CN111999508A - 一种诊断标志物及其在covid-19诊断及冠状病毒既往感染检测中的应用 - Google Patents

一种诊断标志物及其在covid-19诊断及冠状病毒既往感染检测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种诊断标志物及在COVID‑19诊断及冠状病毒既往感染检测中的应用。所述诊断标志物包括肽段COVID19‑V001，所述肽段COVID19‑V001的氨基酸序列为：包含FKEELDKYFKNH中5个及5个以上连续氨基酸的序列；或所述肽段COVID19‑V001的氨基酸序列为：包含FKEELDKYFKNH中1个到几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列。基于本发明的诊断标志物应用间接法定性检测人血清中抗肽段的IgG抗体的水平。通过基于本发明所建立的检测试剂盒，可作为新型冠状病毒肺炎(COVID‑19)诊断的一种辅助手段。

Description

一种诊断标志物及其在COVID-19诊断及冠状病毒既往感染检 测中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种诊断标志物及其在COVID-19诊断及冠状病毒既往感染检测中的应用，尤其涉及一种肽段COVID19-V001及其衍生物在诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)试剂盒中的应用。
背景技术
SARS-CoV-2为一种新型的β属冠状病毒新毒株，可跨越物种屏障感染人类，可通过密切接触、呼吸道飞沫、高浓度气溶胶传播，引起以肺部病变为主的传染病，也可诱发包括神经系统和消化系统在内的全身性损伤，严重者可导致死亡(Lancet.2020Feb15；395(10223):514-523)。基于目前尚无针对SARS-CoV-2的有效药物，以及疫苗尚处于临床验证阶段的现状，准确的早期诊断、及时的隔离治疗是控制疫情的关键。
截至2020年3月27日，国家药监局已经应急批准了23个新型冠状病毒检测产品(其中新冠病毒核酸检测试剂15个，抗体检测试剂8个)以满足疫情防控用检测试剂的需求(http://www.nmpa.gov.cn/)。“呼吸道标本或血液标本实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性或病毒基因测序与已知的新型冠状病毒高度同源”是新型冠状病毒肺炎(COVID-19)诊断的金标准(http://www.nhc.gov.cn/wjw/)。核酸检测虽然具备灵敏度高，特异性强的优势，但结果易受取样部位，样本质量，实验操作的限制而导致与COVID-19影像学表现不一致亦或“假阴性”，不仅如此，核酸检测对实验环境及操作人员的要求较高，耗时较长，检测人员感染风险高。
作为免疫系统抵抗病毒的重要效应分子，血液中的特异性抗体成为诊断病毒感染的另一依据。国家卫生健康委员会在2020年3月3日发布的《新型冠状病毒诊疗方案(试行第七版)》中，正式在原有核酸检测和测序基础上增加“血清学检测”作为依据，即“新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性”或“新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高”也可确诊(http://www.nhc.gov.cn/wjw/)。新冠病毒抗体检测试剂盒主要包括IgG抗体和IgM抗体检测。通常情况下，免疫系统产生IgM抗体较早，感染后一周内出现，通常预示急性感染，可利用该抗体检测阳性作为早期感染的指标；IgG则产生较晚，但维持时间相对更长，可利用该抗体检测阳性作为感染和既往感染的依据(Clinicaland Vaccine Immunology,2004,11(4):665-668)。通过胶体金免疫层析法或磁微粒化学发光法找到疑似患者血清样本中的特异性抵抗病毒的抗体，从而协助判断患者的感染情况，此即为新冠病毒抗体检测试剂盒的原理。抗体检测只需采取患者极少量血样，且对实验环境及检测人员要求没有核酸检测苛刻，操作简易且时间短，在提高检测效率的同时也能很大程度地降低检测人员的感染风险，与核酸检测优势互补，可降低“假阴性”率，是一种高效有保障的辅助诊断手段，更为后续基层检测、居家检测提供一种方便可靠的筛查手段。
抗体检测的准确性取决于抗原位点的选取，由于β属冠状病毒的核衣壳(nucleocapsid，N)蛋白相对较保守，具备较强的抗原性，能够诱导宿主免疫产生高丰度的抗体，通常被选做冠状病毒诊断的抗原位点(Clin Chem 2003Dec；49(12):1989-96；JMicrobiol Biotechnol.2008Oct；18(10):1717-21)，但有研究发现，在一些肺癌患者和健康人群中也能检测到针对N蛋白的抗体(www.amplion.com)，因此N蛋白并不是最理想的检测新型冠状病毒的抗原位点。在发病机制中发挥重要作用且能激发人体免疫反应产生抗体的还有SARS-CoV-2表面的S蛋白。S蛋白即spike glycoprotein(刺突糖蛋白)，位于SARS-CoV-2最外层，研究发现其与人体ACE2(血管紧张素转化酶2)的结合是新冠病毒感染人体细胞的关键。S蛋白包含两个区域：S1和S2，其中S1主要包含受体结合域(receptor bindingdomain，RBD)，负责识别细胞的受体；S2参与病毒与细胞膜的融合(Science 2020Mar 13；367(6483):1260-1263)。总的来说，S蛋白承担病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合功能，是宿主中和抗体的重要作用位点以及诊断、疫苗研制的关键靶点，且相较于N蛋白来说具有更高的特异性。因此，从血清学检测方面来看，针对S蛋白开发诊断试剂是一个最好的选择。
然而，在制备S蛋白或S1-RBD等关键结合域时，蛋白以正确的结构表达通常是最困难的一步，且病毒蛋白往往具有多个糖基化位点，更增加了蛋白表达、纯化的难度(Lancet2020Apr 4；395(10230):1101-1102)。因此制备成本高昂且不易稳定保存。
