CN111879933A - 检测新型冠状病毒的免疫层析试纸 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2的免疫层析试纸，所述试纸条包括基板，以及设置于基板的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上，所述基板为PVC板；所述样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS‑CoV‑2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2(ACE2)，所述结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS‑CoV‑2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。本申请所述免疫层析试纸实现了高灵敏度、高特异性、速度快、操作便捷的检测，可应用基层医院、社区中人群的大规模快速筛查。

Description

检测新型冠状病毒的免疫层析试纸
技术领域
本发明涉及了免疫检测技术领域，特别是涉及了一种检测新型冠状病毒的免疫层析试纸。
背景技术
2019年年底暴发的新型冠状病毒肺炎，严重影响着全球公共卫生安全。 2020年1月 12日 ，世界卫生组织（WHO）正式将该新型冠状病毒命名为“2019-nCov”。 2020年2月11日 ，WHO将该新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。与此同时，国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组（ICVT-CSG）将该病毒命名为 “严重急性呼吸综合征冠状病毒 2”（SARS-CoV-2）。
迄今为止，虽然越来越多的候选药物已进入科研人员视野，大量临床试验正在全球开展，不过真正的新冠特效药迄今仍未出现。同时，新冠疫苗研发有了诸多新进展，多家企业进入新冠疫苗临床阶段，然而，距离临床应用、大范围接种还需要时间。目前而言，新型冠状病毒肺炎管控的有效手段仍是早发现、早隔离、早诊断、早治疗。因而，适用于大量人群的准确、快速、便捷的检测产品，仍是市场、公共卫生机构所迫切需要的。
免疫层析试纸以其简单、经济、快速、灵敏度较高、特异性较强、所需样本量少、不需特制检测仪器等优势，是检测新型冠状病毒的较优选择。目前，已有多家公司、科研单位研发了免疫层析检测新型冠状病毒的免疫层析设备。如专利申请CN202010218543.6，其公开了一种用于检测新型冠状病毒的时间分辨荧光免疫层析试剂盒，微球标记垫上涂覆有微球标记的COVID-19单克隆抗体涂层，检测线上涂覆有COVID-19 N蛋白单克隆抗体涂层。专利申请CN202010136067.3，其公开了一种用于快速检测新型冠状病毒N蛋白的免疫层析试剂盒，检测线上包被有一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，标记物垫上包被有标记物标记的另一株抗新型冠状病毒N蛋白单克隆抗体，标记物为荧光微球、胶体金、胶体硒、彩色乳胶或磁性微球。专利申请CN202010224758.9，一种新型冠状病毒COVID-19抗原荧光检测免疫层析试剂盒，结合垫上含有荧光微球标记的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体，检测区包被T有与结合垫上的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体不同表位的新型冠状病毒COVID-19 Spike蛋白单克隆抗体。专利申请CN202010184382.3，结合垫上包被有胶体金标记的新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体，检测线上包被有新型冠状病毒NP蛋白单克隆抗体。
虽然目前已存在检测新型冠状病毒的免疫层析装置，但是均采用了常规的标记形式，灵敏度仍有所欠缺。本发明提供了一种更为灵敏的免疫层析检测试纸，以其更准确的实现早期鉴别诊断。
发明内容
本发明提供一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，实现了高灵敏度、高特异性、速度快、操作便捷的检测，可应用基层医院、社区中人群的大规模快速筛查。
本发明所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，所述试纸包括基板，以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上。所述基板为PVC板。
优选的，所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布，所述样品垫处理液含有0.1%-0.3%（v/v）Tween 20、0.4%-0.6%（w/v）蔗糖、0.4%-0.7%（w/v）酪蛋白、0.5%-0.8%（w/v）BSA、0.5%-2%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。
优选的，检测样品经样品稀释液稀释，所述样品稀释液为含有0.05%-0.3%（w/v）BSA和0.3%-0.7%（w/v）PEG2000的0.5M PBS溶液。
优选的，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％（v/v）Tween-20、5％（w/v）蔗糖、1％（w/v）BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
优选的，检测样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。
在一个实施例中，样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金。每个亲和素能够结合4分子的生物素，由此使得检测信号放大。硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。
生物素标记抗体或受体方法为：使用碳酸氢钠缓冲液使用将抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体或血管紧张素转换酶2 (ACE2)稀释。BNHS用DMSO稀释至工作浓度。取稀释后的单克隆抗体或ACE2，按照单克隆抗体或ACE2与BNSH物质的量之比为l：15～1：50的比例加入BNSH，混匀后置于室温反应2h，之后在4℃下于PBS缓冲液中透析以进行纯化。
