CN219201611U - 一种多靶标试纸条及多靶标检测卡 - Google Patents

Abstract

本申请提供了一种多靶标试纸条，在试纸条上，沿样品流动方向，依次形成有样本垫、结合垫、反应膜和吸收垫，结合垫包含不同颜色微球标记的抗体，其结合病原体对应的抗原，反应膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，检测线包含与不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体，其中检测线的数量为m，m为1‑3的整数，每条检测线包含的捕获抗体的种类为n，n为2‑6的整数，则所述试纸条可检测病原体的数量为m×n。本申请制备的多靶标试纸条，能够有效地联合检测病原体，并且可以实现通过目测或仪器将感染的病原体分型，一次加样可获得多项结果，具有操作简单，成本低、结果清晰明确的特点。

Description

一种多靶标试纸条及多靶标检测卡

技术领域

本申请属于病原体蛋白标志物检测领域，具体地，本申请涉及一种多靶标试纸条、多靶标检测卡及其制备方法。

背景技术

病原体(pathogen)是能引起疾病的微生物和寄生虫的统称。微生物占绝大多数，包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体和真菌；寄生虫主要有原虫和蠕虫。病原体属于寄生性生物，所寄生的自然宿主为动植物和人。能感染人的微生物超过400种，它们广泛存在于人的口、鼻、咽、消化道、泌尿生殖道以及皮肤中。

常见的病原体包括：呼吸道病原体、消化道病原体和其他传感染疾病病原体等。以呼吸道病原体为例，其引起的感染包括上呼吸道感染和下呼吸道感染。

急性上呼吸道感染简称上感，又称感冒，有70％～80％由病毒引起。包括鼻病毒、冠状病毒、腺病毒、流感和副流感病毒、呼吸道合胞病毒、埃可病毒、柯萨奇病毒等。另有20％～30％的上感由细菌引起。细菌感染可直接感染或继发于病毒感染之后，以溶血性链球菌为最常见，其次为流感嗜血杆菌、肺炎球菌、葡萄球菌等，偶或为革兰氏阴性细菌。该病四季、任何年龄均可发病，通过含有病毒的飞沫、雾滴，或经污染的用具进行传播。常于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病毒或/和细菌，迅速生长繁殖，导致感染。该病预后良好，有自限性，一般5～7天痊愈。常继发支气管炎、肺炎、副鼻窦炎，少数人可并发急性心肌炎、肾炎、风湿热等。目前急性上呼吸道感染检查方法有如下两类。

1血常规：病毒性感染时，白细胞计数多正常或偏低，淋巴细胞比例升高；细菌感染时，白细胞计数常增多，有中性粒细胞增多或核左移现象。

2病原学检查：一般可用免疫荧光法、酶联免疫吸附法、病毒分离鉴定、病毒血清学检查等确定病毒类型。细菌培养可判断细菌类型并做药物敏感试验以指导临床用药。

下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管-支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等。是由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物感染引起。下呼吸道感染在治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。临床上供选择的抗生素日益增多，耐药菌株亦明显增多，由于大剂量头孢菌素的应用，导致院内感染特别是假单孢铜绿杆菌和肠球菌感染日益增多。血清学和分子生物学研究的进展，使人们对支原体、衣原体感染或军团菌感染的认识有很大提高。氟喹诺酮类、大环内酯类等已引起人们重视。目前下呼吸道感染的检查有如下几类。

1血常规：病毒性感染时白细胞计数正常或偏低，淋巴细胞比例升高；细菌感染时白细胞总数和中性粒细胞比例增多，可出现核左移现象。

2病原学检查：必要时可用免疫荧光法、酶联免疫吸附检测法、血清学诊断法或病毒分离和鉴定方法确定病毒的类型，细菌培养和药物敏感试验有助于细菌感染的诊断和治疗。

3X射线：肺炎患者可以看到斑片状浸润影。

4体格检查：可听到呼吸干湿啰音，支气管扩张者闻及固定湿啰音。

实用新型内容

目前病原体检查的问题有：病原体种类繁多，不易同时实现多种检测；检测速度慢，细菌培养和药物敏感试验周期长，一般需要数天，容易延误病情；血常规检验属于间接检测，不是直接检测病原体等问题。目前，在临床检测领域有少数几种病原体联检试剂盒，但种类有限而且多为单指标简单组合。在使用时，也存在检测卡整体较大、需要多次加样等问题。

因此，迫切需要研发一种病原体多指标联合检测卡，具有能够快速、简便地进行联合检测，且成本低、检测准确度高、结果重复性好、操作和判读方式简单明了等特点，除可以在各大医院科室应用外，亦可以在基层社区医院甚至家庭应用。同时该技术平台亦可扩展应用于其他疾病。

基于现有技术的不足，本申请的目的在于提供一种多靶标试纸条或多靶标检测卡，本申请还提供了该试纸条或检测卡的制备方法。

具体来说，本申请涉及如下内容：

一种多靶标试纸条，其特征在于，在所述试纸条上，沿样品流动方向，依次形成有样本垫、结合垫、反应膜和吸收垫，

所述结合垫包含不同颜色微球标记的抗体，所述标记的抗体结合病原体对应的抗原，

所述反应膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包含与所述不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体，

