codificando o polipeptídeo Mtb. Os elementos de controle de expressão são inseridos no vetor viral para controlar e regular a expressão da seqüência de ácido nucléico. Exemplos de elementos de controle de expressão de utilidade nesses vetores incluem, mas não estão limitados a, sistema lac, regiões operadoras e promotoras de fago lambda, promotores de levedura e promotores derivados de polioma, adenovírus, retrovírus ou SV40. Elementos operacionais adicionais incluem, mas não estão limitados a, seqüência líder, códons de terminação, sinais de poliadenilação e quaisquer outras seqüências necessárias para a transcrição apropriada e tradução subseqüente das seqüências de ácido nucléico codificando o polipeptídeo de Mtb no sistema hospedeiro. O vetor de expressão pode conter elementos adicionais necessários para a transferência e subseqüente replicação do vetor de expressão contendo a seqüência de ácido nucléico no sistema hospedeiro. Exemplos de tais elementos incluem, mas não estão limitados a, origens de replicação e marcadores selecionáveis. Será ainda compreendido por um versado na técnica que tais vetores são facilmente construídos usando métodos convencionais (Ausubel e outros (1987) e Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nova York, N.Y.) e estão comercialmente disponíveis.
Seqüências de DNA codificando um polipeptídeo de Mtb podem ser expressas in vitro através de transferência de DNA para uma célula hospedeira adequada. A célula pode ser procariótica ou eucariótica. O termo também inclui qualquer progênie da célula hospedeira objeto. É compreendido que toda a progênie pode não ser idêntica à célula de origem uma vez que pode haver mutações que acontecem durante replicação. Métodos de transferência estável, significando que o DNA estrangeiro é continuamente mantido no hospedeiro, são conhecidos na técnica.
Conforme acima mencionado, uma seqüência de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Mtb pode ser operativamente ligada a seqüências de controle de expressão. Uma seqüência de controle de expressão operativamente ligada a uma seqüência de codificação é ligada de modo que expressão da seqüência de codificação é conseguida sob condições compatíveis com as seqüências de controle de expressão. As seqüências de controle de expressão incluem, mas não estão limitadas a, promotores, au56 mentadores, terminadores de transcrição, um códon curto (isto é, ATG) em frente a um gene de codificação de proteína, sinal de união para introns, manutenção da estrutura de leitura correta daquele gene para permitir tradução apropriada de mRNA e códons de parada.
Células hospedeiras podem incluir células hospediras microbianas, de levedura, inseto e mamífero. Métodos de expressão de seqüências de DNA tendo seqüências eucarióticas ou virais em procariontes são bemconhecidos na técnica. Exemplos não-limitantes de células hospediras adequadas incluem células de bactérias, archea, inseto, fungos (por exemplo, levedura), micobactéria (tal como M. smegmatis), planta e células animais (por exemplo, células de mamífero, tal como humano). Células exemplares de uso incluem Escherichia coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Salmonella typhimurium, células SF9, células C129, células 293, Neurospora, e cepas de células mielóide e linfóide de mamífero imortalizadas. Técni15 cas para a propagação de células de mamífero em cultura são bemconhecidas (vide Jakoby e Pastan (Eds.), 1979, Cell Culture. Methods in Enzymology, volume 58, Academic Press, Inc., Harcourt Brace Jovanovich, N.Y.). Exemplos de cepas de célula hospedeira de mamífero geralmente usadas são células VERO e HeLa, células CHO, e WI38, BHK, e cepas de célula COS, embora cepas de célula possam ser usadas, tal como células planejadas para prover padrões de glicosilação desejáveis maiores, ou outras características. Conforme acima discutido, técnicas para a transformação de células de levedura, tal como transformação de polietileno glicol, transformação de protoplasto e as pistolas de gene são também conhecidas na técnica (vide Gietz e Woods, Methods in Enzymology 350:87-96, 2002).
Transformação de uma célula hospedeira com DNA recombinante pode ser realizada através de técnicas convencionais como são bemconhecidas daqueles versados na técnica. Onde o hospedeiro for procariótico, tal como, mas não limitado a, E. coli, células competentes que são capa30 zes de absorção de DNA podem ser preparadas a partir de células coletadas após fase de crescimento exponencial e subseqüentemente tratadas através do método de CaCb usando procedimentos bem-conhecidos na técnica. Al57 ternativamente, MgCb ou RbCI pode ser usado. Transformação pode ser também realizada após formação de um protoplasto da célula hospedeira se desejado, ou através de eletroporação.
Quando o hospedeiro é um eucarionte, tais métodos de trans5 fecção de DNA como co-precipitados de fosfato de cálcio, procedimentos mecânicos convencionais tal como microinjeção, eletroporação, inserção ou plasmídeo envolvido em lipossomas, ou vetores virais podem ser usados. Células eucarióticas podem também ser co-transformadas com seqüências de polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Mtb, e uma segunda mo10 lécula de DNA estrangeiro codificando um fenótipo selecionável, tal como gene timidina cinase de herpes simplex. Outro método é usar um vetor viral eucariótico, tal como vírus símio 40 (SV40) ou vírus papiloma bovino, para transientemente infectar ou transformar células eucarióticas e expressar a *
proteína (vide, por exemplo, Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor
Laboratory, Gluzman ed., 1982).
Método para Detecção de uma Infecção com Mtb: Detecção de Células T
Métodos para detecção de uma infecção com Mycobacterium em um indivíduo são descritos aqui. Em várias modalidades, uma infecção com Mycobacterium pode ser detectada com base na presença de células T em uma amostra biológica, onde as células T especificamente reagem com um polipeptídeo de Mtb descrito aqui (vide acima).
Em várias modalidades, uma amostra biológica compreendendo células T é obtida de um indivíduo de interesse. Amostras biológicas adequadas incluem, mas não estão limitadas a, amostras de sangue, células mononucleares de sangue periférico, esputo, saliva, fluido do cordão espinhal ou amostras de célula T isoladas (tal como células T CD8+ e/ou células CD4+), tecido de nó linfático, tecido pulmonar ou outra amostra de tecido. Em um exemplo, a amostra é incubada com um polipeptídeo de Mycobacterium, conforme aqui descrito, um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de Mtb e uma APC que expressa o polipeptídeo de Mtb ou um fragmento dele que se liga a MHC. A presença ou ausência de ativação específica das células T é detectada.
As células T CD8+ e/ou células T CD4+ que reconhecem o peptídeo no método de detecção foram geralmente pré-sensibilizadas in vivo para o polipeptídeo de Mtb de interesse. Em várias modalidades, essas células T experientes em peptídeo estão geralmente presentes no sangue periférico de um hospedeiro que foi exposto ao antígeno em uma freqüência de 1 a 106 a 1 em 103 células mononucleares de sangue periférico (PBMCs).
Em um exemplo, a amostra são células T isoladas. Por exemplo, células T podem ser isoladas de um indivíduo de interesse através de técnicas de rotina (tal como através de centrifugação de gradiente de densidade Ficoll/Hypaque de linfócitos de sangue periférico ou através de seleção de célula ativada por fluorescência). Em uma modalidade, as células T usadas no ensaio estão na forma de amostras não-processadas ou diluídas, ou são células T recém-isoladas (tal como na forma de células mononucleares recém-isoladas (MCs) ou células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) que são usadas diretamente ex vivo, de modo que elas não são culturadas antes de serem usadas no método. No entanto, as células T podem ser culturadas antes do uso, por exemplo, na presença de um ou mais dos peptídeos, e geralmente também citocinas de promoção de crescimento exógenas. Durante cultura os peptídeos são tipicamente apresentados na superfície de células tal como APCs. Pré-cultura das células T pode levar a um aumento na sensibilidade do método. Então, as células T podem ser convertidas em cepas celulares, tal como cepas de célula de curto prazo.
Em várias modalidades, as células T são incubadas in vitro por dois a nove dias, tal como cerca de quatro dias, a 37s C com um polipeptídeo de Mtb ou fragmento dele que liga MHC. Em vários exemplos, o polipeptídeo de Mtb ou fragmento dele que liga MHC está incluído (em uma concentração de, por exemplo, cerca de 5 a cerca de 25 pg/ml, tal como cerca de 5, cerca de 10, cerca de 15 ou cerca de 20 pg/ml). Em vários exemplos, outra alíquota de uma amostra de célula T pode ser incubada na ausência do polipeptídeo de Mtb como um controle.
Em uma modalidade, células mononucleares (MCs) são separadas da amostra. As MCs incluem as células T e células apresentando anti59 geno (APCs). Então no método as APCs presentes nas MCs separadas podem apresentar o peptídeo às células T. Em outra modalidade apenas células T, tal como apenas células T CD8+, apenas células T CD4+ ou apenas células T CD3+, podem ser purificadas da amostra.
A APC usada no método pode ser qualquer célula que tenha moléculas do MHC Classe I em sua superfície. Ela pode ou não ser uma célula apresentando antígeno especializada, tal como uma célula B, célula dendrítica ou macrófago. A APC usada no método pode ser do mesmo hospedeiro que a célula T. Em geral, a APC é capaz de apresentar o peptídeo a uma célula T. A APC pode ser uma célula ex vivo recém-isolada ou uma célula culturada tal como a célula de uma cepa de célula.
Células T derivadas de uma amostra do indivíduo de interesse podem ser postas em um ensaio com todos os polipeptídeos de Mtb (ou um grupo dos polipeptídeos de Mtb, ou um polipeptídeo de Mtb específico) que é pretendido testar o painel relevante ou as células T podem ser divididas e postas em ensaios separados cada um dos quais contém um ou mais dos peptídeos. Em uma modalidade, um ou mais dos polipeptídeos com uma seqüência de aminoácido mostrada como SEQ ID NOs: 1-12, ou um fragmento de um ou mais desses polipeptídeos que ligam MHC, são utilizados. Dois ou mais de qualquer um dos peptídeos de Mtb descritos aqui podem ser usados para uso simultâneo,separado ou seqüencial de células T que reconhecem esses polipeptídeos. Combinações adicionais de qualquer um dos polipeptídeos de MTb descritas aqui podem ser utilizadas.
Em uma modalidade o um ou mais polipeptídeo(s) é(são) provido(s) a células apresentando na ausência da célula T. Esta célula é então provida a células T isoladas do indivíduo, tipicamente após serem deixadas apresentar o peptídeo em sua superfície.
A duração que o peptídeo é contatado com as células vai variar dependendo do método usado para determinação do reconhecimento do peptídeo. Tipicamente 105a 107, tal como 5 χ 105 a 106 PBMCs são adicionadas a cada ensaio. No caso onde peptídeo é adicionado diretamente ao ensaio sua concentração é tipicamente de a partir de 10-1 a 103 pg/ml, tal como cerca de 0,5 a cerca de 50 pg/ml ou cerca de 1 a cerca de 10 pg/ml. A duração de tempo pela qual as células T são incubadas com o peptídeo pode ser de a partir de cerca de 4 a cerca de 24 horas, tal como de a partir de cerca de 6 a cerca de 16 horas, ou por cerca de 12 horas.
