CN113341138A - 一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡及其制备方法与应用 - Google Patents

一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时检测非洲猪瘟病毒ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，由IgM检测条和IgG检测条组合在一张检测卡上；检测条包括样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫；两个层析膜采用相同的重组ASFV抗原为固相包被物，分别为MGF360‑14L、CD2v、p72；IgM检测条的样品结合垫上包被生物素标记的抗猪IgM、示踪物标记的链霉亲和素、示踪物标记的兔抗鸡IgY，IgG检测条的样品结合垫上包被生物素标记的抗猪IgG、示踪物标记的链霉亲和素、示踪物标记的兔抗鸡IgY。本发明还提供了一种上述联合检测卡的制备方法与应用。本发明利用免疫层析技术制备检测卡，操作便利，结果直观。

Description

一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡及其制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及体外诊断及生物医学检测试剂领域，尤其涉及一种同时检测 ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡及其制备方法与应用。
背景技术
2021年3月22日，农业农村部网站发布了《养猪场非洲猪瘟(ASFV)变异株监测技术指南》。该指南是国家非洲猪瘟参考实验室为了指导养猪场做好非洲猪瘟监测工作，及时发现非洲猪瘟病毒，特别是针对目前非法疫苗造成的“疫苗毒”感染情况，提升非洲猪瘟防控能力而特意制定的。
非洲猪瘟变异株包括基因缺失株、自然变异株、自然弱毒株等。与2018 年传入的非洲猪瘟毒株相比，非洲猪瘟变异株的基因组序列、致病力等发生明显变化。生猪感染ASFV毒株后，潜伏期延长，临床表现轻微，后期可出现关节肿胀、皮肤出血型坏死灶，感染母猪产仔性能下降、死淘率增高，出现流产死胎/木乃伊胎等。与传统的流行毒株相比，生猪感染变异毒株后排毒滴度低、间隙性排毒，难以早期发现。
2020年下半年，哈尔滨兽医研究所在中国7个省份的监测结果显示：他们分离出的22株Pig/HLJ/2018(HLJ/18)基因II型ASFV，与中国最早的 Pig/HLJ/2018(HLJ/18)分离株相比，均发生基因突变、缺失、插入或短片段替换。其中，11种分离株的EP402R基因有4种不同类型的自然突变或缺失，显现出非血吸附性(non-HAD)表型。对4个分离株进行猪的毒力测试，发现其中两株病毒的致死率与HLJ/18一样高、两株非HAD菌株毒力较低，但传播力较高；低毒力的天然突变株的出现给ASF的早期诊断带来了更大的困难，也为ASFV 的防控带来了新的挑战。所以，开发一种可快速鉴别低毒突变株与野毒株的检测试剂迫在眉睫，具有十分重要的意义。
非洲猪瘟病毒的衣壳主要由病毒编码蛋白p72构成，p72是被感染猪血液中能检测到的主要抗原。CD2v和MGF360-505R是非瘟病毒的毒力基因。如果样品中有非洲猪瘟病毒(包括非瘟流行毒株和基因缺失毒株)，并采用荧光PCR方法检测，若样品中p72基因检测结果为阳性，根据CD2v和MGF360-505R基因检测结果即可鉴别野毒株与基因缺失株，也可判定具体是哪一种基因缺失株。中国检验检疫科学研究院通过与p72基因联合组成ASFV P72/CD2v双重荧光PCR检测方法，或ASFV p72/CD2v/eGFP三重荧光PCR检测方法可以检测非洲猪瘟感染，同时可以鉴别非洲猪瘟病毒野生株和CD2v基因缺失重组疫苗株，从而将感染动物和被免疫过的动物区分开来；湖北省农业科学院畜牧兽医研究所及杭州博日科技股份有限公司都研发了一种针对ASFV CD2v、VP72、MGF360-14L基因的三重荧光定量检测试剂盒；北京济凡生物技术有限公司采用多色荧光标记技术，开发了一款鉴别ASFV野毒、MGF360-505R缺失毒和CD2v与 MGF360-505R联合缺失毒基因型的检测试剂盒；南京众册生物科技有限公司开发了一种VP72基因及CD2v基因的双重实时荧光检测试剂盒；华南农业大学利用LAMP技术开发了一种区分非瘟野毒株与CD2v和MGF360-505R双基因缺失疫苗株的试剂盒。但是，目前已公开专利申请的试剂大多数基于核酸检测方法学，不仅耗时长，还需要特殊实验条件(如：实验室、仪器)，且需要冷链运输、保存。此外，中牧实业股份有限公司研发了一种非洲猪瘟病毒MGFs和CD2v酶联免疫吸附(ELISA)抗体检测试剂盒，但该试剂仅检测IgG，未检测病毒感染早期所产生的IgM抗体；此外，ELISA操作仍需具备一定的专业能力，且需要酶标仪等实验设备，不便于基层检测及应用推广。
