CN111351927A - 针对病原体抗原的抗体矩阵检测法(mega法)及多联检测卡 - Google Patents
针对病原体抗原的抗体矩阵检测法(mega法)及多联检测卡 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了针对病原体抗原的抗体矩阵检测法(MEGA法)及多联检测卡。本发明提供了一种检测或辅助检测被检样品针对病原体抗原的抗体多联检测卡,其由n个不同探测抗体的检测试纸条并联组成;每个所述检测试纸条延所述被检样品流动方向包括样品垫、喷有探测抗体的结合垫、含有m个检测线和质控线的NC膜和吸水纸;m大于等于1。本发明的MEGA法及其多联检测卡可同时检测受试者针对病原体的多种抗原产生的不同种类和亚类的抗体,所得数据能够更准确的反映受感染和保护的情况。MEGA法及其多联检测卡既可以用于血清检测,也可以用于其他体液特别是粘膜液体的无创检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种针对病原体抗原的抗体矩阵检测法(MEGA法)及多联检测卡。
背景技术
在传染病爆发的过程中,有效的快速检测对于患者的隔离,疾病的管控有极其重要的意义。在快速检测的各种手段中,基于免疫学原理的侧向层析技术是一种常用的方法。
在各种疾病中,呼吸道感染疾病是尤为重大的公共卫生问题。呼吸道感染主要由病毒,细菌,支原体,衣原体引起,侵染鼻腔,咽,喉等上呼吸道器官,以及气管,支气管,肺等下呼吸道器官。主要的病原体包括鼻病毒,冠状病毒,流感病毒,腺病毒,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌,肺炎衣原菌,肺炎分枝杆菌等。由于各种病原体在初期引起的症状相似,对于致病因素的区分十分必要,尤其在大流行传染病爆发的时候,迅速鉴别出致病病原体对于疾病和患者的相应管理有重要的意义。准确的快速检测在紧急情况发生时有极大的需求,而且世界各国都普遍存在短缺的现象,这一点在COVID-19流行的发生发展的过程中体现的尤为明显。
机体感染病原体后获得性免疫系统会产生相应的特异性抗体,其中IgM抗体在感染后最先产生,是初次感染的标志性抗体。随着感染的延长或者再次感染,抗体会发生类别转换,血液中IgG水平升高,粘膜免疫相关的IgA水平也会升高。检测血液和粘膜中的特异性IgG和IgA水平对于患者是否受到感染以及感染后是否产生了保护性抗体是非常重要的指示。另一个被相对忽视的抗体类别是IgE,它对病原体的清除和过敏反应的启动都具有功效。
免疫侧向层析试纸是现有最方便的快速检测技术之一。试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、吸水纸、塑料基底板等几部分组成(见图1),结合垫上含可以和靶标物质结合的探测抗原或探测抗体,NC膜上含能与靶标物质结合的抗体或抗原。显色反应有若干种,主要包括胶体金,荧光和量子点,其中,胶体金是一种人眼可见的显色方式,而荧光和量子点需要一定的光学装置。
为了区分鉴定何种病原体侵染宿主,可以将层析试纸分为两种。一种是直接法,即检测受试者是否携带该病原体。另一种是间接法,即检测受试者是否产生了针对该病原体的抗体,由此判断其感染史。直接法和间接法检测各有优势与劣势,直接法给出病原体存在的直接证明,但是该方法依赖于所取的病原体的浓度,如果取样部位不对,该处不存在病原体,或者虽然所取样品中有病原体,但是其浓度低于检测灵敏度,就会给出假阴性结果。间接法检测的是针对病原体的特异性抗体。受病原体感染后,绝大多数具有正常适应性免疫系统的人都会产生针对病原体抗原的特异性抗体,检测特异性抗体来反映感染情况以及受试者的免疫系统状态,和直接法相比检测敏感性高。间接法的不足之处是病原体感染后,要经过几天时间才产生特异性抗体,和直接法相比会有一定的滞后。由于抗体在病原体清除后仍然能够在一段时间内维持较高水平,间接法得到的阳性结果只能表明被检人被该病原体感染过,但是并不能表明检测时该病原体是否还存在于被检人体内。另外抗原也有可能被非特异性抗体吸附,造成假阳性情况,因此需在建立方法的时候排除产生假阳性的条件。
人的抗体根据重链Fc段的区别一共可以分为5种类别即IgM,IgD,IgA,IgE,IgG。IgA和IgG还有亚类,即IgA1,IgA2,IgG1,IgG2,IgG3,IgG4。检测血液和粘膜中的多种特异性抗体的水平可以总观受试者是否受到感染以及感染后是否产生了保护性抗体,对患者的病程进展可以提供重要信息。