若能够找到不需要考虑蛋白结构的肽来代替完整的蛋白，那么将大大简化免疫检测的关键材料的准备，并且有可能在不降低灵敏度的情况下提高特异性，因此，寻找关键组成抗原位点的肽段成为了实现这一设想的突破口。决定抗原特异性的特殊性结构的化学基团成为抗原决定簇，又称表位(Immunology 2014Aug；142(4):526-35)。表位是被免疫细胞识别的靶结构，也是免疫反应具有特异性的基础，也就是说，抗体的特异性是针对抗原表位而不是整个抗原分子。解析出血清中IgM、IgG识别的抗原表位，不仅有助于揭示COVID-19康复者体内免疫反应，推进疫苗研发，还可作为肽生物标志物，相较于重组抗原蛋白可更加特异地诊断SARS-CoV-2，也解决了制备过程中蛋白难以表达，纯化的问题，而且制备成本可减低1-2个数量级。
发明内容
针对现存的技术问题以及更准确的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎诊断标志物发现的需要，本发明提供一种诊断标志物及其在COVID-19诊断及冠状病毒既往感染检测中的应用，为一种肽COVID19-V001(肽序列为FKEELDKYFKNH)在诊断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎的试剂盒中的应用，来定性检测人血液样本中抗该肽的IgG抗体的水平，作为辅助新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎诊断的一种手段，有望大大提高新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎诊断的敏感性和特异性，并大大降低单份样本检测的成本。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
肽芯片作为一种系统性的分析工具，其高效的解析能力不容小觑。本发明尝试将SARS-CoV-2的S蛋白的S1和S2部分(总长为1273个氨基酸，参考序列NCBI GenBank:MN908947.3)切割成～200条小肽并进行了化学合成，在每条小肽的N端添加半胱氨酸，偶联至牛血清白蛋白(BSA)表面，将偶联产物固定于芯片表面，分别与康复者血清及健康人血清孵育，针对血清中的IgG进行免疫检测，最终筛选出能够区分且区分能力高于全长S蛋白的小肽，以期得到有效的新型冠状病毒肺炎肽诊断标志物。
第一方面，本发明提供了一种COVID-19的诊断标志物，所述诊断标志物包括肽段COVID19-V001，所述肽段COVID19-V001的氨基酸序列为：包含FKEELDKYFKNH中5个及5个以上连续氨基酸的序列；或
所述肽段COVID19-V001的氨基酸序列为：包含FKEELDKYFKNH中1个到几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列。
优选地，所述肽段的氨基酸序列为FKEELDKYFKNH，或包含氨基酸序列FKEELDKYFKNH中1个或几个氨基酸的缺失或突变所形成的序列。
更优选地，所述肽段COVID19-V001的氨基酸序列为FKEELDKYFKNH或FKEELDAYFKNH。
本发明所述的肽段COVID19-V001的制备方法包括但不限于化学合成、重组表达或其它方式，优选为化学合成。
本发明通过检测病人体液中的肽段COVID19-V001的抗体(包括IgM，IgG和IgA，优选IgG型抗体)，用于诊断是否为COVID-19患者或/和SARS-CoV-2病毒的既往感染。
所述检测的样本包括但不限于全血、血清、血浆、组织液、尿液以及肺泡灌洗液，优选为血清或血浆样本；
所述的COVID-19患者为由于SARS-CoV-2病毒感染导致的发病状态；
所述的SARS-CoV-2病毒的既往感染为感染SARS-CoV-2病毒后康复而当前无显著疾病症状或/和无症状的既往感染者。既往感染者表示以前感染过，但是身体内发生了比较好的免疫清除，自身产生了保护性的抗体。但不排除其体内仍有残留病毒被激活后，也具备传染的可能性。
已经感染过新冠病毒、但因无症状或症状轻微没有被发现的人可通过检测新冠病毒抗体查出，一是与核酸检测互补验证提高诊断效果，二是在疫苗研发过程中，抗体检测可帮助研究人员了解哪些人感染了、哪些人感染又康复了等。
本发明所采用的抗体检测方法包括但不限于酶联免疫吸附检测(ELISA)、化学发光、电化学发光、液相芯片以及蛋白质芯片技术。根据不同检测方法，所呈现的具体数值或有较大差异，但不影响其变化趋势。
具体检测方法可以是以肽段直接固定于固相载体(或微珠)，然后与待检测样本孵育，再用酶标或荧光标记的二抗检测；
或者是以肽段偶联到蛋白(如BSA,KLH等)载体(或微珠)上，然后与待检测样本孵育，再用酶标或荧光标记的二抗检测。
第二方面，本发明提供了一种诊断COVID-19的诊断试剂盒，包括前述的诊断标志物。
优选地，所述诊断标志物通过环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)与BSA偶联，形成SMCC-BSA-诊断标志物偶联产物。
优选地，所述试剂盒还包括标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
优选地，所述标准品包括抗诊断标志物(肽段COVID19-V001)的IgG抗体的浓度为0U/mL的标准血清1和抗诊断标志物(肽段COVID19-V001)的IgG抗体的浓度为100U/mL的标准血清2；所述标准血清1为正常人血清，标准血清2为COVID19-V001抗体为阳性的血清；
所述肽段COVID19-V001抗原采用包被缓冲液稀释，所述包被缓冲液为0.05±0.005M、pH 9.6±0.05的碳酸盐缓冲液，即每1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3；
所述封闭液为含3％牛血清白蛋白的0.01±0.005M、pH 7.4±0.05的磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即每1L中含有5g牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2g KCl。