据此，目前急需一种可快速鉴别低毒突变株与野毒株的新型血清学检测方法。
本发明提供了一种能够同时对ASFV特异性IgM和IgG抗体进行检测的联合检测装置。病毒侵入机体后首先出现的是免疫球蛋白IgM抗体，该抗体大约需要5-7天产生，然后在10-15天出现IgG抗体。因此，IgM抗体公认为早期病毒感染的检测指标，IgM增高提示早期急性感染，而IgG抗体增高提示既往感染。血清学抗体检测最大的优势在于方便快捷，检测时间较短，能够有效突破现有检测技术对人员、场所的限制，缩短检测用时。值得注意的是，研究发现：基因缺失毒株进行攻毒试验结果显示在同居猪中第28天、49天才可检测出病毒核酸，而在21天、28天可检测出抗体；在河北某猪场检测实验中，用棉线采20个栏猪群的唾液，有17个栏检测到了抗体，但只有2个栏检测到了病毒；病毒检出延后，病原检出率低而抗体检出率高。因此，免疫学检测ASFV 抗体在早期鉴别基因缺失毒与野毒感染十分重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时检测ASFV特异性IgM和 IgG抗体的联合检测卡及其制备方法与应用，其利用免疫层析技术制备抗体检测试纸卡，操作便利，可广泛应用于基层检测工作，结果直观。
本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：
一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，由IgM检测条和IgG检测条组合在一张检测卡上制成；所述IgM检测条与IgG检测条分别包括样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫；其中，两个所述检测条的层析膜上分别采用了相同的重组ASFV抗原作为固相包被物，且分别是：MGF360-14L、 CD2v、p72；同时，所述IgM检测条的样品结合垫上包被有生物素标记的抗猪 IgM、示踪物标记的链霉亲和素及示踪物标记的兔抗鸡IgY，IgG检测条的样品结合垫上包被有生物素标记的抗猪IgG、示踪物标记的链霉亲和素及示踪物标记的兔抗鸡IgY。
作为本发明的优选方式之一，每个所述检测条上，根据待测样品的流动迁移方向，依次布置有所述样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫；并且，所述IgM检测条的层析膜上分别设有CM质控线和T1M检测线、T2M检测线、T3M检测线；IgG检测条的层析膜上分别设有CG质控线和T1G检测线、T2G检测线、 T3G检测线。
作为本发明的优选方式之一，每个所述层析膜上，检测线靠近所述样品垫设置，质控线靠近所述吸水垫设置。
作为本发明的优选方式之一，所述CM质控线和CG质控线由鸡IgY喷涂形成，所述T1M检测线和T1G检测线由p72重组抗原蛋白喷涂形成，T2M检测线和 T2G检测线由CD2v重组抗原蛋白喷涂形成，T3M检测线和T3G检测线由 MGF360-14L重组抗原蛋白喷涂形成。
作为本发明的优选方式之一，所述IgM检测条与IgG检测条的样品结合垫上的示踪物具体为胶体金、荧光微球、彩色微球、磁性微球、量子点、量子点微球，或辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯化合物中的一种。
作为本发明的优选方式之一，所述IgM检测条与IgG检测条的层析膜具体为硝酸纤维素膜。
作为本发明的优选方式之一，所述联合检测卡包括卡壳，所述卡壳的内部平行设置有所述IgM检测条与IgG检测条；其中，所述IgM检测条与IgG检测条分别包括一个底板，每个所述底板上分别布置有所述样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫。
一种上述同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡的制备方法，包括如下步骤：
(1)生物素化抗体的制备
分别取山羊抗猪IgM和小鼠抗猪IgG抗体，按抗体/生物素摩尔比为1：100 的比例加入生物素，室温下培育后，使用PB缓冲液稀释至反应液体积的5倍，接着进行透析处理，制得生物素标记的抗猪IgM与生物素标记的抗猪IgG；
