CN113238048B - 一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用 - Google Patents
一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种诊断标志物及在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种上的应用。所述诊断标志物为新型冠状病毒N蛋白和/或NSP7蛋白,编码所述N蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO：1具有80％以上同源性的序列；编码所述NSP7蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO：2具有80％以上同源性的序列。基于本发明的诊断标志物应用间接法定量检测人血清中抗N蛋白和NSP7蛋白的IgG抗体的水平。通过基于本发明所建立的检测试剂盒，可作为区分新型冠状病毒感染和新型冠状病毒灭活疫苗接种的一种辅助手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用，尤其涉及N蛋白及其衍生物和/或NSP7蛋白及其衍生物在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种试剂盒中的应用。
背景技术
SARS-CoV-2为一种新型的β属冠状病毒新毒株(新冠病毒)，可跨越物种屏障感染人类，可通过密切接触、呼吸道飞沫、高浓度气溶胶传播，引起以肺部病变为主的传染病，也可诱发包括神经系统和消化系统在内的全身性损伤，严重者可导致死亡(Lancet.2020Feb15；395(10223):514-523)。
世界各地的人们都在拼命希望恢复正常的生活。为了实现这一目标，最好的，也许是唯一的办法是通过世界范围的疫苗接种获得群体免疫。我们正在见证人类历史上迄今为止针对一种新出现的病原体(SARS-CoV-2)的最快速的疫苗开发(Nat RevImmunol.2020Dec 18:1–10；Nat Rev Immunol.2020Oct；20(10):615-632)。根据COVID-19疫苗追踪网站(https://covid19.trackvaccines.org)，到2021年3月1日共有12种疫苗获准紧急使用，89种疫苗正在进行临床试验。这些疫苗可分为几种主要策略，包括RNA/DNA疫苗(N Engl J Med.2020Dec 31；383(27):2616-2627；Nat Commun.2020May20；11(1):2601)、亚单位疫苗(Cell.2020Aug 6；182(3):722-733.e11；N Engl J Med.2020Dec 10；383(24):2320-2332)和灭活病毒疫苗(Science.2020Jul3；369(6499):77-81；Cell.2020Aug 6；182(3):713-721.e9；JAMA.2020Sep8；324(10):951-960)。在这些疫苗中，灭活疫苗具有高效、安全、低成本、高可行性等优点，被认为是最有前途的选择之一。目前临床试验的SARS-CoV-2灭活病毒疫苗有9种，其中6种为Ⅲ期，即CoronaVac(Science.2020Jul3；369(6499):77-81)、武汉生物制品研究所灭活病毒疫苗(Lancet Infect Dis.2021Jan；21(1):39-51)、BBIBP-CorV(Cell.2020Aug 6；182(3):713-721.e9；Lancet InfectDis.2021Jan；21(1):39-51)。BBIBP CorV已经获得中国、巴林、埃及、伊拉克、约旦、巴基斯坦、塞舌尔和阿联酋等国家的批准。这些灭活的病毒疫苗可以在多种动物模型中引发深刻的抗体反应，包括非人灵长类动物(NHPs)和人类。然而，未观察到NHPs和人类中TH1或TH2细胞应答的特异性诱导(Nat Rev Immunol.2020Dec 18:1–10)。众所周知，有效抗体反应的刺激是良好灭活疫苗候选者的标志，也可能是灭活SARS-COV-2疫苗有效性的主要机制(Cell.2020Aug 6；182(3):713-721.e9)
在SARS-CoV-2感染人体过程中发挥重要作用且能激发人体免疫反应产生抗体的还有SARS-CoV-2表面的S蛋白。S蛋白即spike glycoprotein(刺突糖蛋白)，位于SARS-CoV-2最外层，研究发现其与人体ACE2(血管紧张素转化酶2)的结合是新冠病毒感染人体细胞的关键。S蛋白包含两个区域：S1和S2，其中S1主要包含受体结合域(receptor bindingdomain，RBD)，负责识别细胞的受体；S2参与病毒与细胞膜的融合(Science 2020Mar 13；367(6483):1260-1263)。总的来说，S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及诊断、疫苗研制的关键靶点，从血清学检测方面来看，针对S蛋白开发诊断试剂是一个最好的选择。
SARS-CoV-2的N蛋白，即nucleocapsid protein，是组成病毒的结构蛋白，它表达丰度较高，与病毒的RNA结合，在病毒的生命周期中发挥多种作用，包括复制，转录和基因组包装(EMBO Journal 2020Oct 15；39(20):e105938)。由于N蛋白也会引起感染者较强的免疫反应，因此在血清学检测方面，N蛋白是另一个较好的用于诊断试剂开发的靶点。