A determinação do reconhecimento específico do peptídeo pelas células T pode ser feita medindo a ligação do peptídeo às células T. Tipicamente células T que ligam o peptídeo podem ser selecionadas com base nesta ligação, por exemplo, usando uma técnica de seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). A detecção da presença de células T que re10 conhecem o peptídeo será considerada ocorrer se a freqüência de células selecionadas usando o peptídeo for acima de um valor controle.
Determinação de se as células T reconhecem o peptídeo pode ser também feita através da detecção de uma mudança no estado das células T na presença do peptídeo ou determinação de se as células T ligam o peptídeo. A mudança em estado é geralmente causada por atividade funcional específica de antígeno da célula T após o receptor de célula T ligar o peptídeo. Em geral quando ligando o receptor de célula Τ o peptídeo é ligado a uma molécula do MHC classe I, que pode estar presente na superfície de uma PBMC ou uma célula apresentando antígeno (APC).
A ativação de célula T pode ser detectada através de quaisquer meios conhecidos de um versado na técnica. Em um exemplo, ativação de célula T CD8+ é detectada através da varredura da atividade citolítica. Em outro exemplo, ativação de célula T CD8+ e/ou ativação de célula T CD4+ é detectada através de proliferação. Em vários exemplos, um nível de prolife25 ração que é pelo menos duas vezes maior e/ou um nível de atividade citolítica que é pelo menos 20% maior do que em indivíduos não-infectados indica a presença de uma infecção com Mycobacterium no indivíduo de interesse.
A mudança em estado da célula T pode ser o início de ou aumento em secreção de uma substância da célula T, tal como uma citocina, tal como interferon (IFN)-y, IL-2 ou TNF-α. Em um exemplo, a substância pode ser detectada permitindo que ela se ligue a um agente de ligação específico e então medição da presença do complexo agente de ligação espe61 cífico/substância. O agente de ligação específico é tipicamente um anticorpo, tal como anticorpos policlonais ou monoclonais que ligam a substância, tal como a citocina. Anticorpos para citocinas estão comercialmente disponíveis, ou podem ser feitos usando técnicas padrão.
Tipicamente o agente de ligação específico tal como o anticorpo é imobilizado em um apoio sólido. Após a citocina ser deixada ligar o apoio sólido pode opcionalmente ser lavado para remover material que não está especificamente ligado ao anticorpo. O complexo anticorpo/citocina pode ser detectado usando um segundo agente de ligação que ligará o complexo, tal como um anticorpo que é marcado (ou diretamente ou indiretamente) com um marcador. Geralmente, o segundo agente liga a substância em um sítio que é diferente do sítio que liga o primeiro agente.
Em vários exemplos, o segundo agente de ligação pode ser detectado por um.terceiro agente que é marcado diretamente ou indiretamente por um marcador detectável. Por exemplo, o segundo agente pode incluir uma biotina, permitindo detecção de um terceiro agente que compreende uma estreptavidina e um marcador, tal como um marcador enzimático, radioativo ou fluorescente.
Em uma modalidade o sistema de detecção é um ensaio ELISPOT, tal como um ensaio descrito na publicação PCT Ns WO 98/23960, incorporada aqui a título de referência. Em um exemplo, IFN-γ secretado da célula T é ligado por um primeiro anticorpo específico de IFN-γ que é imobilizado em um apoio sólido. O IFN-γ ligado é então detectado usando um segundo anticorpo específico de IFN-γ que é marcado com um marcador detectável. Anticorpos marcados exemplares estão comercialmente disponíveis, tal como da MABTECH® (Estocolmo, Suécia). Um ensaio ELISPOT exemplar é descrito na seção de Exemplos abaixo.
A mudança em estado da célula T que pode ser também medida pode ser o aumento na absorção de substâncias pela célula T, tal como a absorção de timidina. A mudança em estado pode ser também medida por um aumento no tamanho das células T, ou proliferação das células T, ou uma mudança nos marcadores de superfície celular na célula T.
Reagentes são providos aqui para a detecção de células expressando CD8(CD8+) que especificamente ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aqui descrito. Esses reagentes são complexos I do MHC Classe/polipeptídeo de TARP imunogênico tetraméricos. Esses complexos tetraméricos incluem um polipeptídeo de Mtb, tal como um polipeptídeo de nove a vinte aminoácidos de comprimento que especificamente liga MHC classe I.
Complexos de MHC Classe l/peptídeo tetraméricos podem ser sintetizados usando métodos bem-conhecidos na técnica (Altmann e outros, Science 274:94, 1996, que é aqui incorporado a título de referência). Em um exemplo não-limitante específico, polipeptídeo de cadeia pesada HLA purificado e p2-microglobulina (β2ηι) podem ser sintetizados por meio de um sistema de expressão procariótico. Um exemplo não-limitante, específico, de um sistema de expressão de utilidadeé o sistema pET (R&D Systems, Mineapolis, MN). A cadeia pesada é modificada através de deleção da transmembrana e filamento citosólico e adição de terminal COOH de uma seqüência contendo o sítio de biotinilação enzimático de biotina proteína ligase (Bir-A). Cadeia pesada, β2ηι, e peptídeo são então redobrados. O produto redobrado pode ser isolado através de quaisquer meios conhecidos na técnica, e então biotinilados por Bir-A. Um tetrâmero é então produzido através de contato do produto biotinilado com estreptavidina.
Em uma modalidade, a estreptavidina é marcada. Marcadores adequados incluem, mas não estão limitados a, enzimas, contas magnéticas, contas magnéticas coloidais, haptenos, fluorcromos, compostos de metal, compostos radioativos ou fármacos. As enzimas que podem ser conjugadas à estreptavidina incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcalina, peroxidase, urease e β-galactosidase. Os fluorcromos que pode ser conjugados à estreptavidina incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína isotiocianato, tetrametilrodamina isotiocianato, ficoeritrina, aloficocianinas e Texas Red. Para fluorcromos adicionais que podem ser conjugados à estreptavidina, vide Haugland, R.P. Molecular Probes: Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992-1994). Os compostos de metal que podem ser conjugados à estreptavidina incluem, mas não estão limitados a, ferritina, ouro coloidal, e, particularmente, contas superparamagnéticas coloidais. Os haptenos que podem ser conjugados à estreptavidina incluem, mas não estão limitados a, biotina, digoxigenina, oxazalona e nitrofe5 nol. Os compostos radioativos que podem ser conjugados à estreptavidina são conhecidos na técnica, e incluem, mas não estão limitados a, tecnécio 99m (99Tc), 125l e aminoácidos compreendendo quaisquer radionuclídeos, incluindo, mas não limitado a, 14C, 3H e 35S. Em geral, estreptavidina marcada com um fluorcromo é utilizada nos métodos descritos aqui.
Em uma modalidade suspensão de células incluindo células T que especificamente reconhecem um polipeptídeo de Mtb é produzida, e as ’ ; células são reagidas com o tetrâmero em suspensão. Em uma modalidade, esses reagentes são usados para marcar células, que são então analisadas através de seleção de célula ativada por fluorescência (FACS). Uma máqui15 na para FACS emprega uma pluralidade de canais de cor, canais de detecção de pouco ângulo e espalhamento de luz obtuso, e canais de impedância, dentre outros níveis de detecção mais sofisticados, para separar ou selecionar células. Qualquer técnica FACS pode ser empregada contanto que ela não seja prejudicial para a detecção das células desejadas. (Quanto a méto20 dos exemplares de FACS vide Patente U.S. Ne 5.061.620, incorporada aqui a título de referência).
Método para Detecção de Infecção com Mtb: Testes de Pele
Em outro aspecto, a presente invenção provê métodos para uso de um ou mais dos polipeptídeos descritos acima para diagnosticar infecção com Mycobacterium, e em particular tuberculose, usando um teste de pele. Um teste de pele é um ensaio realizado diretamente em um paciente onde uma reação de hipersensibilidade do tipo retardada (DTH) (tal como enrijecimento, inchaço, vermelhidão ou dermatite) é medida seguindo administração à pele, tal como a injeção intradermal de um ou mais polipeptídeos des30 critos acima. Tal injeção pode ser feita usando qualquer dispositivo adequado suficiente para contatar o polipeptídeo ou polipeptídeos com células dermais do paciente, tal como uma seringa tuberculina ou seringa de 1 ml. Em vários exemplos, a reação é medida pelo menos 48 horas após injeção, tal como entre cerca de 48 e cerca de 72 horas após injeção.
Uma reação DTH é uma resposta imune mediada por célula que é maior em indivíduos que foram expostos previamente ao antígeno de teste (o polipeptídeo de Mtb, seu fragmento que liga MHC ou sua proteína de fusão). A resposta pode ser medida visualmente, tal como usando uma régua. Em vários exemplos, uma resposta que é maior do que cerca de 0,5 cm de diâmetro, tal como maior do que cerca de 1,0 de diâmetro, é uma resposta positiva, e é indicativa de infecção com Mycobacterium.
Os polipeptídeos de Mtb descritos aqui podem ser formulados para uso em um teste de pele como composições farmacêuticas contendo ' - um polipeptídeo e um veículo fisiologicamente aceitável. Essas composições tipicamente contêm um ou mais dos polipeptídeos de Mtb descritos (ou um fragmento dele que liga MHC ou uma proteína de fusão dele) em uma quan15 tidade variando de a partir de cerca de 1 pg a cerca de 100 pg, tal como de a partir de cerca de 10 pg a cerca de 50 pg em um volume de 0,1 ml. O veículo empregado em uma composição farmacêutica pode ser uma solução salina com preservativos apropriados, tal como fenol e/ou TWEEN80®.
Geralmente, o polipeptídeo empregado em um teste de pele é de tamanho suficiente de modo que ele permanece no sítio de injeção por toda a duração do período de reação. Em vários exemplos, um polipeptídeo que é pelo menos de nove aminoácidos de comprimento é suficiente. Sem ser limitado pela teoria, o polipeptídeo é quebrado por macrófagos dentro de horas de injeção para permitir apresentação a células T. Tais polipeptídeos podem conter repetições de uma ou mais das seqüências acima descritas e/ou outras seqüências imunogênicas ou não-imunogênicas.