(2)示踪物标记的链霉亲和素的制备
在沸腾的0.01％氯金酸水溶液中按照体积比25：1加入0.5％柠檬酸三钠溶液，再调节胶体金pH至8.5，得到稳定的金溶胶；
取100mL胶体金溶液于三角锥瓶中，再取440μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀；接着，加入1.75mL 3％的聚乙二醇作为稳定剂，混匀后，得到金标链霉亲和素溶液；
(3)示踪物标记的兔抗鸡IgY的制备
在沸腾的0.01％氯金酸水溶液中按照体积比25：1加入0.5％柠檬酸三钠溶液，再调节胶体金pH至8.5，得到稳定的金溶胶；
将兔抗鸡IgY按照1:1000的标记比加入100mL金溶胶中，搅拌后，继续加入20％PEG-10000至终浓度0.05％；接着，对混合液进行离心，以除去未结合的胶体金颗粒；接着，再进行一次离心，此次除去上清，以获取初步纯化胶体金标记的兔抗鸡IgY混合物；最后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析分离纯化所得混合物，即得胶体金标记的兔抗鸡IgY；
(4)检测条制备
IgM检测条与IgG检测条分别包括底板、样品垫、样品结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜上设有质控线和检测线；制备过程如下：
制备样品结合垫：首先，取1mL步骤(2)中制备的金标链霉亲和素溶液加入到离心管中，进行离心；离心后，将上部的清亮液体吸出，留下红色沉淀，用5％蔗糖和Triton X-100作为金标链霉亲和素稀释液，加入30μL上述稀释液稀释沉淀；接着，将步骤(1)中所得的生物素化抗体和步骤(3)所得的胶体金标记的兔抗鸡IgY按照1:100稀释至1mg/mL，备用；最后，将上述三种试剂均匀喷涂于玻璃纤维膜上，烘干处理后，得金标垫；其中，IgM检测条的金标垫上，生物素化抗体为生物素标记的山羊抗猪IgM；IgG检测条的金标垫上，生物素化抗体为生物素标记的小鼠抗猪IgG；
制备样品垫：将玻璃棉在缓冲液中充分浸泡后，烘干处理，即得样品垫；所述缓冲液为0.01mol/L PBS、0.1％Triton×100或4％Tween-20、0.01％叠氮钠；
制备层析膜：按照每条检测需用0.2微克鸡IgY、0.35微克蛋白抗原来计算，在划膜喷金一体机样品A池中泵入鸡IgY，B池泵入重组p72抗原蛋白，C池中泵入重组CD2v抗原蛋白，D池中泵入重组MGF360-14L抗原蛋白；设定参数为：50dots/mL/cm；向IgM检测条与IgG检测条的硝酸纤维素膜上分别喷涂鸡IgY抗体质控线、p72蛋白检测线、CD2v蛋白检测线和MGF360-14L蛋白检测线；待所有的质控线与检测线喷涂完成，将硝酸纤维素膜于干燥箱中烘干，即得制备完成的层析膜；
组装与切割：将制备完成的层析膜粘贴在底板上，并在层析膜的一端粘贴吸水垫，在层析膜另一端粘贴金标垫，最后粘贴样品垫；待全部组装完成，将检测条试纸放入切割机中进行切割，然后在其表面封装塑胶膜；
(5)联合检测卡的制备
将步骤(4)最终制得的IgM检测条与IgG检测条分别置于同一卡壳中制成联合检测卡。
作为本发明的优选方式之一，所述步骤(4)的组装过程中，吸水垫与层析膜交叠2mm，金标垫与层析膜交叠2mm，样品垫与金标垫的交叠3mm；所述步骤(4)的切割过程中，将检测条试纸放入切割机中，切割成宽度为4mm 的试纸条。
作为本发明的优选方式之一，本发明所使用的各试剂，如山羊抗猪IgM、小鼠抗猪IgG抗体、兔抗鸡IgY、鸡IgY、重组p72抗原蛋白、重组CD2v抗原蛋白、重组MGF360-14L抗原蛋白等，均为本领域市场所流通，且可直接购买得到的常规原料。
一种上述同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡在现场快速鉴别检测ASFV基因缺失株与野毒株感染中的应用。
工作原理：检测条中待测物样品的免疫学检测方法采用“间接法”，使用时，操作者将待检样品滴加到样品垫上，样品即可通过毛细力作用向前迁移。