其中所述检测线的数量为m，m为1-3的整数，

每条检测线包含的捕获抗体的种类为n，n为2-6的整数，

则所述试纸条可检测病原体的数量为m×n。

进一步的，与同一条检测线上的捕获抗体配对的抗体所结合的病原体为同一病原体的不同类型，或有相关性的不同病原体。

进一步的，所述多靶标试纸条上不同颜色微球标记的抗体均结合同一系统的病原体。

进一步的，所述多靶标试纸条上不同颜色微球标记的抗体之间无交叉反应。

进一步的，相邻两条检测线之间的距离为3mm-10mm，优选为4mm-6mm。

进一步的，相比灵敏度较低的捕获抗体所在的检测线，灵敏度较高的捕获抗体所在的检测线更靠近所述结合垫。

进一步的，用于标记与同一条检测线上的捕获抗体配对的抗体的微球的颜色易于区分，且不互相掩盖。

进一步的，所述结合垫上，每种不同颜色微球标记的抗体的含量为0.1-1μg/cm²，所述反应膜上，每种捕获抗体的含量为5-30μg/cm²。

进一步的，每条检测线包含2种捕获抗体，所述2种捕获抗体配对的微球标记的抗体的颜色选自以下任意一种组合：

红色和黄色、红色和绿色、红色和蓝色、红色和黑色、黄色和蓝色、黄色和紫色、黄色和黑色。

进一步的，所述病原体选自呼吸道病原体、消化道病原体、其他传感染疾病病原体中的一种，

优选地，所述呼吸道病原体选自以下的一种或两种以上：甲型流感、乙型流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒I/II/III型、鼻病毒、EB病毒、人偏肺病毒、博卡病毒、柯萨奇病毒A/B组、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、新型冠状病毒，

优选地，所述消化道病原体选自以下的一种或两种以上：轮状病毒、埃可病毒、诺如病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒，

优选地，所述其他传感染疾病病原体选自以下的一种或两种以上：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒。

本申请还提供一种多靶标试纸条的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

将不同颜色的微球分别与一种抗体通过化学交联结合，形成不同颜色微球标记的抗体；

将所述不同颜色微球标记的抗体混匀后在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到结合垫；

在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中检测线由与所述不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体形成；

将样本垫、所述结合垫、所述反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次粘贴在PVC胶板上，并裁切得到多靶标试纸条。

进一步的，在进行化学交联时，所述微球与所述抗体的质量比为1:0.025-0.2，优选为1:0.05-0.1。

进一步的，所述多靶标试纸条为以上任一项所述的多靶标试纸条。

本申请还提供一种多靶标检测卡，其特征在于，所述多靶标检测卡包括卡壳以及在所述卡壳内的以上任一项所述的多靶标试纸条。

进一步的，所述卡壳上设有视窗，通过所述视窗能够观察所述检测线和所述质控线。

与现有技术相比，本申请的多靶标试纸条和多靶标检测卡取得了如下技术效果：

1能够有效地联合检测病原体，并且可以实现通过目测或仪器将感染的病原体分型，一次加样可获得多项结果，操作简单，成本低、结果清晰。

2可以将多种指标合并至一条检测线上同时检测，提高了检测通量；且多种指标集中在同一张检测卡上判读，可以消除检测卡之间的背景差异。

本申请的多靶标试纸条和多靶标检测卡除可以在各大医院科室应用外，亦可以在基层社区医院甚至家庭应用。同时该技术可结合临床和其他实验室指标，推广至不同应用领域。

附图说明

图1本申请的多靶标试纸条的结构示意图。

图2本申请的多靶标检测卡的结构示意图。

附图标记

1样本垫，2结合垫，3反应膜，311第一检测线，312第二检测线，313第三检测线，32质控线，4吸收垫，5卡壳，6视窗。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。

除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。

本申请提供一种多靶标试纸条。试纸条的结构如图1所示，在本申请的多靶标试纸条上，沿样品流动方向，依次形成有样本垫1，结合垫2，反应膜3和吸收垫4。

所述样本垫1材质为玻璃纤维素膜，用于滴加检测样本。

所述结合垫2材质为玻璃纤维素膜。其中结合垫2包含不同颜色微球标记的抗体。微球的种类可以是本领域已知的适用于抗体标记的任何微球，例如可以为无修饰的、羧基修饰的或氨基修饰的各种材料的微球。

在一个具体的实施方式中，所述微球为市售的羧基乳胶微球。

微球的颜色可以为红色、黄色、绿色、蓝色、紫色、黑色等。

微球的粒径可以为100nm～1μm，例如100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1μm，优选为200nm-400nm，进一步优选为300nm。

