CN116794304A - 一种联合检测asfv抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸及其应用 - Google Patents
一种联合检测asfv抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸及其应用，属于兽医生物诊断制品技术领域。联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸，包括底板，在所述底板上，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接，自结合垫至吸水垫方向，硝酸纤维素膜上依次设有抗体检测线、核酸检测线和质控线，所述抗体检测线上包被有山羊抗猪IgG‑Fc抗体，核酸检测线上包被有链霉亲和素，质控线上包被有兔抗绵羊IgG抗体；结合垫上包被有量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体。本发明试纸，可以对ASFV抗体和核酸进行快速、高特异性及高灵敏性的检测。
Description
技术领域
本发明属于兽医生物诊断制品技术领域，具体涉及一种联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的影响各个品种与年龄段猪的毁灭性传染病。被世界动物卫生组织(World OrganisationForAnimal Health，WOAH)列为必须及时通报的动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。
健康猪与患病猪直接接触ASFV污染物或被带毒的蜱等媒介昆虫叮咬是ASFV传播的主要途径。目前，还没有针对于ASFV的特效药和疫苗，其主要的防控策略依靠严格的生物安全措施以及对感染或暴露动物的扑杀，因此，ASFV的检测与早期诊断对于疫情确认和控制至关重要。
目前ASF现场检测仍主要依靠临床表现和病理病变。现场诊断中，兽医人员依据猪群某种特征性症状或病变进行鉴别诊断，为现场疫病防控提供较快速的猪病防治方向。但是非洲猪瘟有最急性、急性、亚急性和慢性等多种表现，临床症状多样，又缺乏特异性症状，在对非洲猪瘟鉴别诊断时，需要借助实验室检测。通过多种有效的检测方法检测非洲猪瘟的病毒和抗体。
临床应用中，ASFV抗体检测的灵敏度明显低于核酸检测，有时会出现抗体检测呈阴性而ASFV感染的情况，因为ASF患猪急性发病很可能未产生抗体即死亡，活体确诊必须进行组织常规聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)，还需要进行血清学检测以检测抗体。
目前，WOAH建议的非洲猪瘟病毒实验室检测方法包括病毒分离、荧光抗体检测和常规聚合酶链式反应检测。病毒分离对操作环境要求高，所需时间长，而荧光抗体检测和PCR特异性好、灵敏度高，但都对试验条件与仪器设备要求高，难以实现现场快速检测。除此之外，检测方法还包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒和胶体金免疫层析试纸。ELISA试剂盒特异性好、灵敏度高，操作相对简便但是对温度酸碱度等环境因素要求高，而且受自身抗体、嗜异性抗体等干扰，易出现假阳性，不符合现场快速检测的要求。快速检测ASFV抗体的胶体金免疫层析试纸条，灵敏度不高。因此，目前市场缺少同时实现快速、高特异性、高灵敏性的ASFV核酸和抗体的现场检测技术。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸，用于ASFV抗体和核酸的快速、高特异性及高灵敏性的检测。
本发明的第二个目的是提供以非诊断为目的采用所述试纸检测血液样品的方法。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸，包括底板，在所述底板上，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接，自结合垫至吸水垫方向，硝酸纤维素膜上依次设有抗体检测线、核酸检测线和质控线，所述抗体检测线上包被有山羊抗猪IgG-Fc抗体，核酸检测线上包被有链霉亲和素，质控线上包被有兔抗绵羊IgG抗体；结合垫上包被有量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体。
在本发明中，所述重组蛋白P22中的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。在本发明中，所述绵羊抗地高辛抗体购自北京诺为生物技术有限公司，产品编号为3210-0488。
在本发明中，所述山羊抗猪IgG-Fc抗体购自Abmart公司，产品编号为ab112748，所述兔抗绵羊IgG抗体购自哪里Abcam公司，产品编号为31480。
在本发明中，将玻璃纤维素膜在含有Triton、BSA和葡萄糖的硼酸缓冲液中浸泡，干燥，得样品垫。
