CN117589995A

CN117589995A - 一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN117589995A
Application number: CN202311599306.9A
Authority: CN
Inventors: 杨若松; 马增彬; 高培宇; 刘彬; 龚雅云; 蔡云虹; 李爽
Original assignee: Bwt Beijing Biotechnology Co ltd; Zhangjiakou Aquatic Technology Promotion Station; Bwt Tianjin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Bwt Beijing Biotechnology Co ltd; Zhangjiakou Aquatic Technology Promotion Station; Bwt Tianjin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-11-28
Filing date: 2023-11-28
Publication date: 2024-02-23

Abstract

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测牛鼻气管炎抗原量子点微球免疫试纸卡及制备方法和应用。免疫试纸卡，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；量子点结合垫内包被有量子点标记抗牛鼻气管炎gE单克隆抗体；硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，检测线内包被有抗牛鼻气管炎gB单克隆抗体，质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明的免疫试纸卡适用于带有牛鼻腔拭子内牛鼻气管炎病毒的检测，可在短时间内诊断出牛鼻气管炎病毒感染，特别适合现场牛鼻气管炎感染诊断、流行病学调查，具有使用方便、操作迅速简单、准确率高的技术优势。

Description

一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡及制备方法和应用。

背景技术

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)，是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的，一种牛的急性、热性、接触性传染病。该病的主要特征为上呼吸道病征，包括严重的呼吸道感染、结膜炎、脓疱性外阴阴道炎、乳腺炎、产奶量减少、运输热以及流产死胎和新生小牛神经系统感染等。IBRV感染还能诱发动物机体免疫抑制，继而感染细菌性病原和支原体等，是牛呼吸道疾病综合征的重要诱因，被认为是可由同一种病原引起的多种病症的疫病。家牛和野牛是本病的宿主，各种年龄和不同品种的牛均可感染。病牛和带毒牛是主要的传染源，动物直接接触、动物交配及人工授精等都可引发感染。

牛传染性鼻气管炎最早于1953年在美国加利福尼亚洲被报道，在七十年代IBR已广泛流传于欧洲，因此引起世界性关注。控制IBR的最有效措施是对患病动物进行扑杀，但但我国是养牛大国，根除IBR耗资巨大，对于发展中国家很不适用，所以为有效控制IBRV的扩散传播，建立有效的诊断方法以及时监测和预防IBR才是关键。

目前诊断IBRV的方法包括病原学诊断和血清学诊断两大类，病原学诊断包括病毒分离鉴定与病毒核酸检测两方面，病毒核酸检测又包括聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR(qPCR)、等温扩增技术(LAMP)等方法；血清学诊断包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、中和试验(VN)、间接血凝试验(IHA)、间接免疫荧光试验(IFA)、琼脂扩散试验(AGP)、胶体金检测技术。病毒分离鉴定方法虽然可靠，但整个过程比较复杂，费时费力，效率不高，所以在临床上不推荐使用；PCR方法、LAMP方法灵敏度高、简便、快速，但是易出现假阳性、假阴性的结果，存在一定的缺陷；qPCR方法敏感性高、特异性强、高效、不易出现假阴性结果，但试剂及仪器价格昂贵，且对操作人员要求较高，不适合在基层推广；ELISA、中和试验和间接免疫荧光等需要具备相对独立的实验室条件，操作人员的技术水平要求较高，并且实验时间过长，无法满足临床快速检测的要求；琼脂扩散试验和胶体金检测技术灵敏度低，应用价值不高。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种检测牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡及制备方法和应用。

本发明提出一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；量子点结合垫内包被有量子点标记的抗牛鼻气管炎gE蛋白单克隆抗体；硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，检测线内包被有抗牛鼻气管炎gB蛋白单克隆抗体，质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。

本发明提出上述免疫试纸卡的制备方法，包括以下步骤：

S1、将处理液体涂在结合垫上，干燥，制得预处理的结合垫；

S2、将含有所述量子点标记抗牛鼻气管炎gE蛋白的单克隆抗体的溶液涂在所述预处理的结合垫上，冷冻干燥，得到所述量子点结合垫；

S3、所述硝酸纤维素膜表面上喷涂检测线和质控线；所述检测线内包被抗牛鼻气管炎gB蛋白的单克隆抗体；所述质控线内包被羊抗鼠IgG抗体；

S4、将样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组装，得到检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡。