在一个具体的实施方式中，所述微球为市售的羧基乳胶微球，粒径为200nm-400nm。

在同一条检测线上抗体标记所用的微球粒径差异不能过大，否则会导致层析速度差异过大，影响检测结果。

在一个具体的实施方式中，在同一条检测线上抗体标记所用的微球粒径差的绝对值<200nm。

在一个具体的实施方式中，在同一条检测线上抗体标记所用的微球粒径差的绝对值<100nm。

在一个具体的实施方式中，在同一条检测线上抗体标记所用的微球粒径相同。结合垫2上包含的抗体能够结合病原体对应的抗原，本领域技术人员知晓针对不同的病原体，哪些种类的抗体可以结合。所以抗体的具体种类可以根据试纸条所适用的病原体进行相应的设计。

所述反应膜3材质为硝酸纤维素膜。其中反应膜3上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线32。其中，所述检测线包含与所述不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体。检测线的数量可以为1-3之间的整数，例如可以为1条、2条或3条。其中，相比灵敏度较低的捕获抗体所在的检测线，灵敏度较高的捕获抗体所在的检测线更靠近所述结合垫2，即灵敏度越高则越靠近结合垫2，灵敏度越低则越靠近吸收垫4。相邻两条检测线之间的距离可以为3mm-10mm，可以等距或不等距。

所述多靶标试纸条上不配对的不同颜色微球标记的抗体之间无交叉反应，即不配对的不同颜色微球标记的抗体不会与相同的抗原表位结合，进而产生假阳性信号。

质控线32由包被含有羊抗鼠IgG多克隆抗体的溶液形成。

其中，同一条检测线上的捕获抗体配对的抗体所结合的病原体可以为同一病原体的不同类型，也可以为有相关性的不同病原体。例如，对应同一疾病不同分型的抗体可以是甲型流感病毒单克隆抗体和乙型流感病毒单克隆抗体，也可以是副流感病毒I型、II型、III型单克隆抗体；对应不同疾病但有一定相关性的抗体可以是腺病毒单克隆抗体、呼吸道合胞病毒单克隆抗体、鼻病毒单克隆抗体、EB病毒单克隆抗体、人偏肺病毒单克隆抗体等。

同一条检测线上的捕获抗体配对的微球标记的抗体的颜色易于区分，即同一条检测线上捕获抗体配对的抗体进行标记时所采用的微球的颜色易于区分，比如可以选择红色+蓝色的组合或红色+绿色的组合，不能选择红色+橙色的组合或蓝色+绿色的组合。此外，这些颜色不互相掩盖。

在一个具体的实施方式中，所述检测线包括第一检测线311、第二检测线312和第三检测线313。

在一个具体的实施方式中，每条检测线包含2种捕获抗体，所述2种捕获抗体配对的微球标记的抗体的颜色选自以下任意一种组合：

红色和黄色、红色和绿色、红色和蓝色、红色和黑色、黄色和蓝色、黄色和紫色、黄色和黑色。

结合垫2上每种不同颜色微球标记的抗体，反应膜3上每种捕获抗体的含量可以根据实际需要调整。

在一个具体的实施方式中，结合垫2上，每种不同颜色微球标记的抗体的含量为0.1-1μg/cm²。

在一个具体的实施方式中，反应膜3上，每种捕获抗体的含量为5-30μg/cm²。

本申请的多靶标试纸条可以检测的病原体选自呼吸道病原体、消化道病原体、其他传感染疾病病原体中的一种。每个多靶标试纸条优选检测同一系统的病原体，例如同一个试纸条可以同时检测呼吸道系统中的不同病原体。每个多靶标试纸条也可以检测不同系统的病原体，例如也可以同时检测呼吸道病原体和消化道病原体。

其中，所述呼吸道病原体选自以下的一种或两种以上：甲型流感、乙型流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒I/II/III型、鼻病毒、EB病毒、人偏肺病毒、博卡病毒、柯萨奇病毒A/B组、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、新型冠状病毒。

所述消化道病原体选自以下的一种或两种以上：轮状病毒、埃可病毒、诺如病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。

所述其他传感染疾病病原体选自以下的一种或两种以上：乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体、艾滋病毒。

本申请还提供包含一种多靶标检测卡，如图2所示，其包括卡壳5以及在所述卡壳5内的上述的多靶标试纸条。其中，卡壳5的具体结构可以根据实际不同的应用场景进行调整。

进一步地，所述卡壳5上还可以设有视窗6，通过所述视窗6能够观察所述检测线和所述质控线32。

本申请还提供了一种多靶标试纸条的制备方法，其包括：

将不同颜色的微球分别与一种抗体通过化学交联结合，形成不同颜色微球标记的抗体；

将所述不同颜色微球标记的抗体混匀后在玻璃纤维膜上喷涂、干燥得到结合垫；

在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜，其中检测线由与所述不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体形成；

将样本垫、所述结合垫、所述反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次粘贴在PVC胶板上，并裁切得到多靶标试纸条。