在本发明中，采用含有BSA、蔗糖、PEG1500、Tween20的Tris-HCl缓冲液浸泡玻璃纤维素膜，然后依次喷涂量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，干燥，得到结合垫。
在本发明中，将量子点微球分别与重组蛋白P22和绵羊抗地高辛抗体偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体。
在本发明中，所述量子点微球与重组蛋白P22的质量比为5-7:1，所述量子点微球与绵羊抗地高辛抗体的质量比为6-10:1。
本发明还提供以非诊断为目的采用所述试纸检测血液样品的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以血液样品中的基因组DNA为模板，采用引物F、引物R和探针，进行等温核酸扩增；
(2)将核酸扩增产物稀释后和所述血液样品的血清混合，得到混合产物；
(3)在混合产物中滴加量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，震荡混匀，然后用含有Tween-20的缓冲液稀释，滴加在所述试纸的样品垫上，层析后，使用荧光分析仪或紫外激光灯进行结果判读。
在本发明中，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物R的5’端标记有生物素；所述探针的核苷酸序列如SEQ IDNO:3所示，所述探针的5’端连接有地高辛，3’连接有C3-spacer，在SEQ ID NO:3的第30位核苷酸和第31位核苷酸之间标记一个四氢呋喃。
本发明的实验原理为间接法。RPA下游引物的5'端标记一个修饰基团(生物素)；荧光探针5'端修饰一个抗原标记(地高辛)；在5'端和3'端的中部位置标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF),，作为nfo的识别位点；3'端标记一个修饰基团C3-Spacer。当样品中非洲猪瘟病毒靶DNA存在时，经RPA反应产生一个地高辛单标记的扩增产物，探针与之杂交后，体系中核酸内切酶切割THF残基，使探针可以作为新的引物产生地高辛、生物素双标记的双标记靶DNA扩增子。通过量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体捕获双标记靶DNA扩增子，被捕获的靶DNA扩增子和DNA测试线(T2)上包被的链霉亲和素结合固定，过量的量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体和质控线(C)上的包被的兔抗绵羊IgG抗体结合固定，并通过标记上的量子点微球发光显色。此时核酸检测线T2显色，质控线C显色。当样品中非洲猪瘟病毒抗体存在时，通过量子点微球标记的重组蛋白P22捕获血清中的非洲猪瘟病毒抗体，被捕获的抗体和检测线上包被的山羊抗猪IgG-Fc抗体结合固定，通过标记上的量子点微球发光显色。过量的量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体和质控线(C)上包被的兔抗绵羊IgG抗体结合固定，并通过标记上的量子点微球发光显色。此时抗体检测线T1显色，质控线C显色。
本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：
(1)本发明联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸，由于量子点微球具有均一度高，单分散性好，稳定性强等优点，因此使用量子点微球作为标记物制作的试纸批次间差异较小。
(2)本发明联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸，其制备方法，操作易上手，所需原料简单，可在较短时间内掌握，有广阔的市场前景和较大的经济收益。
(3)采用本发明试纸、结合重组酶聚合酶扩增的等温反应体系可以快速同时检测非洲猪瘟病毒抗体和核酸，特异性强，灵敏度高，稳定且具有较好的重复性。
(4)以非诊断为目的采用本发明试纸检测血液样品的方法，操作简单，无需经过专业的培训，可以很好地胜任各种现场、基层实验室等环境下的检测。
附图说明
图1是联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸的结构示意图；其中：1-荧光免疫层析试纸；2-PVC底板；3-样品垫；4-结合垫；5-硝酸纤维素膜；6-抗体检测线；7-核酸检测线；8-质控线；9-吸水垫。
图2是联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸检测核酸抗体双阳性样品、核酸阴性抗体阳性样品、核酸阳性抗体阴性样品、核酸抗体双阴性样品的结果示意图，其中“+”表示阳性，“—”表示阴性。
图3是阳性样品的恒温快速扩增产物的2％琼脂糖凝胶电泳检测结果，其中M为DNAMarker，1为ddH2O阴性对照，2为阳性样品的恒温快速扩增产物。
图4是重组蛋白P22的Western-bloting鉴定图，其中M为蛋白maker，泳道1是纯化后的重组蛋白P22。
具体实施方式
实施例1制备重组蛋白P22
