CN113248580B - 一种诊断标志物及其在新型冠状病毒灭活疫苗保护效果评估中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种诊断标志物及在新型冠状病毒灭活疫苗接种后保护效果评估中的应用。所述诊断标志物包括肽段VSP001,或VSP 001和VSP002的组合,所述肽段VSP001的氨基酸序列为:包含PPAYTNSFTRGV中5个及5个以上连续氨基酸的序列;或所述肽段VSP001的氨基酸序列为:包含PPAYTNSFTRGV中1个到几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列。基于本发明的诊断标志物应用间接法定量检测人血清中抗肽段的IgG抗体水平。基于本发明所建立的检测试剂盒可作为评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后保护效果的一种辅助手段。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种诊断标志物及其在新型冠状病毒灭活疫苗接种后保护效果评估中的应用,尤其涉及肽段VSP001及其衍生物,或VSP001和VSP002及其衍生物组合在评估新型冠状病毒灭活疫苗保护效果的诊断试剂盒中的应用。
背景技术
SARS-CoV-2为一种新型的β属冠状病毒新毒株,可跨越物种屏障感染人类,可通过密切接触、呼吸道飞沫、高浓度气溶胶传播,引起以肺部病变为主的传染病,也可诱发包括神经系统和消化系统在内的全身性损伤,严重者可导致死亡(Lancet.2020Feb 15;395(10223):514-523)。
世界各地的人们都在拼命希望恢复正常的生活。为了实现这一目标,最好的,也许是唯一的办法是通过世界范围的疫苗接种获得群体免疫。我们正在见证人类历史上迄今为止针对一种新出现的病原体(SARS-CoV-2)的最快速的疫苗开发(Nat RevImmunol.2020Dec 18:1–10;Nat Rev Immunol.2020Oct;20(10):615-632)。根据COVID-19疫苗追踪网站(https://covid19.trackvaccines.org),到2021年3月1日共有12种疫苗获准紧急使用,89种疫苗正在进行临床试验。这些疫苗可分为几种主要策略,包括RNA/DNA疫苗(N Engl J Med.2020Dec 31;383(27):2616-2627;Nat Commun.2020May 20;11(1):2601)、亚单位疫苗(Cell.2020Aug 6;182(3):722-733.e11;N Engl J Med.2020Dec 10;383(24):2320-2332)和灭活病毒疫苗(Science.2020Jul 3;369(6499):77-81;Cell.2020Aug 6;182(3):713-721.e9;JAMA.2020Sep 8;324(10):951-960)。在这些疫苗中,灭活疫苗具有高效、安全、低成本、高可行性等优点,被认为是最有前途的选择之一。目前临床试验的SARS-CoV-2灭活病毒疫苗有9种,其中6种为Ⅲ期,即CoronaVac(Science.2020Jul 3;369(6499):77-81)、武汉生物制品研究所灭活病毒疫苗(LancetInfect Dis.2021Jan;21(1):39-51)、BBIBP-CorV(Cell.2020Aug 6;182(3):713-721.e9;Lancet Infect Dis.2021Jan;21(1):39-51)。BBIBP CorV已经获得中国、巴林、埃及、伊拉克、约旦、巴基斯坦、塞舌尔和阿联酋等国家的批准。这些灭活的病毒疫苗可以在多种动物模型中引发深刻的抗体反应,包括非人灵长类动物(NHPs)和人类。然而,未观察到NHPs和人类中TH1或TH2细胞应答的特异性诱导(Nat Rev Immunol.2020Dec 18:1–10)。众所周知,有效抗体反应的刺激是良好灭活疫苗候选者的标志,也可能是灭活SARS-COV-2疫苗有效性的主要机制(Cell.2020Aug 6;182(3):713-721.e9)