优选地，所述酶底物溶液包括：显色剂A：500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含TMB 350mg，DMSO 20mL，柠檬酸·H2O5.1g。
优选地，所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释液为0.01M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)；
所述洗涤采用的洗涤液为含0.05％Tween-20的、0.01±0.005M、pH 7.4±0.05磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，即每1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.5mL Tween-20；
所述终止液为2±0.1M H2SO4溶液；
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
优选地，所述试剂盒中采用的各试剂还包含防腐剂，以便于保存。
第三方面，本发明提供了一种检测SARS-CoV-2病毒既往感染的检测试剂盒，包括前述的诊断标志物。
优选地，所述诊断标志物通过环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)与BSA偶联，形成SMCC-BSA-诊断标志物偶联产物。
优选地，所述试剂盒还包括标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
优选地，所述标准品包括抗诊断标志物(肽段COVID19-V001)的IgG抗体的浓度为0U/mL的标准血清1和抗诊断标志物(肽段COVID19-V001)的IgG抗体的浓度为100U/mL的标准血清2；所述标准血清1为正常人血清，标准血清2为COVID19-V001抗体为阳性的血清；
所述肽段COVID19-V001抗原采用包被缓冲液稀释，所述包被缓冲液为0.05±0.005M、pH 9.6±0.05的碳酸盐缓冲液，即每1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3；
所述封闭液为含3％牛血清白蛋白的0.01±0.005M、pH 7.4±0.05的磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即每1L中含有5g牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2g KCl。
优选地，所述酶底物溶液包括：显色剂A：500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含TMB 350mg，DMSO 20mL，柠檬酸·H2O5.1g。
优选地，所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释液为0.01M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)；
所述洗涤采用的洗涤液为含0.05％Tween-20的、0.01±0.005M、pH 7.4±0.05磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，即每1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl，0.5mL Tween-20；
所述终止液为2±0.1M H2SO4溶液；
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
优选地，所述试剂盒中采用的各试剂还包含防腐剂，以便于保存。
第四方面，本发明提供了一种定性检测人血清中抗肽段COVID19-V001的IgG抗体的方法，包括以下步骤：
A、将前述的诊断标志物肽段COVID19-V001通过SMCC与BSA偶联；
B、将偶联后的肽段通过稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；
C、将标准品与待测血清样品稀释后加入各自的抗原测定孔中，温育后，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成COVID19-V001-抗体-酶标二抗复合物；
D、经步骤C处理后，彻底洗涤，加酶底物溶液显色，然后加入终止液终止反应，通过OD450值即得样品中抗肽COVID19-V001的IgG抗体的水平。
优选地，步骤A中，所述肽COVID19-V001通过SMCC与BSA偶联的步骤具体包括：
A1、将环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)加入含BSA的缓冲液PBS中，混匀，25℃反应1h，得BSA-SMCC溶液；
A2、向肽COVID19-V001溶液中加入BSA-SMCC溶液，混匀后静置于25℃下4至6小时，即得偶联产物BSA-SMCC-肽COVID19-V001。
更优选地，步骤A1中，所述SMCC与BSA的质量比为1:5；
所述BSA-SMCC溶液的浓度为4mg/mL。
现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明利用肽芯片高通量、快速分析的优势，发展了一套快速获取疾病血清标志物的技术。通过对55份新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎康复者血清，18份健康人血清进行分析，在短时间内比较了康复者和健康人血清IgG反应性的不同，筛选出本发明的血清标志物—肽段COVID19-V001，该肽段有望用于辅助特异性诊断新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肺炎。
2、本发明提供的生物标志物，其特异性为100％，灵敏度为100％。