Então, a determinação do reconhecimento do peptídeo pelas células T pode ser medida in vivo. Em vários exemplos, o peptídeo é administrado ao indivíduo e então uma resposta que indica reconhecimento do peptídeo pode ser medida. Em uma modalidade o peptídeo é administrado intradermalmente, tipicamente de uma maneira similar ao teste Mantoux. O peptídeo pode ser administrado epidermalmente. O peptídeo é tipicamente administrado através de agulha, tal como através de injeção, mas pode ser administrado através de outros métodos tal como balística, por exemplo, as técnicas de balística que têm sido usadas para aplicar ácidos nucléicos. O pedido EPC Publicado N9 EP-A-0693119 descreve técnicas que podem tipi5 camente ser usadas para administrar o peptídeo. Em vários exemplos, de a partir de 0,001 a 1000 pg, por exemplo, de a partir de 0,01 a 100 pg ou 0,1 a 10 pg de peptídeo são administrados. Alternativamente um agente pode ser administrado que é capaz de prover o peptídeo in vivo. Então um polinucleotídeo capaz de expressar o polipeptídeo pode ser administrado. O polinucle10 otídeo tipicamente tem qualquer uma das características do polinucleotídeo que é discutido abaixo. Polipeptídeo é expresso do polinucleotídeo in vivo e \ reconhecimento do peptídeo in vivo pode ser medido. Tipicamente de a partir de 0,001 a 1000 pg, por exemplo, de a partir de 0,01 a 100 pg a 10 pg de <polinucleotídeo são administrados.
Método para Detecção de uma Infecção com Mtb: Detecção de Anticorpos
São aqui descritos métodos onde os polipeptídeos descritos acima são usados para diagnosticar infecção com Mycobacteríum, e, em particular, tuberculose. Nessas modalidades, são providos métodos para detecção de infecção com Mycobacteríum em uma amostra biológica, usando um ou mais dos polipeptídeos acima, sozinhos ou em combinação. Em várias modalidades polipeptídeos múltiplos são empregados. O(s) polipeptídeo(s) é(são) usado(s) em um ensaio para determinar a presença ou ausência de anticorpos para o(s) polipeptídeo(s) em uma amostra biológica (tal como, mas não limitado a, sangue integral, esputo, soro, plasma, saliva ou fluido cerebroespinhal) com relação a um controle. A presença de tais anticorpos indica sensibilização prévia a antígenos micobacterianos que pode ser indicativo de infecção Micobacteriana, e em particular tuberculose.
Em uma modalidade onde mais de um polipeptídeo é empregado, os polipeptídeos podem ser complementares, de modo que um polipep30 tídeo componente vai detectar infecção em amostras onde a infecção não seria detectada por outro polipeptídeo componente). Polipeptídeos complementares podem ser geralmente identificados usando cada polipeptídeo in66 dividualmente para avaliar amostras de soro obtidas de uma série de pacientes conhecidos estar infectados com Mycobacterium. Após determinação de quais amostras são corretamente identificadas como positivo com cada polipeptídeo, combinações de dois ou mais polipeptídeos podem ser formuladas que são capazes de detectar infecção na maioria, ou todas, as amostras testadas. Polipeptídeos complementares são de utilidade para melhorar sensibilidade de um teste de diagnóstico. Então, mais de um dos polipeptídeos de Mtb acima descritos pode ser incluído em um ensaio. Polipeptídeos adicionais de Mtb (aqueles não descritos aqui) opcionalmente podem ser incluídos no ensaio.
Existe uma variedade de formatos de ensaio que podem ser usados para detectar anticorpos em uma amostra (vide, por exemplo, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), que é incorporado aqui a título de referência). Em geral, a presença ou ausência de uma infecção com Mtb em um paciente pode ser determinada por (a) contato de uma amostra biológica obtida de um paciente com um ou mais polipeptídeos de Mtb; (b) detecção na amostra da presença (ou ausência) de um anticorpo que se liga ao(s) polipeptídeo(s); e (c) comparação do nível de anticorpo com um controle. O controle pode ser um valor padrão, tal como um valor de corte predeterminado. O controle pode ser a quantidade de anticorpos em um indivíduo conhecido estar infectado com Mtb, ou a quantidade de anticorpos que especificamente liga o(s) polipeptídeo(s) em um indivíduo conhecido estar infectado com Mtb.
Em várias modalidades, o ensaio envolve o uso de um polipeptídeo imobilizado em um apoio sólido. Anticorpos que especificamente ligam o(s) polipeptídeo(s) de interesse se ligam ao apoio sólido. O anticorpo ligado pode ser então detectado usando um reagente de detecção que inclui um marcador detectável. Reagentes de detecção adequados incluem anticorpo marcados que se ligam ao complexo anticorpo/polipeptídeo. Reagentes de detecção adequados também incluem segundos anticorpos não-marcados que se ligam ao complexo anticorpo peptídeo e um terceiro anticorpo que liga especificamente o segundo anticorpo. Reagentes de detecção adequa67 dos também incluem polipeptídeo não-ligado marcado com um grupo repórter (tal como em um ensaio semicompetitivo).
Alternativamente, um ensaio competitivo pode ser utilizado, onde um anticorpo que se liga ao polipeptídeo de interesse é marcado com um grupo repórter é incubado com a amostra. Seguindo incubação, o anticorpo é então deixado se ligar ao antígeno imobilizado após incubação do antígeno com a amostra. O ponto até o qual os componentes da amostra inibem a ligação do anticorpo marcado ao polipeptídeo imobilizado é indicativo da reatividade da amostra com o polipeptídeo imobilizado.
Um apoio sólido usado em um ensaio descrito aqui pode ser qualquer material sólido ao qual o antígeno pode ser ligado. Por exemplo, o apoio sólido pode ser uma cavidade de teste em uma placa de microtitulação ou uma membrana de nitrocelulose ou outra adequada. Alternativamente, o (apoio sólido pode ser uma conta ou disco, tal como um vidro, fibra de vidro, látex ou um material plástico tal como um poliestireno ou cloreto de polivinila. O apoio pode ser também uma partícula magnética ou um sensor óptico de fibra, tal como aqueles descritos, por exemplo, na Patente U.S. Ns 5.359.681.
Os polipeptídeos podem ser ligados ao apoio sólido usando uma variedade de técnicas. A ligação dos polipeptídeos pode ser realizada através de uma associação não-covalente, tal como adsorção, ou ligação covalente, tal como uma ligação direta entre o antígeno e grupos funcionais no apoio ou uma ligação através de um agente de reticulação.
Para ligação através de adsorção, ligação pode ser conseguida através de contato de um ou mais polipeptídeo(s) de Mtb (geralmente em um tampão) com o apoio sólido por uma quantidade de tempo adequada. O tempo de contato para ligação é tipicamente entre cerca de 1 hora e 1 dia. Em geral, ligação é conseguida através de contato de um apoio sólido de poliestireno ou cloreto de polivinila com uma quantidade de um ou mais poli30 peptídeo(s) de Mtb variando de a partir de cerca de 10 mg a cerca de 1 pg, tal como cerca de 100 ng de antígeno.
Ligação covalente dos polipeptídeo(s) de Mtb de interesse a um apoio sólido pode ser geralmente conseguida reagindo o apoio com um reagente bifuncional que reage com ambos o apoio e um grupo funcional, tal como um grupo hidroxila ou amino, no polipeptídeo. Por exemplo, um polipeptídeo de Mtb pode ser ligado a apoios tendo um revestimento de políme5 ro apropriado usando benzoquinona ou através de condensação de um grupo aldeído no apoio com uma amina e um hidrogênio ativo no polipeptídeo (Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, em A12 A13,1991).
Em certas modalidades, o ensaio é um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Este ensaio pode ser realizado primeiro contatando um antígeno de polipeptídeo que foi imobilizado em um apoio sólido (tal como na cavidade de uma placa de microtitulação) com a amostra de uma maneira de modo que os anticorpos presentes dentro da amostra que especificamente liga o polipeptídeo de interesse ligam o polipeptídeo imobilizado. Amostra não-ligada é então removida e um reagente de detecção capaz de ligação ao complexo anticorpo-polipeptídeo imobilizado é adicionado. A quantidade de reagente de detecção que permanece ligada é determinada usando um método apropriado para o reagente de detecção específico. Por exemplo, o método de detecção pode detectar fluorescência ou a presença de uma atividade enzimática.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo é imobilizado no apoio;
quaisquer sítios de ligação de proteína restantes no apoio são tipicamente bloqueados. Qualquer agente de bloqueio adequado pode ser usado para bloquear os sítios de ligação de proteína não-ligada, de modo que albumina de soro bovino ou TWEEN 20® pode ser empregado. O polipeptídeo imobili25 zado é então incubado com a amostra, e o anticorpo é deixado se ligar ao antígeno. A amostra pode ser diluída com um diluente adequado, por exemplo, um tampão tal como solução salina tamponada com fosfato (PBS) antes da incubação. Em geral, um tempo de contato apropriado (tempo de incubação) é um período de tempo que é suficiente para detectar a presença de anticorpo em uma amostra infectada por Mycobacterium. Em um exemplo não-limitante, específico, o tempo de contato é suficiente para atingir um nível de ligação que é pelo menos 95% daquele atingido em equilíbrio entre anticorpo ligado e não-ligado. O tempo necessário para atingir equilíbrio pode ser determinado ensaiando o nível de ligação que acontece durante um período de tempo. Em temperatura ambiente, um tempo de incubação de cerca de 30 minutos é geralmente suficiente.
Amostra não-ligada pode ser então removida através de lavagem do apoio sólido com um tampão apropriado, tal como PBS contendo TWEEN 20® a 0,1%. Um reagente de detecção pode ser então adicionado ao apoio sólido. Um reagente de detecção pode ser qualquer composto que se ligue ao complexo anticorpo imobilizado-polipeptídeo e possa ser detec10 tado. Em várias modalidades, o reagente de detecção contém um agente de ligação (tal como, por exemplo, Proteína A, Proteína G, imunoglobulina, lectina ou antígeno livre) conjugado a um marcador. Marcadores de utilidade incluem enzimas (tal como peroxidase de rábano silvestre), substratos, cofatores, inibidores, corantes, radionuclídeos, grupos luminescentes, grupos fluorescentes e biotina. A conjugação de um agente de ligação a um marcador pode ser conseguida usando métodos conhecidos na técnica; agentes de ligação conjugados são também comercialmente disponíveis (tal como da Zymed Laboratories, São Francisco, Calif. e Pierce, Rockford, lll.).
O reagente de detecção é incubado com o complexo de anticor20 po imobilizado-polipeptídeo por uma quantidade de tempo suficiente para detectar o anticorpo ligado. Uma quantidade apropriada de tempo pode geralmente ser determinada a partir das instruções do fabricante ou avaliando o nível de ligação que acontece durante um período de tempo. Reagente de detecção não-ligado é então removido e reagente de detecção ligado é de25 tectado usando o marcador. Para marcadores radioativos, métodos de contagem por cintilação ou autorradiográficos podem ser usados para detecção. Métodos espectroscópicos podem ser usados para detectar corantes, grupos luminescentes e grupos fluorescentes usados como marcadores. Biotina pode ser detectada usando uma avidina acoplada a um marcador diferente, tal como um marcador radioativo, marcador fluorescente ou um marcador enzimático. Marcadores enzimáticos podem ser detectados através da adição de substrato (geralmente por um período de tempo específico), seguido por a70 nálise espectroscópica ou outra dos produtos de reação.