在新冠疫苗大规模免疫接种后,迫切地需要一种成本效益高的检测方法可同时在个体层面和群体层面快速、简单且有效地评估疫苗接种对SARS-CoV-2感染的保护效果。最可靠的测试是对真实病毒的中和活性测定,然而,由于真病毒测试需要三级生物安全设施,实际上不可能对大量样本进行测定。即使是对假病毒的中和检测,其实验技术要求高、成本高,仍然限制了其应用。其他方法包括针对峰值蛋白或RBD结构域测试IgG,例如sVNT分析(Nat Biotechnol.2020Sep;38(9):1073-1078)。sVNT具有良好的性能,但需要活性RBD和hACE2,难以制备和维护,因此阻碍了sVNT的大规模应用。若能够找到不需要考虑蛋白结构的肽来代替完整的蛋白,那么将大大简化免疫检测的关键材料的准备,并且有可能在不降低灵敏度的情况下提高特异性,因此,寻找关键抗原蛋白位点所对应的肽段是实现这一设想的关键突破口。
发明内容
针对现存的技术问题以及更准确的新型冠状病毒灭活疫苗接种后保护效果评估诊断标志物发现的需要,本发明提供一种诊断标志物及其在新型冠状病毒灭活疫苗评估中的应用,尤其为一种肽VSP001(肽序列为PPAYTNSFTRGV),或VSP001(肽序列为PPAYTNSFTRGV)和VSP002(肽序列为PSKRSFIEDLLF)在评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果的试剂盒中的应用,来定量检测人血液样本中抗该肽的IgG抗体的水平,作为评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果评估的一种手段,有望大大提高新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果检测的敏感性和特异性,并大大降低单份样本检测的成本。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的:
肽芯片作为一种系统性的分析工具,其高效的解析能力不容小觑。本发明尝试将SARS-CoV-2的S蛋白的S1和S2部分(总长为1273个氨基酸,参考序列NCBI GenBank:MN908947.3)切割成~200条小肽并进行了化学合成,在每条小肽的N端添加半胱氨酸,偶联至牛血清白蛋白(BSA)表面,将偶联产物固定于芯片表面,接种灭活疫苗的健康人血清孵育,针对血清中的IgG进行免疫检测,并与接种灭活疫苗的健康人血清的新冠病毒中和效果对比,最终筛选出能够评估疫苗效果的肽,以期得到有效的新型冠状病毒灭活疫苗评估标志物。
第一方面,本发明提供了评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后保护效果的诊断标志物,所述诊断标志物包括肽段VSP001,或VSP001和VSP002的组合;
所述肽段VSP001的氨基酸序列为:包含PPAYTNSFTRGV中5个及5个以上连续氨基酸的序列;或所述肽段VSP001的氨基酸序列为:包含PPAYTNSFTRGV中1个到几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列;
所述肽段VSP002的氨基酸序列为:包含PSKRSFIEDLLF中5个及5个以上连续氨基酸的序列;或所述肽段VSP002的氨基酸序列为:包含PSKRSFIEDLLF中1个到几个氨基酸的取代或/和缺失或/和添加所形成的序列。
优选地,所述肽段VSP001的氨基酸序列为PPAYTNSFTRGV,或包含氨基酸序列PPAYTNSFTRGV中1个或几个氨基酸的缺失或突变所形成的序列;
所述肽段VSP002的氨基酸序列为PSKRSFIEDLLF,或包含氨基酸序列PSKRSFIEDLLF中1个或几个氨基酸的缺失或突变所形成的序列。
本发明所述的肽段VSP001和VSP002的制备方法包括但不限于化学合成、重组表达或其它方式,优选为化学合成。
本发明通过检测病人体液中的肽段VSP001,或VSP001和VSP002的抗体(包括IgM,IgG和IgA,优选IgG型抗体),用于评估接种新型冠状病毒灭活疫苗后是否有效。
所述检测的样本包括但不限于全血、血清、血浆、组织液、尿液以及肺泡灌洗液,优选为血清或血浆样本;
所述的接种新型冠状病毒灭活疫苗者为接种疫苗后的状态。
本发明所采用的抗体检测方法包括但不限于酶联免疫吸附检测(ELISA)、化学发光、电化学发光、液相芯片以及蛋白质芯片技术。根据不同检测方法,所呈现的具体数值或有较大差异,但不影响其变化趋势。
具体检测方法可以是以肽段直接固定于固相载体(或微珠),然后与待检测样本孵育,再用酶标或荧光标记的二抗检测;
或者是以肽段偶联到蛋白(如BSA,KLH等)载体(或微珠)上,然后与待检测样本孵育,再用酶标或荧光标记的二抗检测。
第二方面,本发明提供了一种根据前述的诊断标志物在制备评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果的产品中的应用。