亲和素交联胶体金的方法为：将胶体金溶液250ml加入25ml，0.1M，pH＝9.00碳酸盐缓冲液，再按照20μg/mL的量加入亲和素5.0mg，最后加入2％（w/v）BSA溶液25ml，形成亲和素胶体金复合物。
在另一个实施例中，在EP管中将样品与生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)混合，孵育30min，之后，将混合液添加到样品垫上，结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金。硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。
如以上两个实施例，含有SARS-CoV-2的样品经由样品垫流至结合垫，由于生物素、亲和素之间的相互作用形成：胶体金-亲和素--生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体--SARS-CoV-2、胶体金-亲和素--生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)-- SARS-CoV-2。混合物继续流动，流至硝酸纤维素膜，检测线上抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体截留上述混合物，形成胶体金-亲和素--生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体--SARS-CoV-2--抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体、胶体金-亲和素--生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)-- SARS-CoV-2--抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体。过量的胶体金-亲和素--生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体可涌动至质控线与羊抗鼠IgG结合。
本发明创造性的使用了抗体、受体的组合用于结合新型冠状病毒SARS-CoV-2，使用另一株不同的抗体将反应复合物捕获，其结合新型冠状病毒SARS-CoV-2的不同抗原表位，能够准确的鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2，有效的避免漏检，使得假阴性率显著降低。同时，本发明采用了生物素-亲和素系统，其进一步提升了本发明的灵敏度。
具体实施方式
实施例1：重组抗原的制备
参照 CN202010105749.8专利申请，合成S蛋白、N蛋白、M蛋白，所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述E蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。
SEQID NO.1序列如下：
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTAAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
SEQID NO.12序列如下：
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTLEHHHHHH。
SEQ ID NO.13序列如下：
MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ。
SEQIDNO.14序列如下：
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLVGGGGSASGGGSMYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLVGGGGSASGGGSMYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV。
实施例2：单克隆抗体的制备
参照 CN202010105749.8专利申请，选择免疫动物、细胞融合、选择特异性杂交瘤细胞、单克隆抗体的大量制备(腹水制备)，以及，使用硫酸铵沉淀、Protein A亲和层析纯化获得针对于S蛋白、N蛋白、M蛋白、E蛋白的单克隆抗体。
实施例3：重组ACE2蛋白的制备
ACE2的RNA提取：取约100 mg肺组织，加入Trizol试剂1 ml，匀浆器匀浆。转入1.5 mlEP管，室温放置5 min后，4℃，12 000 g，离心10 min。加入氯仿0.2 ml，混匀，室温放置3min后，4℃，15 000 g，离心15 min。取上清，加入0.5 ml异丙醇，室温放置10 min后， 4℃，12000 g，离心10 min。弃上清，加 1 ml 75%乙醇，振荡混匀，4℃，7800g，离心 5 min。弃上清，空气干燥后，加入 30μL 1‰DEPC 处理水溶解。
根据GenBank ACE-2序列信息（NM021804）设计逆转录巢式聚合酶链反应引物。
外引物对为：ACE2-OutF：5’-CCCAACCCAAGTTCAAAG-3’，ACE2-OutR: 5’-GCATGCCATTCTCAATCC-3’，预扩增片段大小为 2961bp。
内引物对为：ACE2-InF: 5’-ATGTCAAGCTCTTCCTGGC-3’, ACE2-InR:5’-CTAAAAGGAGGTCTGAACATC-3’，预扩增片段为 2418 bp，为其完整开放读码框。
采用ThermoScript RT-PCR System，取2μg总RNA为模板，以Oligo(dT) 20为引物，50℃进行60 min的逆转录反应合成cDNA；取 2μl作为PCR反应模板，TaKaRa公司高保真LA-Taq DNA 聚合酶进行Nested-PCR扩增。PCR产物经切胶纯化，TA克隆至pcDNA4/HisMax-TOPO载体上，构建成 SARS-CoV受体ACE-2的真核表达质粒pcDNA4/ACE-2。采用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将重组质粒 cDNA4/ACE-2转染293T细胞，48h后收集转染细胞，重悬于含50 mmol/L T ris、150mmol/L NaCl、1% NP-40和1 mmol /L PMSF的细胞裂解液，过NTA-Ni柱纯化蛋白。
实施例4：生物素标记物的制备