核酸检测是诊断SARS-CoV-2感染的“金标准”，然而，基于PCR方法的核酸检测在很大程度上依赖于病毒载量，低拷贝的病毒会产生假阴性结果。在低病毒载量情况下，血清学检测可以作为一种与核酸检测相结合、提高检测灵敏度和准确性的有益补充。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》将抗体检测结果纳入确诊病例的诊断标准以及疑似病例的排除标准。目前，S蛋白和N蛋白是SARS-CoV-2血清学诊断的主要抗原位点，并已有几十家公司的检测试剂盒上市。大部分是以S蛋白为检测靶点，如万泰生物、博奥赛斯的试剂盒，N蛋白为检测靶点的试剂盒有伯乐、罗氏的检测试剂盒，也有同时以S蛋白和N蛋白为靶点的，如Sugentech、TBG、Biocan等公司开发的检测试剂盒。
SARS-CoV-2的NSP7蛋白的主要功能是与NSP8蛋白和RdRp蛋白形成复合物，发挥引物酶的作用参与病毒复制的过程(Nature 2020May 21；584(7819):154-156)。在新型冠状病毒肺炎患者中，NSP7并没有引起太强的免疫反应，因此没有针对NSP7开发的诊断试剂盒(Nature Communications 2020Jul 14；11(1):3581)。
由于灭活病毒含有与活病毒相同的免疫原，理论上已有的新冠感染的血清学诊断试剂，例如针对S蛋白和N蛋白的试剂，恐怕将不能有效的区分新冠灭活疫苗的接种者与新冠肺炎感染者，因此在灭活疫苗大规模接种的大背景下，新冠感染的血清学诊断试剂及原有的标准将不再适用。为了解决行数问题，我们需要一种可靠、简单和成本效益高的替代诊断标志物，可同时在个体和群体层面区分新型冠状病毒感染和新冠病毒灭活疫苗的接种。
发明内容
在灭活疫苗大规模接种的大背景下，为了在个体和群体层面区分新型冠状病毒感染和新冠病毒灭活疫苗的接种，本发明提供一种诊断标志物及其在区分新型冠病毒感染和新型冠状病毒灭活疫苗接种的试剂盒中的应用，该诊断标志物为一种蛋白质N蛋白(SEQ IDNO:1)、NSP7蛋白(SEQ ID NO:2)或N蛋白(SEQ ID NO:1)和NSP7蛋白(SEQ ID NO:2)的组合，用其来定量检测人血液样本中抗该蛋白的IgG抗体的水平，作为在灭活疫苗大规模接种的背景下，区分感染和疫苗接种的一种手段，有望大大提高区分新型冠病毒感染和新型冠状病毒灭活疫苗接种的敏感性和特异性，并大大降低单份样本检测的成本。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
蛋白芯片作为一种系统性的分析工具，其高效的解析能力不容小觑。本发明尝试将SARS-CoV-2的21个蛋白进行了表达纯化，并将蛋白固定于芯片表面，接种灭活疫苗的健康人血清孵育，针对血清中的IgG进行免疫检测，并与接种灭活疫苗的健康人血清的新冠病毒中和效果对比，最终筛选出能够区分接种新冠灭活疫苗与新冠肺炎感染者的蛋白，以期得到有效的新型冠状病毒灭活疫苗接种标志物。
第一方面，本发明提供了一种诊断标志物在制备区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种的产品中的应用，其特征在于，所述诊断标志物为新型冠状病毒N蛋白和/或NSP7蛋白。
优选地，编码所述N蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO：1具有80％同源性的序列；
编码所述NSP7蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO：2具有80％以上同源性的序列。
更优选地，编码所述N蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO：1具有90％以上同源性的序列；最优选与SEQ ID NO：1具有95％以上同源性的序列。
编码所述NSP7蛋白的氨基酸序列为：SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO：2具有90％以上同源性的序列；最优选与SEQ ID NO：2具有95％以上同源性的序列。
本发明所述的N蛋白和NSP7蛋白的制备方法包括但不限于重组表达或其它方式，优选为为重组表达，可采用真核表达体系，原核表达体系以及无细胞表达体系。
本发明通过检测病人体液中的N蛋白或NSP7蛋白的抗体(包括IgM，IgG和IgA，优选IgG型抗体)，用于区分新型冠病毒感染和新型冠状病毒灭活疫苗接种。
所述检测的样本包括但不限于全血、血清、血浆、组织液、尿液以及肺泡灌洗液，优选为血清或血浆样本；
所述的接种新型冠状病毒灭活疫苗者为接种疫苗后的状态。
本发明所采用的抗体检测方法包括但不限于酶联免疫吸附检测(ELISA)、化学发光、电化学发光、液相芯片以及蛋白质芯片技术。根据不同检测方法，所呈现的具体数值或有较大差异，但不影响其变化趋势。
具体检测方法是以蛋白直接固定于固相载体(或微珠)，然后与待检测样本孵育，再用酶标或荧光标记的二抗检测。
第二方面，本发明提供了一种区分新型冠病毒感染和新型冠状病毒灭活疫苗接种的检测试剂盒，包括前述的诊断标志物。
优选地，所述试剂盒还包括标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
所述试剂盒中，诊断标志物抗原采用包被缓冲液稀释，所述包被缓冲液为0.05±0.005M、pH 9.6±0.05的碳酸盐缓冲液，即每1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93gNaHCO3；
所述封闭液为含3％牛血清白蛋白的0.01±0.005M、pH 7.4±0.05的磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即每1L中含有5g牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2g KCl。
优选地，所述酶底物溶液包括：显色剂A：500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含TMB 350mg，DMSO 20mL，柠檬酸·H2O5.1g。