目前市场上已经有一些使用间接法的快速检测层析试纸,但是这些试纸都是血清学检测,即通过取血来检测被检者是否有针对病原体某抗原的抗体,主要检测IgM与总IgG两种情形,生成单指标或双指标的数据。
发明内容
本发明一个目的是提供一种检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体抗原的抗体的多联检测卡。
本发明提供的多联检测卡,其由n个不同探测抗体的检测试纸条并联组成;
每个所述检测试纸条延所述被检样品流动方向包括样品垫、喷有探测抗体的结合垫、含有m个检测线和质控线的NC膜(硝酸纤维素膜)和吸水纸;m大于等于1;
每个所述检测试纸条的结合垫上的探测抗体为n种抗体中任一种,且不相同;所述n种抗体为如下任一种:能与所述病原体抗原反应的n种人免疫球蛋白或其亚类对应结合的抗体;n大于等于1;
每个所述检测试纸条中的m个检测线均由m个病原体抗原蛋白溶液依次包被形成;每个所述检测试纸条中m个病原体抗原的包被顺序相同;
每个所述检测试纸条中的质控线由结合每个试纸条中探测抗体的抗体溶液包被形成。
所述结合每个试纸条中探测抗体的抗体溶液相同或不同。
上述检测卡中,所述探测抗体为能与IgG、IgM、IgD、IgA、IgE或其亚类结合的抗体。
上述检测卡中,每个试纸条中所述喷有探测抗体的结合垫在所述结合垫上面喷有显色物标记的探测抗体溶液形成;
或,所述显色物标记探测抗体中的显色物为胶体金、荧光基团或量子点;
所述结合垫和样品垫可以为玻璃纤维或聚酯膜。
所述显色物标记的探测抗体溶液为用所述显色物标记所述探测抗体的溶液;
或,每个试纸条中所述含有m个检测线和质控线的NC膜为将所述m种病原体抗原蛋白溶液依次包被在NC膜上作为m条检测线,且将所述结合该试纸条中探测抗体的抗体溶液包被在所述NC膜上作为质控线。
上述检测卡中,所述显色物标记的探测抗体溶液的浓度为0.4%(质量百分含量);
所述m种病原体抗原蛋白溶液的包被浓度均为0.5-2mg/ml;
所述结合每个试纸条中探测抗体的抗体溶液的包被浓度均为0.5-2mg/ml;
上述检测卡中,所述病原体抗原在本发明的实施例中为新冠病毒COVID-19的N蛋白;
所述N蛋白为如下(1)或(2)或(3):
(1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)由序列表中序列1所示的氨基酸序列的末端添加标签序列组成的蛋白质;
(3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)或(2)衍生的蛋白质。
或,所述探测抗体在本发明的实施例中具体为如下3种抗体:抗IgG抗体、抗IgA抗体和抗IgM抗体;在本发明的实施例中,均为单克隆抗体。
本发明另一个目的是提供一种试剂盒。
本发明提供的试剂盒,为如下1)或2):
1)所述试剂盒包括上述检测卡和样品稀释液;
2)所述试剂盒包括上述检测卡、样品稀释液和记载如下方法的可读载体;
所述样品稀释液为含1M NaCl的磷酸盐缓冲液。
上述的检测卡在如下1)-6)任一种中应用也是本发明保护的范围:
1)检测或辅助检测针对病原体的抗体;
2)制备检测或辅助检测针对病原体的抗体产品;
3)检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体的抗体;
4)制备检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体的抗体产品;
5)检测或辅助检测被检者感染病原体的风险度;
6)制备检测或辅助检测被检者感染病原体的风险度产品;
或,上述检测卡在如下7)-12)任一种中应用:
7)检测或辅助检测针对新冠病毒COVID-19的抗体;
8)制备检测或辅助检测针对新冠病毒COVID-19的抗体产品;
9)检测或辅助检测被检样品中是否含有针对新冠病毒COVID-19的抗体;
10)制备检测或辅助检测被检样品中是否含有针对新冠病毒COVID-19的抗体产品;
11)检测或辅助检测被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度;
12)制备检测或辅助检测被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度产品。
上述应用中,所述被检样品来自于血清或粘膜组织体液;
或所述粘膜组织体液具体为痰液、唾液、鼻液、泪液、消化道液、咽拭子、鼻拭子和/或阴道拭子。
本发明还有一个目的是提供如下方法。