本发明提出一种牛鼻气管炎抗原的检测方法，采用上述试剂盒，检测方法至少包括以下步骤：

将采样拭子浸泡至样品稀释液中，充分混匀后加入3～10滴，室温静置15～20分钟，插入便携免疫荧光分析仪，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值；若检测值＞100，则结果判定为阳性，表明样品中存在牛鼻气管炎抗原；若检测值≤100，则结果判定为阴性，表明样品中无牛鼻气管炎抗原；所述采样拭子为牛鼻腔拭子。

本发明提出上述免疫试纸卡或上述试剂盒在用于流行病学调查中的应用。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明的一种检测牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡，适用于牛鼻腔拭子内牛鼻气管炎病毒的检测，可在短时间内诊断出牛鼻气管炎病毒感染，特别适合现场牛鼻气管炎病毒感染诊断、流行病学调查。其与便携免疫荧光分析仪协同使用，可直接显示检测结果，使用方便、操作迅速简单、准确率高，避免人为因素干扰，具有很强的实用性。

附图说明

图1为本发明实施例的免疫试纸卡的组装结构示意图；

图2为本发明实施例的免疫试纸卡灵敏度检测结果；

其中：1-上壳体，2-下壳体，3-加样孔，4-可视窗，5-样品垫，6-量子点结合垫，7-硝酸纤维素膜，8-吸水垫，9-检测线，10-质控线。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例提出一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡，采用量子点荧光免疫层析技术检测牛鼻气管炎病毒，其原理是：试纸条以抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体蛋白标记的量子点微球制备结合垫，硝酸纤维素膜上分别包被抗牛鼻气管炎病毒gB蛋白(T线)单克隆抗体和羊抗鼠IgG(C线)。在侧向层析过程中，当待测样本中含有牛鼻气管炎病毒时，可与量子点微球上标记的抗体特异性结合，并被捕获形成免疫复合物。冗余的量子点抗原结合物被C线上的羊抗鼠单克隆抗体捕获，固定在C线上。被捕获后的量子点微球经紫外线(波长365nm)激发可产生红色荧光信号。具体的，检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡包括：PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；量子点结合垫内包被有量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白的单克隆抗体；硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，检测线内包被有抗牛鼻气管炎病毒gB蛋白的单克隆抗体，质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。

作为本发明实施例的一种改进，抗牛鼻气管炎病毒单克隆抗体(gE蛋白、gB蛋白)，购自北京中科锐进科技有限责任公司，规格：20mg/mL，1mL/管。由于本发明实施例中需要将抗牛鼻气管炎病毒单克隆抗体与量子点标记微球连接，因此对于单抗的选择具有较高的要求，本发明通过筛选，发现北京中科锐进科技有限责任公司的单抗的效果最好。

作为本发明实施例的一种改进，量子点结合垫内量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体包被的浓度为20～100μL/cm²，优选为50μL/cm²；检测线中抗牛鼻气管炎病毒gB蛋白单克隆抗体包被质量为每厘米检测线内包被1～3μg，优选为2μg。质控线中的羊抗鼠IgG抗体包被的包被质量为每厘米检测线内包被0.5～3μg，优选为2μg。通过上述包被浓度以及比例，可以很好的控制检测的灵敏度。如果抗牛鼻气管炎病毒单克隆抗体包被量过大，会有非特异信号，如果包被量过小信号变弱，灵敏度降低；因此需要控制在一个合理的范围内。同时，也需要控制检测线和质控线中的包被量，如果检测线和质控线中的包被量过大，也会产生非特异性信号，如果包被量过小也会使信号变弱，灵敏度降低。

作为本发明实施例的一种改进，检测线与质控线之间距离为4～8mm，优选5mm。如果两者之间的距离过大或过小，都会降低其信号强度，导致灵敏度降低。

作为本发明实施例的一种改进，本发明实施还提出了量子点标记抗牛鼻气管炎病毒的单克隆抗体的制备方法，具体至少包括以下步骤：

S1、活化量子点微球，加入缓冲液；

S2、于活化后的量子点微球溶液中，加入抗抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体，混合均匀后，35～38℃放置0.5～2小时；

其中，量子点微球与抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的质量比为1：1；

S3、加入封闭剂后37℃放置30min进行封闭，离心后加入MES缓冲液，37℃放置1h，制得含有量子点标记抗抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的溶液；