优选地，所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释液为0.01M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)；
所述洗涤采用的洗涤液为含0.05％ Tween-20的、0.01±0.005M、pH 7.4±0.05磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，即每1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.5mL Tween-20；
所述终止液为2±0.1M H2SO4溶液；
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
优选地，所述试剂盒中采用的各试剂还包含防腐剂，以便于保存。
第三方面，本发明提供了一种定性检测人血清中抗N蛋白和/或NSP7蛋白的IgG抗体的方法，包括以下步骤：
A、将前述的诊断标志物N蛋白或NSP7蛋白通过通过稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；
B、将标准品与待测血清样品稀释后加入各自的抗原测定孔中，温育后，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成蛋白-抗体-酶标二抗复合物；
C、经步骤B处理后，彻底洗涤，加酶底物溶液显色，然后加入终止液终止反应，通过OD450值即得样品中抗蛋白N蛋白或NSP7蛋白的IgG抗体的水平。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明利用蛋白芯片高通量、快速分析的优势，发展了一套快速获取血清标志物的技术。通过对59份接种新型冠状病毒灭活疫苗者的血清，在短时间内比较了其血清IgG反应性的不同，并通过血清中和效果测定结果的比较，筛选出本发明的血清标志物—N蛋白和NSP7蛋白，该蛋白及其组合有望用于区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种。
2、本发明提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的可商品化试剂盒，定量测定人血液中抗N蛋白或NSP7蛋白的抗体水平，用于区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例1中发现阶段N蛋白的诊断能力分析图；其中图1a为疫苗组和感染组区分的ROC曲线图；图1b为疫苗组和健康组区分的ROC曲线图；图1c为散点图；
图2为本发明实施例1中发现阶段NSP7蛋白的诊断能力分析图；其中图2a为疫苗组和感染组区分的ROC曲线图；图2b为疫苗组和健康组区分的ROC曲线图；图2c为散点图；
图3为本发明实施例1中发现阶段N蛋白与NSP7蛋白组合的诊断能力分析图；其中图3a为ROC曲线图；图3b为散点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1采用蛋白芯片的形式对接种新型冠状病毒灭活疫苗者血清的检测
1、蛋白芯片的制备
1.1准备样品：SARS-CoV-2共21个蛋白，其中包括本发明中的N蛋白(编码其的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)和NSP7蛋白(编码其的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)，21个蛋白最终通过常规方法表达并纯化获得。
另外增加对照样品：BSA(牛血清白蛋白),IgG标准品,IgM标准品，Cy3荧光二抗，Cy5荧光二抗，PBS缓冲液。以上对照的设置用于确保后续实验流程的正确。例如BSA作为没有偶联蛋白的阴性对照，IgG标准品和IgM标准品用于作为芯片扫描时针对血清重IgG和IgM两个通道的参照标准，Cy3荧光二抗与Cy5荧光二抗用于提取数据时对整个阵列的定位，PBS缓冲液用于空白对照。
1.2点制芯片：将步骤1.1准备的各样品利用喷墨式点样仪ArrayJet Marathon进行点样，完成后置于4℃过夜固定，固定后放入-80℃储存。
1.3芯片质检：为了检测芯片的质量，即是否出现样品漏点，拖尾等芯片常见问题，我们针对偶联产物中的BSA进行了芯片的质检。首先，从-80℃中取出一片芯片移至4℃冰箱中复温1小时，再放置于室温复温1小时，芯片盒全程封闭。在无蛋白封闭液(QuickBlockTMWestern封闭液，购于上海碧云天生物技术有限公司)中封闭3小时，用1×PBST清洗干净后，使用兔抗BSA多抗(购于上海生工生物工程股份有限公司，取6μL按照1:5000的比例稀释于1×PBST中)于4℃孵育1小时，用1×PBST清洗干净后，利用Cy5荧光二抗进行孵育(按照1：5000的比例稀释于1×PBST中)，用1×PBST清洗干净并干燥后，按照扫描仪(Genepix 4200A)的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMTvalue 550；532nm，Power 100％，PMT value 550。
2、芯片与血清的孵育
2.1配制需要的试剂
封闭液：3g BSA，加入100mL 1x PBS溶液(由10x PBS稀释而成)，混匀。
孵育液：1x PBST溶液(0.1％ Tween20)。
清洗液：1x PBST。
10x PBS(1L)配方如下表1所示。
表1
2.2血清实验
a.封闭芯片：在可放置4张芯片的芯片盒中准备30mL封闭液(3％ BSA in PBSbuffer)。