本发明提供了一种检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体抗原的抗体的方法,包括如下步骤:将被检样品分别加入上述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检样品中含有或候选含有针对病原体的抗体;所述阴性为被检样品中不含有或候选不含有针对病原体的抗体;
本发明还提供了一种检测或辅助检测被检者中感染病原体的风险度的方法,包括如下步骤:将来源于被检者的被检样品分别加入上述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检者感染病原体的风险度大;所述阴性为被检者感染病原体的风险度小;
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若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检样品中含有或候选含有针对新冠病毒COVID-19的抗体;所述阴性为被检样品中不含有或候选不含有针对新冠病毒COVID-19的抗体;
本发明还提供了一种检测或辅助检测被检者中感染新冠病毒COVID-19的风险度的方法,包括如下步骤:将来源于被检者的被检样品分别加入上述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度大;所述阴性为被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度小。
上述方法中,所述被测样品来自于血清或粘膜组织液;
或,所述粘膜组织液具体为痰液、唾液、鼻液、泪液、消化道液、咽拭子、鼻拭子和/或阴道拭子;
或在所述被检样品加入所述加样孔前,还包括用上述试剂盒中的稀释液稀释所述被检样品的步骤。
本发明使用侧向层析技术开发出针对病原体抗原的抗体快速检测矩阵法(以下简称‘MEGA法’)的多联检测卡。MEGA法及其多联检测卡可同时检测受试者针对病原体的多种抗原产生的不同种类和亚类的抗体,获得被检者针对该病原体抗原的各种类别或亚类的特异性抗体信息。MEGA法及其多联检测卡既可以用于血清检测,也可以用于其他体液特别是粘膜液体的无创检测。粘膜液体包括痰液、唾液、鼻液、泪液、消化道液、咽拭子、鼻拭子、阴道拭子等等,使用粘膜液体极大的降低了对检测条件的要求。特别是针对呼吸道感染病原体,可以直接检测粘膜组织液中的抗体分布,这对于受试者方便自行检测,减少因取血检测而带来的心理障碍和感染风险有重要的意义。
MEGA法的多联检测卡不仅具有层析试纸条的快速特点,由于它可以一次产生m xn个数据点,所生成的数据量要远远大于常规的单指标或双指标试纸条,这样就更系统的刻画了受试者各类抗原特异性抗体的水平,从而更准确的反映了机体免疫系统的状态。
同时检测多种类别和亚类抗体的另一个优点是减少假阳性现象。IgM不仅是获得性免疫系统遭遇抗原后最先产生的抗体,也是天然免疫系统产生的抗体。即使没有接触过某个病原体,机体产生的天然IgM抗体也可能识别该病原体,造成假阳性结果。MEGA法同时检测多种抗体,当一个检测样本中同时在几种抗体位置都出现条带,相比于单指标检测,所得结果假阳性特别是IgM假阳性的几率就大大减少了。
附图说明
图1为免疫侧向层析试纸示意图。
图2为MEGA法的多联检测卡的结构示意图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、针对病原体抗原的抗体快速检测矩阵法(MEGA法)及其专用多联检测卡的制备
一、多联检测卡的结构
针对病原体抗原的抗体快速检测矩阵法(MEGA法)的多联检测卡由n个不同探测抗体的检测试纸条并联组成(如图2所示);每个检测试纸条延被检样本(液体)流动方向依次包括样品垫(设有加样孔)、喷有探测抗体的结合垫、含有m(大于等于1)个检测线和质控线的NC膜和吸水纸;
多联检测卡中每个检测试纸条中的结合垫上的探测抗体选自n(血液检测n大于等于3,粘膜液体检测n大于等于1)种抗体中任一种,且不重复。
所述n种抗体为如下任一种:能与所述病原体抗原反应的n种人免疫球蛋白或其亚类对应结合的抗体;
上述探测抗体选自如下任一种:能与IgG、IgM、IgD、IgA、IgE或其亚类结合的抗体。IgA的亚类为IgA1和IgA2;IgG的亚类为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
每个检测试纸条中m条检测线均由m个病原体抗原依次包被形成;每个检测试纸条中m个病原体抗原的包被顺序相同;