当流经样品结合垫时，如果样品中存在待检靶物质ASFV特异性抗体IgM 和/或IgG，那么，ASFV特异性抗体IgM和/或IgG将与生物素标记的抗猪IgM 和/或抗猪IgG结合，生物素与示踪物标记的链霉亲和素结合，最终形成“ASFV 特异性抗体IgM和/或IgG-生物素标记的抗猪IgM和/或IgG抗体-示踪物标记的链霉亲和素”复合物，然后继续流动。当继续迁移至层析膜的检测线位置时，“ASFV特异性抗体IgM和/或IgG-生物素标记的抗猪IgM和/或IgG抗体-示踪物标记的链霉亲和素”复合物将与此处的特异性固相抗原(MGF360-14L、 CD2v或p72)结合，形成“特异性固相抗原-特异性抗体IgM和/或IgG-生物素标记的抗猪IgM和/或IgG抗体-示踪物标记的链霉亲和素”复合物，出现可识别的信号(光信号或磁信号，或肉眼可观察到的颜色条带)，从而可判定“待检样品中含有相应的待检靶物质”。反之，如果待检样品中不含有相应的待检靶物质，则在此区域无复合物形成，因此无光信号或磁信号，或肉眼可识别的反应条带。
同时，质控线(C区，CM、CG)用于说明检测结果的有效性，有效的检测会在质控线处形成“鸡IgY-示踪物标记的兔抗鸡IgY”复合物，出现可检测到的光信号/磁信号，或肉眼可见的反应条带；若质控线(C区，CM、CG)无上述信号或反应条带出现，则说明该检测结果无效。
至于如何通过各检测条的检测结果来鉴别是否为ASFV野毒株或基因缺失株感染，以及ASFV感染时期，见实施例。
本发明相比现有技术的优点在于：
(1)本发明采用同时检测两种ASFV特异性抗体，特别是对病毒感染早期产生的IgM和出现稍晚的IgG抗体实现联合检测，并利用快速的免疫层析技术制备抗体检测试纸卡，操作便利、现场即时检测，可广泛应用于基层检测工作，结果直观；
(2)本发明采用了生物素-链霉亲和素标记技术，该技术是以生物素和亲和素具有的独特结合特性以及很高的亲和力(10-15M)为基础，结合二者即可偶联抗原抗体等大分子生物活性物质，它们之间的结合迅速、专一、稳固，并具有多级放大效应；基于该技术建立的检测方法极大地提高了检测的灵敏度。
(3)本发明对于现场快速鉴别检测ASFV基因缺失株与野毒株感染具有十分重要的意义。
附图说明
图1是实施例1中同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡的整体结构图；
图2是实施例1中IgM检测条与IgG检测条的侧视结构图；
图3是实施例1中IgM检测条与IgG检测条的正视平铺结构图；
图4是实施例3中判断为“早期感染”结果的检测卡展示图；
图5是实施例3中判断为“感染活跃期”结果的检测卡展示图；
图6是实施例3中判断为“中晚期或复发感染”结果的检测卡展示图；
图7是实施例3中判断为“不含有ASFV抗体”和“ASFV抗体可疑阳性”结果的检测卡展示图；
图8是实施例3中判断为“检测无效”结果的检测卡展示图；
图9是实施例3中功能性验证实验的具体检测结果图。
图中：1为卡壳，2为IgM检测条，21为CM质控线，22为T1M检测线， 23为T2M检测线，24为T3M检测线，3为IgG检测条，31为CG质控线，32为 T1G检测线，33为T2G检测线，34为T3G检测线，4为底板，5为样品垫，6为样品结合垫，7为硝酸纤维素膜，8为吸水垫。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
如图1～3所示，本实施例的一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，包括卡壳1，卡壳1的内部平行设置有IgM检测条2与IgG检测条3。IgM检测条2与IgG检测条3分别包括一个底板4，每个底板4上，根据待测样品的流动迁移方向，依次布置有样品垫5、样品结合垫6、硝酸纤维素膜 7与吸水垫8；其中，吸水垫8与硝酸纤维素膜7部分交叠，硝酸纤维素膜7 与样品结合垫6部分交叠，样品结合垫6与样品垫5部分交叠。
具体地，在本实施例中，IgM检测条2的硝酸纤维素膜7上分别设有CM质控线21和T1M检测线22、T2M检测线23、T3M检测线24，IgG检测条3的硝酸纤维素膜7上分别设有CG质控线31和T1G检测线32、T2G检测线33、T3G检测线34。其中，检测线靠近样品垫5设置，并且，T1M检测线22和T1G检测线32由p72重组抗原蛋白喷涂形成，T2M检测线23和T2G检测线33由CD2v 重组抗原蛋白喷涂形成，T3M检测线24和T3G检测线34由MGF360-14L重组抗原蛋白喷涂形成。质控线靠近吸水垫8设置，并且，CM质控线21和CG质控线31由鸡IgY喷涂形成。
具体地，在本实施例中，IgM检测条2的样品结合垫6上喷涂有生物素标记的抗猪IgM、胶体金标记的链霉亲和素及胶体金标记的兔抗鸡IgY，IgG检测条3的样品结合垫6上喷涂有生物素标记的抗猪IgG、示踪物标记的链霉亲和素及示踪物标记的兔抗鸡IgY。