3、本发明提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的可商品化试剂盒，定性测定人血液中抗肽段COVID19-V001的抗体水平，用于特异性诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)或检测SARS-CoV-2病毒的既往感染。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明实施例1中S蛋白肽芯片质检图；
图2为本发明实施例1中发现阶段肽的诊断能力分析图；其中图2a为ROC曲线图；图2b为散点图；
图3为本发明实施例1中验证阶段肽的诊断能力分析图；其中图3a为ROC曲线图；图3b为散点图；
图4为本发明实施例2中发现阶段肽的诊断能力分析图；其中图4a为ROC曲线图；图4b为散点图；
图5为本发明实施例2中验证阶段肽的诊断能力分析图；其中图5a为ROC曲线图；图5b为散点图；
图6为本发明实施例3中对肽进行点突变分析图；其中图6a为芯片质检图；图6b为血清与芯片反应后的扫描图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1采用小肽芯片的形式对COVID-19康复患者血清的检测
1、肽的加工和偶联
1.1准备样品：根据每条肽长度为12aa，每两条肽之间有6aa的重叠长度的条件特定截取，S蛋白共220条肽。其中S1区域包含118条肽，S2区域包括102条肽，其中包括本发明中肽段FKEELDKYFKNH，最终由吉尔生化(上海)有限公司合成并纯化，在纯化后的各肽的N端加上Cys偶联至BSA上，共偶联成功197条(偶联产物)。
具体偶联步骤如下：
①取10mg BSA溶于1mL PBS Buffer中，浓度为10mg/mL。
②取10μL SMCC(称取1mg SMCC溶于10μL DMSO)溶于BSA溶液中，于25℃放置1h。
③将激活好的BSA-SMCC溶液转移至透析袋中，在4℃用1×PBS Buffer透析过夜。期间换两次Buffer。
④将透析好后的BSA-SMCC溶液浓度稀释到4mg/mL。
⑤取合成好的肽各1mg于Eppendorf管中。
⑥加入10μL DMSO将肽溶解，加入200μL 1×PBS重悬，并调整其pH值在7-7.5范围内。
⑦向肽中加入200μL激活好的BSA-SMCC溶液。放置于25℃反应4-6h。
⑧将偶联产物溶于ddH20中，利用含10％甘油和0.01％SDS的PBS将其定容为0.9mg/mL,0.3mg/mL,0.1mg/mL三个浓度以确定筛选过程中最佳的反应浓度(防止信号过高等情况影响最终统计)。
另外增加对照样品：S1区域,S2区域,S-RBD区域，对应地，每个对照准备3个浓度梯度；以及其它对照样品：BSA(牛血清白蛋白),IgG标准品,IgM标准品，Cy3荧光二抗，Cy5荧光二抗，PBS缓冲液。以上对照的设置用于确保后续实验流程的正确。例如S1区域等用来证明既往感染者的血清重含有针对S蛋白的抗体，BSA作为没有偶联肽的阴性对照，IgG标准品和IgM标准品用于作为芯片扫描时针对血清重IgG和IgM两个通道的参照标准，Cy3与Cy5荧光二抗用于提取数据时对整个阵列的定位。
1.2点制芯片：将步骤1.1准备的各样品利用喷墨式点样仪ArrayJet Marathon进行点样，完成后置于4℃过夜固定，固定后放入-80℃储存。
1.3芯片质检：为了检测芯片的质量，即是否出现样品漏点，拖尾等芯片常见问题，我们针对偶联产物中的BSA进行了芯片的质检。首先，从-80℃中取出一片芯片移至4℃冰箱中复温1小时，再放置于室温复温1小时，芯片盒全程封闭。在无蛋白封闭液(QuickBlockTMWestern封闭液，购于上海碧云天生物技术有限公司)中封闭3小时，用1×PBST清洗干净后，使用兔抗BSA多抗(购于上海生工生物工程股份有限公司，取6μL按照1:5000的比例稀释于1×PBST中)于4℃孵育1小时，用1×PBST清洗干净后，利用Cy5荧光二抗进行孵育(按照1：5000的比例稀释于1×PBST中)，用1×PBST清洗干净并干燥后，按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMT value 550；532nm，Power 100％，PMT value 550。扫描结果如图1，共9条偶联产物未检测到信号，原因可能是合成以及纯化后样品的纯度过低以及溶解时出现不易溶现象，其余偶联产物(包括候选肽COVID19-V001在内)及对照显示信号均无异常。该结果说明芯片点制的过程中给没有出现漏点，拖尾等现象，芯片的质量足够保证后续筛选的正常进行。
2、芯片与血清的孵育
2.1配制需要的试剂
封闭液：3g BSA，加入100mL 1x PBS溶液(由10x PBS稀释而成)，混匀。
孵育液：1x PBST溶液(0.1％Tween20)。
清洗液：1x PBST。
10x PBS(1L)配方如下表1所示。
表1
Figure BDA0002700993900000091
2.2血清实验
a.封闭芯片：在可放置4张芯片的芯片盒中准备30mL封闭液(3％BSA in PBSbuffer)。
将步骤1.2制备的芯片从-80℃取出至4℃和室温复温，芯片进入封闭液后，快速平行晃动芯片，并反转置于封闭液中,将封闭盒放置于侧摆摇床20-30rpm下，室温3h。倒弃封闭液，分别使用1×PBS,0.2×PBS(将1×PBS稀释5倍于ddH2O中)和ddH2O清洗1次，5min/次；然后离心干燥。安装围栏待用。
b.样本孵育：血清样本(其中既往感染者27例vs健康人9例)从-80℃取出，置于冰上融解，待完全融解后，4℃离心(12000rpm)20min，取上清作为样本进行样本检测。用孵育液(1％BSA in PBST)稀释样本(稀释比例为1：200)，并将稀释后的样本加入步骤a的芯片中(加入量为200μL体积)，然后置于湿盒中，侧摆摇床20-30rpm下，4℃过夜反应。
c.清洗：保持围栏安装在芯片上，用排枪吸出反应液，再逐一清洗各孔3次，每次300μL PBST(每张芯片耗时大约11min)。再用PBST冲洗一次，摘除围栏，置于加入有30mL清洗液的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。