其中，在进行化学交联时，所述微球与所述抗体的质量比为1:0.025-0.2，优选为1:0.05-0.1。

将所述不同颜色微球标记的抗体混匀后在玻璃纤维膜上喷涂，包括将所不同颜色微球标记的抗体用重悬液复溶，复溶后所述每一种抗体的浓度为1-30μg/mL，优选为5-20μg/mL，最优选为10-15μg/mL。

在硝酸纤维素膜上制备检测线包括将含有与所述不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体的溶液在反应膜上喷涂，其中每种捕获抗体的浓度为0.5-2.0mg/mL，优选为0.8-1.8mg/mL，最优选为0.8-1.2mg/mL。

进一步地，该制备方法用于制备上述多靶标试纸条。

本申请还提供了一种多靶标检测卡的制备方法，其包括：将上述多靶标试纸条装入卡壳。

本申请的多靶标试纸条或多靶标检测卡可以利用下述步骤来进行检测：1)将一定量的检测样本滴加到试纸条的加样孔；2)一段时间后，肉眼或仪器进行判读，根据判读标准得到检测结果。一段时间例如可以为15-20min。检测样本的用量可以为80-120μL。

其中，判读标准为：

阴性：只在质控区出现一条混色条带，检测区无任何颜色条带出现；

阳性：在检测区出现1～3条有色的条带，质控区出现一条混色条带；

可疑；质控区和检测区有色条带不清楚，可再次进行检测；

无效：质控区和检测区均无有色条带出现，或只在检测区出现1～3条有色条带。

所述肉眼或仪器判读颜色可用于分型，具体标准为：

单一感染：1～3条检测线上各显现单一颜色，可通过具体颜色判断单一感染类型；混合感染：1～3条检测线上各显现混合后的颜色，可通过具体颜色判断混合感染类型。

其中，混色、混合色或混合后的颜色可以根据具体实验条件不同而有差异。如果两种颜色微球粒径不同，则层析速度会有明显差异，这样得到的混合色是上下分别为单色，中间是混合色；如果两种微球粒径相同，则层析速度接近，有可能会得到比较均匀的混合色。以红色+蓝色微球为例，如红色微球粒径为300nm，蓝色微球粒径为400nm则混合色是上(靠近吸收垫一侧)红-中间紫-下(靠近结合垫一侧)蓝；如两种微球粒径均为300nm，则混合色可能为全部紫色。

使用本申请的多靶标试纸条或多靶标检测卡检测时，需采集人体液，所述体液包括但不限于：咽喉分泌物、鼻腔分泌物、尿液、血液、唾液。所述人咽喉分泌物采集是将拭子适度用力擦拭双侧咽扁桃体及咽后壁来采集的，应避免触及舌部；所述人鼻腔分泌物采集是将拭子插入鼻孔分泌物较多处，轻轻转动并推动拭子，直至鼻甲(离鼻孔约2.0cm～5.0cm)受阻处，贴鼻壁旋转拭子三次来采集的。人咽喉分泌物或人鼻腔分泌物采样后，将采样后的拭子插入样本处理管的处理液(0.5～1mL)中，紧靠处理管内壁旋转约10次，挤压管壁5～10次，使样本尽可能溶解在溶液中，折断咽拭子尾部(留棉签头)，盖上处理管的盖子，轻轻摇匀管内溶液。向试剂盒的加样孔中滴加入100μL(约3滴)处理后的样本提取物后进行检测。

对于样本处理液，具体配制方法如下，用量筒量取700.0mL纯化水于容器中，再按照标准配方内容准确称取三羟甲基氨基甲烷6.06g于容器中，搅拌(稳定、匀速转动即可)使充分溶解后，缓慢加入适量浓盐酸，继续搅拌均匀，使用pH计测量液体的pH应为8.00～8.05。再依次准确称量氯化钠20g、BSA 20g、SDS 3mL、脱氧胆酸钠5g、PC300 0.3mL加入上述溶液中，继续搅拌溶解后加纯化水至总体积1000.0mL，使用pH计测量液体的pH，并调整至8.00～8.05，2～8℃保存备用。

本申请制备的检测卡和试剂盒能够有效地联合检测病原体，并且可以实现通过目测或仪器将感染的病原体分型，具有操作简单，成本低、结果清晰明确的特点，除可以在各大医院科室应用外，亦可以在基层社区医院甚至家庭应用。同时该技术可结合临床和其他实验室指标，推广至不同应用领域。

实施例

实施例1

在下述实施例中，除非另有说明，实施例中使用的物质均为市售的产品。

(1)鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体

在本实施例以及下述实施例中，使用了市售的抗体。其中本实施例中两种标记抗体可以是购买自菲鹏生物股份有限公司的鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体(货号FLUA-REAB-G1-006)和购买自菲鹏生物股份有限公司的鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体(货号FLUB-Ab1#)。两种包被抗体可以是购买自菲鹏生物股份有限公司的鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体(货号FLUA-REAB-G1-007)和购买自菲鹏生物股份有限公司的鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体(货号FLUB-REAB-G2-004)。