MES缓冲液的配方为：0.01M～0.1M的MES，pH为6.5；

封闭剂为含1wt％BSA的甘氨酸缓冲液，甘氨酸的浓度为50mmol/L。

利用本发明实施例制备得到的量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体，可以显著提高试纸条的稳定性能。

具体的，在上述制备方法中，量子点微球选自直径为150～350nm、优选200nm的量子点微球；如果量子点微球的粒径过大，会卡在NC膜下跑不上去或有非特异信号，如果量子点微球的粒径过小，信号会变弱，灵敏度降低。

具体的，在上述制备方法中，量子点微球与单抗质量的体积质量比为4：3～4，优选为4：3；量子点微球的单位为μL，抗体的单位为μg；如果比例过大，会有非特异信号，如果比例过小，信号变弱灵敏度降低。

具体的，在上述制备方法中，活化采用EDC和NHS溶液进行活化，活化的条件为震荡反应3～10秒；量子点微球与EDC、NHS的质量比为1：20：20；每1mg量子点微球加入20～30mL、优选25mL的缓冲液。

本发明实施例还涉及上述免疫试纸卡的制备方法，包括以下步骤：

S2、将含有量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的溶液涂在预处理的结合垫上，冷冻干燥，得到量子点结合垫；

S3、硝酸纤维素膜表面上喷涂检测线和质控线；

处理液的组成为：

PEG20000：质量百分比浓度为0.2～1％；

BSA：质量百分比浓度为0.05～0.2％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.01～0.1％；

优选为：

PEG20000：质量百分比浓度为0.5％；

BSA：质量百分比浓度为0.1％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.05％；

在S2中，标记的量子点微球溶液1：100稀释后按50μL/cm²均匀涂在预处理的量子点结合垫上。

本发明实施例还涉及一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的试剂盒，包括上述免疫试纸卡，试剂盒中还含有样品稀释液，样品稀释液的组成为：氯化钠：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；Na₂HPO₄：0.08mmol～0.12mmol；酪蛋白：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；Tween-20：体积百分比浓度为0.5％～1.5％；优选为：氯化钠：质量百分比浓度为0.4％；Na₂HPO₄：0.1mmol；酪蛋白：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；Tween-20：体积百分比浓度为0.5％～1.5％。

本发明通过样本稀释液，从而可采用牛鼻腔拭子进行检测，可以快速提取拭子中的抗原，避免了采血操作，减少了采样过程中的病原扩散和污染。

本发明实施例还涉及一种牛鼻气管炎病毒抗原的检测方法，采用上述试剂盒，检测方法至少包括以下步骤：将采样拭子浸泡至样品稀释液中，充分混匀后加入3～5滴，室温静置15～20分钟，插入便携免疫荧光分析仪，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值；若检测值＞100，则结果判定为阳性，表明样品中存在牛鼻气管炎病毒抗原；若检测值≤100，则结果判定为阴性，表明样品中无牛鼻气管炎病毒抗原；采样拭子为牛鼻腔拭子。

本发明实施例还涉及上述免疫试纸卡试剂盒在用于流行病学调查中的应用。

以下具体实施例所用的试剂和生物制品来源均为市售。

实施例1：

本实施例用于说明检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡的制备方法。

检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡的制备方法包括以下步骤：

1、量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的制备：

1.1、在20μL的量子点微球中加入20mg/mL EDC溶液、20mg/mL NHS溶液各1μL，涡旋仪振荡5秒钟后，37℃保温15min，获得活化后的量子点微球；量子点微球的粒径为200nm；

1.2、活化后的量子点微球缓冲液离心后弃上清，加入缓冲液(0.1M MES pH＝6.5)25μL，得到活化后的量子点微球缓冲液；

1.3、将活化后的量子点微球缓冲液超声分散后，加入牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体15μg，混合均匀后，37℃放置1小时；

1.4、加入封闭液5μL(含1wt％BSA的甘氨酸缓冲液，浓度为50mmol/L)，于37℃恒温放置30min进行封闭，30min后离心，加入0.1M的MES(pH6.5)缓冲液25μL，制得标记的量子点微球溶液；

2、标记有量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体的量子点结合垫制备：

2.1、将未处理的结合光垫(上海金标生物科技有限公司)均匀涂上处理液，处理液的组成为：0.5wt％PEG20000、0.1wt％BSA、0.05wt％Tween-20，干燥温度为55℃；

