CN113295865B - 检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的免疫层析装置及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗体检测领域，具体涉及检测SARS‑CoV‑2病毒中和抗体的免疫层析装置及其应用，进一步包括SARS‑CoV‑2病毒中和抗体的免疫层析装置的制备和使用方法。本发明所述的冠状病毒中和抗体的免疫检测装置，包括冠状病毒的刺突蛋白部分、特异性结合所述冠状病毒刺突蛋白部分的ACE2蛋白或其功能片段以及固相支持物，在所述固相支持物上检测待测样品对所述冠状病毒刺突蛋白部分与ACE2蛋白或其功能片段结合的影响，判断样品中是否存在冠状病毒中和抗体。本发明的免疫层析检测装置，如检测试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。

Description

检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的免疫层析装置及其应用
技术领域
本发明涉及抗体检测领域，具体涉及免疫层析技术对SARS-CoV-2病毒中和抗体进行检测的方法以及针对SARS-CoV-2病毒中和抗体的免疫层析检测装置。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)病原体SARS-CoV-2病毒，又称2019新型冠状病毒(2019Novel coronavirus,2019-nCoV)，是一种RNA冠状病毒。目前全球已有220多个国家和地区累计报告逾470万名确诊病例，逾30万名患者死亡。2019冠状病毒病疫情逐渐变成一场全球性大瘟疫。全球至今尚未出现用于SARS-CoV-2病毒疾病的疫苗和特效药。
SARS-CoV-2病毒是一类具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒。SARS-CoV-2病毒进入宿主细胞是由跨膜刺突(S)糖蛋白(S蛋白)介导的。S蛋白分为S1和S2两个亚基，其中S1亚基负责与宿主细胞受体结合，S2亚基负责病毒膜和细胞膜融合。S1通过结合宿主受体促进病毒感染。它包含两个结构域，即与宿主受体直接相互作用的N端结构域和C 端RBD结构域。C端RBD结构域位于SARS-CoV-2病毒亚基上，是与人ACE2(血管紧张素转化酶2)受体的相互作用位点，在病毒的传染过程中发挥着重要作用。ACE2是SARS- CoV进入细胞的受体。它是一种锌金属蛋白酶，属于1型跨膜蛋白。它的结构包括一个信号肽、一个跨膜结构域和一个含有HEMGH锌结合结构域的金属蛋白酶活性位点。全长ACE2 受体由805个氨基酸组成，位于上皮细胞的腔面。
2009年纽约血液中心使用小鼠模型研究证明在哺乳动物、昆虫和大肠杆菌细胞中表达的 SARS病毒S蛋白RBD结构域能引发有效的中和抗体和保护性免疫。研究表明，在新型冠状病毒肺炎患者治疗过程中，康复期病人血浆治疗取得了较好的疗效，显示出中和抗体在新冠病毒肺炎治疗方面的潜力。S蛋白是进行疫苗和抗体研究的一个比较理想和有效的诊断和药物开发靶点。
SARS-CoV-2病毒的检测方法主要有2019-nCoV病毒核酸检测方法和血清检测方法。 SARS-CoV-2血清检测法如化学发光法、酶联免疫吸附试验法(ELISA)、胶体金法检测法均为分析SARS-CoV-2总抗体(Ab)和SARS-CoV-2IgM抗体，但不能区分SARS-CoV-2 中和抗体与非中和抗体，无法准确评价免疫保护效果。因此，开发用于检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的试剂盒可有效评估保护效果，对SARS-CoV-2感染状况具有辅助诊断作用。
免疫层析试纸具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，是理想的即时检测(point-of-care test,POCT)和现场检测技术,能在1-15min内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，因此研制SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试剂盒具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是研制适用于检测人血清和血浆的SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析装置，如检测试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。
一方面，本发明提供了一种检测冠状病毒中和抗体的免疫层析装置，其特征在于，所述免疫层析装置包括冠状病毒的刺突蛋白部分、特异性结合所述冠状病毒刺突蛋白部分的 ACE2蛋白或其功能片段以及固相支持物，在所述固相支持物上检测待测样品对所述冠状病毒刺突蛋白部分与ACE2蛋白或其功能片段结合的影响，判断样品中是否存在冠状病毒中和抗体。