每个检测试纸条中质控线由结合该试纸条中探测抗体的抗体包被形成;
结合垫为玻璃纤维或聚酯膜,喷有探测抗体的结合垫为在结合垫上面喷有显色物(胶体金、荧光微球、量子点)标记的探测抗体形成;
上述含有m个检测线和质控线的NC膜按照如下方法制备:将m个病原体抗原依次包被在NC膜上,作为m个检测线,且将结合探测抗体的抗体包被在同一NC膜上,作为质控线。
上述多联检测卡中同一抗原包被的检测线并联排列。
二、多联检测卡的制备
1、制备多个检测试纸条
1)、样品垫
将玻璃纤维或聚酯膜(可选用上海金标SB06、SB08、RB45、RB65、VL98中任意一种)用含1%(质量百分含量)酪蛋白钠(购买自sigma)和0.05%(质量百分含量)S17(购自武汉科茵世纪科技有限公司)的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)中浸泡60分钟,再放入37℃的温箱中过夜干燥,取出备用;
上述含1%酪蛋白钠和0.05%S17的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)配方:将酪蛋白钠和S17加入0.1M pH值7.5的磷酸盐缓冲液中,使酪蛋白钠的浓度为1%(质量百分含量),S17的浓度为0.05%(质量百分含量)。
上述0.1M pH7.5的磷酸盐缓冲液为将160ml 0.1M NaH2PO4水溶液(购买自国药集团)和840ml 0.1M Na2HPO4水溶液(购买自国药集团)混合,调节pH值为7.5。
2)、制备喷有探测抗体的结合垫
(1)、显色标志物标记探测抗体
显色标志物可以为胶体金,也可以为荧光微球或量子点;在本发明的实施例中采用的是胶体金;
探测抗体选自能与n种人免疫球蛋白结合的抗体;在本发明的实施例中具体为抗IgG抗体、抗IgM抗体和抗IgA抗体。
胶体金标记的探测抗体溶液按照如下方法制备:
胶体金的制备:称取双蒸水150g,倒入烧金用的瓶中,加入150μl 10%氯金酸水溶液(质量百分含量,购买自国药集团),加热至溶液沸腾。之后迅速向瓶中加入1%柠檬酸三钠水溶液(质量百分含量,购买自Sigma)2.3-2.9ml,溶液在沸腾过程中逐渐稳定为酒红色,继续加热15min,之后放置室温冷却;得到胶体金溶液,金含量为0.01%(质量百分含量),粒径为20-40nm。
胶体金标记探测抗体:将上述0.01%(质量百分含量)胶体金溶液100ml,用0.2MK2CO3(购买自国药集团)水溶液调节pH至7.5,分别加入1mg不同的探测抗体,磁力搅拌反应5分钟,加入2.5ml 10%BSA溶液(质量百分含量,购买自Sigma)封闭5-10分钟,离心去掉上清,沉淀用2.5ml含1%酪蛋白钠的0.02M(pH7.5)磷酸缓冲液重悬,得到不同的胶体金标记探测抗体溶液,浓度均为0.4%(质量百分含量)。
上述含1%酪蛋白钠的0.02M(pH 7.5)磷酸缓冲液为将16ml 0.02M NaH2PO4水溶液和84ml 0.02M Na2HPO4水溶液混合,调节pH值为7.5,加入酪蛋白钠使其浓度为1%(质量百分含量)。
(2)、喷有探测抗体的结合垫的制备
预处理:将玻璃纤维或聚酯膜(可选用上海金标RB45、RB65、VL98、DL42中任意一种)用含0.5%(体积百分含量)Tween20(购自Sigma)的0.1M pH7.5的磷酸盐缓冲液浸泡60分钟,放入37℃的温箱中过夜干燥,取出备用。
喷探测抗体到结合垫:用三维喷金划线仪(上海金标)将2.5ml上述1制备的某种胶体金标记探测抗体溶液喷在处理过的玻璃纤维或聚酯膜上,胶体金标记探测抗体的浓度均为0.4%(质量百分含量),放入37℃的温箱中过夜干燥,取出后备用。
按照上述方法制备n个(血液检测n大于等于3,粘膜液体检测n大于等于1)喷有不同探测抗体的结合垫。
3)、划有检测线和质控线的NC膜的制备
(1)、检测线
某种病原体抗原蛋白溶液为将该病原体抗原蛋白溶解在含2%蔗糖0.02M(pH7.5)的磷酸盐缓冲液中,得到该抗原蛋白溶液。
上述含2%蔗糖(购自国药集团)0.02M(pH7.5)的磷酸盐缓冲液为将16ml 0.02MNaH2PO4水溶液和84ml 0.02M Na2HPO4水溶液混合,调节pH值为7.5,得到0.02M(pH7.5)的磷酸盐缓冲液,再加入蔗糖使其的浓度为2%(质量百分含量)。
检测线(T):将m种病原体抗原蛋白溶液依次用三维喷金划线仪在NC膜上划出m条检测线(T1……Tm),m种病原体抗原蛋白溶液的包被浓度为0.5-2mg/ml。
各个检测线间隔4mm。
