CN111896747A - 检测新型冠状病毒IgM和IgG的免疫层析试纸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测新型冠状病毒SARS‑CoV‑2IgM和IgG的免疫层析试纸,所述免疫层析试纸能够准确的鉴定新型冠状病毒SARS‑CoV‑2感染,有效的避免漏检,使得假阴性率显著降低。同时,本发明采用了生物素‑亲和素系统,其进一步提升了本发明的灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及了免疫检测技术领域,特别是涉及了一种检测新型冠状病毒的免疫层析试纸。
背景技术
2019年年底暴发的新型冠状病毒肺炎,严重影响着全球公共卫生安全。 2020年1月 12日 ,世界卫生组织(WHO)正式将该新型冠状病毒命名为“2019-nCov”。 2020年2月11日 ,WHO将该新型冠状病毒感染的肺炎命名为“COVID-19”。与此同时,国际病毒分类委员会冠状病毒研究小组(ICVT-CSG)将该病毒命名为 “严重急性呼吸综合征冠状病毒 2”(SARS-CoV-2)。
迄今为止,虽然越来越多的候选药物已进入科研人员视野,大量临床试验正在全球开展,不过真正的新冠特效药迄今仍未出现。同时,新冠疫苗研发有了诸多新进展,多家企业进入新冠疫苗临床阶段,然而,距离临床应用、大范围接种还需要时间。目前而言,新型冠状病毒肺炎管控的有效手段仍是早发现、早隔离、早诊断、早治疗。因而,适用于大量人群的准确、快速、便捷的检测产品,仍是市场、公共卫生机构所迫切需要的。
新型冠状病毒(SARS-CoV-2)特异性IgM抗体多在发病3-5天后阳性,IgG抗体滴度恢复期较急性期有4倍及以上增高,新型冠状病毒特异性IgG抗体/IgM抗体的检测可用于评价受试者是否存在新型冠状病毒感染。
免疫层析试纸以其简单、经济、快速、灵敏度较高、特异性较强、所需样本量少、不需特制检测仪器等优势,是检测新型冠状病毒感染的较优选择。目前,已有多家公司、科研单位研发了免疫层析检测新型冠状病毒感染的免疫层析设备。如专利申请CN202010122827.5,其公开了一种新冠病毒抗体胶体金检测卡,IgM、IgG在不同的试纸条上进行检测。专利申请CN202010218543.6,其公开了一种联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒,NC膜上靠近所述金标垫侧设有IgM检测线和IgG检测线,以及质控线,金标垫含有金标N蛋白,IgM检测线上包被有鼠抗人u链单抗,IgG检测线上包被有鼠抗人IgG单抗。专利申请CN202010217588.1,其公开了新型冠状病毒IgG/IgM抗体检测试剂盒,胶体金垫为含有胶体金标记的新型冠状病毒S1重组抗原蛋白、N重组抗原蛋白和鼠IgG抗原蛋白的胶体金垫,硝酸纤维素膜第一检测条带含有抗人IgG单克隆抗体,所述第二检测条带含有抗人IgM单克隆抗体,质控条带含有羊抗鼠IgG多克隆抗体。
虽然目前已存在检测新型冠状病毒感染的免疫层析装置,但是均采用了常规的标记形式,灵敏度仍有所欠缺。本发明提供了一种更为灵敏的免疫层析检测试纸,以其更准确的实现早期鉴别诊断。
发明内容
本发明提供一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2IgM和IgG的免疫层析试纸,实现了高灵敏度、高特异性、速度快、操作便捷的检测,可应用基层医院、社区中人群的大规模快速筛查。
本发明所述一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2IgM和IgG的免疫层析试纸,所述试纸包括基板,以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上。所述基板为PVC板。
优选的,所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布,所述样品垫处理液含有0.1%-0.3%(v/v)Tween 20、0.4%-0.6%(w/v)蔗糖、0.4%-0.7%(w/v)酪蛋白、0.5%-0.8%(w/v)BSA、0.5%-2%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。
优选的,检测样品经样品稀释液稀释,所述样品稀释液为含有0.05%-0.3%(w/v)BSA和0.3%-0.7%(w/v)PEG2000的0.5M PBS溶液。
优选的,结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
优选的,检测样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液。
在一个实施例中,样品垫上涂覆有生物素标记的N蛋白、生物素标记的S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的鸡IgY。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金。每个亲和素能够结合4分子的生物素,由此使得检测信号放大。硝酸纤维素膜上沿液体样本流动方向分别设有IgM检测线、IgG检测线和质控线,IgM检测线上包被鼠抗人u链单抗,包被浓度为1.0-1.5mg/ml,IgG检测线上包被鼠抗人IgG,包被浓度为1.0-1.5mg/ml,质控线上羊抗鸡IgY。
生物素标记N蛋白、S蛋白或M蛋白方法为:使用碳酸氢钠缓冲液使用N蛋白、S蛋白或M蛋白稀释。BNHS用DMSO稀释至工作浓度。取稀释后的N蛋白、S蛋白,按照N蛋白、S蛋白或M蛋白与BNSH物质的量之比为l:15~1:50的比例加入BNSH,混匀后置于室温反应2h,之后在4℃下于PBS缓冲液中透析以进行纯化。