1.P22基因重组载体的构建
参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟CP204L基因序列(MH766894，KP177R，3251-3784)，对密码子进行了针对大肠杆菌的嗜性优化，得到了重组蛋白P22的基因序列(如SEQ ID NO：4所示)，重组蛋白P22的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。采用基因合成的方式(南京金斯瑞生物科技有限公司)制备重组蛋白P22的基因，将该基因序列插入载体pET-21a(+)的多克隆酶切位点NdeⅠ和XholⅠ之间，得到重组质粒pET-21a-P22。通过“热激”法，将重组质粒pET-21a-P22转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-21a-P22(BL21)。经菌落PCR鉴定，在768bp处出现特异性条带，说明重组载体构建成功。
3.重组蛋白的表达及纯化
将pET-21a-P22(BL21)在含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，培养条件均如下：培养温度为37℃、摇床转速为180r/min，待OD600＝0.6～0.8时降温至20℃，30min后加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG诱导表达，然后继续在20℃培养17小时，收集菌体。用缓冲液洗涤菌体，菌体重悬后加入PMSF(苯甲基磺酰氟)进行超声波裂解，在4℃下10000r/min离心30分钟。取上清，按照Ni-NTA亲合层析介质(金斯瑞生物科技有限公司产品，Cat.No：L00250)的说明书纯化重组蛋白P22。纯化后的重组蛋白P22在20KDa左右出现特异性的条带，与预期一致。因此，重组蛋白P22成功表达，置于-70℃以下保存备用。
3.重组蛋白的抗原性检测
将纯化的重组蛋白P22经SDS-PAGE电泳后转印至NC膜，进行Western-bloting检测。用5％脱脂乳封闭过夜后，以1：200稀释的非洲猪瘟抗体阳性参考血清(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)作为一抗，37℃孵育2小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。用1:20000倍稀释的HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(购自Bethyl，货号为a100-105p)作为二抗，37℃孵育1.0小时。TBST洗涤5次，5分钟/次。ECL避光显色5min，曝光10sec。结果：重组蛋白P22在20KDa左右出现了特异性反应条带(图4)。上述结果说明，重组蛋白P22可与非洲猪瘟抗体阳性参考血清发生特异性反应，具有良好的抗原性。
实施例2联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸条
1.量子点微球标记绵羊抗地高辛抗体
(1)量子点微球的活化：取50μL浓度为1.2μg/μL的量子点微球悬浮液(购自北京纳晶生物科技有限公司，产品编号为FM610C)加入到100μL含有10mg/mL的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.01M、pH 6.0的MES缓冲液中，在37℃下连续摇动恒温孵育30min后，离心取沉淀。将沉淀分散在100μL浓度为0.02M、pH＝7.2的MES缓冲液中重悬，得到活化的量子点微球。
(2)量子点微球的偶联：室温下，在活化的量子点微球中加入7μg绵羊抗地高辛抗体(购自北京诺为生物技术有限公司，产品编号为3210-0488)，反应4h，使绵羊抗地高辛抗体与量子点微球进行偶联，得到抗地高辛抗体和量子点微球的偶联物。
(3)量子点微球的封闭：在抗地高辛抗体和量子点微球的偶联物中，加入2μL含有10％(质量百分浓度)BSA的浓度为0.01M、pH 7.0的PBS缓冲溶液，在室温下轻轻搅拌20分钟，封闭抗地高辛抗体和量子点微球的偶联物。
(4)量子点微球的重悬：将封闭后的抗地高辛抗体和量子点微球的偶联物以10,000rpm的转速离心15min，取沉淀，加入100μL浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬，得到量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，置于4℃冰箱中保存。
2.量子点微球标记重组蛋白P22
(1)量子点微球的活化：取50μL浓度为1.2μg/μL的量子点微球悬浮液(购自北京纳晶生物科技有限公司，产品编号为FM610C)加入到100μL含有10mg/mL的1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和10mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.01M、pH 6.0的MES缓冲液中，在37℃下连续摇动恒温孵育30min后，离心取沉淀。将沉淀分散在100μL浓度为0.02M、pH＝7.2的MES缓冲液中重悬，得到活化的量子点微球。