在一些实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分或者所述ACE2蛋白或其功能片段连接信号物。在另一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段或者所述冠状病毒刺突蛋白部分固定在固相支持物上。优选地，所述免疫层析装置中(1)所述冠状病毒刺突蛋白部分连接信号物，所述ACE2蛋白或其功能片段固定在固相支持物上；或(2)所述ACE2蛋白或其功能片段连接信号物，所述冠状病毒刺突蛋白部分固定在固相支持物上。
在一些实施方案中，所述待测样品对冠状病毒刺突蛋白部分与ACE2蛋白或其功能片段结合的影响情况通过信号物产生信号判断。
在一些实施方案中，所述信号物选自可视化信号物、荧光信号物、磁信号物中的至少一种。其中，所述可视化信号物包括胶体金、胶体银、彩色乳胶微球和彩色染料，优选为胶体金。在另一些实施方案中，所述荧光信号物包括荧光微球和量子点。
本发明中所述免疫层析装置选自胶体金免疫层析装置、量子点免疫层析装置或免疫荧光检测装置，优选为胶体金免疫层析装置和免疫荧光检测装置。
在一些实施方案中，所述胶体金免疫层析装置包括金标记的冠状病毒刺突蛋白部分，所述ACE2蛋白或其功能片段固定在固相支持物上的特定位置，通过待测样品中的冠状病毒中和抗体阻断病毒刺突蛋白部分和ACE2蛋白或其功能片段的结合产生检测信号。在另一些实施方案中，所述胶体金免疫层析装置包括金标记的ACE2蛋白或其功能片段，所述冠状病毒刺突蛋白部分固定在固相支持物上的特定位置，通过待测样品中的冠状病毒中和抗体阻断病毒刺突蛋白部分和ACE2蛋白或其功能片段的结合产生检测信号。
在一些实施方案中，所述量子点免疫层析装置包括量子点标记的冠状病毒刺突蛋白部分，所述ACE2蛋白或其功能片段固定在固相支持物上的特定位置，通过待测样品中的冠状病毒中和抗体阻断病毒刺突蛋白部分和ACE2蛋白或其功能片段的结合产生检测信号。在另一些实施方案中，所述量子点免疫层析装置包括量子点标记的ACE2蛋白或其功能片段，所述冠状病毒刺突蛋白部分固定在固相支持物上的特定位置，通过待测样品中的病毒中和抗体阻断病毒刺突蛋白部分和ACE2蛋白或其功能片段的结合产生检测信号。优选地，所述量子点选自第IV族和第VI族组成的化合物或由量子点化合物与其它化学物质组装而成的量子点颗粒。在一些实施方案中，所述免疫荧光检测装置为时间分辨免疫荧光检测装置，所述装置包括免疫荧光微球标记的冠状病毒刺突蛋白部分，所述ACE2蛋白或其功能片段固定在固相支持物上的特定位置，通过待测样品中的病毒中和抗体阻断病毒刺突蛋白部分和ACE2蛋白或其功能片段的结合产生检测信号。在另一些实施方案中，所述免疫荧光检测装置为时间分辨免疫荧光检测装置，所述装置包括免疫荧光微球标记的ACE2蛋白或其功能片段，所述冠状病毒刺突蛋白部分固定在固相支持物上的特定位置，通过待测样品中的病毒中和抗体阻断病毒刺突蛋白部分和ACE2蛋白或其功能片段的结合产生检测信号。优选地，所述免疫微球选自含钐(SM)免疫荧光微球，含铕(Eu)免疫荧光微球，含镝(Dy)免疫荧光微球或含锝(Te) 免疫荧光微球。
本发明中所述冠状病毒选自SARS-CoV-2或其变体、SARS-CoV或其变体或者MERS-Cov或其变体，优选为SARS-CoV-2或其变体。在一些实施方案中，所述冠状病毒为SARS- CoV相关的病毒。在另一些实施方案中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2相关的病毒。在一些实施方案中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2或其变体。在一个具体实施方案中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
本发明中所述冠状病毒刺突蛋白部分选自冠状病毒S蛋白、冠状病毒S1蛋白、冠状病毒RBD蛋白或者带有His或者Fc标签的冠状病毒RBD蛋白，优选为冠状病毒S1蛋白或冠状病毒RBD蛋白，更优选为SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。在一些实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分为冠状病毒S1蛋白或冠状病毒RBD蛋白。优选地，所述冠状病毒刺突蛋白部分为SARS-CoV-2病毒S1蛋白或SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。更优选地，所述冠状病毒刺突蛋白部分为SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。