第二方面,本发明提供了一种用于评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果的诊断试剂盒,包括前述的评估标志物。
优选地,所述诊断标志物通过环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)与BSA偶联,形成SMCC-BSA-诊断标志物偶联产物。
优选地,所述试剂盒还包括标准品、包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
所述肽段VSP001或VSP002抗原采用包被缓冲液稀释,所述包被缓冲液为0.05±0.005M、pH 9.6±0.05的碳酸盐缓冲液,即每1L溶液中含1.59g Na2CO3,2.93g NaHCO3;
所述封闭液为含3%牛血清白蛋白的0.01±0.005M、pH 7.4±0.05的磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液,即每1L中含有5g牛血清白蛋白(BSA),8g NaCl,0.2g KH2PO4,2.9gNa2HPO4·12H2O,0.2g KCl。
优选地,所述酶底物溶液包括:显色剂A:500mL溶液中含醋酸钠13.6g,柠檬酸1.6g,30%双氧水0.3mL;显色剂B:500mL溶液中含TMB 350mg,DMSO 20mL,柠檬酸·H2O5.1g。
优选地,所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释,所述样品稀释液为0.01M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS);
所述洗涤采用的洗涤液为含0.05%Tween-20的、0.01±0.005M、pH 7.4±0.05磷酸盐-NaCl缓冲液(PBST),即每1升溶液中含8g NaCl,0.2g KH2PO4,2.9g Na2HPO4·12H2O,0.2g KCl,0.5mL Tween-20;
所述终止液为2±0.1M H2SO4溶液;
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
优选地,所述试剂盒中采用的各试剂还包含防腐剂,以便于保存。
第三方面,本发明提供了一种定性检测人血清中抗诊断标志物的IgG抗体的方法,包括以下步骤:
A、将前述的诊断标志物通过SMCC与BSA偶联;
B、将偶联后的诊断标志物通过稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原,加入封闭液;
C、将标准品与待测血清样品稀释后加入各自的抗原测定孔中,温育后,每孔加入含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂,形成诊断标志物-抗体-酶标二抗复合物;
D、经步骤C处理后,彻底洗涤,加酶底物溶液显色,然后加入终止液终止反应,通过OD450值即得样品中抗诊断标志物的IgG抗体的水平。
优选地,步骤A中,所述诊断标志物(肽段VSP001和/或VSP002)通过SMCC与BSA偶联的步骤具体包括:
A1、将环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)加入含BSA的缓冲液PBS中,混匀,25℃反应1h,得BSA-SMCC溶液;
A2、向肽段VSP001和/或VSP002溶液中加入BSA-SMCC溶液,混匀后静置于25℃下4至6小时,即得偶联产物BSA-SMCC-肽VSP001和/或BSA-SMCC-肽VSP002。
更优选地,步骤A1中,所述SMCC与BSA的质量比为1:5;
所述BSA-SMCC溶液的浓度为4mg/mL。
现有技术相比,本发明具有如下的有益效果:
1、本发明利用肽芯片高通量、快速分析的优势,发展了一套快速获取血清标志物的技术。通过对59份接种新型冠状病毒灭活疫苗者的血清,在较短的时间内分析了这些血清样本IgG反应性的不同,并通过与病毒中和效果的比较,筛选出本发明的血清标志物——肽段VSP001、VSP002,该肽段及其组合有望用于评估新型冠状病毒灭活疫苗的效果。
2、本发明提供一种灵敏、安全、可靠、易操作的可商品化试剂盒,定性测定人血液中抗肽段VSP001或VSP002的抗体水平,用于评估新型冠状病毒灭活疫苗的效果。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述,本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显:
图1为本发明实施例1中发现阶段所有候选肽的评估能力分析图;
图2为本发明实施例1中发现阶段目标肽的评估能力分析图;其中图2a为VSP001与中和效果相关性散点图;图2b为VSP001和VSP002的组合与中和效果相关性散点图;
图3为本发明实施例1中发现阶段对COVID19-001、COVID19-003和COVID19-004的评估能力分析图;其中图3a为COVID19-001与中和效果相关性散点图;图3b为COVID19-003与中和效果相关性散点图;图3c为COVID19-004的组合与中和效果相关性散点图;
图4为本发明实施例1中发现阶段效果不佳的肽的评估能力分析图,为VSP003与中和效果相关性散点图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。应当指出的是,对本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1采用小肽芯片的形式对已接种新型冠状病毒灭活疫苗者血清的检测
1、肽的加工和偶联
1.1准备样品:根据每条肽长度为12aa,每两条肽之间有6aa的重叠长度的条件特定截取,S蛋白共220条肽。其中S1区域包含118条肽,S2区域包括102条肽,其中包括本发明中肽段PPAYTNSFTRGV、PSKRSFIEDLLF,最终由吉尔生化(上海)有限公司合成并纯化,在纯化后的各肽的N端加上Cys偶联至BSA上,共偶联成功197条(偶联产物)。
具体偶联步骤如下:
①取10mg BSA溶于1mL PBS Buffer中,浓度为10mg/mL。
②取10μL SMCC(称取1mg SMCC溶于10μL DMSO)溶于BSA溶液中,于25℃放置1h。
③将激活好的BSA-SMCC溶液转移至透析袋中,在4℃用1×PBS Buffer透析过夜。期间换两次Buffer。
④将透析好后的BSA-SMCC溶液浓度稀释到4mg/mL。
⑤取合成好的肽各1mg于Eppendorf管中。
⑥加入10μL DMSO将肽溶解,加入200μL 1×PBS重悬,并调整其pH值在7-7.5范围内。
⑦向肽中加入200μL激活好的BSA-SMCC溶液。放置于25℃反应4-6h。
⑧将偶联产物溶于ddH20中,利用含10%甘油和0.01%SDS的PBS将其定容为0.9mg/mL,0.3mg/mL,0.1mg/mL三个浓度以确定筛选过程中最佳的反应浓度(防止信号过高等情况影响最终统计)。
另外增加对照样品:S1区域,S2区域,S-RBD区域,对应地,每个对照准备3个浓度梯度;以及其它对照样品:BSA(牛血清白蛋白),IgG标准品,IgM标准品,Cy3荧光二抗,Cy5荧光二抗,PBS缓冲液。以上对照的设置用于确保后续实验流程的正确。例如S1区域等用来证明疫苗接种者的血清重含有针对S蛋白的抗体,BSA作为没有偶联肽的阴性对照,IgG标准品和IgM标准品用于作为芯片扫描时针对血清重IgG和IgM两个通道的参照标准,Cy3与Cy5荧光二抗用于提取数据时对整个阵列的定位。
1.2点制芯片:将步骤1.1准备的各样品利用喷墨式点样仪ArrayJet Marathon进行点样,完成后置于4℃过夜固定,固定后放入-80℃储存。
1.3芯片质检:为了检测芯片的质量,即是否出现样品漏点,拖尾等芯片常见问题,我们针对偶联产物中的BSA进行了芯片的质检。首先,从-80℃中取出一片芯片移至4℃冰箱中复温1小时,再放置于室温复温1小时,芯片盒全程封闭。在无蛋白封闭液(QuickBlockTMWestern封闭液,购于上海碧云天生物技术有限公司)中封闭3小时,用1×PBST清洗干净后,使用兔抗BSA多抗(购于上海生工生物工程股份有限公司,取6μL按照1:5000的比例稀释于1×PBST中)于4℃孵育1小时,用1×PBST清洗干净后,利用Cy5荧光二抗进行孵育(按照1:5000的比例稀释于1×PBST中),用1×PBST清洗干净并干燥后,按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作,设置参数为:635nm,Power 100%,PMT value 550;532nm,Power 100%,PMT value 550。扫描结果如图1,共9条偶联产物未检测到信号,原因可能是合成以及纯化后样品的纯度过低以及溶解时出现不易溶现象,其余偶联产物(包括候选肽VSP001和VSP002在内)及对照显示信号均无异常。该结果说明芯片点制的过程中给没有出现漏点,拖尾等现象,芯片的质量足够保证后续筛选的正常进行。
2、芯片与血清的孵育
2.1配制需要的试剂
封闭液:3g BSA,加入100mL 1x PBS溶液(由10x PBS稀释而成),混匀。