d.荧光标记IgG/IgM二抗孵育：提前准备二抗稀释液(1：1000,1％BSA in PBST)。二抗稀释液体积根据芯片数而定。若一张芯片，可用芯片专用孵育盒，按照3mL体积配置；若3-4张，可放置清洗盒，准备15ml体积。将二抗稀释液加入步骤c清洗后的芯片中，侧摆摇床20-30rpm下，避光，室温孵育1h。
e.清洗：置于加入有30ml清洗液(PBST)的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。清洗时避光。
f.完成步骤e后用ddH2O清洗5min x 2次，并再冲洗10s。
g.干燥：将步骤f处理后的芯片置于芯片干燥机，离心干燥。
h.扫描：按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMT value 550；532nm，Power 100％，PMT value 550。
i.数据提取：将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存GPR文件。通过Excel、R语言对提取出的数据进行初步处理。
j.数据分析：将提取出的每条肽所对应不同样品的信号值进行归一化和取对数后，利用Graphpad prism 6.0得到ROC曲线图和散点图，根据ROC曲线中AUC(曲线下面积)和两组间差异显著分析进行诊断力的评定，由此获得了候选肽COVID19-V001(氨基酸序列为：FKEELDKYFKNH)，在发现阶段该候选肽AUC达到1且区分既往感染者与健康对照的P-value低于0.0001，较其他肽更加具备作为诊断标志物的潜能。
2.3ELISA验证候选肽
a.对芯片实验分析后的候选肽进行独立样本的验证(其中既往感染者28例vs健康人9例)，候选肽COVID19-V001(氨基酸序列为：FKEELDKYFKNH)由吉尔生化(上海)有限公司合成并纯化，在N端加上Cys偶联至BSA上，获得偶联产物。
各种缓冲液及试剂的配制方法：
样品稀释液：pH 7.4PBS溶液，组成如下表2所示。
表2
Figure BDA0002700993900000111
洗涤液：pH 7.4的PBST溶液，组成如下表3所示。
表3
Figure BDA0002700993900000112
封闭液：3％BSA的pH 7.4PBS溶液，组成如下表4所示。
表4
Figure BDA0002700993900000113
Figure BDA0002700993900000121
酶底物溶液：显色剂A和显色剂B(现配现用)，组成如下表5和6所示。
表5
Figure BDA0002700993900000122
表6
Figure BDA0002700993900000123
终止液：2mol/L H2SO4溶液(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀)，组成如下表7所示。
表7
Figure BDA0002700993900000124
b.包被：将步骤a获得的偶联产物用PBS稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，37℃包被2小时或4℃过夜；洗涤液洗板1次，甩干。
c.封闭：在步骤b处理后的96孔酶标板中加入封闭液200μL，室温保温2小时；然后用洗涤液洗板1次，甩干。
d.与血清孵育：将标准品(抗肽COVID19-V001的IgG抗体的浓度为0U/mL标准血清1和抗肽COVID19-V001的IgG抗体的浓度为100U/mL标准血清2；所述标准血清1为正常人血清，标准血清2为COVID19-V001抗体为阳性的血清)与待测血清样品以1:100的比例用样品缓冲液稀释至100μL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，加样时将稀释后的待测血清样品加于步骤c处理后的96孔酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板上加盖或覆膜。然后将酶标板置于37℃反应60分钟，甩净孔中液体，洗涤6次。
e.加酶：在步骤d处理后的酶标板的每孔中加含辣根过氧化物酶标记的anti-HumanIgG抗体的酶标试剂100μL，37℃，60分钟，形成肽段-抗体-酶标二抗复合物。甩净孔中液体，同上洗板6次拍干。
f.显色：步骤e拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL,再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
g.终止：依序在显色后的每孔中加终止液100μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
h.结果判定:
1).用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
单位值(U/mL)＝(A450<待测血清样品>-A450<标准血清1>)/(A450<标准血清2>-A450<标准血清1>)×100
*A450是450nm处吸光度的缩写。
*目前肽等抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。
2).血清中抗肽COVID19-V001值的判定
单位值≥100U/mL：可初步诊断该病人为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者
单位值＜100U/mL：不能诊断该病人为新型冠状病毒)肺炎(COVID-19)患者
3).质量控制
每个检测结果必须符合以下标准：
标准血清1的A450：≤0.100
标准血清2的A450：≥0.700
如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。
i.检验结果的解释
本实施例通过对18例健康人血清、55例COVID-19康复者血清的ROC分析确立了以上参考值。