(2)不同颜色的乳胶微球

在本实施例以及下述实施例中，使用了市售的不同颜色的乳胶微球。其中本实施例中两种标记用的乳胶微球可以是购买自杭州博岳生物技术有限公司的蓝色乳胶微球(粒径为400nm，货号DB0400C)和购买自杭州博岳生物技术有限公司的红色乳胶微球(粒径为300nm，货号DR0300C)。

(3)乳胶微球标记抗体

a)分别用50mM MES将菲鹏FLUA-REAB-G1-006和FLUB-Ab1#抗体稀释至0.5mg/mL，各100μl，混匀。

b)各取25μl博岳蓝色微球DB0400C和博岳红色微球DR0300C，分别加入500μl 50mMMES混匀，低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，用500μl50mM MES重悬，超声分散。

c)现用现配10mg/mL EDC和10mg/mL NHS，分别向分散后的微球溶液中加入10μl10mg/mL EDC和10μl 10mg/mL NHS，混匀后避光反应30分钟。反应后低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，分别用400μl 50mM MES重悬，超声分散。

d)将分散后的微球溶液各加入100μl 0.5mg/mL FLUA-REAB-G1-006和FLUB-Ab1#抗体，混匀后避光反应2小时。反应后各加入50μl 10％酪蛋白封闭30分钟，再低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，各加500μl 50mM MES清洗一次，低温离心12000rpm 10分钟。去掉上清，各用500μl乳胶微球重悬液重悬，超声分散，2～8℃保存备用。

(4)乳胶结合垫的制备

将上述鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体-蓝色乳胶微球结合物以及鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体-红色乳胶微球结合物各取100μl，再加入乳胶微球重悬液800μl混匀，将混合后的溶液均匀喷涂于未处理的玻璃纤维垫上，喷涂量为0.033mL/cm²，喷涂完毕后置于干燥间干燥4小时以上，之后于室温干燥器内保存。

其中，乳胶微球重悬液的制备如下：

将MES 1g，牛血清白蛋白2g，聚乙二醇2000 1g，表面活性剂S9 0.25g，蔗糖10g，海藻糖1g，PC300 0.05mL，加纯化水700.0mL，搅拌使充分溶解后，加入1M NaOH适量，搅拌均匀，调节pH至6.95～7.05。充分搅拌溶解后定容至100mL。

(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜

取步骤(1)中的两种包被抗体等质量混合，用含有蔗糖和BSA的50mMPB稀释至总浓度为2mg/mL(其中鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体浓度分别为1mg/mL)，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％。将上述混合溶液喷涂到一条硝酸纤维素膜上，形成检测线311。

取羊抗鼠IgG多克隆抗体(来源于洛阳佰泰科生物技术有限公司)，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至1mg/mL，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％。将所得溶液按照喷涂量10.0μL/cm²喷涂到上述硝酸纤维素膜上，质控线32。将包被完毕检测线和质控线的反应膜放入干燥车间干燥72h。

(6)将未处理的样本垫11、上述乳胶微球结合垫、包被后的反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、乳胶结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切、装入卡壳，得到甲流乙流联合检测卡。

经计算，制备得到的甲流乙流联合检测卡上，乳胶结合垫上鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体的含量均为0.333μg/cm²，反应膜上鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体的含量均为10μg/cm²。

实施例2

(1)鼠抗甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒单克隆抗体

在本实施例以及下述实施例中，使用了市售的抗体。其中本实施例中几种标记和包被抗体购买公司和对应货号如表1所示。

表1

指标	标记抗体货号	包被抗体货号	厂家
				甲型流感病毒	FLUA-REAB-G1-006	FLUA-REAB-G1-006	菲鹏生物股份有限公司
乙型流感病毒	FLUB-Ab1#	FLUB-REAB-G2-004	菲鹏生物股份有限公司
				腺病毒	MI02401	MI02402	杭州隆基生物技术有限公司
呼吸道合胞病毒	A138-Ab1	A138-Ab2	奥创生物技术(山东)有限公司

(2)不同颜色的乳胶微球

在本实施例以及下述实施例中，使用了市售的不同颜色的乳胶微球。

a)分别用50mM MES将上述几种标记抗体稀释至0.5mg/mL，各100μl，混匀。

b)各取25μl上述不同颜色微球，分别加入500μl 50mM MES混匀，低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，用400μl 50mM MES重悬，超声分散。将分散后的微球与稀释后的抗体按照表2进行混合，避光反应15分钟。

表2

c)现用现配10mg/mL EDC，向上述溶液中各加入10μl 10mg/mL EDC，混匀后避光反应60分钟。反应后各加入50μl 10％酪蛋白封闭30分钟，再低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，各加500μl 50mM MES清洗2次，低温离心12000rpm 10分钟。去掉上清，各用500μl乳胶微球重悬液重悬，超声分散，2～8℃保存备用。