亲和素交联胶体金的方法为:将胶体金溶液250ml加入25ml,0.1M,pH=9.00碳酸盐缓冲液,再按照20μg/mL的量加入亲和素5.0mg,最后加入2%(w/v)BSA溶液25ml,形成亲和素胶体金复合物。
在另一个实施例中,在EP管中将样品与生物素标记的N蛋白、生物素标记S蛋白和生物素标记的M蛋白混合,孵育30min,之后,将混合液添加到样品垫上,结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金。硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线,硝酸纤维素膜上沿液体样本流动方向分别设有IgM检测线、IgG检测线和质控线,IgM检测线上包被鼠抗人u链单抗,包被浓度为1.0-1.5mg/ml,IgG检测线上包被鼠抗人IgG,包被浓度为1.0-1.5mg/ml,质控线上羊抗鸡IgY。
如以上两个实施例,含有SARS-CoV-2的样品经由样品垫流至结合垫,由于生物素、亲和素之间的相互作用形成:胶体金-亲和素--生物素标记的N蛋白--IgM/IgG、胶体金-亲和素--生物素标记的S蛋白—IgM/IgG、胶体金-亲和素--生物素标记的M蛋白—IgM/IgG。混合物继续流动,流至硝酸纤维素膜,IgM检测线上鼠抗人u链单抗截留上述混合物,形成胶体金-亲和素--生物素标记的N蛋白--IgM--鼠抗人u链单抗、胶体金-亲和素--生物素标记的S蛋白--IgM--鼠抗人u链单抗、胶体金-亲和素--生物素标记的M蛋白--IgM--鼠抗人u链单抗。IgG检测线上形成胶体金-亲和素--生物素标记的N蛋白--IgG--鼠抗人IgG、胶体金-亲和素--生物素标记的S蛋白--IgM--鼠抗人IgG、胶体金-亲和素--生物素标记的M蛋白--IgM--鼠抗人IgG。质控线上形成胶体金-亲和素--生物素标记的鸡IgY--羊抗鸡IgY。
本发明创造性的使用了N蛋白、S蛋白、M蛋白的抗原组合用于结合新型冠状病毒SARS-CoV-2 IgM和IgG,其能够准确的鉴定新型冠状病毒SARS-CoV-2感染,有效的避免漏检,使得假阴性率显著降低。同时,本发明采用了生物素-亲和素系统,其进一步提升了本发明的灵敏度。
具体实施方式
实施例1:重组抗原的制备
参照CN202010105749.8专利申请,合成S蛋白、N蛋白、M蛋白、E蛋白,所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示,所述M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示,所述E蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.14所示。
SEQID NO.1序列如下:
MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTAAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA。
SEQID NO.12序列如下:
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTLEHHHHHH。
SEQ ID NO.13序列如下:
MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ。
SEQIDNO.14序列如下:
MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLVGGGGSASGGGSMYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLVGGGGSASGGGSMYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV。
实施例2:生物素标记物的制备
用0.1mol/L、pH8.5的碳酸氢钠缓冲液分别将S蛋白、M蛋白、N蛋白、E蛋白、鸡IgY稀释成浓度为:1mg/mL,BNHS用DMSO稀释成浓度为20mg/ml。取1mL抗原,按生物素与单抗物质的量之比为l:15~1:50加入BNHS,混匀后置于室温反应2h,之后在4℃下于0.1mol/L、pH8.5的PBS缓冲液中透析以进行纯化。
实施例3:胶体金的制备
配制1%(w/v)的氯金酸,取1mL 1%(w/v) 的氯金酸溶液与99mL的超纯水混合,加入到预热干燥的250mL锥形瓶中,加热至沸腾并煮沸15min;快速加入还原剂 1%(w/v)柠檬酸钠2.75mL。加入还原剂的过程要迅速,连续。持续加热沸腾 5min左右,当溶液变为稳定的酒红色,停止加热,胶体金直径为13-40nm。
实施例4:亲和素交联胶体金的制备
将胶体金溶液250ml加入25ml,0.1M,pH=9.00碳酸盐缓冲液,再按照20μg/mL的量加入亲和素5.0mg,最后加入2%(w/v)BSA溶液25ml,形成亲和素胶体金复合物。
实施例5:免疫层析试纸1的制备