特异性和灵敏度检测：采用55份COVID-19康复者血清与18份对照血清(健康人血清)对本发明的诊断试剂盒(肽COVID19-V001(氨基酸序列为：FKEELDKYFKNH)作为诊断标志物)进行了特异性和敏感性检测。检测吸光值OD450后利用Graphpad prism 6.0得到ROC曲线和散点图(结果如图2、3所示，图2为采用肽芯片筛选出候选标志物阶段，其中图2a为ROC曲线图，横坐标为1-特异性，纵坐标为灵敏度，AUC达到1；图2b为散点图，两组血清之间p-value小于0.0001；图3为利用ELISA对候选肽COVID19-V001进行验证的结果，其中图3a为ROC曲线图，横坐标为1-特异性，纵坐标为灵敏度，AUC达到1；图3b为散点图，两组血清之间p-value小于0.0001)。本发明的诊断试剂盒辅助诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的特异性为100％，灵敏度为100％，AUC＝1.000，均提高了现有技术中新型冠状病毒肺炎(COVID-19)诊断的指标。
实施例2通过小肽芯片对大量血清样本进行验证
1、肽的加工和偶联
此步骤与实施例1相同
2、芯片与血清的孵育
2.1配制需要的试剂
封闭液：3g BSA，加入100mL 1x PBS溶液(由10x PBS稀释而成)，混匀。
孵育液：1x PBST溶液(0.1％Tween20)。
清洗液：1x PBST。
10x PBS(1L)配方采用实施例1中表1所示的各组成成分进行配制。
2.2血清实验
a.封闭芯片：在可放置4张芯片的芯片盒中准备30mL封闭液(3％BSA in PBSbuffer)。将步骤1制备的芯片从-80℃取出至4℃和室温复温，芯片进入封闭液后，快速平行晃动芯片，并反转置于封闭液中,将封闭盒放置于侧摆摇床20-30rpm下，室温3h。倒弃封闭液，分别使用1×PBS,0.2×PBS(将1×PBS稀释5倍于ddH2O中)和ddH2O清洗1次，5min/次；然后离心干燥。安装围栏待用。
b.样本孵育：血清样本(其中既往感染者729例vs含上呼吸道感染(104)、自免病(120)、肺癌(41)、其他疾病(112)、中检院阴性样本(73)、健康人(92)共542例对照血清)从-80℃取出，置于冰上融解，待完全融解后，4℃离心(12000rpm)20min，取上清作为样本进行样本检测。用孵育液(1％BSA in PBST)稀释样本(稀释比例为1：200)，并将稀释后的样本加入步骤a的芯片中(加入量为200μL体积)，然后置于湿盒中，侧摆摇床20-30rpm下，4℃过夜反应。
c.清洗：保持围栏安装在芯片上，用排枪吸出反应液，再逐一清洗各孔3次，每次300μL PBST(每张芯片耗时大约11min)。再用PBST冲洗一次，摘除围栏，置于加入有30mL清洗液的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。
d.荧光标记IgG/IgM二抗孵育：提前准备二抗稀释液(1：1000,1％BSA in PBST)。二抗稀释液体积根据芯片数而定。若一张芯片，可用芯片专用孵育盒，按照3mL体积配置；若3-4张，可放置清洗盒，准备15ml体积。将二抗稀释液加入步骤c清洗后的芯片中，侧摆摇床20-30rpm下，避光，室温孵育1h。
e.清洗：置于加入有30ml清洗液(PBST)的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，
100-110rpm，10min每次，清洗3次。清洗时避光。
f.完成步骤e后用ddH2O清洗5min x 2次，并再冲洗10s。
g.干燥：将步骤f处理后的芯片置于芯片干燥机，离心干燥。
h.扫描：按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMT value 550；532nm，Power 100％，PMT value 550。
i.数据提取：将对应GAL文件打开，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存GPR文件。通过Excel、R语言对提取出的数据进行初步处理。
j.数据分析：将提取出的每条肽所对应不同样品的信号值进行归一化和取对数后，利用Graphpad prism 6.0得到ROC曲线图和散点图，根据ROC曲线中AUC(曲线下面积)和两组间差异显著分析进行诊断力的评定，候选肽COVID19-V001(氨基酸序列为：FKEELDKYFKNH)在AUC达到0.9904且区分既往感染者与其他对照的P-value低于0.0001，较其他肽更加具备作为诊断标志物的潜能。
2.3ELISA验证候选肽
a.对芯片实验分析后的候选肽进行独立样本的验证(其中既往感染者19例vs健康人50例)，候选肽COVID19-V001(氨基酸序列为：FKEELDKYFKNH)由吉尔生化(上海)有限公司合成并纯化，在N端加上Cys偶联至BSA上，获得偶联产物。
各种缓冲液及试剂的配制方法：
样品稀释液：pH 7.4PBS溶液，组成采用实施例1中表2所示的成分。
洗涤液：pH 7.4的PBST溶液，组成采用实施例1中表3所示的成分。
封闭液：3％BSA的pH 7.4PBS溶液，组成采用实施例1中表4所示的成分。
酶底物溶液：显色剂A和显色剂B(现配现用)，组成采用实施例1中表5和6所示的成分。
终止液：2mol/L H2SO4溶液(配时将浓硫酸缓慢滴入蒸馏水中，边加边混匀)，组成采用实施例1中表7所示的成分。
b.包被：将步骤a获得的偶联产物用PBS稀释至1μg/mL，加入到96孔酶标板中，每孔100μL，37℃包被2小时或4℃过夜；洗涤液洗板1次，甩干。
c.封闭：在步骤b处理后的96孔酶标板中加入封闭液200μL，室温保温2小时；然后用洗涤液洗板1次，甩干。
d.与血清孵育：将标准品(抗肽COVID19-V001的IgG抗体的浓度为0U/mL标准血清1和抗肽COVID19-V001的IgG抗体的浓度为100U/mL标准血清2；所述标准血清1为正常人血清，标准血清2为COVID19-V001抗体为阳性的血清)与待测血清样品以1:100的比例用样品缓冲液稀释至100μL，加入到各自的抗原测定孔板中。注意不要有气泡，加样时将稀释后的待测血清样品加于步骤c处理后的96孔酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板上加盖或覆膜。然后将酶标板置于37℃反应60分钟，甩净孔中液体，洗涤6次。
e.加酶：在步骤d处理后的酶标板的每孔中加含辣根过氧化物酶标记的anti-HumanIgG抗体的酶标试剂100μL，37℃，60分钟，形成肽段-抗体-酶标二抗复合物。甩净孔中液体，同上洗板6次拍干。