Para determinar a presença ou ausência de anticorpos antiMicobacterianos na amostra, o sinal detectado do marcador que se liga ao apoio sólido é geralmente comparado com um controle. Em uma modalida5 de, o controle é um valor padrão, tal como o sinal médio obtido quando o antígeno imobilizado é incubado com amostras de um paciente nãoinfectado. Em geral, uma amostra gerando um sinal que está dois ou três desvios padrão acima do controle é considerada positiva para infecção com Mycobacterium. Em outra modalidade, o valor controle é determinado usan10 do uma Receiver Operator Curve, de acordo com o método de Sackett e outros, Clinicai Epidemiology: A Basic Science for Clinicai Medicine, Little Brown and Co., pp. 106-107 (1985). Resumidamente, nesta modalidade, o valor controle é determinado a partir de um gráfico de pares de taxas de verF ♦ dadeiro positivo (sensibilidade) e taxas de falso positivo (100% de especifici15 dade) que correspondem a cada valor controle possível para o resultado de teste de diagnóstico. O valor controle no gráfico que inclui a área maior é o valor de corte mais preciso, e uma amostra gerando um sinal que é maior do que o valor de corte determinado através deste método é considerado positivo. Alternativamente, o valor de corte pode ser mudado para minimizar a taxa de falso positivo, ou para minimizar a taxa de falso negativo. Em geral, uma amostra gerando um sinal que é maior do que o valor de corte determinado através deste método é considerada positiva para tuberculose.
Em uma modalidade relacionada, o ensaio é realizado em um rápido escoamento ou em formato de teste de tiras (stríp tesf), onde o antí25 geno é imobilizado em uma membrana, tal como, mas não limitado a, nitrocelulose. Em um teste rápido por imunoconcentração, anticorpos dentro da amostra se ligam ao polipeptídeo imobilizado conforme a amostra passa pela membrana. Um reagente de detecção (por exemplo, proteína A-ouro coloidal) se liga ao complexo anticorpo-peptídeo conforme a solução contendo o reagente de detecção flui através da membrana. A detecção de reagente de detecção ligado pode ser realizada conforme acima descrito.
Em um exemplo do formato de teste de tira, uma extremidade da membrana à qual o polipeptídeo é ligado é imersa em uma solução contendo a amostra. A amostra migra ao longo da membrana através de uma região contendo o reagente de detecção e para a área de polipeptídeo imobilizado. A concentração do reagente de detecção no polipeptídeo indica a presença de anticorpos anti-Mycobacteríum na amostra. Tipicamente, a concentração de reagente de detecção neste estágio gera um padrão, tal como uma linha, que pode ser visualmente lido. A ausência de tal padrão indica um resultado negativo. Em geral, a quantidade de polipeptídeo imobilizado na membrana é selecionada para gerar um padrão visualmente discernível quando a amostra biológica contém um nível de anticorpos que seria suficiente para gerar um sinal positivo em um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Em várias modalidades, a quantidade de polipeptídeo imobilizado na membrana varia de a partir de cerca de 25 ng a cerca de 1 pg, tal como de a partir de cerca de 50 ng a cerca de 500 ng. Tais testes podem tipicamente ser realizados com um volume muito pequeno de soro ou sangue do paciente.
Método para Detecção de uma Infecção com Mtb: Detecção de Polinucleotídeos
Reagentes de diagnóstico incluem o uso de seqüências de polinucleotídeo codificando um ou mais dos polipeptídeos de Mtb acima descritos. Infecção com Mycobacteríum pode ser detectada através da detecção da presença, ausência ou nível de mRNA codificando um polipeptídeo de Mycobacteríum em uma amostra biológica. Em vários exemplos, ensaios de hibridização são utilizados, tal como ensaios Northern blot ou dot blot. Em exemplos adicionais, ensaios baseados em PCR são utilizados.
Métodos gerais para extração de mRNA são bem-conhecidos na técnica e são descritos em livros padrão de biologia molecular, incluindo Ausubel e outros, Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997). Métodos para extração de RNA de tecidos embebidos em parafina são descritos, por exemplo, em Rupp e Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987) e De Andres e outros, BioTechniques 18:42044 (1995). Em particular, isolamento de RNA pode ser realizado usando estojo de purificação, conjunto de tampão e protease de fabricantes comerciais, tal como QIAGEN®, de acordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, RNA total de células em cultura (tal como aquelas obtidas de um indivíduo) pode ser isolado usando minicolunas QIAGEN® RNeasy. Outros estojos de isolamento de RNA co5 mercialmente disponíveis incluem MASTERPURE®. Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE® Madison, Wis.) e Paraffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.). RNA total de amostras de tecido pode ser isolado usando RNA Stat-60 (Tel-Test). RNA preparado uma amostra biológica pode ser isolado, por exemplo, através de centrifugação de gradiente de densida10 de de cloreto de césio.
Métodos para quantificação de mRNA são bem-conhecidos na técnica. Em um exemplo, o método utiliza reação em cadeia de polimerase de transcriptase reversa (RT-PCR). Geralmente, a primeira etapa em traçado de perfil de expressão de gene através de RT-PCR é a transcrição rever15 sa do molde de RNA em cDNA, seguido por sua amplificação exponencial em uma reação PCR. As duas transcriptases reversas mais comumente usadas são transcriptase reversa do vírus de mieloblastose de ave (AMV-RT) e transcriptase reversa do vírus da leucemia de murino Moloney (MMLV-RT). A etapa de transcrição reversa é tipicamente iniciada usando iniciadores es20 pecíficos, hexâmeros aleatórios ou iniciadores oligo-dT, dependendo das circunstâncias e do objetivo de traçado de perfil. Por exemplo, RNA extraído pode ser transcrito reverso usando um GeneAmp RNA PCR Kit (Perkin Elmer, Calif., USA), seguindo as instruções do fabricante. O cDNA derivado pode ser então usado como um molde na reação PCR subseqüente.
Embora a etapa de PCR possa usar uma variedade de polimerases de DNA dependentes de DNA termoestável, ela tipicamente emprega a Taq DNA polimerase, que tem uma atividade de 5'-3‘ nuclease mas não tem uma atividade de 3'-5' endonuclease revisora. Então, TaqMan® PCR tipicamente utiliza a atividade de 5'-nuclease de Taq ou Tth polimerase para hidrolisar uma sonda de hibridização ligada a seu amplicon alvo, mas qualquer enzima com atividade de 5' nuclease equivalente pode ser usada. Dois iniciadores de oligonucleotídeo são usados para gerar um amplicon típico de uma reação PCR. Um terceiro oligonucleotídeo, ou sonda, é projetado para detectar seqüência de nucleotídeo localizada entre os dois iniciadores de PCR. A sonda é não-extensível através da enzima Taq DNA polimerase, e é marcada com um corante fluorescente repórter e um corante fluorescente de extinção. Qualquer emissão induzida por laser do corante repórter é extinta pelo corante de extinção quando os dois corantes estão localizados próximos como eles estão na sonda. Durante a reação de amplificação, a enzima Taq DNA polimerase cliva a sonda de uma maneira dependente do molde. Os fragmentos de sonda resultantes dissociam em solução, e sinal do coran10 te repórter liberado é livre do efeito de extinção do segundo fluorforo. Uma molécula de corante repórter é liberada para cada nova molécula sintetizada,
- e detecção do corante repórter não-extinto provê a base para interpretação quantitativa dos dados.
TAQMAN® RT-PCR pode ser realizada usando equipamento 15 comercialmente disponível, tal como, por exemplo, ABI PRISM 7700® Sequence Detection System. TM. (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), ou Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Manneheim, Alemanha). Em uma modalidade, o procedimento de 5' nuclease é realizado em um dispositivo de PCR quantitativa de tempo real tal como o
ABI PRISM 7700®. Sequence Detection System®. O sistema inclui termociclizador, laser, dispositivo acoplado à carga (CCD), câmera e computador. O sistema amplifica amostras em um formato de 96 cavidades em um termociclizador. Durante amplificação, sinal fluorescente induzido por laser é coletado em tempo real através de cabos de fibra óptica para todas as 96 cavida25 des, e detectado no CCD. O sistema inclui software para ativar o instrumento e para análise dos dados.
Em alguns exemplos, dados de ensaio de 5'-nuclease são inicialmente expressos como Ct, ou o ciclo limiar. Conforme acima discutido, valores de fluorescência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidade de produto amplificado para aquele ponto na reação de amplificação. O ponto quando o sinal fluorescente é primeiro registrado como estatisticamente significante é o ciclo limiar (Ct).
Para minimizar erros e o efeito de variação amostra-paraamostra, RT-PCR pode ser realizada usando um padrão interno. O padrão interno ideal é expresso em um nível constante dentre tecidos diferentes, e é não-afetado pelo tratamento experimental. RNAs mais freqüentemente usa5 dos para normalizar padrões de expressão de gene são mRNAs para os genes de manutenção gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH), betaactina e RNA ribossomal 18S.
Uma variação mais recente da técnica de RT-PCR é a PCR quantitativa em tempo real, que mede o acúmulo de produto de PCR através de uma sonda fluorigênica duplamente marcada (isto é, sonda TAQMAN®). PCR em tempo real é compatível com ambas PCR competitiva quantitativa, onde competidor interno para cada seqüência alvo é usado para normalização, e com PCR comparativa quantitativa usando um gene de normalização contido dentro da amostra, ou um gene de manutenção para RT-PCR (vide
Held e outros, Genome Research 6:986 994, 1996). PCR quantitativa é também descrita na Patente U.S. Ns 5.538.848, cuja descrição é aqui incorporada a título de referência. Sondas e procedimentos de amplificação quantitativos relacionados são descritos na Patente U.S. Ns 5.716.784 e Patente U.S. Ne 5.723.591, cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência.
Instrumentos para realização de PCR quantitativa em placas de microtitulação estão disponíveis da PE Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, Calif. 94404 sob a marca registrada ABI PRISM® 7700.
As etapas de um protocolo representativo para quantificação de expressão de gene usando tecidos embebidos em parafina, fixados, como uma fonte de RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão e amplificação de iniciador são dadas em vários artigos de jornal publicados (vide Godfrey e outros, J. Molec. Diagnostics 2:84 91, 2000; K. Specht e outros, Am. J. Pathol. 158:419 29, 2001). Resumidamente, um processo representativo começa com corte de seções de cerca de 10 pm de espessura de amostra de tecido embebido em parafina. O RNA é então extraído, e proteína e DNA são removidos. Após análise da concentração de RNA, etapas de reparo e/ou amplificação de RNA podem ser incluídas, se necessário, e RNA é transcrito reverso usando promotores específicos de gene seguido por RTPCR.