孵育液:1x PBST溶液(0.1%Tween20)。
清洗液:1x PBST。
10x PBS(1L)配方如下表1所示。
表1
2.2血清实验
a.封闭芯片:在可放置4张芯片的芯片盒中准备30mL封闭液(3%BSA in PBSbuffer)。将步骤1.2制备的芯片从-80℃取出至4℃和室温复温,芯片进入封闭液后,快速平行晃动芯片,并反转置于封闭液中,将封闭盒放置于侧摆摇床20-30rpm下,室温3h。倒弃封闭液,分别使用1×PBS,0.2×PBS(将1×PBS稀释5倍于ddH2O中)和ddH2O清洗1次,5min/次;然后离心干燥。安装围栏待用。
b.样本孵育:血清样本(新型冠状肺炎病毒灭活疫苗接种者59例)从-80℃取出,置于冰上融解,待完全融解后,4℃离心(12000rpm)20min,取上清作为样本进行样本检测。用孵育液(1%BSA in PBST)稀释样本(稀释比例为1:200),并将稀释后的样本加入步骤a的芯片中(加入量为200μL体积),然后置于湿盒中,侧摆摇床20-30rpm下,4℃过夜反应。
c.清洗:保持围栏安装在芯片上,用排枪吸出反应液,再逐一清洗各孔3次,每次300μL PBST(每张芯片耗时大约11min)。再用PBST冲洗一次,摘除围栏,置于加入有30mL清洗液的芯片清洗盒中,剧烈晃动10-15次,并更换清洗液,再次剧烈晃动10-15次;再次更换清洗液20-25mL,至于水平摇床上,100-110rpm,10min每次,清洗3次。
d.荧光标记IgG/IgM二抗孵育:提前准备二抗稀释液(1:1000,1%BSA in PBST)。二抗稀释液体积根据芯片数而定。若一张芯片,可用芯片专用孵育盒,按照3mL体积配置;若3-4张,可放置清洗盒,准备15ml体积。将二抗稀释液加入步骤c清洗后的芯片中,侧摆摇床20-30rpm下,避光,室温孵育1h。
e.清洗:置于加入有30ml清洗液(PBST)的芯片清洗盒中,剧烈晃动10-15次,并更换清洗液,再次剧烈晃动10-15次;再次更换清洗液20-25mL,至于水平摇床上,100-110rpm,10min每次,清洗3次。清洗时避光。
f.完成步骤e后用ddH2O清洗5min x 2次,并再冲洗10s。
g.干燥:将步骤f处理后的芯片置于芯片干燥机,离心干燥。
h.扫描:按照扫描仪(Genepix4200A)的操作规范和使用说明操作,设置参数为:635nm,Power 100%,PMT value 550;532nm,Power 100%,PMT value 550。
i.数据提取:将对应GAL文件打开,将芯片图像和GAL文件每个阵列整体对齐,按下自动对齐按钮,提取数据并保存GPR文件。通过Excel、R语言对提取出的数据进行初步处理。
3.血清50%中和滴度检测
3.1配制需要的试剂
细胞培养液:500mL DMEM培养液+50mL胎牛血清+5mL青霉素/链霉素双抗。
8%多聚甲醛溶液:称取8g多聚甲醛粉末,加入到100mL PBS溶液中,放置于37℃培养箱2天溶解完全。
0.5%结晶紫溶液:称取0.5g结晶紫粉末,加入到100mL乙醇中。
3.2 50%中和滴度检测实验
a.将Vero-E6细胞接种到12孔板中培养24小时。
b.将血清用细胞培养液进行2倍梯度稀释,如稀释10倍、20倍、40倍和80倍梯度稀释。
c.取300微升各个稀释浓度的血清与300微升新型冠状病毒(300PFU/mL)混合均匀,在37℃培养箱中孵育1小时。
d.吸弃Vero-E6细胞中的细胞培养液,将600微升血清-病毒混合液加入到细胞中,在37℃培养箱中孵育1小时。
e.孵育结束后,吸弃血清-病毒混合液,加入细胞培养液,在37℃培养箱中继续培养4天。
f.培养结束后,吸弃培养液,加入600微升8%多聚甲醛溶液,于室温固定1小时。
g.固定结束后吸弃8%多聚甲醛溶液,用蒸馏水清洗细胞。
h.加入600微升0.5%结晶紫溶液,于室温固定1小时。
i.计数紫色毒斑的数目,根据紫斑数目和血清稀释浓度利用Graphpad prism 6.0计算50%中和滴度。