在一些实施方案中，冠状病毒刺突蛋白部分包含与SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列至少70％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分包含与SEQID NO:1或2所示氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。在一些实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。在一些实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分包含与SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在一个具体实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明中所述ACE2蛋白或其功能片段来源于人。在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段选自重组ACE2蛋白或带Fc标签ACE2蛋白。在另一些实施方案中，所述 ACE2蛋白选自人重组ACE2蛋白。
在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列至少70％一致性的序列。在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段包含与SEQID NO:3所示氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中所述固相支持物选自硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜，优选为硝酸纤维素膜。在一些实施方案中，所述固相支持物为硝酸纤维素膜。其中的硝酸纤维素膜可以为任何商品化的硝酸纤维素膜，包括S&SAE99、whatman 8um、Millipore M135、Sartoirus CN140等。
本发明提供一种检测冠状病毒中和抗体的免疫层析装置，其特征在于，所述装置包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向包含依次设置的检测线和质控线，所述检测线上包含冠状病毒刺突蛋白部分或者ACE2蛋白或其功能片段，所述装置还包括信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段或者信号物标记的冠状病毒刺突蛋白部分，所述冠状病毒刺突蛋白部分与ACE2蛋白或其功能片段结合后在检测线上产生检测信号。
在一些实施方案中，所述检测线上包含ACE2蛋白或其功能片段时，所述装置包括信号物标记的冠状病毒刺突蛋白部分，所述信号物标记的冠状病毒刺突蛋白部分与所述ACE2蛋白或其功能片段结合产生检测信号。
在另一些实施方案中，所述检测线上包含冠状病毒刺突蛋白部分时，所述装置包括信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段，所述信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段与所述冠状病毒刺突蛋白结合产生检测信号。
本发明中所述ACE2蛋白或其功能片段选自重组ACE2蛋白或带Fc标签ACE2蛋白。
在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段为重组人ACE2蛋白。在另一些方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列至少70％一致性的序列。
在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段包含与SEQ ID NO:3所示氨基酸序列至少 70％、至少75％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。在一些实施方案中，所述ACE2 蛋白或其功能片段包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述ACE2 蛋白或其功能片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在一些实施方案中，所述冠状病毒刺突蛋白部分包括冠状病毒S蛋白、冠状病毒S1蛋白、冠状病毒RBD蛋白或者带有His或者Fc标签的冠状病毒RBD蛋白。优选地，所述冠状病毒刺突蛋白部分为SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分。更优选地，所述冠状病毒刺突蛋白部分为SARS-CoV-2病毒S1蛋白或SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。更优选地，所述SARS- CoV-2病毒刺突蛋白部分包含与SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列至少70％一致性的序列。