Um procedimento de amplificação de ácido nucléico quantitativo alternativo é descrito na Patente U.S. NQ 5.219.727, que é aqui incorporada a título de referência. Neste procedimento, a quantidade de uma seqüência alvo em uma amostra é determinada através de amplificação simultânea da seqüência alvo e um segmento de ácido nucléico de padrão interno. A quantidade de DNA amplificado de cada segmento é determinada e comparada com uma curva padrão para determinar a quantidade de segmento de ácido nucléico alvo que estava presente na amostra antes da amplificação.
Em algumas modalidades deste método, a expressão de um gene de manutenção ou controle interno pode ser também avaliada. Esses termos pretendem incluir qualquer gene constitutivamente ou globalmente *
expresso cuja presença permite uma varredura de níveis de mRNA de cito15 cina. Tal varredura compreende uma determinação do nível constitutivo geral de transcrição de gene e um controle para variações em recuperação de
RNA.
Monitoramento da Progressão de uma Infecção e/ou Eficácia de Terapia
Em várias modalidades, os métodos de diagnóstico descritos 20 aqui são usados para monitoramento da progressão de uma infecção com Mycobacterium. Nesta modalidade, ensaios conforme acima descrito para o diagnóstico de uma infecção com Mycobacterium podem ser realizados com o tempo, e a mudança no nível de polipeptídeo(s) reativo(s) avaliada. Por exemplo, os ensaios podem ser realizados mais ou menos a cada 12, 24,
36, 48, 60 ou 72 horas durante um período especificado, tal como durante meses ou semanas, e em seguida realizado conforme necessário.
Em alguns exemplos, a presença de um polipeptídeo de Mtb, ou um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo, é ensaiada. Geralmente, a infecção com Mycobacterium está progredindo naqueles pacientes em que o nível de polipeptídeo (tal como detectado usando um agente de ligação), o nível de polinucleotídeo, o nível de anticorpos ou o nível de células T aumenta com o tempo. Em contraste, a infecção com Mycobacterium não está pro76 gredindo quando o nível de polipeptídeo reativo, o nível de polinucleotídeo, o nível de anticorpos ou o nível de células T ou permanece constante ou diminui com o tempo. Desta maneira, a eficácia de um regime terapêutico particular pode ser avaliada.
Em uma modalidade, a presença de um polipeptídeo de Mtb é avaliada em um indivíduo. O indivíduo é administrado com um protocolo terapêutico. A presença do polipeptídeo de Mtb é então avaliada. Um aumento ou nenhuma mudança na quantidade do polipeptídeo de Mtb (ou polinucleotídeo) conforme comparado com a quantidade do polipeptídeo de Mtb antes da administração do protocolo terapêutico indica que o protocolo terapêutico não é eficaz, e a infecção com Mtb está progredindo. Uma diminuição na quantidade do polipeptídeo de Mtb (ou polinucleotídeo) conforme comparado com a quantidade de polipeptídeo de Mtb (ou polinucleotídeo) antes da administração do protocolo terapêutico indica que o protocolo terapêutico é eficaz, e que a infecção com Mtb não está progredindo.
Em outra modalidade, a presença de células T, tal como células
T CD8+ e/ou células T CD4+, que especificamente reconhecem um polipeptídeo de Mtb é avaliada em um indivíduo. O indivíduo é administrado com um protocolo terapêutico. A presença das células T que especificamente reco20 nhecem o polipeptídeo de Mtb é então avaliada. Uma diminuição ou nenhuma mudança na quantidade de células T CD 8+ e/ou células T CD4+ que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb conforme comparado com a quantidade de células T CD8+ e/ou células T CD4+, respectivamente, que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb antes da administração do protocolo terapêutico indica que o protocolo terapêutico não é eficaz. Um aumento na quantidade de células T CD8+ e/ou células T CD4+ que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb conforme comparado com a quantidade das células T CD8+ e/ou células T CD4+ que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb antes da administração do protocolo te30 rapêutico indica que o protocolo terapêutico é eficaz.
Deve ser notado que para qualquer um dos ensaios acima descritos, para melhorar sensibilidade, marcadores de Mycobacterium múltiplos podem ser avaliados dentro de uma dada amostra. Ficará aparente que os ensaios descritos aqui podem ser usados em combinação. Então, conjuntos de polipeptídeos de Mycobacterium e combinações de ensaios podem ser para sensibilidade e especificidade ótimas.
Vários outros protocolos de ensaio existem que são adequados para uso com os polipeptídeos da presente invenção. As descrições acima pretendem ser exemplares apenas.
A descrição é ilustrada pelos Exemplos não-limitantes que seguem.
EXEMPLOS
Para muitas infecções, o repertório da resposta de CD8 é moldado pela entrada de antígeno no curso de processamento de MHC-I, ligação de antígenos de peptídeos e/ou não-peptídeo a moléculas do MHC-I, e reconhecimento dessas estruturas pelas células T. Por fim, um subconjunto relativamente limitado de células T específicas de patógeno emerge. Embora vários antígenos de Mtb de CD4 geralmente reconhecidos tenham sido descritos (Reed e outros, Microbes Infect. 7:922-931, 2005) (ESAT-6, CFP10, Ag85, etc), surpreendentemente pouco se sabe sobre antígenos de Mtb comuns reconhecidos por células T CD8+ humanas. A maioria dos epítopos de
CD8 que foram identificados foi definida pelo teste de peptídeos de Mtb selecionado quanto à ligação de alta afinidade a moléculas do MHC Classe Ia (HLA-2 na maioria dos casos (vide, por exemplo, Lalvania, Microbes Infect. 7:922-931, 1998)). Em quase todos desses, no entanto, a freqüência ex vivo dessas células T em indivíduos infectados com Mtb é baixa ou indetectável, sugerindo que essas especificidades podem não representar respostas imunodominantes. Em contraste, nos casos limitados onde células T foram usadas para definir epítopos contidos em antígenos de Mtb selecionados, freqüências ex vivo altas foram demonstradas (vide Lewinsohn e outros. Am. J. Respir. Cirt. Care Med. 166:843-848, 2002), sugerindo que uma abordagem centrada em célula T pode identificar epítopos imunodominantes. Além disso, respostas de célula T CD8 a alguns antígenos de Mtb que representam bons antígenos de CD4 (CFP10, ESAT-6, Ag85 e Mtb39) foram detectadas em alta freqüência em pessoas infectadas com Mtb. Então, uma biblioteca limitada de peptídeos sintéticos de sobreposição representando vários antígenos de Mtb de CD4 foi usada para determinar a magnitude da resposta de CD8 a esses antígenos em pessoas com tuberculose (TB) ativa e infecção com tuberculose latente (LTBI) bem como indivíduo não-infectados. Ainda, um painel de clones de célula T CD8+ específica de Mtb foi utilizado para definir epítopos mínimos reconhecidos dentro desses antígenos e determinou a contribuição desses novos epítopos para a resposta de CD8 específica de Mtb.
Exemplo 1
Materiais e Métodos
Indivíduos humanos. Indivíduos não-infectados foram definidos como indivíduos saudáveis com um teste de pele de tuberculina negativo (TST) e quaisquer fatores de risco conhecidos para infecção com Mtb. Indi15 víduos com LTBI foram definidos como pessoas saudáveis com um TST positivo e quaisquer sintomas e sinais de TB ativa. Em todos os casos de TB ativa, TB pulmonar foi diagnosticada pelo TB Controller da região e confirmada por cultura de esputo positiva para Mycobacterium tuberculosis. Células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas de sangue integral obtido através de venipunção e aférese.
Meios e Reagentes. Meio de cultura consistia em RPMI 1640 suplementado com Soro bovino fetal a 10% (FBS; Bio Whittaker), 5 X 10'5 M2 ME (Sigma-Aldrich) e glutamina a 2 mM (GIBCO BRL). Para o cultivo e ensaio de clones de célula T reativa a Mtb, RMPI 1640 foi suplementado com soro humano a 10%. Cepa de Mtb H37Rv foi obtida da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e preparada conforme previamente descrito (Lewinsohn e outros, J. Immunol., 165:925-930, 2000). Peptídeos foram sintetizados através da Genemed Synthesis, Inc., (São Francisco, CA). Grupos de peptídeo sintético consistiam em 15 mers se sobrepondo em 11 ami30 noácidos (aa) representando proteínas de Mtb demonstradas ser antígenos de CD4 potentes. Grupos de peptídeo representando CDP-10 (Berthet e outros, Microbiology 144:3195-3203, 1998; Dillon e outros, J. Clin. Microbiol.
38:3285-3290, 2000), ESAT-6 (Sorenson e outros, Infect. Immun. 63:171 ΟΙ 717, 1995), Mtb39a (dois grupos, A&B, referência) (Dillon e outros, Infect. Immun. 67:2941-2950, 1999), Mtb8.4 (Colere outros, J. Immunol. 161:23562364, 1998), Mtb 9.9 (Alderson e outros, J. Exp. Med. 191:551-560, 2000), (Coler e outros, J. Immunol. 161:2356-2364, 1998), Mtb 9.9 (Alderons e outros, J. Exp. Med. 191:551-560, 2000), EsxG (Rosenkrands e outros, Electrophoresis 21:3740-3756, 2002), antígeno de 19 kDa (Collins e outros, J. Gen. Microbiol. 136:1429-1436, 1990), antígeno 85b (Borremans e outros, Infect. Immun. 57:3132-3130, 1989) (dois grupos, A&B, referência) foram sintetizados. Peptídeos foram ressuspensos em DMSO e até 50 peptídeos foram combinados em um grupo de modo que cada peptídeo no grupo estava em uma concentração de 1 mg/ml. Grupos de peptídeo foram armazenados a-80sC.
Cepas de Célula e Clones de Célula T. Cepas de célula B trans15 formadas com EBV, LCL, ou foram geradas usando sobrenadantes da cepa de célula 9B5-8 (American Type Cultura Collectiori) ou obtidas do National Marrow Donor Program (NMDP; Mineápolis, MN). LCL foram mantidas através de passagem contínua conforme previamente descrito (Heinzel e outros, J. Exp. Med. 196:1437-1481, 2002). Clones de célula T específica de Mtb foram isolados de indivíduos com LTBI ou tuberculose ativa, usando DCs infectadas com Mtb e metodologia de clonagem de diluição limitante conforme previamente descrito (Lewinsohn e outros, J. Immunol. 165:925-930, 2000). Rapidamente, células T CD8+ foram isoladas de PBMC usando seleção negativa usando contas revestidas com anticorpo CD4 e então seleção positiva usando contas magnéticas revestidas com anticorpo CD8 pelas instruções do fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn CA) ou através de citometria de fluxo. Neste caso, (BD Bioscience Ns Cat. 555347) células negativas CD4-PE, positivas CD8-APC (BD Bioscience, Ns Cat. 555369) (pureza >99%) foram selecionadas em um Becton Dickenson LSR II. Células T foram semeadas em várias concentrações na presença de uma CD infectada com Mtb autóloga irradiada 1 x 105, gerada conforme descrito abaixo, e rlL-2 (5 ng/ml) em meio de cultura celular consistindo em 200 pl de RPMI 1640 su80 plementado com soro humano a 10%. Cavidades exibindo crescimento entre 10-14 dias foram avaliadas quanto à especificidade de Mtb usando ELISPOT e DC infectadas com Mtb como uma fonte de APCs. Células T retendo especificidade de Mtb foram fenotipadas adicionalmente quanto à expressão do receptor de célula T αβ e expressão de CD8 através de FACS e expandidas conforme descrito abaixo. Uso de νβ foi determinado usando o lOTest Beta Mark Kit da Beckman Coulter.