数据分析:将提取出的每条肽所对应不同样品的信号值进行归一化和取对数后,利用Graphpad prism 6.0得到与新型冠状病毒灭活疫苗接种者血清50%中和活性的相关性图(图2-图4)。根据相关性图中与50%中和滴度成正相关性好的候选肽进行评定,获得了候选肽VSP001(氨基酸序列为:PPAYTNSFTRGV)和VSP002(氨基酸序列为:PSKRSFIEDLLF),该候选肽VSP001的信号与中和效果相关性达到了0.615(VSP001),且显著性P-value低于0.0001,将候选肽VSP001(氨基酸序列为:PPAYTNSFTRGV)和VSP002(氨基酸序列为:PSKRSFIEDLLF)进行组合,发现阶段该候选肽的组合的信号与中和效果相关性达到了0.770且显著性P-value低于0.0001。而另一条候选肽VSP0003(氨基酸序列为:IYKTPPIKDFGG)的相关性仅次于VSP001和VSP002,但其信号与中和效果的相关性仅为0.3088,远远低于VSP001,或VSP001和VSP002的组合。而发明人前期获得的候选肽COVID19-001(氨基酸序列为:FKEELDKYFKNH)、COVID19-003(氨基酸序列为:HADQLTPTWRVYSTGSNV)和COVID19-004(氨基酸序列为:NRALTGIAVEQDKNTQEV)的结果显示其缺乏对新型冠状病毒灭活疫苗效果的评估能力。因此VSP001,或VSP001和VSP002的组合均较其它肽更加具备作为评估灭活疫苗接种后的保护效果的诊断标志物的潜力。
基于前述实施例的结果,我们还通过具体的应用试验验证了其可行性。
本发明具体应用途径很多,以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出,以上实施例仅用于说明本发明,而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进,这些改进也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后保护效果的诊断标志物,其特征在于,所述诊断标志物包括肽段VSP001和VSP002的组合;
所述肽段VSP001的氨基酸序列为PPAYTNSFTRGV;
所述肽段VSP002的氨基酸序列为PSKRSFIEDLLF;
所述的诊断标志物应用于制备评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果的产品。
2.一种用于评估新型冠状病毒灭活疫苗接种后的保护效果的诊断试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的诊断标志物。
3.根据权利要求2所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述诊断标志物通过SMCC与BSA偶联,形成SMCC-BSA-肽偶联产物。
4.根据权利要求2所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括包被缓冲液、封闭液、样品稀释液、终止液、酶标试剂、酶底物溶液和洗涤液。
5.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述肽段VSP001或VSP002抗原采用包被缓冲液稀释,所述包被缓冲液为0.05 ± 0.005 M、 pH 9.6 ± 0.05的碳酸盐缓冲液,即每1 L 溶液中含1.59 g Na2CO3,2.93 g NaHCO3;
所述封闭液为含3% 牛血清白蛋白的0.01±0.005 M、 pH 7.4±0.05的磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)溶液,即每1 L中含有5 g牛血清白蛋白(BSA),8 g NaCl,0.2 g KH2PO4,2.9 gNa2HPO4·12H2O,0.2 g KCl。
6.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述酶底物溶液包括:显色剂A:500mL溶液中含醋酸钠13.6 g,柠檬酸1.6 g,30%双氧水0.3 mL;显色剂B:500 mL溶液中含TMB350 mg,DMSO 20 mL,柠檬酸·H2O 5.1 g。
7.根据权利要求4所述的诊断试剂盒,其特征在于,所述标准品与待测血清样品采用样品稀释液进行稀释,所述样品稀释液为0.01 M pH 7.4磷酸盐-NaCl缓冲液;
所述洗涤采用的洗涤液为含0.05% Tween-20的、0.01±0.005 M、 pH 7.4±0.05磷酸盐-NaCl缓冲液,即每1升溶液中含8 g NaCl,0.2 g KH2PO4,2.9 g Na2HPO4·12H2O,0.2 gKCl,0.5 mL Tween-20;
所述终止液为2 ± 0.1 M H2SO4溶液;
所述酶标试剂为含有辣根过氧化物酶标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂。
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