(4)乳胶结合垫的制备

将上述鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体-蓝色乳胶微球结合物、鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体-红色乳胶微球结合物、鼠抗腺病毒单克隆抗体-橙色乳胶微球结合物以及鼠抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体-深蓝色乳胶微球结合物各取50μl，再加入乳胶微球重悬液800μl混匀，将混合后的溶液均匀喷涂于未处理的玻璃纤维垫上，喷涂量为0.033mL/cm²，喷涂完毕后置于干燥间干燥4小时以上，之后于室温干燥器内保存。

其中，乳胶微球重悬液的制备同实施例1。

(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜

取步骤(1)中的鼠抗甲型流感病毒、鼠抗乙型流感病毒两种包被抗体等质量混合，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至总浓度为2mg/mL(其中鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体浓度分别为1mg/mL)，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％；鼠抗腺病毒、鼠抗呼吸道合胞病毒两种包被抗体等质量混合，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至总浓度为2mg/mL(其中鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体浓度分别为1mg/mL)，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％。将上述两种混合溶液分别喷涂到同一条硝酸纤维素膜上，形成检测线311和312。

取羊抗鼠IgG多克隆抗体(来源于洛阳佰泰科生物技术有限公司)，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至1mg/mL，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％。将所得溶液按照喷涂量10.0μL/cm²喷涂到上述硝酸纤维素膜上，质控线32。将包被完毕检测线和质控线的反应膜放入干燥车间干燥72h。

(6)将未处理的样本垫11、上述乳胶微球结合垫、包被后的反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、乳胶结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切、装入卡壳，得到甲流、乙流、腺病毒、呼吸道合胞病毒联合检测卡。

经计算，制备得到的甲流、乙流、腺病毒、呼吸道合胞病毒联合检测卡上，乳胶结合垫上每种标记抗体的含量均为0.1666μg/cm²，反应膜上每种包被抗体的含量均为10μg/cm²。

实施例3

(1)呼吸道病原体六项单克隆抗体

在本实施例以及下述实施例中，使用了市售的抗体。其中本实施例中几种标记和包被抗体购买公司和对应货号如表3所示。

表3

(2)不同颜色的乳胶微球

在本实施例以及下述实施例中，使用了市售的不同颜色的乳胶微球。

a)分别用50mM MES将上述几种标记抗体稀释至0.5mg/mL，各100μl，混匀。

b)如下表所列各取25μl不同颜色微球，分别加入500μl 50mM MES混匀，低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，用400μl 50mM MES重悬，超声分散。将分散后的微球与稀释后的抗体按照表4进行混合，避光反应15分钟。

表4

c)现用现配10mg/mL EDC，向上述溶液中各加入10μl 10mg/mL EDC，混匀后避光反应60分钟。反应后各加入50μl 10％酪蛋白封闭30分钟，再低温离心12000rpm 10分钟，去掉上清液，各加500μl 50mM MES清洗2次，低温离心12000rpm 10分钟。去掉上清，各用500μl乳胶微球重悬液重悬，超声分散，2～8℃保存备用。

(4)乳胶结合垫的制备

将上述鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体-蓝色乳胶微球结合物、鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体-红色乳胶微球结合物、鼠抗腺病毒单克隆抗体-橙色乳胶微球结合物、鼠抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体-深蓝色乳胶微球结合物、鼠抗副流感病毒1型单克隆抗体-红色乳胶微球结合物以及鼠抗副流感病毒2型单克隆抗体-蓝色乳胶微球结合物、各取50μl，再加入乳胶微球重悬液800μl混匀，将混合后的溶液均匀喷涂于未处理的玻璃纤维垫上，喷涂量为0.033mL/cm²，喷涂完毕后置于干燥间干燥4小时以上，之后于室温干燥器内保存。

其中，乳胶微球重悬液的制备同实施例1。

(5)在硝酸纤维素膜上制备检测线和质控线，得到反应膜

取步骤(1)中的鼠抗甲型流感病毒、鼠抗乙型流感病毒两种包被抗体等质量混合，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至总浓度为1.6mg/mL(其中鼠抗甲型流感病毒单克隆抗体和鼠抗乙型流感病毒单克隆抗体浓度分别为0.8mg/mL)，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％；鼠抗腺病毒、鼠抗呼吸道合胞病毒两种包被抗体等质量混合，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至总浓度为1.6mg/mL(其中鼠抗腺病毒单克隆抗体和鼠抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体浓度分别为0.8mg/mL)，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％；鼠抗副流感病毒1型、鼠抗副流感病毒2型两种包被抗体等质量混合，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至总浓度为1.6mg/mL(其中鼠抗副流感病毒1型单克隆抗体和鼠抗副流感病毒2型单克隆抗体浓度分别为0.8mg/mL)，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％。将上述三种混合溶液分别喷涂到同一条硝酸纤维素膜上，形成检测线311、312和313。

取羊抗鼠IgG多克隆抗体(来源于洛阳佰泰科生物技术有限公司)，用含有蔗糖和BSA的50mM PB稀释至1mg/mL，蔗糖终浓度为1％，BSA终浓度为0.1％。将所得溶液按照喷涂量10.0μL/cm²喷涂到上述硝酸纤维素膜上，质控线32。将包被完毕检测线和质控线的反应膜放入干燥车间干燥72h。