在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分包含与SEQ ID NO:1或2所示氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分包括SARS-CoV-2病毒S1蛋白或SARS-CoV-2病毒 RBD蛋白。在一些实施方案中，SARS-CoV-2病毒RBD蛋白包含与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒S1蛋白包含与SEQID NO:2所示氨基酸序列至少70％、至少75％、至少80％、至少83％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少97％或至少99％一致性的序列。在一些具体实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒RBD 蛋白包含SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。在另一些具体实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒 S1蛋白包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列。在一些具体实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在另一些具体实施方案中，所述SARS- CoV-2病毒RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方案中，所述质控线包含第一分子，所述加样垫上包含第二分子或检测时所述加样垫上另添加第二分子，所述第二分子能与第一分子结合产生检测信号。在另一些实施方案中，所述第一分子和第二分子分别选自免疫球蛋白和抗免疫球蛋白抗体、受体和配体或生物素和亲和素组成分子对中的任一个。在一些具体实施方案中，所述第一分子选自抗免疫球蛋白抗体、配体或者生物素，对应地所述第二分子选自信号物标记的免疫球蛋白、信号物标记的受体或者亲和素。在另一些实施方案中，所述第一分子选自免疫球蛋白、受体或者亲和素，对应地所述第二分子选自信号物标记的抗免疫球蛋白抗体、信号物标记的配体或者生物素。在一个具体实施方案中，所述第一分子为抗免疫球蛋白抗体，所述第二分子为信号物标记的免疫球蛋白。在另一个具体实施方案中，所述第一分子为免疫球蛋白，所述第二分子为信号物标记的抗免疫球蛋白抗体。在一个具体实施方案中，所述第一分子为配体，所述第二分子为信号物标记的受体。在另一个具体实施方案中，所述第一分子为受体，所述第二分子为信号物标记的配体。在一个具体实施方案中，所述第一分子为生物素，所述第二分子为亲和素。在另一个具体实施方案中，所述第一分子为亲和素，所述第二分子为生物素。
在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段以0.2-1.0ug/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。在一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段以0.2-1.0ug/cm均匀划线包被在检测线位置形成检测线。在一些具体实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段以约0.2ug/cm、0.3ug/cm、0.4ug/cm、0.5ug/cm、0.6ug/cm、0.7ug/cm、 0.8ug/cm、0.9ug/cm或1.0ug/cm均匀划线包被在检测线位置形成检测线。在一些优选实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段，以0.3μg/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。在另一些优选实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段，以0.5μg/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。其中，所述信号物标记的病毒刺突蛋白部分的量为 1.5μg-5mg。在一些实施方案中，所述信号物标记的病毒刺突蛋白部分为SARS-CoV-2病毒 RBD蛋白。在一些实施方案中，所述胶体金标记的病毒刺突蛋白部分的量为1.0-5mg。在一些具体实施方案中，所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量约为1.0mg、1.5mg、 2.0mg、2.5mg、3.0mg、3.5mg、4.0mg、4.5mg或5.0mg。在另一些实施方案中，所述荧光微球标记的冠状病毒刺突蛋白部分为1.0-5μg。在一些具体实施方案中，所述荧光微球标记的 SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量约为1.0μg、1.5μg、2.0μg、2.5μg、3.0μg、3.5μg、 4.0μg、4.5μg或5.0μg。