(2)量子点微球的偶联：在活化的量子点微球中，加入10μg重组蛋白P22，于37℃摇床中恒温孵育2h，将重组蛋白P22与量子点微球进行偶联，得到重组蛋白P22和量子点微球的偶联物。
(3)量子点微球的封闭：在重组蛋白P22和量子点微球的偶联物中，加入2μL质量百分浓度为10％的BSA溶液，在37℃摇床中恒温孵育15min，封闭重组蛋白P22和量子点微球的偶联物。
(4)量子点微球的重悬：将封闭后的重组蛋白P22和量子点微球的偶联物在离心机中10000rpm离心10分钟，取沉淀，加入浓度为0.02M、pH 7.0的MES缓冲液重悬至总体积为500μL，得到量子点微球标记的重组蛋白P22，置于4℃冰箱中保存。
3.联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸的制备
联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸条1的结构如图1，在PVC底板2上，样品垫3、结合垫4、硝酸纤维素膜5和吸水垫9依次首尾搭接；硝酸纤维素膜5黏贴在底板2中部，硝酸纤维素膜5一端粘贴叠压有结合垫4，另一端粘贴叠压有吸水垫9(吸水纸)，自结合垫至吸水垫方向，硝酸纤维素膜5上依次设有抗体检测线6、核酸检测线7和质控线8，抗体检测线6上包被有山羊抗猪IgG-Fc抗体，核酸检测线7上包被有链霉亲和素，质控线8上包被有兔抗绵羊IgG抗体。
上述荧光免疫层析试纸的具体制备步骤如下：
(1)样品垫的制备：裁剪16mm宽的玻璃纤维素膜，在含有1％(体积百分浓度)Triton、1％(质量百分浓度)BSA(牛血清白蛋白)和2％(质量百分浓度)葡萄糖的pH 8.0、浓度为50mm的硼酸缓冲液中浸泡，干燥，得到样品垫。
(2)结合垫的制备：采用含有5％(质量百分浓度)BSA、8％(质量百分浓度)蔗糖、0.5％(质量百分浓度)PEG1500、0.5％(体积百分浓度)Tween20的50mM、pH8.0的Tris-HCl缓冲液浸泡处理玻璃纤维素膜，在处理后的玻璃纤维素膜上依次均匀喷涂量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，喷涂量为0.5μg/cm。喷涂量是指宽度为0.9cm的结合垫每厘米长喷涂的蛋白质量。37℃干燥5h，得到结合垫。
(3)划线：将链霉亲和素用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至0.6mg/mL，制得核酸检测线(T2)工作液，将山羊抗猪IgG-Fc抗体(购买来源Abmart公司，产品编号ab112748)用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至0.6mg/mL，制得抗体检测线(T1)工作液；将兔抗绵羊IgG抗体(购自Abcam公司，产品编号为31480)用含有3％(质量百分浓度)蔗糖的0.01M、pH7.4的PBS缓冲液稀释至0.8mg/mL，制得质控线(C)工作液；用三维平面点膜喷金仪向硝酸纤维素膜上喷涂核酸检测线、抗体检测线和质控线溶液。质控线、核酸检测线和抗体检测线划线速度均为1μL/cm，相邻的检测线和质控线的间距控制在6mm左右；将划线的硝酸纤维素膜于37℃烘干12小时，得到处理后的硝酸纤维素膜，放置于干燥柜中保存备用。
(4)组装：在正常湿度和温度下的洁净操作台上，按照图1，将处理好的样品垫3、结合垫4、喷涂了检测线和质控线的硝酸纤维素膜5、吸水垫9(材质为吸水滤纸)依次以2-4mm两两重叠黏贴在底板2上，然后送入切条机，得到宽为4±0.5mm的试纸条。挑取完好整齐的试纸条，放入卡壳中，压盖完成后连同1粒干燥剂放入铝箔袋中密封保存。其中底板2为PVC板。
4.联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸的使用方法
采用联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸检测样品，包括以下步骤：
(1)采用健康猪血液制备血清，得到抗体阴性样品。采用SimpleViral DNA/RNAKit试剂盒(购自北京全式金生物公司，货号为EC311-11)从健康猪血液中提取核酸，得到核酸提取物，作为核酸阴性样品。采用ASFV阳性猪血液制备血清，得到抗体阳性样品。从ASFV阳性猪血液中提取核酸，得到核酸提取物，作为核酸阳性样品。
(2)使用DNA恒温快速扩增试剂盒(购自潍坊安普未来生物科技有限公司，产品编号为WLN8203KIT)进行RPA扩增。RPA体系：在一个干粉反应管(内含RPA反应颗粒)中加入2μL的待测样品(核酸阳性样品或核酸阴性样品)，2.5μL B buffer，29.4μLAbuffer、2μL浓度为10μM的上游引物F、2μL浓度为10μM的下游引物R、0.6μL浓度为10μM的RPA探针和11.15μL的ddH2O。将RPA体系充分混合均匀，置于冰上备用；