2.2、将标记的量子点微球溶液1：100稀释后按50μL/cm²均匀涂在预处理的量子点结合垫上，冻干机冷阱-50℃以下放入，预冻30min，抽干3小时以上。

3、硝酸纤维素膜检测线和质控线喷涂：

在硝酸纤维素膜表面用喷金划膜一体机喷涂检测线(T)和质控线(C)，检测线为牛鼻气管炎病毒gB蛋白单克隆抗体，质控线为羊抗鼠IgG抗体；

牛鼻气管炎病毒gB蛋白单克隆抗体包被浓度为1.0mg/mL，羊抗鼠IgG抗体包被浓度为1.0mg/mL，两者划膜时喷涂量均为1μL/cm，且检测线与质控线之间距离5mm。

4、量子点微球免疫试纸卡的组装

PVC底板(上海金标生物科技有限公司)粘面朝上，按照如图1所示的免疫试纸卡的结构示意图将硝酸纤维素膜粘在PVC板中间位置，然后将量子点结合垫粘附于硝酸纤维素膜前，两者重叠2mm；再在量子点结合垫前、硝酸纤维素膜后分别将样品垫(上海金标生物科技有限公司)、吸水垫(上海金标生物科技有限公司)粘附在PVC底板上，样品垫、吸水垫分别和量子点结合垫、硝酸纤维素膜重叠2mm。最终切成宽度为3.5mm试纸条，外面压上塑料外壳，组装成试纸卡。

塑料外壳由下壳体和上壳体组成；下壳体内侧设有若干试纸条的定位柱，上壳体设有正对正对样品垫的加样孔，及正对硝酸纤维素膜的可视窗。

制备得到的免疫试纸卡的使用方法为：

1、如果样本冷藏或者冷冻储存，将待测样本及所需试剂从储存条件下取出，平衡至室温(15～30℃)。

2、准备检测时，从撕口处打开铝箔袋。将检测卡取出，平放于水平桌面上。

3、在检测卡上标注样本号。

4、将拭子样本放入缓冲液中，旋转拭子约10秒，同时将拭子头部靠提样管内壁按压，以释放拭子中的抗原。

5、取出拭子，按照生物危害废物处理规程丢弃拭子。

6、将瓶盖旋紧至提样管上，用力摇动提样管，使样本与缓冲液充分混合。

7、加入3滴溶液(约100μL)到样品孔中，然后开始计时。在15～20分钟判读结果。

插入便携免疫荧光分析仪，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值；

插入便携免疫荧光分析仪插口，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值A：

若检测值A＞临界值B，则结果判定为阳性，表明样品中存在牛鼻气管炎病毒抗原；

若检测值A≤临界值B，则结果判定为阴性，表明样品中无牛鼻气管炎病毒抗原。

实施例2

本实施例用于说明检测牛鼻气管炎病毒抗原的试剂盒，包括实施例1的免疫试纸卡，其还含有样品稀释液，样品稀释液的组成为：

氯化钠：质量百分比浓度为0.4％；

Na₂HPO₄：0.1mmol；

酪蛋白：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.5％～1.5％。

实验例1：

1.量子点微球免疫试纸卡的检测临界值确定

用实施例1制备的牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡，按照上述方法，检测已确认牛鼻气管炎病毒为阴性的拭子样品150份，免疫荧光分析仪读取每个样品检测值(表1)，计算牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡检测临界值，临界值＝平均检测值+2SD(标准差)＝9.99+2×9.75＝29.49。

2.量子点微球免疫试纸卡的灵敏度测定

将牛鼻气管炎病毒灭活后，用无菌PBS梯度稀释成50ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1ng/mL，用牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡进行检测，每个样品重复检验10次，以10次检测结果均为阳性的病毒最大稀释度作为该检测卡的最低检出限，结果如表1所示。

表1：牛鼻气管炎病毒量子点微球免疫试纸卡灵敏度检测结果

由以上实验结果可知，本发明实施例试纸条的灵敏度为1ng/mL。

3.量子点微球免疫试纸卡符合率测定

对收集的120份临床样品分别用牛鼻气管炎病毒荧光PCR检测试剂盒进行检测、牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡进行检测，以牛鼻气管炎病毒荧光PCR检测试剂盒检测结果作为标准，确定牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡对临床样品的检测敏感性、特异性以及总符合率。