f.显色：步骤e拍干后各孔先滴加显色剂A 50μL,再加入显色剂B 50μL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
g.终止：依序在显色后的每孔中加终止液100μL，终止反应。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。底物反应时间到后应尽快加入终止液。
h.结果判定:
1).用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度(OD值)。
单位值(U/mL)＝(A450<待测血清样品>-A450<标准血清1>)/(A450<标准血清2>-A450<标准血清1>)×100
*A450是450nm处吸光度的缩写。
*目前肽等抗体尚无国际通行的参考标准，因此本检测结果校准时采用了相对单位。
2).血清中抗肽COVID19-V001值的判定
单位值≥100U/mL：可初步诊断该病人为新型冠状病毒肺炎(COVID-19)患者
单位值＜100U/mL：不能诊断该病人为新型冠状病毒)肺炎(COVID-19)患者
3).质量控制
每个检测结果必须符合以下标准：
标准血清1的A450：≤0.100
标准血清2的A450：≥0.700
如不符合上述标准，则结果视为无效，必须重新检测。
i.检验结果的解释
本实施例通过对592例对照血清、748例COVID-19康复者血清的ROC分析确立了以上参考值。
特异性和灵敏度检测：采用748份COVID-19康复者血清与592份对照血清(含上呼吸道感染(104例)、自免病(120例)、肺癌(41例)、其他疾病(112例)、中检院阴性样本(73例)、健康人(142例))对本发明的诊断试剂盒(肽COVID19-V001(氨基酸序列为：FKEELDKYFKNH)作为诊断标志物)进行了特异性和敏感性检测。检测吸光值OD450后利用Graphpad prism 6.0得到ROC曲线和散点图(结果如图4、5所示，图4为采用肽芯片筛选出候选标志物阶段，其中图4a为ROC曲线图，横坐标为1-特异性，纵坐标为灵敏度，AUC达到0.9904；图4b为散点图，两组血清之间p-value小于0.0001；图5为利用ELISA对候选肽COVID19-V001进行验证的结果，其中图5a为ROC曲线图，横坐标为1-特异性，纵坐标为灵敏度，AUC达到0.9958；图5b为散点图，两组血清之间p-value小于0.0001)。本发明的诊断试剂盒辅助诊断新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的特异性为98％，灵敏度为100％，AUC＝0.9958，均提高了现有技术中新型冠状病毒肺炎(COVID-19)诊断的指标。
实施例3通过对候选肽COVID19-V001进行位点突变
1、肽的加工和偶联
将实施例1和2获得的候选肽COVID19-V001的后7个氨基酸(DKYFKNH)逐个突变为丙氨酸(A)，共产生7个突变型(突变后的后7个氨基酸序列分别为AKYFKNH,DAYFKNH，DKAFKNH，DKYAKNH，DKYFANH，DKYFKAH，DKYFKNA)，将7个突变型和1个野生型偶联于BSA(偶联方法与实施例1相同)。
2、芯片的制备：方法与实施例1中芯片的制备相同
3、芯片与血清的孵育
3.1配制需要的试剂
封闭液：3g BSA，加入100mL 1x PBS溶液(由10x PBS稀释而成)，混匀。
孵育液：1x PBST溶液(0.1％Tween20)。
清洗液：1x PBST。
10x PBS(1L)配方采用实施例1中表1所示的各组成成分进行配制。
3.2血清实验
k.封闭芯片：在可放置4张芯片的芯片盒中准备30mL封闭液(3％BSA in PBSbuffer)。将步骤1制备的芯片从-80℃取出至4℃和室温复温，芯片进入封闭液后，快速平行晃动芯片，并反转置于封闭液中,将封闭盒放置于侧摆摇床20-30rpm下，室温3h。倒弃封闭液，分别使用1×PBS,0.2×PBS(将1×PBS稀释5倍于ddH2O中)和ddH2O清洗1次，5min/次；然后离心干燥。安装围栏待用。
l.样本孵育：血清样本(既往感染者2例)从-80℃取出，置于冰上融解，待完全融解后，4℃离心(12000rpm)20min，取上清作为样本进行样本检测。用孵育液(1％BSAin PBST)稀释样本(稀释比例为1：200)，并将稀释后的样本加入步骤a的芯片中(加入量为200μL体积)，然后置于湿盒中，侧摆摇床20-30rpm下，4℃过夜反应。
m.清洗：保持围栏安装在芯片上，用排枪吸出反应液，再逐一清洗各孔3次，每次300μL PBST(每张芯片耗时大约11min)。再用PBST冲洗一次，摘除围栏，置于加入有30mL清洗液的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。
n.荧光标记IgG/IgM二抗孵育：提前准备二抗稀释液(1：1000,1％BSA in PBST)。二抗稀释液体积根据芯片数而定。若一张芯片，可用芯片专用孵育盒，按照3mL体积配置；若3-4张，可放置清洗盒，准备15ml体积。将二抗稀释液加入步骤c清洗后的芯片中，侧摆摇床20-30rpm下，避光，室温孵育1h。
o.清洗：置于加入有30ml清洗液(PBST)的芯片清洗盒中，剧烈晃动10-15次，并更换清洗液，再次剧烈晃动10-15次；再次更换清洗液20-25mL，至于水平摇床上，100-110rpm，10min每次，清洗3次。清洗时避光。
p.完成步骤e后用ddH2O清洗5min x 2次，并再冲洗10s。
q.干燥：将步骤f处理后的芯片置于芯片干燥机，离心干燥。
r.扫描：按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作，设置参数为：635nm，Power 100％，PMT value 550；532nm，Power 100％，PMT value 550。
s.数据处理：打开对应的GAL文件，将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐，按下自动对齐按钮，提取数据并保存GPR文件。通过Excel对提取出的数据进行量化分析处理。