其中，上游引物F、下游引物R和RPA引物探针的序列如下所示：
引物F(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列如下：5’-TGATAGACCCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3’。
引物R的结构如下：5’-biotin–GTTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATA-3’。引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，5’端连接有生物素。
RPA探针的结构如下：
5’-DIG-CTCCCGTGGCTTCAAAGCAAAGGTAATCAT–THF–
ATCGCACCCGGATCATCG–C3–spacer-3’。
RPA探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，5’端连接有地高辛(DIG)，3’连接有一个修饰基团C3–spacer，在RPA探针的第30位核苷酸与第31位核苷酸之间标记一个dSpacer(四氢呋喃，THF)，作为核酸外切酶Ⅳ(nfo)的识别位点。
上游引物F、下游引物R和RPA引物探针由通用生物公司合成。
(3)将RPA体系在37℃下静置反应20分钟后，立即置于冰上备用；图3显示了阳性样本的扩增产物。
(4)取步骤(3)所得扩增产物1μL加入1000μL样品稀释液中进行稀释。样品稀释液是含有0.5％(质量百分浓度)PVP-40(聚乙烯吡咯烷酮40)、0.1％(质量百分浓度)Proclin300、1％(体积百分浓度)Tween-20的浓度为0.1M、pH8.0的Tris-Hcl缓冲液。取稀释后的扩增产物和血清样品(抗体阳性样品或抗体阴性样品)等体积混合，得到混合产物。取100uL混合产物加入PCR管中，滴加0.5uL的量子点微球标记的重组蛋白P22、2uL量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，震荡混匀(微球每次滴加前均震荡摇匀)，然后用含有1％(体积百分浓度)Tween-20的0.1M、pH8.0的Tris-Hcl缓冲液稀释10倍，滴加在联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸条的样品垫上，层析10分钟。其中，健康猪血清与健康猪血液核酸提取物的扩增产物的混合物为核酸抗体双阴性样品；ASFV阳性猪血清与ASFV阳性猪血液核酸提取物的扩增产物的混合物为核酸抗体双阳性样品；健康猪血清与ASFV阳性猪血液核酸提取物的扩增产物的混合物为核酸阴性抗体阳性样品；ASFV阳性猪血清与健康猪血液核酸提取物的扩增产物的混合物为核酸阳性抗体阴性样品。
(5)用波长在300～450nm的紫外激发光对核酸检测线、抗体检测线和质控线进行照射，观察显色情况(注意佩戴配套护目镜)；结果如图2所示。
从图2可看出，质控线和抗体检测线、核酸检测线均显色，表示检测样品中有ASFV抗体和核酸存在；质控线显色，抗体检测线、核酸检测线都不显色，表示检测样品中不存在ASFV抗体和ASFV核酸；质控线显色，抗体检测线显色而核酸检测线不显色，说明检测样品中含ASFV抗体，而不含ASFV核酸；质控线显色，核酸检测线显色，而抗体检测线不显色，表示检测样品中存在ASFV核酸，不存在ASFV抗体。若出现质控线不显色，则检测结果无效。
实施例3联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸条的敏感性
联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸条的敏感性分析，具体步骤如下：
(1)对阳性血清检测的敏感性
阴性血清的制备：选择4-5周龄，体温、食欲、排泄正常，且经非洲猪瘟病毒荧光定量PCR检测试剂盒(购自青岛立见生物科技有限公司)检测为阴性的仔猪。采集血液并分离血清，加入终浓度为0.01％(质量百分浓度)的硫柳汞，于-20℃保存，作为阴性血清。
阳性血清的制备：采用PBS缓冲液(浓度0.01M、pH7.4)将重组蛋白P22调整为1mg/mL，得到P22抗原。采用P22抗原免疫仔猪，具体方法如下：将1mg/mL的抗原与等体积的弗氏完全佐剂混合并乳化，然后肌肉注射2月龄健康仔猪1头，免疫剂量为2mL(含有1mg蛋白)/头；第一次免疫10天后，将1mg/mL的抗原与弗氏不完全佐剂按照体积比为1:1混合、乳化，按照首免时相同的剂量加强免疫1次；10天后再用二免时相同的免疫方法和免疫剂量加强免疫1次；在第三次免疫后第7天，无菌采集猪血分离血清，得到阳性血清。
将阳性血清用阴性血清按照稀释度为1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1:256000、1:512000、1:1024000进行稀释。用联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸分别对阳性血清的不同稀释度的稀释液和阴性血清进行检测。