将步骤1.2制备的芯片从-80℃取出至4℃和室温复温，芯片进入封闭液后，快速平行晃动芯片，并反转置于封闭液中,将封闭盒放置于侧摆摇床20-30rpm下，室温3h。倒弃封闭液，分别使用1×PBS,0.2×PBS(将1×PBS稀释5倍于ddH2O中)和ddH2O清洗1次，5min/次；然后离心干燥。安装围栏待用。
b.样本孵育：血清样本(新型冠状肺炎病毒灭活疫苗接种者59例vs健康人(52)和新型冠状肺炎康复者(52)共104例作为对照)从-80℃取出，置于冰上融解，待完全融解后，4℃离心(12000rpm)20min，取上清作为样本进行样本检测。用孵育液(1％ BSA in PBST)稀释样本(稀释比例为1：200)，并将稀释后的样本加入步骤a的芯片中(加入量为200μL体积)，然后置于湿盒中，侧摆摇床20-30rpm下，4℃过夜反应。
c.清洗：保持围栏安装在芯片上，用排枪吸出反应液，再逐一清洗各孔3次，每次300μL PBST(每张芯片耗时大约11min)。再用PBST冲洗一次，摘除围栏，置于加入有30mL清洗液的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。
d.荧光标记IgG/IgM二抗孵育：提前准备二抗稀释液(1：1000,1％ BSA in PBST)。
二抗稀释液体积根据芯片数而定。若一张芯片，可用芯片专用孵育盒，按照3mL体积配置；若3-4张，可放置清洗盒，准备15ml体积。将二抗稀释液加入步骤c清洗后的芯片中，侧摆摇床20-30rpm下，避光，室温孵育1h。
e.清洗：置于加入有30ml清洗液(PBST)的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。清洗时避光。
f.完成步骤e后用ddH2O清洗5min x 2次，并再冲洗10s。
g.干燥：将步骤f处理后的芯片置于芯片干燥机，离心干燥。
h.扫描：按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMT value 550；532nm，Power 100％，PMT value 550。i.数据提取：将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下
自动对齐按钮，提取数据并保存GPR文件。通过Excel、R语言对提取出的数据进行初步处理。
数据分析：将提取出的每个蛋白所对应不同样品的信号值进行归一化和取对数后，利用Graphpad prism 6.0得到ROC曲线图和散点图，根据ROC曲线中AUC(曲线下面积)和两组间差异显著分析进行诊断力的评定，获得了候选蛋白N蛋白(SEQ ID NO:1)和NSP7蛋白(SEQ ID NO:2)，发现阶段该候选蛋白的AUC达到了0.877和0.881且显著性P-value低于0.0001(如图1和图2所示)，将候选蛋白N蛋白(SEQ ID NO:1)和NSP7蛋白(SEQ ID NO:2)进行组合，发现阶段该候选蛋白的组合的信号与中和效果相关性达到了0.971且显著性P-value低于0.0001(如图3所示)，均较其它蛋白更加具备用于区分新型冠病毒感染和新型冠状病毒灭活疫苗接种的诊断标志物的潜能。同时，N蛋白和NSP7蛋白也能用于区分疫苗接种与健康人的区分，AUC分别达到了0.972和0.890。
基于前述实施例的结果，我们还通过具体的应用试验验证了其可行性。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海真测生物科技有限公司
<120> 一种诊断标志物及其在区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种中的应用
<130> DD14025
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 419
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr
1 5 10 15
Phe Gly Gly Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ser Asn Gln Asn Gly Glu Arg
20 25 30
Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn
35 40 45
Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu
50 55 60
Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro
65 70 75 80
Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly
85 90 95
Gly Asp Gly Lys Met Lys Asp Leu Ser Pro Arg Trp Tyr Phe Tyr Tyr
100 105 110
Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp
115 120 125
Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp
130 135 140
His Ile Gly Thr Arg Asn Pro Ala Asn Asn Ala Ala Ile Val Leu Gln
145 150 155 160
Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser
165 170 175
Arg Gly Gly Ser Gln Ala Ser Ser Arg Ser Ser Ser Arg Ser Arg Asn
180 185 190
Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala
195 200 205
Arg Met Ala Gly Asn Gly Gly Asp Ala Ala Leu Ala Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Asp Arg Leu Asn Gln Leu Glu Ser Lys Met Ser Gly Lys Gly Gln Gln
225 230 235 240
Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys
245 250 255
Lys Pro Arg Gln Lys Arg Thr Ala Thr Lys Ala Tyr Asn Val Thr Gln
260 265 270
Ala Phe Gly Arg Arg Gly Pro Glu Gln Thr Gln Gly Asn Phe Gly Asp
275 280 285
Gln Glu Leu Ile Arg Gln Gly Thr Asp Tyr Lys His Trp Pro Gln Ile
290 295 300
Ala Gln Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Phe Phe Gly Met Ser Arg Ile
305 310 315 320
Gly Met Glu Val Thr Pro Ser Gly Thr Trp Leu Thr Tyr Thr Gly Ala
325 330 335
Ile Lys Leu Asp Asp Lys Asp Pro Asn Phe Lys Asp Gln Val Ile Leu
340 345 350
Leu Asn Lys His Ile Asp Ala Tyr Lys Thr Phe Pro Pro Thr Glu Pro
355 360 365
Lys Lys Asp Lys Lys Lys Lys Ala Asp Glu Thr Gln Ala Leu Pro Gln
370 375 380
Arg Gln Lys Lys Gln Gln Thr Val Thr Leu Leu Pro Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Asp Asp Phe Ser Lys Gln Leu Gln Gln Ser Met Ser Ser Ala Asp Ser
405 410 415
Thr Gln Ala
<210> 2
<211> 83
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ser Lys Met Ser Asp Val Lys Cys Thr Ser Val Val Leu Leu Ser Val
1 5 10 15
Leu Gln Gln Leu Arg Val Glu Ser Ser Ser Lys Leu Trp Ala Gln Cys
20 25 30
Val Gln Leu His Asn Asp Ile Leu Leu Ala Lys Asp Thr Thr Glu Ala
35 40 45
Phe Glu Lys Met Val Ser Leu Leu Ser Val Leu Leu Ser Met Gln Gly
50 55 60
Ala Val Asp Ile Asn Lys Leu Cys Glu Glu Met Leu Asp Asn Arg Ala
65 70 75 80
Thr Leu Gln
Claims (5)
1.N蛋白和/或 NSP7蛋白在制备区分新冠病毒感染和新冠病毒灭活疫苗接种的产品中的应用，编码所述N蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，编码所述NSP7蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品还包括标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，
所述产品中，诊断标志物抗原采用包被缓冲液稀释，所述包被缓冲液为每1 L 溶液中含1.59 g Na2CO3，2.93 g NaHCO3的的碳酸盐缓冲液；
所述封闭液为每1 L中含有5 g牛血清白蛋白，8 g NaCl，0.2 g KH2PO4，2.9 gNa2HPO4·12H2O，0.2 g KCl的磷酸盐-NaCl缓冲液溶液。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述酶底物溶液包括显色剂A和显色剂B；所述显色剂A包括：500 mL溶液中含醋酸钠13.6 g，柠檬酸1.6 g，30%双氧水0.3 mL；所述显色剂B包括：500 mL溶液中含TMB 350 mg，DMSO 20 mL，柠檬酸·H2O 5.1 g。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释液为0.01 M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液；
洗涤采用的洗涤液为每1升溶液中含8 g NaCl，0.2 g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4·12H2O，0.2 g KCl，0.5 mL Tween-20的磷酸盐-NaCl缓冲液；
所述终止液为2 ± 0.1 M H2SO4溶液；
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
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