①配制样品垫处理液,样品垫处理液含有0.2%(v/v)Tween 20、0.5%(w/v)蔗糖、0.6%(w/v)酪蛋白、0.7(w/v)BSA、1%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆生物素标记的N蛋白、生物素标记的鸡IgY,混合溶液中生物素标记的N蛋白、生物素标记的鸡IgY浓度均为1mg/mL,涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金,亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml,涂覆量为50μL。其中,结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向,将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将鼠抗人u链单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgM检测线。将鼠抗人IgG单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgG检测线;将羊抗鸡IgY抗体溶液装入划膜机,抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。IgM检测线、IgG检测线和质控线相距0.4cm。
实施例6:免疫层析试纸2的制备
①配制样品垫处理液,样品垫处理液含有0.2%(v/v)Tween 20、0.5%(w/v)蔗糖、0.6%(w/v)酪蛋白、0.7(w/v)BSA、1%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆生物素标记的S蛋白、生物素标记的鸡IgY,混合溶液中生物素标记的S蛋白、生物素标记的鸡IgY浓度均为1mg/mL,涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金,亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml,涂覆量为50μL。其中,结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向,将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将鼠抗人u链单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgM检测线。将鼠抗人IgG单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgG检测线;将羊抗鸡IgY抗体溶液装入划膜机,抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。IgM检测线、IgG检测线和质控线相距0.4cm。
实施例7:免疫层析试纸3的制备
①配制样品垫处理液,样品垫处理液含有0.2%(v/v)Tween 20、0.5%(w/v)蔗糖、0.6%(w/v)酪蛋白、0.7(w/v)BSA、1%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆生物素标记的N蛋白、生物素标记的S蛋白、生物素标记的鸡IgY,混合溶液中生物素标记的N蛋白、S蛋白、生物素标记的鸡IgY浓度均为1mg/mL,涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金,亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml,涂覆量为50μL。其中,结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向,将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将鼠抗人u链单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgM检测线。将鼠抗人IgG单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgG检测线;将羊抗鸡IgY抗体溶液装入划膜机,抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。IgM检测线、IgG检测线和质控线相距0.4cm。
实施例8:免疫层析试纸4的制备
①配制样品垫处理液,样品垫处理液含有0.2%(v/v)Tween 20、0.5%(w/v)蔗糖、0.6%(w/v)酪蛋白、0.7(w/v)BSA、1%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆生物素标记的N蛋白、生物素标记的S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的鸡IgY,混合溶液中生物素标记的N蛋白、生物素标记S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的鸡IgY浓度均为1mg/mL,涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金,亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml,涂覆量为50μL。其中,结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向,将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将鼠抗人u链单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgM检测线。将鼠抗人IgG单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgG检测线;将羊抗鸡IgY抗体溶液装入划膜机,抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。IgM检测线、IgG检测线和质控线相距0.4cm。