Expansão de clones de célula T. Para expandir os clones de células T CD8+, um protocolo de expansão rápida usando estimulação de mAB anti-CD3 foi usado conforme anteriormente descrito (Heinzel e outros, J. Exp. Med. 196:1473-1481,2002).
Geração e Infecção de DC de Sangue Periférico. DCs derivadas de monócito foram preparadas (Heinzel e outros, supra; Romaní e outros, J. Exp. Med. 180:83-93, 1994). Para gerar DC infectada com Mtb, células (1 x
106) foram culturadas da noite para o dia na presença de Mtb (multiplicidade de infecção [MOI] = 50:1). Após 18 horas, as células foram colhidas e ressuspensas em RPMI/soro humano a 10%.
Ensaios de ligação de MHC. O ensaio de ligação de MHCpeptídeo utilizado mede a habilidade de ligantes de peptídeo em inibir a liga20 ção de um peptídeo radiomarcado a moléculas de MHC purificadas, e foi descrito em detalhes em outro lugar (Sidney e outros, 1999. UNIT 18.3 Measurement of MHC/peptide interactions by gel filtration. In Current Protocols in Immunology. Colígan e outros, eds., John Wiley & Sons, Inc., 1996). Rapidamente, moléculas de MHC purificadas, peptídeos de teste e um peptídeo de sonda radiomarcado foram incubados em temperatura ambiente na presença de microglobulina B2 humana e um coquetel de inibidores de protease. Após uma incubação de dois dias, ligação do peptídeo radiomarcado à molécula do MHC classe I correspondente foi determinada através da captura de complexos de MHC/peptídeo em placas revestidas com anticorpo
W6/32 (anti-HLA A, B e C) ou B123.2 (anti-HLA B, C e um pouco de A), e contagens ligadas por minuto (cpm) foram medidas usando um contador de microcintilação. Para ensaios de competição, a concentração de peptídeo dando 50% de inibição da ligação do peptídeo radiomarcado foi calculada. Peptídeos foram tipicamente testados em seis concentrações diferentes cobrindo uma faixa de dose de 100.000 vezes, e em três ou mais ensaios independentes. Sob as condições utilizadas, onde [marcador]<[MHC] e IC50 £ [MHC], os valores de IC5o medidos são aproximações razoáveis dos valores Kd verdadeiros.
Ensaio ELISPOT IFN-γ. O ensaio ELISPOT IFN-γ foi realizado conforme previamente descrito (Beckman e outros, J. Immunol. 157:27952803, 1996). Para determinação de freqüências ex vivo de células T CD4+ ou CD8+ respondendo à infecção com Mtb ou antígenos de Mtb, células T CD4+ ou CD8+ foram positivamente selecionadas de PBMC usando contas magnéticas (Miltenyi Biotec, Auburn CA) como uma fonte de células T respondedoras e testadas em duplicata em quatro concentrações diferentes. DC autólogas (20.000 células/cavidade) foram usadas como APC e DC fo15 ram ou infectadas com Mtb ou pulsadas com grupos de peptídeo (5 pg/ml, concentração final de cada peptídeo) e então adicionadas ao ensaio. Para ensaio usando clones de célula T, células T (1000 ou 5000 células/cavidade) foram incubadas com LCL autóloga (20.000 células/cavidade) na presença ou ausência de antígeno.
Análise de dados: Para determinar a freqüência ex vivo de células T específicas de antígeno, o número médio de manchas por cavidade para cada duplicata foi posto em gráfico contra o número de células respondedoras por cavidade. Análise de regressão linear foi usada para determinar a inclinação da linha, que representa a freqüência de células T específicas de antígeno. O ensaio é considerado positivo, isto é, refletindo a presença de uma resposta de célula T iniciada, se a probabilidade binominal (Lewinshon e outros, Microbes Infect. 8:2587-2598, 2006) para o número de manchas for significantemente diferente através de ensaios experimentais e de controle. Para determinar diferenças em freqüências de célula T ex vivo en30 tre grupos análise Wilcoxon/Kruskal foi usada.
Exemplo 2
Definição de Antígenos de CD8+ Específicos de Mtb Imunodominantes
Para definir antígenos de CD8+ específicos de Mtb imunodominantes, e para determinar se ou não essas respostas resultam da infecção com Mtb, células T CD8+ foram usadas de doadores não-infectados, com LTBI, ou ativamente infectados com Mtb. Respostas foram determinadas ou diretamente ex vivo ou usando clones de célula T CD8+ obtidos através de clonagem de diluição limitante em DC autóloga infectada com Mtb (Lewingsohn e outros, J. Immunol. 165:925-930, 2000). Como muito é conhecido sobre antígeno de Mtb de CD4+, um painel desses antígenos geralmente conhecidos foi selecionado para varredura adicional. Esses foram: Mtb39, CPF10 e Mtb8.4, Mtb9.9, ESAT-6, Ag85b, 19 KDa e EsxG. Para evitar influência introduzida usando peptídeos de especificidade de ligação de HLA prevista, foram sintetizados peptídeos de sobreposição (15 aa, sobreposição
11 aa) para representar as proteínas de interesse (Lewinshon e outros, J.
/mmuno/. 166:439-446, 2001).
Para determinar precisamente as freqüências de célula efetora ex vivo de células T CD8+, análise de regressão linear foi usada. Conforme mostrado na Figura 1, células T CD8+ purificadas com conta magnética fo20 ram testadas contra DC pulsada com peptídeo em uma faixa de números de células T CD8+ em um ensaio ELISPOT IFN-γ. Um ensaio positivo foi determinado conforme descrito abaixo e, se positivo, a freqüência específica de antígeno seria determinada usando regressão linear.
Indivíduos não-infectados (n = 14), aqueles com LTBI (n = 20) e aqueles com TB ativa (n = 12) foram avaliados quanto a respostas de CD8+ para um painel de antígenos de célula T CD4+ Mtb, bem como DC infectada com Mtb. Todos os indivíduos testados tinham respostas de célula T CD8+ robustas para DC infectada com Mtb e eram de magnitude maior em indivíduos com TB ativa do que naqueles com TLBI (p = 0,01; Figura 2, Tabela I).
No entanto, respostas de célula T CD8+ para o painel de antígenos de Mtb foram encontradas quase exclusivamente naqueles infectados com Mtb pelo que diferenças estatisticamente significantes entre indivíduos não-infectados e infectados com Mtb foram notadas para sete de dez antígenos para ambas a magnitude da resposta (Figura 2) e a proporção de ensaios positivos (Tabela I).
Tabela I.
Respostas de célula T CD8+ a antígenos de TB conhecidos
Antígeno Infectado com Mtb Ns de positivo®/ Ns testado (%) Não-infectado com Mtb Ne de positivo®/ Ns testado (%) Valor P (teste de fisher bilateral)
DC de Mtb 17/17(100) 11/11 (100)
Mtb39 Grupo A 13/30(43 0/14(0) 0,003
Mtb39 Grupo B 10/30 (33) 0/14(0) 0,01
CFP10 14/30 (47) 1/14(7) 0,02
Mtb 8,4 13/30 (43) 0/14(0) 0,003
Mtb 9,9 10/25(40) 1/14(7) 0,06
ESAT6 12/25 (48) 0/14(0) 0,003
Ag85b Grupo A 5/22 (23) 1/14(7) 0,37
Ag85b Grupo G 4/22(18) 0/14(0) 0,14
19 kd 6/22 (27) 1/12(8) 0,38
EsxG 9/22(41) 0/14 (0) 0,006
aEnsaio positivo definido no texto.
No entanto diferenças em respostas de célula T CD8+ entre indivíduos com TB ativa e LTBI não foram estatisticamente diferentes. Embora respostas de célula T CD8+ fortes fossem observadas contra muitos dos an10 tígenos testados, é igualmente notado que vários indivíduos com respostas de célula T CD8+ direcionadas a Mtb fortes não tiveram respostas demonstráveis a muitos dos antígenos testados.
Esses dados de freqüência ex vivo demonstram a presença de respostas de alta freqüência a vários antígenos de Mtb conhecidos, mas não esclarece alelo de restrição, epítopo mínimo ou hierarquia de dominância dentro do gene de interesse. Para se direcionar a esta questão, clonagem de diluição limitante de células T CD8+ humanas usando DC infectada com Mtb foi realizada (vide Lewinsohn e outros, J. Immunol. 166:439-446, 2001) e painéis de ambos clones de célula T CD8+ classicamente e não-classica84 mente restritos a HLA foram gerados. Usando grupos de peptídeo representando antígenos de CD4+ conhecidos, a especificidade antigênica dos clones restritos a HLA-la pode ser definida em mais da metade dos clones (Tabela O5 Tabela II.
Muitos clones de célula T CD8+ reconhecem antígenos de célula T CD4+ conhecidos
Doador Estado da TB Clones de HLA-la (N9)a Antígeno Identificado (N9)b N9 de Antígenos Distintos (N9)0 N9 de Epítopos Distintos (N9)d
D431 TB Ativa 1 0 0 0
D432 TB Ativa 14 4 2 2
D466 TB Ativa 11 10 1 2
D571 TB Ativa 7 7 1 1
D480 TB Ativa 6 6 1 1
D481 TB Ativa 11 11 1 1
D426 LTBI 1 0 0 0
D443 LTBI 1 1 1 1
D454 LTBI 2 2 2 2
D504 LTBI 7 2 1 1
Total 61 42 10 11
aNúmero de clones derivados de doador. bNúmero de clones para os quais antígeno cognato foi identificado. cNúmero total de antígenos distintos identificados do conjunto de clone. dNúmero total de epítopos distintos identificados do conjunto de clone.