在另一些实施方案中，所述病毒刺突蛋白部分以0.5-1.5μg/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。在一些实施方案中，所述病毒刺突蛋白部分为SARS-CoV-2病毒 RBD蛋白。在一些具体实施方案中，所述病毒刺突蛋白部分以0.5ug/cm、0.6ug/cm、0.7ug/cm、0.8ug/cm、0.9ug/cm、1.0ug/cm、1.1ug/cm、1.2ug/cm、1.3ug/cm、1.4ug/cm或1.5ug/cm的量均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。在一些优选实施方案中，所述病毒刺突蛋白部分以0.3μg/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。其中，所述信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段与信号物标记的免疫球蛋白抗体按体积比0.5:1～1:1.5 混合喷洒在结合垫上，其中，所述信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段的量为0.1-1mg/ml，信号物标记的免疫球蛋白抗体为0.1-1mg/ml。优选地，所述信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段与信号物标记的免疫球蛋白抗体按体积比1:1混合喷洒在结合垫上，其中，所述信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段的量为1mg/ml，信号物标记的免疫球蛋白抗体为1mg/ml。
本发明中所述质控线包含的抗免疫球蛋白抗体选自抗小鼠IgG抗体或抗羊IgG抗体；所述信号物标记免疫球蛋白抗体对应的选自小鼠IgG抗体或羊IgG抗体。在一些实施方案中，所述质控线包含的抗免疫球蛋白抗体为抗小鼠IgG抗体，所述信号物标记免疫球蛋白抗体对应为小鼠IgG抗体。在另一些实施方案中，所述质控线包含的抗免疫球蛋白抗体为抗羊IgG 抗体，所述信号物标记免疫球蛋白抗体对应的为羊IgG抗体。
本发明所述信号物选自胶体金、量子点或免疫荧光微球，优选为胶体金和免疫荧光微球。在一些实施方案中，所述免疫荧光微球选自含钐(SM)免疫荧光微球，含铕(Eu)免疫荧光微球，含镝(Dy)免疫荧光微球或含锝(Te)免疫荧光微球。在另一些实施方案中，所述量子点选自第IV族和第VI族组成的化合物或由量子点化合物与其它化学物质组装而成的量子点颗粒。
本发明所述反应垫为硝酸纤维素膜(NC膜)或醋酸纤维素膜，优选为硝酸纤维素膜。所述底板为聚乙烯材料。
本发明所述免疫层析装置中还包括样品稀释液。所述样品稀释液包括20-50mMPBS， 0.01％Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5。
本发明中所述样品包括：
(1)感染或疑似感染冠状病毒的血浆、血清或全血；
(2)接种冠状病毒疫苗后的血浆、血清或全血；
(3)冠状病毒刺突蛋白免疫的动物血浆、血清或全血；或
(4)生物学方法获得的抗冠状病毒的抗体样品。
另一方面，本发明提供了上述免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
(1)待测样品中加入样品稀释液稀释后，加入信号标记物混匀；
(2)将混合物滴加至所述免疫层析装置的加样垫上；
(3)待一段时间后，根据检测线和质控线的显色情况，判断样品中是否有冠状病毒中和抗体，判断方法如下：
(a)阳性：所述质控线呈现信号，检测线不呈现信号，说明样品中含有冠状病毒中和抗体；
(b)阴性：所述质控线和检测线均呈现信号，说明样品中不含有冠状病毒中和抗体；
(c)失效：所述质控线和检测线均不呈现信号，说明免疫层析装置失效。
本发明所述免疫层析装置使用方法中，所述信号标记物为胶体金标记的冠状病毒刺突蛋白部分，选自胶体金标记的冠状病毒刺突蛋白S1亚基、胶体金标记的冠状病毒RBD、荧光微球标记的冠状病毒刺突蛋白S1亚基或荧光微球标记的冠状病毒RBD。优选地，所述信号标记物为胶体金标记的SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基、胶体金标记的SARS-CoV-2RBD、荧光微球标记的SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基或荧光微球标记的SARS-CoV-2RBD，优选为胶体金标记的SARS-CoV-2RBD或荧光微球标记的SARS-CoV-2RBD。
本发明提供了另一种免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
(1)待测样品中加入样品稀释液稀释；
(2)将稀释的样品液滴加至所述免疫层析装置的加样垫上；
(3)待一段时间后，根据检测线和质控线的显示信号情况，判断样品中是否有冠状病毒中和抗体，判断方法如下：