用0.1mol/L、pH8.5的碳酸氢钠缓冲液分别将针对于S蛋白的单克隆抗体、M蛋白的单克隆抗体、N蛋白的单克隆抗体、E蛋白的单克隆抗体、ACE2蛋白稀释成浓度为：1mg/mL，BNHS用DMSO稀释成浓度为20mg/ml。取1mL单抗或ACE2，按生物素与单抗物质的量之比为l：15～1：50加入BNHS，混匀后置于室温反应2h，之后在4℃下于0.1mol/L、pH8.5的PBS缓冲液中透析以进行纯化。
实施例5：胶体金的制备
配制1％(w/v)的氯金酸，取1mL 1％(w/v) 的氯金酸溶液与99mL的超纯水混合，加入到预热干燥的250mL锥形瓶中，加热至沸腾并煮沸15min；快速加入还原剂 1％(w/v)柠檬酸钠2.75mL。加入还原剂的过程要迅速，连续。持续加热沸腾 5min左右，当溶液变为稳定的酒红色，停止加热，胶体金直径为13-40nm。
实施例6：亲和素交联胶体金的制备
将胶体金溶液250ml加入25ml，0.1M，pH＝9.00碳酸盐缓冲液，再按照20μg/mL的量加入亲和素5.0mg，最后加入2％（w/v）BSA溶液25ml，形成亲和素胶体金复合物。
实施例7：免疫层析试纸1的制备
①配制样品垫处理液，样品垫处理液含有0.2%（v/v）Tween 20、0.5%（w/v）蔗糖、0.6%（w/v）酪蛋白、0.7（w/v）BSA、1%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆生物素标记的抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体，生物素标记的抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体浓度为1mg/mL，涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml，涂覆量为50μL。其中，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％(v/v)Tween-20、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体溶液装入划膜机，单克隆抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为检测线。将羊抗鼠IgG抗体溶液装入划膜机，抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。检测线和质控线相距0.4cm。
实施例8：免疫层析试纸2的制备
①配制样品垫处理液，样品垫处理液含有0.2%（v/v）Tween 20、0.5%（w/v）蔗糖、0.6%（w/v）酪蛋白、0.7（w/v）BSA、1%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆有生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)，生物素标记的ACE2浓度为1mg/mL，涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml，涂覆量为50μL。其中，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％(v/v)Tween-20、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体溶液装入划膜机，单克隆抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为检测线。将羊抗鼠IgG抗体溶液装入划膜机，抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。检测线和质控线相距0.4cm。
实施例9：免疫层析试纸3的制备
①配制样品垫处理液，样品垫处理液含有0.2%（v/v）Tween 20、0.5%（w/v）蔗糖、0.6%（w/v）酪蛋白、0.7（w/v）BSA、1%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体混合溶液中两者浓度均为1mg/mL，混合溶液的涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml，涂覆量为50μL。其中，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％Tween-20、5％蔗糖、1％BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体溶液装入划膜机，单克隆抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为检测线。将羊抗鼠IgG抗体溶液装入划膜机，抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。检测线和质控线相距0.4cm。
实施例10：免疫层析试纸4的制备
①配制样品垫处理液，样品垫处理液含有0.2%（v/v）Tween 20、0.5%（w/v）蔗糖、0.6%（w/v）酪蛋白、0.7（w/v）BSA、1%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)。生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)混合溶液中两者浓度均为1mg/mL，混合溶液的涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml，涂覆量为50μL。其中，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％(v/v)Tween-20、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体溶液装入划膜机，单克隆抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为检测线。将羊抗鼠IgG抗体溶液装入划膜机，抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。检测线和质控线相距0.4cm。
实施例11：免疫层析试纸5的制备