Esta abordagem é mostrada em detalhes para um clone representativo único, D466 D6, derivado de um indivíduo com TB ativa. Conforme mostrado na Figura 3A, teste do clone contra DC autóloga pulsada com um painel de grupos de peptídeo definiu sem ambiguidade a especificidade antigênica como CFP10. O clone foi então testado contra cada um dos peptídeos de 15 mer que compreende o grupo CFP10, revelando que o epítopo estava contido dentro de CFP101-15 (Figura 3B). Cada peptídeo 8 aa, 9 aa,
10 aa e 11 aa possível foi então sintetizado e testado quanto à reatividade, revelando atividade antigênica entre aa 2-11 (Figura 3C). Similarmente, cada clone foi testado contra cepas de célula linfoblastóide (LCL) compartilhando pelo menos um tipo de HLA com o doador (Figura 3D).
LCL autóloga e LCL IHW 9058, que compartilham B4501 e 5 C1601, apresentam o epítopo para o clone, identificando ambos B4501 e
C1601 como possíveis alelos de restrição. No entanto, CLC C1601+ D433 não apresentam o epítopo, eliminando C1601 como um alelo de restrição candidato. Deste modo D466 D6 é restrito por HLA-B4501. Conforme demonstrado na Figura 4, através do teste de cada epítopo plausível em uma ampla faixa de concentrações, o epítopo mínimo foi definido como CFP10210 para D466 D6. Dados experimentais apoiando a designação do epítopo mínimo são providos para cada clone na Figura suplementar. Um sumário da especificidade antigênica, epítopo mínimo e alelo de restrição de HLA é apresentado na Tabela III. Inesperadamente, todos exceto um dos clones de célula T foram restritos por alelos de HLA-B. Ainda, uma minoria daqueles observados eram 9 aa de comprimento.
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IND = Indeterminado.
TBD = A ser feito.
Devido ao fato de que cada um dos clones de célula T CD8+ individuais foi derivado com base em cultivo de DC infectada com Mtb, foi determinado se ou não o antígeno e epítopos identificados refletiam epítopos imunodominantes ex vivo. Duas abordagens independentes foram seguidas, a primeira para determinar se a resposta estava presente em alta freqüência e a segunda para determinar qual proporção da resposta total ao antígeno é constituída pelo antígeno. Para determinar a freqüência de célula efetora ex vivo, conforme descrito na Figura 1, cada epítopo foi testado usando DC autóloga e células T CD8+ purificadas com conta magnética do doador do qual os clones de célula T foram isolados. Um sumário das freqüências de célula efetora é apresentado na Tabela III. Para a maioria, os epítopos refletem respostas de alta freqüência, e então poderíam ser considerados uma resposta que foi iniciada pela exposição a Mtb. Notavelmente, clones de célula T isolados de quatro doadores reconhecidos CFP10. Para determinar se os epítopos definidos refletiam uma proporção substancial da resposta total ao antígeno de interesse, células T CD8+ purificadas com conta magnética de três doadores com células mononucleares de sangue periférico (PMBC) disponíveis suficientes foram testadas quanto à reatividade a cada peptídeo de 15-mer individual, o grupo de peptídeo e peptídeo representando o epítopo mínimo. Como é demonstrado na Figura 5, as freqüências ex vivo para o epítopo mínimo, peptídeo(s) de 15-mer contendo o epítopo mínimo e grupo de peptídeo foram notavelmente concordantes. Esses dados sugerem que para cada doador a hierarquia de dominância foi claramente estabelecida, e é refletida nos clones originais. Finalmente, como é notado na Tabela III, clones filhas de especificidade idêntica foram freqüentemente identificadas, um resultado que seria previsto com base em uma hierarquia de imunodominância. Tingimento com TCR V beta foi usado para confirmar a relação clonal entre clones filhas. Interessantemente, em dois casos, o epítopo mínimo idêntico e restrição por HLA foram representados por dois clones distin30 tos (Tabela III).
Devido ao fato de que muito trabalho em respostas de célula T CD8+ humana para Mtb se apoiou no uso de algoritmos de previsão de HLA, conforme cada epítopo era definido era perguntado se ou não os epítopos teriam sido previstos através dessas abordagens. Muitos desses epítopos não foram classificados fortemente. Isto poderia destacar as limitações desses algoritmos no momento em que eles foram usados. Para se endereçar a esta ques5 tão experimentalmente, a IC50 de cada peptídeo que tinha sido sintetizado no curso da definição do epítopo mínimo foi determinada contra um painel de moléculas de HLA humana. É mostrada na Tabela III a IC50 para 0 epítopo mínimo com o alelo de restrição cognato. Os dados demonstraram que os epítopos de célula T ligaram avidamente a HLA, e mostram um alto grau de concordância entre os dados de epítopo de célula T e dados de ligação de HLA.
Os dados demonstraram que respostas de célula T CD8+ estão presentes em pessoas infectadas com Mtb em freqüências que são comparáveis com aqueles vistas seguindo muitas infecções virais comuns tal como vaccínia, influenza e CMV. Todos exceto um dos epítopos que foram mape15 ados foram restritos por moléculas de HLA-B. Os dados sugerem que usando uma abordagem guiada por célula T para identificação de epítopo, epítopos dominantes podem ser definidos em humanos infectados com Mtb. Exemplo 3
Varredura de clones de célula T contra uma biblioteca de peptídeo genômico
Os clones de célula T classicamente restritos e não-classicamente restritos (vide Tabela II acima) que não reconheceram um dos grupos de peptídeo de antígeno de Mtb conhecidos (Rv3875, Rv3874, Rv1886c, Rv0287, Rv3763, Rv1174, Rv1196, Rv1793, Rv2346c, Rv1037c, Rv3619c e Rv1198) foram avaliados contra uma biblioteca de peptídeo genômico. Esta biblioteca de peptídeo representa 389 genes, representando aproximadamente 10% do genoma de Mtb. Os peptídeos são de 15 mers se sobrepondo 11 para cada produto de gene. 50 nmols de cada peptídeo foram sintetizados individualmente e então agrupados em 777 grupos de 50 peptídeos em um formato de 96 cavidades (nove placas). Cinco cavidades vazias e uma cavidade de um grupo de peptídeo irrelevante, SIV gag, foram incluídas em cada uma das nove placas. Para avaliar os clones contra a biblioteca de peptídeo genômico, os clones são primeiro expandidos e testados contra
DCs infectadas com Mtb para assegurar que cada clone desta expansão particular dê um sinal específico de Mtb robusto no ensaio ELISPOT. Então até seis clones de célula T são agrupados. Para a varredura, clones de célula T (5.000 células/cavidade de cada clone), DCs autólogas (20.000 célu5 las/cavidade), IL-2 (0,5 ng/ml) e os grupos de peptídeo (5 ug/ml, peptídeos individuais) foram incubados da noite para o dia a 37s C no ensaio ELISPOT. Apenas uma réplica técnica é feita por grupo porque 5000 clones de célula T por cavidade com um antígeno de peptídeo produziram uma resposta positiva esmagadora, resultando em um resultado definitivo. Seis clones clássicos de D504 foram avaliados contra a biblioteca de peptídeo genômica, levando ao encontro de um novo epítopo. Este epítopo era da família de quatro proteínas que inclui EsxJ, EsxW, EsxK e EsxP. Essas proteínas compartilham 98% de homologia e diferem em apenas 3 aminoácidos. Há um quinto membro desta família, EsxM (Rv1792), que não estava incluído na biblioteca de peptídeo genômico.
Os clones foram avaliados contra os quinze mers individuais para esses grupos de peptídeo. Todos os seis clones clássicos reconheceram EsxJ 21-35. Esta é uma região de EsxJ que é idêntica as outros quatro membros desta família. Em seguida, peptídeos de 9, 10 e 11 mers foram feitos destes 15 mers e avaliados contra cada clone. O epítopo mínimo foi determinado ser EsxJ 24-34. Em adição, a restrição por HLA foi verificada ser B5701.
Exemplo 4
Varredura adicional de clones de célula T contra uma biblioteca de peptídeo genômico
Onze clones clássicos de D432B foram avaliados contra a biblioteca de peptídeo genômico descrita acima. O antígeno foi determinado para dois clones, que levaram à identificação de dois novos epítopos, PE_PGRS4247-55 θ PE953-67· O epítopo mínimo para um clone foi determinado ser PE_PGRS4247-55 e a restrição por HLA foi verificada ser B3514.O epítopo mínimo para o outro clone não é ainda determinado, mas está contido no PE9s3-67de 15 mer. A restrição por HLA para este clone foi verificada ser B3905.
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N9 Não-clássico disponível (avaliado) T“ 6(4) (6)6
N9 Clássico Disponível (avaliado) 1 (1) T“ t— T~ T ♦ 1 (1) (9)9
Estado da TB PPD+ Ativa Ativa PPD+ Ativa PPD+ 1
Doador 426 431 432 454 466 504
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Exemplo 5
Varredura de células T CD8+ ex vivo contra uma biblioteca de peptídeo genômica
Células T CD8+ de doador LTBI, D610 (SE Asian), foram avalia5 das contra a biblioteca de peptídeo genômica descrita acima. Cada placa da biblioteca de peptídeo genômica foi avaliada em duplicata, para um total de 18 placas ELISPOT por varredura. Células T CD8+ foram preparadas de PBMC criopreservadas por seleção de CD8+ usando separação de conta magnética. Populações de célula resultantes continham □ 96% de células T
CD8+. Células T CD8+ (250.000 células/cavidade), DC autólogas (20.000 células/cavidade) e IL-2 (0,5 ng/ml) foram adicionadas a peptídeo (final 5 ug/ml, peptídeos individuais) em placas ELISPOT. Cinco cavidades de con’ trole médias são incluídas em cada placa. Para cada placa, a média dessas cinco cavidades foi subtraída de cada cavidade daquela placa para normali15 zar entre as placas. Cada replicação técnica em cada placa foi então scored. Uma cavidade foi marcada positiva se as unidades de formação de mancha (SFU), menos a média das cavidades médias, fosse maior do que ou igual a dez e a SFU fosse maior do que ou igual a duas vezes a média da média (Hudgens e outros, J. Immunol. Methods. 288:19-34, 2004). Este doador respondeu às quatro cavidades de peptídeo contendo EsxJ, EsxW, EsxK e EsxP. Células T CD8+ foram então avaliadas contra cada 15 mer desses grupos de peptídeo e verificadas responder a apenas EsxJ 21-35, a mesma região de EsxJ, EsxW, EsxK e EsXP que é descrita no exemplo 3 acima.
Sete doadores adicionais foram avaliados contra a biblioteca de peptídeo genômico. As 10 primeiras respostas são detalhadas na Tabela 7. Os quatro grupos de peptídeo destacados em amarelo contêm peptídeos de apenas um gene. Esses quatro genes contêm quatro nove epítopos.
Tabela Ί.