具体地，在本实施例中，底板4为60mm长的硬质塑料底板，底板4的中部设黏附有25mm长的硝酸纤维素膜7；吸水垫8长18mm，与硝酸纤维素膜 7重叠2mm；样品结合垫6长10mm，与硝酸纤维素膜7重叠2mm；样品垫 5长15mm，与样品结合垫6重叠3mm。
实施例2
本实施例的一种上述实施例1中同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡的制备方法，包括如下步骤：
(1)生物素化抗体的制备
分别取100μg山羊抗猪IgM和小鼠抗猪IgG抗体，按抗体/生物素摩尔比为1：100的比例加入生物素，总体积为100μL；室温下培育4h，使用PB缓冲液稀释至反应液体积的5倍，4℃下透析72h，得生物素标记的抗猪IgM 与生物素标记的抗猪IgG。
(2)胶体金标记的链霉亲和素的制备
在50mL沸腾的0.01％氯金酸水溶液中加入2mL 0.5％柠檬酸三钠溶液，再用0.1mol/L K2 CO3调节胶体金pH至8.5得到稳定的金溶胶；
取100mL胶体金溶液于三角锥瓶中，再取440μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀20min；接着，加入1.75mL 3％的聚乙二醇作为稳定剂，继续混匀15min，用锡纸包住三角锥瓶的瓶口，得到金标链霉亲和素溶液，放入4℃冰箱中保存。
(3)胶体金标记的兔抗鸡IgY的制备
在50mL沸腾的0.01％氯金酸水溶液中加入2mL 0.5％柠檬酸三钠溶液，再用0.1mol/L K2 CO3调节胶体金pH至8.5得到稳定的金溶胶；
将兔抗鸡IgY按照1:1000的标记比加入100mL金溶胶中，缓慢搅拌10 min，继续加入20％PEG-10000至终浓度0.05％；接着，于4℃、1500rpm条件下离心20min，除去未结合的胶体金颗粒；接着，再于4℃、15000rpm条件下离心1h，此次除去上清，以获取初步纯化胶体金标记的兔抗鸡IgY混合物；最后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析分离纯化所得混合物，即得胶体金标记的兔抗鸡IgY。
(4)检测条制备
IgM检测条与IgG检测条分别包括底板、样品垫、样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，硝酸纤维素膜上设有质控线和检测线；制备过程如下：
制备样品结合垫：首先，取1mL步骤(2)中制备的金标链霉亲和素溶液加入到1.5mL离心管中，于12000rpm条件下离心15min；离心后，将上部的清亮液体吸出，留下红色沉淀，用5％蔗糖和Triton X-100作为金标链霉亲和素稀释液，加入30μL上述稀释液稀释沉淀；接着，将步骤(1)中所得的生物素化抗体和步骤(3)所得的胶体金标记的兔抗鸡IgY按照1:100稀释至1mg/mL，备用；最后，将上述三种试剂均匀喷涂于玻璃纤维膜上，56℃烘干1h，得金标垫；其中，IgM检测条的金标垫上，生物素化抗体为生物素标记的山羊抗猪 IgM；IgG检测条的金标垫上，生物素化抗体为生物素标记的小鼠抗猪IgG。
制备样品垫：将玻璃棉在缓冲液中充分浸泡后，于56℃干燥1h，即得样品垫；抽真空密封，4℃干燥保存备用；所述缓冲液为0.01mol/L PBS、0.1％ Triton×100或4％Tween-20、0.01％叠氮钠。
制备硝酸纤维素膜：按照每条检测需用0.2微克鸡IgY、0.35微克蛋白抗原来计算，在划膜喷金一体机样品A池中泵入鸡IgY，B池泵入重组p72抗原蛋白，C池中泵入重组CD2v抗原蛋白，D池中泵入重组MGF360-14L抗原蛋白；设定参数为：50dots/mL/cm；向IgM检测条与IgG检测条的硝酸纤维素膜上分别喷涂鸡IgY抗体质控线、p72蛋白检测线、CD2v蛋白检测线和MGF360-14L 蛋白检测线；待所有的质控线与检测线喷涂完成，将硝酸纤维素膜于42℃干燥箱中烘干，即得制备完成的硝酸纤维素膜。
组装与切割：将制备完成的硝酸纤维素膜粘贴在底板上，并在硝酸纤维素膜的一端粘贴吸水垫，在硝酸纤维素膜另一端粘贴金标垫，最后粘贴样品垫；待全部组装完成，将检测条试纸放入切割机中，切割成宽度为4mm的试纸条，然后在其表面封装塑胶膜。
(5)联合检测卡的制备
将步骤(4)最终制得的IgM检测条与IgG检测条分别置于同一卡壳中制成联合检测卡。
其中，需要注意的是，本实施例所使用的试剂，如山羊抗猪IgM、小鼠抗猪IgG抗体、兔抗鸡IgY、鸡IgY、重组p72抗原蛋白、重组CD2v抗原蛋白、重组MGF360-14L抗原蛋白等，均为本领域市场所流通，且可直接购买得到的常规原料。