检测结果：采用联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸条对稀释度为1:1024000的阳性血清稀释液检测的结果为阳性，表明该试纸对阳性血清中非洲猪瘟病毒抗体的检出限最低可达1:1024000的稀释度。
(2)对核酸检测的敏感性
阴性核酸样品的制备：采用健康猪全血样品的核酸提取物作为阴性核酸样品。
阳性核酸样品的制备：将ASFV P72全长质粒作为阳性核酸样品，经过分光光度计测定含量后，用健康猪全血样品的核酸提取物分别稀释至1000copies/μL，100copies/μL，10copies/μL，1copies/μL，0.1copies/μL。ASFV P72全长质粒由铭研生物公司合成，具体基因序列如SEQ ID NO:6所示。
采用联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸，分别对不同浓度阳性核酸样品和阴性核酸样品进行检测。检测结果：该试纸对阳性核酸样品检出限最低可达到1copies/μL，对阴性核酸样品检测无显色。
实施例3联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸的特异性
联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸的特异性检测方法：采用联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层试纸检测猪圆环病毒抗体标准阳性血清及核酸提取物、口蹄疫病毒抗体标准阳性血清及核酸提取物、猪繁殖呼吸综合症病毒抗体标准阳性血清及核酸提取物、猪瘟病毒抗体标准阳性血清及核酸提取物、猪伪狂犬病毒抗体标准阳性血清及核酸提取物。
检测结果：所有病毒核酸及抗体判定结果均为阴性，说明本发明试纸条与猪的其他病毒无交叉反应，特异性良好。
Claims (10)
1.联合检测ASFV抗体和核酸的量子点微球荧光免疫层析试纸，其特征在于包括底板，在所述底板上，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次首尾搭接，自结合垫至吸水垫方向，硝酸纤维素膜上依次设有抗体检测线、核酸检测线和质控线，所述抗体检测线上包被有山羊抗猪IgG-Fc抗体，核酸检测线上包被有链霉亲和素，质控线上包被有兔抗绵羊IgG抗体；结合垫上包被有量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体。
2.根据权利要求1所述试纸，其特征在于所述重组蛋白P22中的氨基酸序列如SEQ IDNO:5所示。
3.根据权利要求2所述试纸，其特征在于所述绵羊抗地高辛抗体购自北京诺为生物技术有限公司，产品编号为3210-0488。
4.根据权利要求3所述试纸，其特征在于所述山羊抗猪IgG-Fc抗体购自Abmart公司，产品编号为ab112748，所述兔抗绵羊IgG抗体购自哪里Abcam公司，产品编号为31480。
5.根据权利要求4所述试纸，其特征在于将玻璃纤维素膜在含有Triton、BSA和葡萄糖的硼酸缓冲液中浸泡，干燥，得样品垫。
6.根据权利要求5所述试纸，其特征在于采用含有BSA、蔗糖、PEG1500、Tween20的Tris-HCl缓冲液浸泡玻璃纤维素膜，然后依次喷涂量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，干燥，得到结合垫。
7.根据权利要求6所述试纸，其特征在于将量子点微球分别与重组蛋白P22和绵羊抗地高辛抗体偶联，分别得到量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体。
8.根据权利要求7所述的试纸，其特征在于所述量子点微球与重组蛋白P22的质量比为5-7:1，所述量子点微球与绵羊抗地高辛抗体的质量比为6-10:1。
9.以非诊断为目的采用权利要求1所述试纸检测血液样品的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以血液样品中的基因组DNA为模板，采用引物F、引物R和探针，进行等温核酸扩增；
(2)将核酸扩增产物稀释后和所述血液样品的血清混合，得到混合产物；
(3)在混合产物中滴加量子点微球标记的重组蛋白P22和量子点微球标记的绵羊抗地高辛抗体，震荡混匀，然后用含有Tween-20的缓冲液稀释，滴加在所述试纸的样品垫上，层析后，使用荧光分析仪或紫外激光灯进行结果判读。
10.根据权利要求9所述方法，其特征在于所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述引物R的5’端标记有生物素；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述探针的5’端连接有地高辛，3’连接有C3-spacer，在SEQ ID NO:3的第30位核苷酸和第31位核苷酸之间标记一个四氢呋喃。
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