Principais Respostas de Varreduras de Grupo de Peptídeo de Sete Doadores. Unidades de Formação de Mancha são para 250.000 Células T CD8+
Pool de Peptídeo Doador SFU Média Números de Rv Representados em Cavidades Categoria Funcional
C09_1 D560 208,2 Rv1860(50): parede celular e processos celulares
C12_4 D545 156,4 Rv0468(27): Rv0456c(23): metabolismo de lipídeo
A04_3 D454 136 Rv0284(17): Rv0288(11): Rv0287(22) parede celular e processos celulares
B10_3 D560 112,3 Rv1273c(50): parede celular e processos celulares
E04_4 D560 78,2 Rv0152c(40): Rv0151c(10): PE/PPE
G12_8 D560 77,4 Rv3478(18): Rv3507(32): PE/PPE
E07_4 D525 76,8 Rv0159c(50): PE/PPE
A10_8 D560 70,4 Rv3136(47): Rv3144c(3): PE/PPE
E11_8 D560 66,4 Rv3350c(50): PE/PPE
E08_9 D545 60,2 Rv1404(13): Rv2711(37): proteínas reguladoras
Exemplo 6
Modelos animais
Em pesquisa de tuberculose, o modelo de camundongo foi usado extensivamente para modelo de vários aspectos da doença. Camundongos podem ser infectados por uma variedade de vias incluindo intravenosa, intraperitoneal e traqueal. Uma via é aerossolização do organismo para in10 fecção respiratória. Os camundongos são expostos ao aerossol em uma câmara (corpo inteiro enfraquecido ou infecção apenas no nariz). A dose da invenção pode ser variada manipulando a concentração de Mtb no nebulizador ou tempo de exposição. Uma infecção de dose baixa, tal como cerca de unidades de formação de colônia (UFC) através de aerossol resulta em um aumento lento e uniforme em números bacterianos nos pulmões, geralmente atingido um pico em quatro semanas, que coincide com o número de pico de células T nos pulmões. O período inicial é considerado o estágio a5 gudo de infecção. Seguindo infecção, há uma disseminação de bactérias para os nós linfáticos mediastinais. Inicialização de célula T é geralmente detectável entre duas e três semanas. Após cerca de quatro semanas os números bacterianos estabilizam, e há uma resposta patológica progressiva lenta. Este sistema é de uso para modelagem da infecção ativa.
A habilidade de uma composição de interesse em prevenir infecção em um modelo animal pode ser avaliada usando o método descrito aqui. A eficácia da composição de interesse pode ser monitorada através da medição da resposta de célula T, tal como o número de células T CD8+ ou CD4+ respondendo a um polipeptídeo de Mtb em uma amostra biológica.
Para esses ensaios células T com um são contatadas com pelo menos um polipeptídeo de Mycobacterium, e uma célula apresentando antígeno apresentando o um ou mais polipeptídeos de Mycobacterium. Os polipeptídeos de Mycobacterium incluem a seqüência de aminoácido mostrada como (a) uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID
NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID
NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:í1 ou SEQ ID NO:12; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de pelo menos uma das seqüências de aminoácido mostradas como SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6,
SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:7, SEQ ID N 0:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11 ou SEQ ID NO:12, onde os nove a vinte aminoácidos consecutivos especificamente se ligam a complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe I. É determinado se as células T reconhecem especificamente o polipeptídeo de Mycobacterium. Um aumento no número de células
T que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mtb indica que a composição é eficaz.
Modelos animais exemplares são descritos abaixo (vide também
Repique e outros, Infec. Immunol. 70:3318-3323, 2002, incorporado aqui a título de referência para um protocolo adicional).
A. Modelo de Camundongo de Curto Prazo:
Camundongos C57BL76 são vacinados com uma composição de acordo com 5 o protocolo apropriado e então descansados por 4 a 6 semanas. Camundongos imunizados são infectados com um aerossol de dose baixa (50-100
UFC) de M. tuberculosis virulento e proteção é avaliada estimando o número de bacilos viáveis 30 dias pós-provocação.
Contagens viáveis são realizadas no pulmão e baço de camun10 dongos através de homogeneização dos órgãos e plaqueamento de diluições de 10 vezes seriais em placas de ágar 7H11. As placas são incubadas por até 21 dias e o número de unidades de formação de colônia por órgão determinado.
Camundongos vacinados com BCG têm aproximadamente pro15 teção de 1 Log10 em seus pulmões e baços quando comparado com camundongos tratados com PBS.
Uma amostra biológica é obtida antes da administração da composição de interesse e após administração da composição de interesse. Alternativamente, amostras biológicas são obtidas de animais tratados com veículo e de animais tratados com a composição de interesse. Um aumento no número de células T que ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aqui descrito indica que a composição é eficaz.
B. Modelo de porguinho-da-índia de curto prazo
Porquinhos-da-índia Hartley exogâmicos são vacinados com uma composi25 ção incluindo um ou mais polipeptídeo de Mtb, ou um polinucleotídeo codificando esses um ou mais polipeptídeos e então descansados por 8 a 10 semanas. Porquinhos-da-índia imunizados são infectados com uma dose de aerossol baixa (10-30 UFC) de M. tuberculosis virulento e proteção é avaliada estimando o número de bacilos viáveis 30 dias pós-provocação.
Contagens viáveis são realizadas no pulmão e baço de porquinhos-da-índia através de homogeneização dos órgãos e plaqueamento de diluições 10 vezes seriais em placas de ágar 7H11. Placas são incubadas por até 21 dias e o número de unidades de formação de colônia por órgão determinado. Segmentos do pulmão e baço são também tomados para análises histológicas.
Porquinhos-da-índia vacinados com BCG têm proteção de apro5 ximadamente 2-3Log10 em seus pulmões e baço quando comparado com porquinhos-da-índia tratados com PBS. Ainda, porquinhos-da-índia vacinados com BCG têm granulomas bem definidos quando comparado com animais não-vacinados.
Uma amostra biológica é obtida antes da administração da com10 posição de interesse e após administração da composição de interesse. Alternativamente, amostras biológicas são obtidas de animais tratados com veículo e de animais tratados com a composição de interesse. Um aumento no número de células T que ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aqui descrito indica que a composição é eficaz.
C. Modelo de porguinho-da-índia de longo prazo
O modelo de porquinho-da-índia é similar ao modelo de camundongo, mas os experimentos são do tipo sobrevivência abertos e podem durar até 2 anos. Porquinhos-da-índia desenvolvem granulomas 'clássicos1 similares a humanos com tuberculose ativa (TB), e conforme necrose do teci20 do pulmonar progride, eles começam a perder peso e morrem de TB similar a humanos. O número de unidades de formação de colônia nos pulmões e baço pode ser avaliado. Exame histológico pode ser também realizado para determinar o grau de envolvimento do pulmão e destruição de tecido. Após exposição a aerossol de baixa dose no porquinho-da-índia o número de or25 ganismos aumenta progressivamente durante as três primeiras semanas e então atinge um platô em um estado crônico. Durante os últimos estágios de infecção há carga bacteriana aumentada no pulmão e isto está associado com uma piora da condição patológica. Sem tratamento, há um aumento concomitante em ambas células CD4 e CD8 nos pulmões de porquinhos-da30 índia infectados.
Porquinhos-da-índia Hartley exogâmicos são vacinados com a vacina do experimento de acordo com o protocolo apropriado e então des97 cansados por 8 a 10 semanas. Porquinhos-da-índia imunizados são então infectados com um aerossol de dose baixa (10-30 UFC) de M. tuberculosis virulento. Os porquinhos-da-índia são pesados semanalmente e monitorados diariamente quanto a sinais de doença (tal como respiração aumentada e falha em se desenvolver). Porquinhos-da-índia não-vacinados sucumbem à infecção de 20 a 25 semanas pós-provocação, enquanto porquinhos-daíndia vacinados com BCG sobrevivem por 50 a 55 semanas pós-provocação.
Na necropsia, o pulmão e baço são avaliados quanto ao número 10 de UFC e a extensão de patologia. A proteção relativa da composição experimental é comparada com animais vacinados com BCG.
Uma amostra biológica é obtida antes da administração da composição de interesse e após administração da composição de interesse. Alternativamente, amostras biológicas são obtidas de animais tratados com veículo e de animais tratados com a composição de interesse. Um aumento no número de células T que ligam um polipeptídeo de Mtb conforme aqui descrito indica que a composição é eficaz.
Será aparente que os detalhes precisos dos métodos ou composições descritos podem ser variados ou modificados sem se afastar do espí20 rito da invenção descrita. Todas tais modificações e variações que se encaixarem no escopo e espírito das reivindicações abaixo são reivindicadas.

Claims (2)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método in vitro para detecção de Mycobacteríum tuberculosis em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:
    contato de uma amostra biológica do indivíduo compreendendo células T com um ou mais polipeptídeos de Mycobacteríum, e uma célula apresentadora de antígeno apresentando o um ou mais polipeptídeos de Mycobacteríum em que o um ou mais polipeptídeos de Mycobacteríum compreendem (a) a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11; ou (b) pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11 em que os nove a vinte aminoácidos consecutivos especificamente se ligam ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I; e determinação de se as células T especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mycobacteríum, em que a presença de células T que especificamente reconhecem o polipeptídeo de Mycobacteríum detecta Mycobacteríum tuberculosís no indivíduo.
    2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de Mycobacteríum compreende
    a) a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 11.
    3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de Mycobacteríum consiste em
    b) pelo menos nove aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 11 que especificamente se ligam ao MHC de classe I.
    4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que as células T são células T CD8+.
    5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a determinação de se as células especificamente reconhecem o polipeptídio de Mycobacteríum é determinada medindo a secreção de uma citocina a partir das células T CD8+.
    6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a citocina é interferon (IFN)-g.
    11/10/2017, pág. 36/43
    7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a medição da secreção de IFN-g é determinada usando um anticorpo que se liga especificamente a IFN-g.
    8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-7, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é sangue, células mononucleares de sangue periférico isoladas, células mononucleares isoladas.
    9. Método de detecção de células T expressando CD8 que especificamente reconhecem SEQ ID NO: 11 em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende (A) contato de células mononucleares de sangue periférico isoladas do indivíduo com um reagente compreendendo (1) um polipeptídeo de Mycobacterium compreendendo pelo menos nove a vinte aminoácidos consecutivos de SEQ ID NO: 11, em que os nove a vinte aminoácidos consecutivos se ligam especificamente ao complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I;
  2. (2) polipeptídeo de cadeia pesada HLA e b2-microglobulina; e (3) estreptavidina, em que o reagente é marcado ou nãomarcado; e (B) detecção da presença do reagente ligado às células mononucleares de sangue periférico, deste modo detectando células T expressando CD8 que se ligam especificamente ao polipeptídeo de Mycobacterium.
    10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende ainda quantificação do número de células T CD8+ que se ligam ao reagente.
    11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o reagente é marcado.
    12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o marcador é um fluorocromo.
    11/10/2017, pág. 37/43
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