实施例9:免疫层析试纸5的制备
①配制样品垫处理液,样品垫处理液含有0.2%(v/v)Tween 20、0.5%(w/v)蔗糖、0.6%(w/v)酪蛋白、0.7(w/v)BSA、1%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。使用样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜以获得样品垫。
②样品垫上涂覆生物素标记的N蛋白、生物素标记的S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的E蛋白、生物素标记的鸡IgY,混合溶液中生物素标记的N蛋白、生物素标记S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的鸡IgY浓度均为1mg/mL,涂覆量为50μL。结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金,亲和素交联的胶体金浓度为3mg/ml,涂覆量为50μL。其中,结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
③沿待检测液体样本流动方向,将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴于PVC板上。
④将鼠抗人u链单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgM检测线。将鼠抗人IgG单抗溶液装入划膜机,单克隆抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为IgG检测线;将羊抗鸡IgY抗体溶液装入划膜机,抗体的浓度为1mg/mL,液体装入划膜机,设定划线量为1μL/cm,在硝酸纤维素膜上划线作为质控线。IgM检测线、IgG检测线和质控线相距0.4cm。
实施例10:样品检测
采用免疫层析试纸1-5检测10例正常人血清、20例新冠肺炎患者血清。对于正常人血清,免疫层析试纸1-5的检测结果均为阴性。免疫层析试纸1-3检测到了18例阳性,2例呈阴性。免疫层析试纸4、5检测到了20例阳性,与患者的诊断结果相同。对于上述2例阴性样本,免疫层析试纸4、5中检测线均呈现淡红色条带。
对于一份强阳性样品采用样品稀释液进行倍比稀释,稀释度分别为1:20,1:40,1:60,1:80,1:160。其中,免疫层析试纸1、2均可检测1:60稀释的样品。免疫层析试纸3可检测1:80稀释的样品。而免疫层析试纸4、5可检测1:160稀释的样品。N蛋白、S蛋白是现有技术常用的检测抗原,采用N、S混合抗原能够结合机体内两种不同的抗体,因而,其检测效果优于单一抗原。同时,采用三种或四种抗原的检测结果优于N、S混合抗原。然而,采用四种抗原(N、S、M、E蛋白)的检测结果并未优于三种抗原(N、S、M蛋白),其可能是由于E蛋白并未激起机体内大规模的免疫反应。因此,本发明人最终选择在样品垫上涂覆生物素标记的N蛋白、生物素标记的S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的鸡IgY。
尽管对本发明已作出了详细的说明并引证了一些具体实施例,但是对本领域技术人员而言,只要不离开本发明的精神和范围可作各种变化或修正是显然的。
Claims (5)
1.一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2IgM和IgG的免疫层析试纸,所述试纸包括基板,以及设置于基板上的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫,样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫沿待检测液体样本流动方向依次固定粘贴于基板上,优选的,所述基板为PVC板;所述样品垫上涂覆有生物素标记的N蛋白、生物素标记的S蛋白、生物素标记的M蛋白、生物素标记的鸡IgY;所述结合垫上涂覆有亲和素交联的胶体金;所述硝酸纤维素膜上沿液体样本流动方向分别设有IgM检测线、IgG检测线和质控线,IgM检测线上包被鼠抗人u链单抗,包被浓度为1.0-1.5mg/ml,IgG检测线上包被鼠抗人IgG,包被浓度为1.0-1.5mg/ml,质控线上羊抗鸡IgY。
2.根据权利要求1所述免疫层析试纸,其特征在于,所述样品垫是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布,所述样品垫处理液含有0.1%-0.3%(v/v)Tween 20、0.4%-0.6%(w/v)蔗糖、0.4%-0.7%(w/v)酪蛋白、0.5%-0.8%(w/v)BSA、0.5%-2%(w/v)NaCl,余量为超纯水,pH8.0。
3.根据权利要求1所述免疫层析试纸,其特征在于,检测样品经样品稀释液稀释,所述样品稀释液为含有0.05%-0.3%(w/v)BSA和0.3%-0.7%(w/v)PEG2000的0.5M PBS溶液。
4.根据权利要求1所述免疫层析试纸,其特征在于,所述结合垫经结合垫处理液浸泡烘干后,滴加金标抗体烘干,结合垫处理液含0.1%(v/v)Tween-20、5%(w/v)蔗糖、1%(w/v)BSA的0.01mol/L PBS溶液,pH 7.2。
5.根据权利要求1所述免疫层析试纸,其特征在于,检测样品包括鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、或血液。
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