(2)、质控线
结合上述探测抗体的抗体作为质控线,在本发明的实施例中具体采用的是羊抗小鼠抗体(M8642,购自Sigma公司)。
羊抗小鼠抗体溶液的配制:将羊抗小鼠抗体溶解在含2%蔗糖0.02M(pH7.5)的磷酸盐缓冲液中,得到羊抗小鼠抗体溶液。
质控线(C):将羊抗小鼠抗体溶液用三维喷金划线仪在划有m条检测线的NC膜上划质控线,包被浓度为0.5-2mg/ml;
质控线(C)与最近的检测线(T)间隔4mm。
将上述含有m条检测线和质控线的NC膜放入37℃的温箱中过夜干燥,取出后备用,得到含有m条检测线和质控线的NC膜。
2、多联检测卡的组装
揭开PVC大板上的胶纸,将含有m条检测线和质控线的NC膜附在中间位置上,上端粘附吸水纸,吸水纸压NC膜重叠1-2mm,下端粘附喷有某种探测抗体的结合垫,结合垫压NC膜1-2mm,最下面粘附样品垫;组装好了后裁切成3-4mm细条,得到1种探测抗体检测试纸条;
按照上述方法制备n种不同探测抗体的试纸条;
将n种不同探测抗体的试纸条按照图2的方式并联装入卡盒中,得到多联检测卡。
卡盒设于试纸条外,具有多个检测窗和多个加样孔;每个加样孔位于每个试纸条的样品垫上方;每个检测窗用于观察该试纸条对应的C线和m条T线的显色情况。
上述多联检测卡中的各个并联的试纸条结合垫上的探测抗体各不相同,检测线并联位置包被的抗原一样(如同一抗原包被的检测线并联排列),质控线包被的抗体可以一样也可以不一样。组装完成后多联卡加入干燥剂密封4-25℃保存。
三、多联检测卡的检测方法
1、检测原理
本发明的检测原理:结合垫上喷有和不同类别的免疫球蛋白结合的胶体金标记抗体(也可以标记荧光微球或量子点)作为探测抗体;本发明使用的是多联卡,每一联为识别不同免疫球蛋白的探测抗体;NC膜上包被的是病原体的各种蛋白,每种蛋白包被一条线,最上端为与探测抗体结合的质控线。
检测时把待检样品溶液滴到点样孔上,样品溶液在毛细作用下延流动方向逐渐往上迁移,迁移过程中待检样品中的免疫球蛋白先与结合垫上相应的探测抗体结合,结合物再继续迁移到NC膜上,若所检样品中含有和病原体抗原结合的免疫球蛋白,则在迁移过程中,结合物停留在病原体蛋白的相应位置并在该位置显色,可判断该样品中含有病原体蛋白对应的抗体;若所检样品中不含与病原体抗原结合的免疫球蛋白,则结合物继续迁移到质控线相应位置显色;不管所检样品中是否含有病原体抗原蛋白结合的免疫球蛋白,结合物最终都会停留在质控线相应位置显色。
二、针对病原体抗原的抗体快速检测矩阵法(MEGA法)的多联检测卡的检测方法
1、待测样品处理
将待测样品用适当稀释液稀释,得到稀释样品;
上述稀释液为含1M NaCl的磷酸盐缓冲液,配方:将NaCl溶解在0.02M(pH7.0)的磷酸盐缓冲液中,使其浓度为1M。
2、加样
取出多联检测卡水平放置;将1制备好的稀释样品分别加入多联卡的各个加样孔中,每孔60-100微升;
3、观察
静置5-10分钟后观察各条带显色状况;
阳性结果:在质控线C和至少一个检测线T的位置显示肉眼可见线(荧光微球或量子点需用仪器探测)为阳性结果。
阴性结果:仅在质控线C位置上出现一条肉眼可见的线,其他检测线T位置上均无肉眼可见线显示。
无效结果:在试条卡的质控线C位置上未出现肉眼可见线,表示实验失败,需另取卡重新检测。
实施例2、检测新冠病毒COVID-19的多联检测卡的制备及应用
一、检测新冠病毒COVID-19的多联检测卡的制备
按照实施例1的二的方法制备:
1、检测试纸条的制备
1)、样品垫
与实施例1的二的方法相同,采用玻璃纤维;
2)制备喷有探测抗体的结合垫
(1)、胶体金标记探测抗体
探测抗体分别为IgG单克隆抗体(KT131,北京爱博生生物技术有限公司)、IgA单克隆抗体(KT13,北京爱博生生物技术有限公司)、IgM单克隆抗体(KT194,北京爱博生生物技术有限公司)。
胶体金标记探测抗体制备方法与实施例1的二的方法相同,采用玻璃纤维,得到喷有IgG探测抗体的结合垫、喷有IgA探测抗体的结合垫、喷有IgM探测抗体的结合垫。
3)、包被检测线和质控线的NC膜
(1)、检测线
选择新冠病毒COVID-19蛋白N作为抗原,该蛋白的氨基酸序列为序列1。
新冠病毒COVID-19蛋白N溶液为将新冠病毒COVID-19蛋白N溶解在含2%蔗糖的0.02M(pH值7.5)的磷酸盐缓冲液中,得到COVID-19抗原蛋白N溶液(浓度为0.8mg/ml)。
(2)、质控线
羊抗小鼠抗体溶液:羊抗小鼠抗体溶解在含2%蔗糖的0.02M(pH值7.5)的磷酸盐缓冲液中(浓度为1.5mg/ml)。