结果牛鼻气管炎病毒荧光PCR检测试剂盒检测，该牛鼻气管炎病毒抗原量子点微球免疫试纸卡，

敏感性＝(阳性检出数/阳性数)×100％＝(53/58)×100％＝91.38％；

特异性＝(阴性检出数/阴性数)×100％＝(62/62)×100％＝100％；

总符合率＝(正确检出数/样品总数)×100％＝(115/120)×100％＝95.83％。

4.量子点微球免疫试纸卡特异性测定：

选择大肠杆菌，牛流行性腹泻病毒，支原体，牛流行热病毒﹑霍乱弧菌以及肠炎沙门氏菌进行交叉反应检测，交叉试验结果表明该试纸条与大肠杆菌，牛流行性腹泻病毒，支原体，牛流行热病毒﹑霍乱弧菌以及肠炎沙门氏菌均不发生交叉反应。

实验例2：

采用实施例1的方法制备试纸卡，区别在于单抗对的来源不同。制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表2所示。

表2

其中其他单抗对1为中国农林科学院提供单克隆抗体对(2mL/瓶)，其他单抗对2为河北农业大学提供单克隆抗体对(1mL/瓶)。

通过筛选发现北京中科锐进科技有限责任公司(货号分别为：ZK-gB，ZK-gE)的单抗对在此项目上效果最好。

实验例3：

采用实施例1的方法制备试纸卡，区别在于单抗对的选择不同，具体如表3所示。将制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表3所示。

表3

通过筛选发现用抗牛鼻气管炎gE蛋白单克隆抗体进行量子点标记，用抗牛鼻气管炎gE蛋白单克隆抗体进行检测线包被，效果最佳。

实验例4

采用实施例1的方法制备试纸卡，区别在于：量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体包被浓度不同。将制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表4所示。

表4

由表3所示实验结果可知，量子点标记抗牛鼻气管炎病毒gE蛋白单克隆抗体包被浓度为30～70μL/cm²时，均可满足检测要求，并以50μL/cm²为最佳。

实验例5

采用实施例1的方法制备试纸卡，区别在于：抗牛鼻气管炎病毒gB蛋白单克隆抗体(T线)和羊抗鼠IgG抗体(C线)包被量不同。将制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表5所示。

表5

由表4所示实验结果可知，抗牛鼻气管炎病毒gB蛋白单克隆抗体(T线)和羊抗鼠IgG抗体(C线)的浓度为0.8～1.2mg/mL时，均可满足检测要求，并以1mg/mL为最佳。

实验例6

采用实施例1的方法制备试纸卡，区别在于：检测线与质控线之间距离不同。将制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表6所示。

表6

由表6所示实验结果可知，检测线与质控线之间距离过大或者过小时，对检测的灵敏度及信号强度均有不利影响。

实验例7

采用实施例1的方法制备试纸卡，区别在于：量子点微球体积与单抗质量的比例不同。将制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表7所示。

表7

由表7所示实验结果可知，量子点微球体积与单抗质量的比例为过大或者过小时，对检测的灵敏度及信号强度均有不利影响。

实验例8

采用实施例2的方法制备试剂盒，区别在于：处理液的组成不同，具体如表8所示。将制备的得到的试纸卡按照实施例2的方法检测灵敏度，得到的实验结果如表8所示。

表8

由表8所示实验结果可知，处理液浓度过高，会抑制荧光信号，浓度过低，有非特异性，会降低其检测特异性。

实验例9

采用实施例1的方法制备试纸卡，将同一批次的试纸条在室温条件下干燥避光保存，并分别在第1月、6月、12月、18月随机抽取试纸条对0.5ng/mL的牛鼻气管炎病毒标准品进行检测，重复三次，并用公式C.V＝(SD/MN)×100％计算变异系数，考查试纸条的稳定性。实验结果如表9所示。

表9

/>

由表9的实验结果可知，结果1年半内荧光强度值无明显下降，变异系数均不超过10％，说明本发明的量子点免疫层析试纸条检测牛鼻气管炎病毒重复性好，1年半内的保存期内稳定性良好。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的免疫试纸卡，其特征在于，包括PVC底板，在PVC底板上按顺序依次固定有样品垫、量子点结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫；