①配制样品垫处理液，样品垫处理液含有0.2%（v/v）Tween 20、0.5%（w/v）蔗糖、0.6%（w/v）酪蛋白、0.7（w/v）BSA、1%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的抗SARS-CoV-2 E蛋白单克隆抗体、生物素标记的抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的抗SARS-CoV-2 E蛋白单克隆抗体、生物素标记的抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体混合溶液中三者浓度均为1mg/mL，混合溶液的涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml，涂覆量为50μL。其中，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％(v/v)Tween-20、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体溶液装入划膜机，单克隆抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为检测线。将羊抗鼠IgG抗体溶液装入划膜机，抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。检测线和质控线相距0.4cm。
实施例12：免疫层析试纸6的制备
①配制样品垫处理液，样品垫处理液含有0.2%（v/v）Tween 20、0.5%（w/v）蔗糖、0.6%（w/v）酪蛋白、0.7（w/v）BSA、1%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)、生物素标记的抗SARS-CoV-2 E蛋白单克隆抗体。生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)、生物素标记的抗SARS-CoV-2 E蛋白单克隆抗体混合溶液中三者浓度均为1mg/mL，混合溶液的涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml，涂覆量为50μL。其中，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％(v/v)Tween-20、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次固定于PVC底板上。
④将抗SARS-CoV-2 M蛋白单克隆抗体溶液装入划膜机，单克隆抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为检测线。将羊抗鼠IgG抗体溶液装入划膜机，抗体的浓度为1mg/mL，液体装入划膜机，设定划线量为1μL/cm，在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。检测线和质控线相距0.4cm。
实施例13：标准品的检测
配制不同浓度的人新型冠状病毒SARS-CoV-2校准品(70ng/ml、35ng/ml、14ng/ml、7ng/ml、3.5ng/ml、 0.7ng/ml、0.0ng/ml)共七个浓度，每个浓度设置六个重复。将不同浓度的标准品分别添加至上述免疫层析试纸1-6的样品垫上。免疫层析试纸1、2在SARS-CoV-2为35ng/ml时均可见淡红色检测线，其中，试纸2中检测线条带较试纸1检测线条带的颜色略深，其表明血管紧张素转换酶2 (ACE2)结合病毒的能力优于抗SARS-CoV-2 S蛋白单克隆抗体。免疫层析试纸3在SARS-CoV-2为14ng/ml时可见淡红色检测线，免疫层析试纸4在SARS-CoV-2为7ng/ml时可见淡红色检测线，混合的抗体，或混合的抗体、受体能够结合病毒上的不同位点，避免了单一抗体受反应环境影响导致的结合能力不足的问题，其表明采用混合的抗体、受体比单独的检测抗体具有更高的检测灵敏度。免疫层析试纸5、6在SARS-CoV-2为14ng/ml时可见淡红色检测线，并不能检测7ng/ml的SARS-CoV-2。出乎意料的是，三种抗体的混合物、或两种抗体与受体的混合物并未增加，这可能是由于已经结合至病毒的胶体金颗粒增加了位阻，阻碍了其他抗体与病毒的结合。
实施例14：样品检测
采用免疫层析试纸1-6检测10例正常人血清、10例新冠肺炎患者血清。对于正常人血清，免疫层析试纸1-6的检测结果均为阴性。免疫层析试纸1-2、免疫层析试纸3、5-6检测到了9例阳性，1例呈阴性。免疫层析试纸4检测到了10例阳性。对于上述阴性样本，免疫层析试纸4中检测线呈现淡红色条带。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例，但是对本领域技术人员而言，只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。

Claims (5)

1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的免疫层析试纸，所述试纸条包括基板，以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上，优选的，所述基板为PVC板；所述样品垫上涂覆有生物素标记的抗SARS-CoV-2 N蛋白单克隆抗体、生物素标记的血管紧张素转换酶2 (ACE2)，所述结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线上包被抗SARS-CoV-2M蛋白单克隆抗体，质控线上羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述免疫层析试纸，其特征在于，所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布，所述样品垫处理液含有0.1%-0.3%（v/v）Tween 20、0.4%-0.6%（w/v）蔗糖、0.4%-0.7%（w/v）酪蛋白、0.5%-0.8%（w/v）BSA、0.5%-2%（w/v）NaCl，余量为超纯水，pH8.0。
3.根据权利要求1所述免疫层析试纸，其特征在于，检测样品经样品稀释液稀释，所述样品稀释液为含有0.05%-0.3%（w/v）BSA和0.3%-0.7%（w/v）PEG2000的0.5M PBS溶液。
4.根据权利要求1所述免疫层析试纸，其特征在于，结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后，滴加金标抗体烘干，结合垫处理液含0.1％（v/v）Tween-20、5％(w/v)蔗糖、1％(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液，pH 7.2。
5.根据权利要求1所述免疫层析试纸，其特征在于，检测样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。
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