同时，本实施例所使用的示踪物除了采用胶体金外，还可以替换为荧光微球、彩色微球、磁性微球、量子点、量子点微球，或辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或吖啶酯化合物中的一种。
工作原理：检测条中待测物样品的免疫学检测方法采用“间接法”，使用时，操作者将待检样品滴加到样品垫上，样品即可通过毛细力作用向前迁移。
当流经样品结合垫时，如果样品中存在待检靶物质ASFV特异性抗体IgM 和/或IgG，那么，ASFV特异性抗体IgM和/或IgG将与生物素标记的抗猪IgM 和/或抗猪IgG结合，生物素与示踪物标记的链霉亲和素结合，最终形成“ASFV 特异性抗体IgM和/或IgG-生物素标记的抗猪IgM和/或IgG抗体-示踪物标记的链霉亲和素”复合物，然后继续流动。当继续迁移至硝酸纤维素膜的检测线位置时，“ASFV特异性抗体IgM和/或IgG-生物素标记的抗猪IgM和/或IgG 抗体-示踪物标记的链霉亲和素”复合物将与此处的特异性固相抗原 (MGF360-14L、CD2v或p72)结合，形成“特异性固相抗原-特异性抗体IgM 和/或IgG-生物素标记的抗猪IgM和/或IgG抗体-示踪物标记的链霉亲和素”复合物，出现可识别的信号(光信号或磁信号，或肉眼可观察到的反应条带)，从而可判定“待检样品中含有相应的待检靶物质”。反之，如果待检样品中不含有相应的待检靶物质，则在此区域无复合物形成，因此无光信号或磁信号，或肉眼可识别的反应条带。
同时，质控线(C区，CM、CG)用于说明检测结果的有效性，有效的检测会在质控线处形成“鸡IgY-示踪物标记的兔抗鸡IgY”复合物，出现可检测到的光信号/磁信号，或肉眼可见的反应条带；若质控线(C区，CM、CG)无上述信号或反应条带出现，则说明该检测结果无效。
至于如何通过各检测条的检测结果来鉴别是否为ASFV野毒株或基因缺失株感染，以及ASFV感染时期，见实施例3部分。
实施例3
本实施例的一种上述实施例1中同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡的的功能性验证：
取9支上述制备的试剂卡平放于干燥平面上，其中3支滴加10μL ASFV 野毒阳性血清(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心)于试纸卡加样孔正上方、3支滴加10μL ASFV基因缺失毒阳性血清(购于中国兽医微生物菌种保藏管理中心)于试纸卡加样孔正上方、另外3支滴加10μL正常猪只血清(购买) 于试纸卡加样孔正上方作为阴性对照，并分别垂直滴加2滴缓冲液至加样孔中，计时5分钟，根据结果判断方法对检测结果进行判定。结果判读标准如下，示意图见图4～9所示：
1、判断为“早期感染”有以下几种情况(图4)：
参见图4a，若质控线(CM、CG)、p72检测线(T1M线)、CD2v检测线(T2M线)、MGF360-14L检测线(T3M线)均显色，p72检测线(T1G线)、CD2v检测线(T2G线)、MGF360-14L检测线(T3G线)不显色，结果提示：样本含有ASFV 野毒抗体，并处于ASFV感染早期。
参见图4b，若质控线(CM、CG)、p72检测线(T1M线)显色，但CD2v检测线(T2M线)或MGF360-14L检测线(T3M线)不显色，且p72检测线(T1G线)、CD2v检测线(T2G线)、MGF360-14L检测线(T3G线)也不显色，结果提示：标本含有基因缺失毒抗体，并处于ASFV感染早期。
2、判断为“感染活跃期”有以下几种情况(图5)：
参见图5a，若质控线(CM、CG)、p72检测线(T1M线及T1G线)、CD2v检测线(T2M线及T2G线)、MGF360-14L检测线(T3M线及T3G线)均显色，结果提示：样本含有ASFV野毒抗体，并处于ASFV感染活跃期。
参见图5b，若质控线(CM、CG)、p72检测线(T1M线及T1G线)显色，但 CD2v检测线(T2M线及T2G线)或MGF360-14L检测线(T3M线及T3G线)不显色，结果提示：标本含有基因缺失毒抗体，并处于ASFV感染活跃期。
3、判断为“中晚期或复发感染”有以下几种情况(图6)：
参见图6a，若质控线(CM、CG)、p72检测线(T1G线)、CD2v检测线(T2G线)、MGF360-14L检测线(T3G线)均显色，且p72检测线(T1M线)、CD2v 检测线(T2M线)、MGF360-14L检测线(T3M线)不显色，结果提示：样本含有ASFV野毒抗体，并处于ASFV感染中晚期或复发感染期。