所述量子点结合垫内包被有量子点标记的抗牛鼻气管炎gE蛋白单克隆抗体；

所述硝酸纤维素膜表面上设置有检测线和质控线，所述检测线内包被有抗牛鼻气管炎gB蛋白单克隆抗体，所述质控线内包被有羊抗鼠IgG抗体。

2.根据权利要求1所述的免疫试纸卡，其特征在于，所述抗牛鼻气管炎gE、gB蛋白单克隆抗体购自北京中科锐进科技有限责任公司。

3.根据权利要求1所述的免疫试纸卡，其特征在于：

所述量子点结合垫内量子点标记抗牛鼻气管炎gE蛋白单克隆抗体包被的浓度为20～100μL/cm²，优选为50μL/cm²；

所述检测线中抗牛鼻气管炎gB蛋白单克隆抗体包被质量为每厘米检测线内包被1～3μg，优选为2μg；所述质控线中的羊抗鼠IgG抗体包被的包被质量为每厘米检测线内包被0.5～3μg，优选为2μg；所述检测线与所述质控线之间距离为4～8mm，优选5mm。

4.根据权利要求1所述的免疫试纸卡，其特征在于，所述量子点标记抗牛鼻气管炎gE蛋白的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

S1、活化量子点微球，加入MES缓冲液；

S2、于活化后的量子点微球溶液中，加入所述抗牛鼻气管炎gE蛋白的单克隆抗体，混合均匀后，35～38℃放置0.5～2小时；所述量子点微球与所述抗牛鼻气管炎gE蛋白的单克隆抗体的体积质量比为4：3～4，优选为4：3；量子点微球的单位为μL，抗体的单位为μg；

所述量子点微球的直径为150～350nm，优选200nm；

S3、加入封闭剂后35～38℃放置一段时间，离心后加入MES缓冲液，35～38℃放置一段时间，制得含有所述量子点标记抗牛鼻气管炎gE蛋白的单克隆抗体的溶液；

所述MES缓冲液的配方为：0.01M～0.1M的MES，pH为6.5；

所述封闭剂为含1％BSA的甘氨酸缓冲液，甘氨酸的浓度为50mmol/L。

5.根据权利要求4所述的免疫试纸卡，其特征在于，在S1中，所述活化采用EDC和NHS溶液进行活化，活化的条件为震荡反应3～10秒；优选的，所述量子点微球与EDC、NHS的质量比为1：20：20；

每1mg量子点微球加入20～30mL、优选25mL的MES缓冲液。

6.如权利要求1～5任一项所述的免疫试纸卡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述处理液的组成为：

PEG20000：质量百分比浓度为0.2～1％；

BSA：质量百分比浓度为0.05～0.2％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.01～0.1％；

优选为：

PEG20000：质量百分比浓度为0.5％；

BSA：质量百分比浓度为0.1％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.05％；

在S2中，标记的量子点微球溶液1：100稀释后按50μL/cm²均匀涂在预处理的量子点结合垫上；

在S3中，所述牛鼻气管炎gB蛋白的单克隆抗体的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL；所述羊抗鼠IgG抗体的浓度为0.5～2mg/mL，优选为1mg/mL。

8.一种检测牛鼻气管炎病毒抗原的试剂盒，包括如权利要求1～7任一项所述的免疫试纸卡，其特征在于，所述试剂盒中还含有样品稀释液，所述样品稀释液的组成为：

氯化钠：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；

Na₂HPO₄：0.08mmol～0.12mmol；

酪蛋白：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.5％～1.5％；

优选为：

氯化钠：质量百分比浓度为0.4％；

Na₂HPO₄：0.1mmol；

酪蛋白：质量百分比浓度为0.3％～0.7％；

Tween-20：体积百分比浓度为0.5％～1.5％。

9.一种牛鼻气管炎抗原的检测方法，其特征在于，采用如权利要求8所述的试剂盒，所述检测方法至少包括以下步骤：

将采样拭子浸泡至样品稀释液中，充分混匀后加入3～10滴，室温静置15～20分钟，插入便携免疫荧光分析仪，通过收集及分析免疫荧光分析仪检测到的荧光信号，转换成检测值；若检测值＞100，则结果判定为阳性，表明样品中存在牛鼻气管炎抗原；若检测值≤100，则结果判定为阴性，表明样品中无牛鼻气管炎抗原；

所述采样拭子为牛鼻腔拭子。

10.如权利要求1～7任一项所述的免疫试纸卡或如权利要求8所述的试剂盒在用于流行病学调查中的应用。