(6)将未处理的样本垫11、上述乳胶微球结合垫、包被后的反应膜、吸收垫粘贴在PVC胶板上，使样本垫、乳胶结合物垫、反应膜、吸收垫沿样品的流动方向依次排列，并裁切、装入卡壳，得到呼吸道病原体六项联合检测卡。

经计算，制备得到的呼吸道病原体六项联合检测卡上，乳胶结合垫上每种标记抗体的含量均为0.1666μg/cm²，反应膜上每种包被抗体的含量均为8μg/cm²。

上述3个实施例制备检测卡的具体的反应条件如表5所示。

表5不同实施例制备检测卡的反应条件

试验例1

将实施例1中制备的检测卡，用于甲型流感病毒和乙型流感病毒的定性检测。

具体的，将实施例1制备的检测卡，分别检测不同浓度的甲型流感病毒天然病毒提取物和乙型流感病毒天然病毒提取物。用样本处理液梯度稀释病毒提取物至1:100、1:200、1:500、1:1000，充分混匀后滴加3滴样本(约100μL)至检测卡的样品垫，加样15分钟后，进行结果判读。

其中，肉眼或仪器判读检测结果，标准如下：

阴性：只在质控区出现一条混色条带，检测区无任何颜色条带出现；

阳性：在检测区出现1条有色的条带，质控区出现一条混色条带；

可疑；质控区和检测区有色条带不清楚，可再次进行检测；

无效：质控区和检测区均无有色条带出现，或只在检测区出现1条有色条带。

肉眼或仪器分型具体标准为：

单一感染：1条检测线上各显现单一颜色，可通过具体颜色判断单一感染类型；

混合感染：1条检测线上各显现混合后的颜色，可通过具体颜色判断混合感染类型。

测试结果如表6所示。根据表6的检测结果，本联合检测卡对甲型流感病毒和乙型流感病毒的天然病毒提取物检测灵敏度可达1:1000以上，且显色情况与预期一致。

表6不同病毒提取物检测结果

其中，表6的混合色是指颜色呈上(靠近吸收垫一侧)红-中间紫-下(靠近结合垫一侧)蓝。

试验例2

将实施例2中制备的检测卡，用于甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒及呼吸道合胞病毒的定性检测。

具体的，将实施例2制备的检测卡，分别检测不同浓度的甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒的天然病毒提取物。用样本处理液梯度稀释病毒提取物至1:100、1:200、1:500、1:1000，充分混匀后滴加3滴样本(约100μL)至检测卡的样品垫，加样15分钟后，进行结果判读。

其中，肉眼或仪器判读检测结果，标准如下：

阴性：只在质控区出现一条混色条带，检测区无任何颜色条带出现；

阳性：在检测区出现1条有色的条带，质控区出现一条混色条带；

可疑；质控区和检测区有色条带不清楚，可再次进行检测；

无效：质控区和检测区均无有色条带出现，或只在检测区出现1条有色条带。

肉眼或仪器分型具体标准为：

单一感染：1条检测线上各显现单一颜色，可通过具体颜色判断单一感染类型；

混合感染：1条检测线上各显现混合后的颜色，可通过具体颜色判断混合感染类型。

测试结果如表7所示。根据表7的检测结果，本联合检测卡对甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒的天然病毒提取物检测灵敏度可达1:1000以上，对呼吸道合胞病毒的天然病毒提取物检测灵敏度可达1:500，且显色情况与预期一致。

表7不同病毒提取物检测结果

其中，表7中的混合色是指紫色。

试验例3

将实施例3中制备的联合检测卡，用于呼吸道病原体六项的定性检测。

具体的，将实施例3制备的检测卡，分别检测不同浓度的甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感1型和副流感2型的天然病毒提取物。用样本处理液梯度稀释病毒提取物至1:100、1:200、1:500、1:1000，充分混匀后滴加3滴样本(约100μL)至检测卡的样品垫，加样15分钟后，进行结果判读。

其中，肉眼或仪器判读检测结果，标准如下：

阴性：只在质控区出现一条混色条带，检测区无任何颜色条带出现；

阳性：在检测区出现1条有色的条带，质控区出现一条混色条带；

可疑；质控区和检测区有色条带不清楚，可再次进行检测；

无效：质控区和检测区均无有色条带出现，或只在检测区出现1条有色条带。

肉眼或仪器分型具体标准为：

单一感染：1条检测线上各显现单一颜色，可通过具体颜色判断单一感染类型；

混合感染：1条检测线上各显现混合后的颜色，可通过具体颜色判断混合感染类型。

测试结果如表8所示。根据表8的检测结果，本联合检测卡对甲型流感病毒、乙型流感病毒和腺病毒的天然病毒提取物检测灵敏度可达1:1000以上，对呼吸道合胞病毒、副流感病毒1型和副流感病毒2型的天然病毒提取物检测灵敏度可达1:500，且显色情况与预期一致。