参见图6b，若质控线(CM、CG)、p72检测线(T1G线)显色，但CD2v检测线(T2G线)或MGF360-14L检测线(T3G线)不显色，且p72检测线(T1M线)、CD2v检测线(T2M线)、MGF360-14L检测线(T3M线)也不显色，结果提示：标本含有基因缺失毒抗体，并处于ASFV感染中晚期或复发感染期。
4、其他情况(图7、图8)：
参见图7a，若质控线(CM、CG)显色，而p72检测线(T1M线及T1G线)、 CD2v检测线(T2M线及T2G线)、MGF360-14L检测线(T3M线及T3G线)均无显色，结果提示：样本不含有ASFV抗体。
参见图7b、7c、7d，若质控线(CM、CG)显色，CD2v检测线(T2M线、 T2G线)和/或MGF360-14L检测线(T3M线、T3G线)显色，而p72检测线(T1M线、T1G线)却没有显色，提示该标本为ASFV抗体可疑阳性，需重新检测一次。
参见图8a、8b、8c、8d、8e、8f、8g，若质控线(CM、CG)没有显色，但 CD2v检测线(T2M线、T2G线)和/或MGF360-14L检测线(T3M线、T3G线)和 /或p72检测线(T1M线、T1G线)出现显色，结果提示该检测无效。
具体检测结果如图9所示。根据图9可以看出：3支滴加野毒阳性血清的试纸卡在T1G检测线、T2G检测线、T3G检测线和质控线(CM、CG)位置同时出现五条深色反应带，在T1M检测线、T2M检测线、T3M检测线不显色(图9a)，结果判定为ASFV野毒阳性，并处于ASFV感染中后期。3支滴加ASFV基因缺失毒阳性血清的试纸卡在T1G检测线及质控线位置同时出现两条深色反应带，其余条带均不显色(图9b)，结果判定为ASFV基因缺失毒阳性，并处于 ASFV感染中后期；3支滴加正常猪只血清的试纸卡在T1M和T1G检测线、T2M和T2G检测线及T3M和T3G检测线处均不显色，在质控线(CM、CG)位置出现两条深色反应带，结果判定为ASFV阴性(图9c)。
据上述检测结果表明，本发明制备试纸卡具备能够准确检测并区分ASFV 野毒及ASFV基因缺失毒抗体功能，从而鉴别是否为ASFV野毒株或基因缺失株感染，并可通过双联卡IgM和IgG抗体同时检测鉴别ASFV感染时期。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，由IgM检测条和IgG检测条组合在一张检测卡上制成；所述IgM检测条与IgG检测条分别包括样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫；其中，两个所述检测条的层析膜上分别采用了相同的重组ASFV抗原作为固相包被物，且分别是：MGF360-14L、CD2v、p72；同时，所述IgM检测条的样品结合垫上包被有生物素标记的抗猪IgM、示踪物标记的链霉亲和素及示踪物标记的兔抗鸡IgY；所述IgG检测条的样品结合垫上包被有生物素标记的抗猪IgG、示踪物标记的链霉亲和素及示踪物标记的兔抗鸡IgY。
2.根据权利要求1所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，每个所述检测条上，根据待测样品的流动迁移方向，依次布置有所述样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫；并且，所述IgM检测条的层析膜上分别设有CM质控线和T1M检测线、T2M检测线、T3M检测线；IgG检测条的层析膜上分别设有CG质控线和T1G检测线、T2G检测线、T3G检测线。
3.根据权利要求2所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，每个所述层析膜上，检测线靠近所述样品垫设置，质控线靠近所述吸水垫设置。
4.根据权利要求2所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，所述CM质控线和CG质控线由鸡IgY喷涂形成，所述T1M检测线和T1G检测线由p72重组抗原蛋白喷涂形成，T2M检测线和T2G检测线由CD2v重组抗原蛋白喷涂形成，T3M检测线和T3G检测线由MGF360-14L重组抗原蛋白喷涂形成。
5.根据权利要求1所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，所述IgM检测条与IgG检测条的样品结合垫上的示踪物具体为胶体金、荧光微球、彩色微球、磁性微球、量子点、量子点微球，或辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、吖啶酯化合物中的一种。