t.检测结果的解释：芯片扫描结果如图，图6a为芯片质检图，信号值的波动可能是由芯片点制时小肽浓度的差异所致，后续数据分析均根据质检中各点的信号值进行归一化；图6b为芯片分别与两例既往感染者血清孵育后的扫描结果图，从左到右依次是：landmarker——Cy3,BSA偶联的候选肽COVID19-V001，以及后7个氨基酸逐个进行丙氨酸突变的COVID19-V001肽段(后7个氨基酸序列分别为AKYFKNH,DAYFKNH，DKAFKNH，DKYAKNH，DKYFANH，DKYFKAH，DKYFKNA)，将提取出的数据归一化后计算出该点的真实信号值进行量化分析，发现原始序列和DAYFKNH表现出较强的信号，说明该序列中的K不是必需的氨基酸，其余经过丙氨酸突变的序列信号均出现大幅度降低甚至无信号，说明在产生免疫反应时原始序列中D YFKNH氨基酸都是必需的，但是仍然有贡献的差别，该差别体现在信号降低的程度不同。
本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种COVID-19的诊断标志物，其特征在于，所述诊断标志物包括肽段COVID19-V001，所述肽段COVID19-V001的氨基酸序列为：包含FKEELDKYFKNH中5个及5个以上连续氨基酸的序列；或
所述肽段COVID19-V001的氨基酸序列为：包含FKEELDKYFKNH中1个到几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列。
2.根据权利要求1所述的COVID-19的诊断标志物，其特征在于，所述肽段的氨基酸序列为FKEELDKYFKNH，或包含氨基酸序列FKEELDKYFKNH中1个或几个氨基酸的缺失或突变所形成的序列。
3.一种用于COVID-19的诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的诊断标志物。
4.一种检测SARS-CoV-2病毒既往感染的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1-2任一项所述的诊断标志物。
5.根据权利要求3或4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述诊断标志物通过SMCC与BSA偶联，形成SMCC-BSA-肽偶联产物。
6.根据权利要求3或4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
7.根据权利要求3或4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述标准品包括抗诊断标志物(肽段COVID19-V001)的IgG抗体的浓度为0U/mL的标准血清1和抗诊断标志物(肽段COVID19-V001)的IgG抗体的浓度为100U/mL的标准血清2；所述标准血清1为正常人血清，标准血清2为COVID19-V001抗体为阳性的血清；
所述肽段COVID19-V001抗原采用包被缓冲液稀释，所述包被缓冲液为0.05±0.005M、pH 9.6±0.05的碳酸盐缓冲液，即每1L溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3；
所述封闭液为含3％牛血清白蛋白的0.01±0.005M、pH 7.4±0.05的磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液，即每1L中含有5g牛血清白蛋白(BSA)，8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl。
8.根据权利要求3或4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液包括：显色剂A：500mL溶液中含醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL；显色剂B：500mL溶液中含TMB350mg，DMSO 20mL，柠檬酸·H2O 5.1g。
9.根据权利要求3或4所述的诊断试剂盒，其特征在于，所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释，所述样品稀释液为0.01M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)；
所述洗涤采用的洗涤液为含0.05％Tween-20的、0.01±0.005M、pH 7.4±0.05磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST)，即每1升溶液中含8g NaCl，0.2g KH2PO4，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2gKCl，0.5mL Tween-20；
所述终止液为2±0.1M H2SO4溶液；
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
10.一种定性检测人血清中抗肽段COVID19-V001的IgG抗体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、将权利要求1所述的诊断标志物肽段COVID19-V001通过SMCC与BSA偶联；
B、将偶联后的肽段COVID19-V001通过稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；
C、将标准品与待测血清样品稀释后加入各自的抗原测定孔中，温育后，每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成COVID19-V001-抗体-酶标二抗复合物；
D、经步骤C处理后，彻底洗涤，加酶底物溶液显色，然后加入终止液终止反应，通过OD450值即得样品中抗肽COVID19-V001的IgG抗体的水平。
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