表8不同病毒提取物检测结果

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其中，表8中的混合色是指紫色。

试验例4将实施例3中制备的联合检测卡，用于人咽喉分泌物中呼吸道病原体的定性检测。

具体的，将实施例3制备的联合检测卡，分别检测呼吸道感染患者的灭活后的咽喉分泌物和正常人的咽喉分泌物样本，其中，正常人10例，阳性患者10例，所有与样本均经过万孚生物和杭州创新公司的胶体金法试剂盒测试，具体如表9所示。

表9

指标	缩写	试剂盒厂家
			甲型流感病毒	FLUA	广州万孚生物技术股份有限公司
乙型流感病毒	FLUB	广州万孚生物技术股份有限公司
			腺病毒	ADV	杭州创新生物检控技术有限公司
呼吸道合胞病毒	RSV	杭州创新生物检控技术有限公司
			副流感病毒1型	PIV-1	杭州创新生物检控技术有限公司
副流感病毒2型	PIV-2	杭州创新生物检控技术有限公司

通过棉拭子采集咽喉部样本，将粘有样本的棉拭子加入含有0.5mL样本处理液的样本处理管中，充分混匀后滴加3滴样本(约100μL)至试纸条的样品垫，加样15分钟后，进行结果判读。

其中，肉眼或仪器判读检测结果，标准如下：

阴性：只在质控区出现一条混色条带，检测区无任何颜色条带出现；

阳性：在检测区出现1条有色的条带，质控区出现一条混色条带；

可疑；质控区和检测区有色条带不清楚，可再次进行检测；

无效：质控区和检测区均无有色条带出现，或只在检测区出现1条有色条带。

肉眼或仪器分型具体标准为：

单一感染：1条检测线上各显现单一颜色，可通过具体颜色判断单一感染类型；

混合感染：1条检测线上各显现混合后的颜色，可通过具体颜色判断混合感染类型。

测试结果如表10所示。根据表10的检测结果，本联合检测卡对不同呼吸道病原体检测结果与单指标对比试剂盒结果完全一致，且可以实现分型。

表10呼吸道疾病患者和正常人咽喉分泌物样本检测结果

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Claims (13)

1.一种多靶标试纸条，其特征在于，在所述试纸条上，沿样品流动方向，依次形成有样本垫、结合垫、反应膜和吸收垫，

所述结合垫包含不同颜色微球标记的抗体，所述标记的抗体结合病原体对应的抗原，

所述反应膜上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包含与所述不同颜色微球标记的抗体配对的捕获抗体，

其中所述检测线的数量为m，m为1-3的整数，

每条检测线包含的捕获抗体的种类为n，n为2-6的整数，

则所述试纸条可检测病原体的数量为m×n。

2.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，与同一条检测线上的捕获抗体配对的抗体所结合的病原体为同一病原体的不同类型，或有相关性的不同病原体。

3.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，相邻两条检测线之间的距离为3mm-10mm。

4.根据权利要求3所述的多靶标试纸条，其特征在于，相邻两条检测线之间的距离为4mm-6mm。

5.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，相比灵敏度较低的捕获抗体所在的检测线，灵敏度较高的捕获抗体所在的检测线更靠近所述结合垫。

6.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，用于标记与同一条检测线上的捕获抗体配对的抗体的微球的颜色易于区分，且不互相掩盖。

7.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，所述结合垫上，每种不同颜色微球标记的抗体的含量为0.1-1μg/cm²，所述反应膜上，每种捕获抗体的含量为5-30μg/cm²。

8.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，每条检测线包含2种捕获抗体，所述2种捕获抗体配对的微球标记的抗体的颜色选自以下任意一种组合：

红色和黄色、红色和绿色、红色和蓝色、红色和黑色、黄色和蓝色、黄色和紫色、黄色和黑色。

9.根据权利要求1所述的多靶标试纸条，其特征在于，所述病原体选自呼吸道病原体、消化道病原体、梅毒螺旋体、艾滋病毒中的一种。

10.根据权利要求9所述的多靶标试纸条，其特征在于，

所述呼吸道病原体选自以下的一种或两种以上：甲型流感、乙型流感、腺病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒I/II/III型、鼻病毒、EB病毒、人偏肺病毒、博卡病毒、柯萨奇病毒A/B组、肺炎支原体、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、嗜肺军团菌、新型冠状病毒。

11.根据权利要求9所述的多靶标试纸条，其特征在于，

所述消化道病原体选自以下的一种或两种以上：轮状病毒、埃可病毒、诺如病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒。

12.一种多靶标检测卡，其特征在于，所述多靶标检测卡包括卡壳以及在所述卡壳内的权利要求1-11中任一项所述的多靶标试纸条。

13.根据权利要求12所述的多靶标检测卡，其特征在于，所述卡壳上设有视窗，通过所述视窗能够观察所述检测线和所述质控线。

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