6.根据权利要求1所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，所述IgM检测条与IgG检测条的层析膜具体为硝酸纤维素膜。
7.根据权利要求1～6任一所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡，其特征在于，所述联合检测卡包括卡壳，所述卡壳的内部平行设置有所述IgM检测条与IgG检测条；其中，所述IgM检测条与IgG检测条分别包括一个底板，每个所述底板上分别布置有所述样品垫、样品结合垫、层析膜与吸水垫。
8.一种如权利要求1～7任一所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)生物素化抗体的制备
分别取山羊抗猪IgM和小鼠抗猪IgG抗体，按抗体：生物素摩尔比为1：100的比例加入生物素，室温下培育后，使用PB缓冲液稀释至反应液体积的5倍，接着进行透析处理，制得生物素标记的抗猪IgM与生物素标记的抗猪IgG；
(2)示踪物标记的链霉亲和素的制备
在沸腾的0.01％氯金酸水溶液中按照体积比25：1加入0.5％柠檬酸三钠溶液，再调节胶体金pH至8.5，得到稳定的金溶胶；
取100mL胶体金溶液于三角锥瓶中，再取440μL浓度为1mg/mL的链霉亲和素溶液逐滴加入到胶体金溶液中，震荡混匀；接着，加入1.75mL 3％的聚乙二醇作为稳定剂，混匀后，得到金标链霉亲和素溶液；
(3)示踪物标记的兔抗鸡IgY的制备
在沸腾的0.01％氯金酸水溶液中按照体积比25：1加入0.5％柠檬酸三钠溶液，再调节胶体金pH至8.5，得到稳定的金溶胶；
将兔抗鸡IgY按照1:1000的标记比加入100mL金溶胶中，搅拌后，继续加入20％PEG-10000至终浓度0.05％；接着，对混合液进行离心，以除去未结合的胶体金颗粒；接着，再进行一次离心，此次除去上清，以获取初步纯化胶体金标记的兔抗鸡IgY混合物；最后，用丙烯葡聚糖S-400柱层析分离纯化所得混合物，即得胶体金标记的兔抗鸡IgY；
(4)检测条制备
IgM检测条与IgG检测条分别包括底板、样品垫、样品结合垫、层析膜和吸水垫，层析膜上设有质控线和检测线；制备过程如下：
制备样品结合垫：首先，取1mL步骤(2)中制备的金标链霉亲和素溶液加入到离心管中，进行离心；离心后，将上部的清亮液体吸出，留下红色沉淀，用5％蔗糖和Triton X-100作为金标链霉亲和素稀释液，加入30μL上述稀释液稀释沉淀；接着，将步骤(1)中所得的生物素化抗体和步骤(3)所得的胶体金标记的兔抗鸡IgY按照1:100稀释至1mg/mL，备用；最后，将上述三种试剂均匀喷涂于玻璃纤维膜上，烘干处理后，得金标垫；其中，IgM检测条的金标垫上，生物素化抗体为生物素标记的山羊抗猪IgM；IgG检测条的金标垫上，生物素化抗体为生物素标记的小鼠抗猪IgG；
制备样品垫：将玻璃棉在缓冲液中充分浸泡后，烘干处理，即得样品垫；所述缓冲液为0.01mol/L PBS、0.1％Triton×100或4％Tween-20、0.01％叠氮钠；
制备层析膜：按照每条检测需用0.2微克鸡IgY、0.35微克蛋白抗原来计算，在划膜喷金一体机样品A池中泵入鸡IgY，B池泵入重组p72抗原蛋白，C池中泵入重组CD2v抗原蛋白，D池中泵入重组MGF360-14L抗原蛋白；设定参数为：50dots/mL/cm；向IgM检测条与IgG检测条的硝酸纤维素膜上分别喷涂鸡IgY抗体质控线、p72蛋白检测线、CD2v蛋白检测线和MGF360-14L蛋白检测线；待所有的质控线与检测线喷涂完成，将硝酸纤维素膜于干燥箱中烘干，即得制备完成的层析膜；
组装与切割：将制备完成的层析膜粘贴在底板上，并在层析膜的一端粘贴吸水垫，在层析膜另一端粘贴金标垫，最后粘贴样品垫；待全部组装完成，将检测条试纸放入切割机中进行切割，然后在其表面封装塑胶膜；
(5)联合检测卡的制备
将步骤(4)最终制得的IgM检测条与IgG检测条分别置于同一卡壳中制成联合检测卡。
9.根据权利要求8所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)的组装过程中，吸水垫与层析膜交叠2mm，金标垫与层析膜交叠2mm，样品垫与金标垫的交叠3mm；所述步骤(4)的切割过程中，将检测条试纸放入切割机中，切割成宽度为4mm的试纸条。
10.一种如权利要求1～7任一所述的同时检测ASFV特异性IgM和IgG抗体的联合检测卡在现场快速鉴别检测ASFV基因缺失株与野毒株感染中的应用。
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