质控线(C):将羊抗小鼠抗体溶液用三维喷金划线仪依次在NC膜上划质控线,包被浓度为1.5mg/ml;
将上述包被有检测线和质控线的NC膜放入37℃的温箱中过夜干燥,取出后备用,得到包被检测线和质控线的NC膜。
2、多联检测卡的组装
与实施例1的二的方法相同;得到检测新冠病毒COVID-19的多联检测卡(1*3)。
二、多联检测卡的应用
1、待测样本处理
取50个COVID-19核酸检测单阳性或双阳性的新冠肺炎患者(结合临床确诊新冠肺炎)和14个COVID-19核酸与影像检测阴性的非新冠肺炎患者样本(结合临床检测非新冠肺炎)的咽拭子样本;
将咽拭子样本放置在400微升稀释液里得到稀释后样本。
上述稀释液为含1M NaCl的磷酸盐缓冲液,配方:将NaCl溶解在0.02M(pH7.0)的磷酸盐缓冲液中,使其浓度为1M。
磷酸盐缓冲液配方为将16ml 0.02M NaH2PO4水溶液和84ml 0.02M Na2HPO4水溶液混合,调节pH值为7.0。
2、加样
取出上述一制备的检测新冠病毒COVID-19的多联检测卡,水平放置;将1制备好的稀释样品分别加入多联卡的每个加样孔中,每孔60微升;
3、静置观察
静置5-10分钟后肉眼观察C线和T线出线情况。
阳性结果:在质控线C和至少一个检测线T的位置显示肉眼可见线为阳性结果;
阴性结果:仅在质控线C位置上出现一条肉眼可见的线,其他检测线T位置上均无肉眼可见线显示。
结果见表1,50个新冠肺炎确诊患者中的46个三条检测线均显示阳性,有四个轻症患者显示两条检测线阳性,一条检测线似有似无,难以确定是否阳性。相较之下,14个非新冠肺炎患者中的12人三条检测线均显示阴性,有两个人显示两条检测线阴性,一条IgM检测线似有似无,难以确定是否阳性。
表1.COVID-19的咽拭子检测结果
说明:+表示T线位置出现明显可见的线,-表示T线位置没有线,+/-表示T线位置显色线似有似无,难以判断。
SEQUENCE LISTING
<110> 陈韬
<120> 针对病原体抗原的抗体矩阵检测法(MEGA法)及多联检测卡
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<400> 1
Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg
20 25 30
Gly Ser Glu Phe Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala
35 40 45
Pro Arg Ile Thr Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln
50 55 60
Asn Gly Glu Arg Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly
65 70 75 80
Leu Pro Asn Asn Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly
85 90 95
Lys Glu Asp Leu Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr
100 105 110
Asn Ser Ser Pro Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg
115 120 125
Arg Ile Arg Gly Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp
130 135 140
Tyr Phe Tyr Tyr Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly
145 150 155 160
Ala Asn Lys Asp Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn
165 170 175
Thr Pro Lys Asp His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala
180 185 190
Ile Val Leu Gln Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr
195 200 205
Ala Glu Gly Ser Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser
210 215 220
Arg Ser Arg Asn Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly
225 230 235 240
Thr Ser Pro Ala Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala
245 250 255
Leu Leu Leu Leu Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly
260 265 270
Lys Gly Gln Gln Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala
275 280 285
Glu Ala Ser Lys Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr
290 295 300
Asn Val Thr Gln Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly
305 310 315 320
Asn Phe Gly Asp Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His
325 330 335
Trp Pro Gln Ile Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly
340 345 350
Met Ser Arg Ile Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr
355 360 365
Tyr Thr Gly Ala Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp
370 375 380
Gln Val Ile Leu Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro
385 390 395 400
Pro Thr Glu Pro Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln
405 410 415
Ala Leu Pro Gln Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro
420 425 430
Ala Ala Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser
435 440 445
Ser Ala Asp Ser Thr Gln Ala
450 455
Claims (10)
1.一种检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体抗原的抗体的多联检测卡,其由n个不同探测抗体的检测试纸条并联组成;
每个所述检测试纸条延所述被检样品流动方向包括样品垫、喷有探测抗体的结合垫、含有m个检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水纸;m大于等于1;
每个所述检测试纸条的结合垫上的探测抗体为n种抗体中任一种,且不相同;所述n种抗体为如下任一种:能与所述病原体抗原反应的n种人免疫球蛋白或其亚类对应结合的抗体;n大于等于1;
每个所述检测试纸条中的m个检测线均由m个病原体抗原蛋白溶液依次包被形成;每个所述检测试纸条中m个病原体抗原的包被顺序相同;
每个所述检测试纸条中的质控线由结合每个试纸条中探测抗体的抗体溶液包被形成。
2.根据权利要求1所述的多联检测卡,其特征在于:
所述探测抗体为能与IgG、IgM、IgD、IgA、IgE或其亚类结合的抗体。
3.根据权利要求1或2所述的多联检测卡,其特征在于:
每个试纸条中所述喷有探测抗体的结合垫在所述结合垫上面喷有显色物标记的探测抗体溶液形成;
或,所述显色物标记探测抗体中的显色物为胶体金、荧光基团或量子点;
或,每个试纸条中所述含有m个检测线和质控线的硝酸纤维素膜为将所述m种病原体抗原蛋白溶液依次包被在硝酸纤维素膜上作为m条检测线,且将所述结合该试纸条中探测抗体的抗体溶液包被在所述硝酸纤维素膜上作为质控线。
4.根据权利要求3所述的多联检测卡,其特征在于:
所述显色物标记的探测抗体溶液的浓度为0.4%;
所述m种病原体抗原蛋白溶液的包被浓度均为0.5-2mg/ml;
所述结合每个试纸条中探测抗体的抗体溶液的包被浓度均为0.5-2mg/ml;
5.根据权利要求1-4中任一所述的多联检测卡,其特征在于:
所述病原体抗原为新冠病毒COVID-19的N蛋白;
或,所述探测抗体为如下3种抗体:抗IgG抗体、抗IgA抗体和抗IgM抗体。
6.一种试剂盒,为如下1)或2):
1)所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述的检测卡和样品稀释液;
2)所述试剂盒包括权利要求1-5任一所述的检测卡、样品稀释液和记载如下权利要求9或10所述方法的可读载体;
所述样品稀释液为含1M NaCl的磷酸盐缓冲液。
7.权利要求1-4任一所述的检测卡在如下1)-6)任一种中应用:
1)检测或辅助检测针对病原体的抗体;
2)制备检测或辅助检测针对病原体的抗体产品;
3)检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体的抗体;
4)制备检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体的抗体产品;
5)检测或辅助检测被检者感染病原体的风险度;
6)制备检测或辅助检测被检者感染病原体的风险度产品;
或,权利要求5所述的检测卡在如下7)-12)任一种中应用:
7)检测或辅助检测针对新冠病毒COVID-19的抗体;
8)制备检测或辅助检测针对新冠病毒COVID-19的抗体产品;
9)检测或辅助检测被检样品中是否含有针对新冠病毒COVID-19的抗体;
10)制备检测或辅助检测被检样品中是否含有针对新冠病毒COVID-19的抗体产品;
11)检测或辅助检测被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度;
12)制备检测或辅助检测被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度产品。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述被检样品来自于血清或粘膜组织液;
或所述粘膜组织液具体为痰液、唾液、鼻液、泪液、消化道液、咽拭子、鼻拭子和/或阴道拭子。
9.一种检测或辅助检测被检样品中是否含有针对病原体抗原的抗体的方法,包括如下步骤:将被检样品分别加入权利要求1-4任一所述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检样品中含有或候选含有针对病原体的抗体;所述阴性为被检样品中不含有或候选不含有针对病原体的抗体;
或,一种检测或辅助检测被检者中感染病原体的风险度的方法,包括如下步骤:将来源于被检者的被检样品分别加入权利要求1-4任一所述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检者感染病原体的风险度大;所述阴性为被检者感染病原体的风险度小;
或,一种被检样品中是否含有针对新冠病毒COVID-19的抗体的方法,包括如下步骤:将被检样品分别加入权利要求5所述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检样品中含有或候选含有针对新冠病毒COVID-19的抗体;所述阴性为被检样品中不含有或候选不含有针对新冠病毒COVID-19的抗体;
或,一种检测或辅助检测被检者中感染新冠病毒COVID-19的风险度的方法,包括如下步骤:将来源于被检者的被检样品分别加入权利要求5所述的检测卡的多个加样孔中,静置,
若所述检测卡中质控线C和至少1条检测线T显示出线,则所述被检样品为阳性;
若所述检测卡中质控线C出线,但是检测线T不出线,则所述被检样品为阴性;
所述阳性为被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度大;所述阴性为被检者感染新冠病毒COVID-19的风险度小。
10.根据权利要求9所述的方法,其特征在于:
所述被检样品来自于血清或粘膜组织液;
或,所述粘膜组织液具体为痰液、唾液、鼻液、泪液、消化道液、咽拭子、鼻拭子和/或阴道拭子;
或在所述被检样品加入所述加样孔前,还包括用权利要求6所述试剂盒中的稀释液稀释所述被检样品的步骤。
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