(a)阳性：所述质控线呈现信号，检测线不呈现信号，说明样品中含有冠状病毒中和抗体；
(b)阴性：所述质控线和检测线均呈现信号，说明样品中不含有冠状病毒中和抗体；
(c)失效：所述质控线和检测线均不呈现信号，说明免疫层析装置失效。
本方法中所述信号标记物为胶体金标记的ACE2蛋白或其功能片段，优选为胶体金标记的人重组的ACE2蛋白或其功能片段。
又一方面，本发明提供了上述的免疫层析装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备信号物标记的冠状病毒刺突蛋白或信号物标记的ACE2蛋白或其片段和信号物标记的免疫球蛋白抗体；
(2)将ACE2蛋白或其片段包被在反应垫上形成检测线或将冠状病毒刺突蛋白包被在反应垫上形成检测线，将抗免疫球蛋白抗体包被在反应垫上形成质控线，将信号物标记的免疫球蛋白抗体喷洒在结合垫上；
(3)将样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的反应垫和吸水垫按照顺序依次粘附在底板上，组装后得到免疫层析装置。
在一些实施方案中，所述步骤(2)中将ACE2蛋白或其片段包被在反应垫上形成检测线时，所述装置中还包括信号物标记的冠状病毒刺突蛋白部分。在另一些实施方案中，所述步骤(2)中所述ACE2蛋白或其片段以0.2-1.0ug/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。其中，所述装置中包含的信号物标记的冠状病毒刺突蛋白部分的量为1.0μg-5mg。在一些实施方案中，所述胶体金标记的冠状病毒刺突蛋白部分的量为1.0mg-5mg。在另一些实施方案中，所述荧光微球标记的冠状病毒刺突蛋白部分的量为1.0μg-5μg。
在另一些实施方案中，所述步骤(2)中将冠状病毒刺突蛋白部分包被在反应垫上形成检测线时，所述装置中还包括信号物标记的ACE2蛋白或其片段。在一些实施方案中，所述步骤(2)病毒刺突蛋白部分0.5-1.5ug/cm均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。进一步，所述步骤(2)还包括将信号物标记的ACE2蛋白或其片段与信号物标记的免疫球蛋白抗体以1：1的比例混合喷洒在结合垫上，其中，所述信号物标记的ACE2蛋白或其功能片段为0.1-1mg/ml，信号物标记的免疫球蛋白抗体为0.1-1mg/ml。
本发明制备的免疫层析装置为免疫层析试纸条。优选地，所述试纸条放入盒体内制成免疫检测试剂盒。
又一方面，本发明提供了上述免疫层析装置在检测受试者感染或疑似感染SARS-CoV-2 病毒或其变体中的应用。
另一方面，本发明提供了上述免疫层析装置在检测样品中SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体中的应用。在一些实施方案中，所述所述样品来源于感染或疑似感染SARS-CoV-2 病毒或其变体的受试者，感染SARS-CoV-2病毒或其变体后康复者，接种针对SARS-CoV-2 或其变体的疫苗的受试者，或者通过生物学方法获得的抗SARS-CoV-2或其变体的抗体。进一步，上述免疫层析装置在检测受试者接种针对SARS-CoV-2或其变体的疫苗后是否产生有效免疫中的应用。上述免疫层析装置在检测受试者感染SARS-CoV-2或其变体后是否产生有效免疫中的应用。上述免疫层析装置用于检测通过生物学方法获得的抗SARS-CoV-2抗体的应用。
发明详述
本发明的原理可以表述为：一种通过免疫层析作用与SARS-CoV-2病毒中和抗体阻断 SARS-CoV-2病毒RBD蛋白与ACE2受体结合产生检测信号来检测样本中的SARS-CoV-2 病毒中和抗体。它是将重组ACE2蛋白固定在检测膜上。当检测样本中存在SARS-CoV-2病毒中和抗体时，中和抗体与信号物标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合阻断膜上的重组 ACE2蛋白与信号物标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合，不出现检测信号(或条带)，检测结果呈阳性。当检测样本中不存在SARS-CoV-2病毒中和抗体时，膜上的重组ACE2受体与信号物标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合。出现检测信号(或条带)，检测结果呈阴性(见图1)。
本发明的原理又可以表述为：一种通过免疫层析作用与SARS-CoV-2病毒中和抗体阻断 ACE2受体与SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合产生检测信号来检测样本中的SARS-CoV-2病毒中和抗体。它是将重组SARS-CoV-2病毒RBD蛋白固定在检测膜上。样本中的SARS- CoV-2病毒RBD蛋白中和抗体与信号物标记的重组ACE2受体竞争结合固定在载体膜上的重组SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。当检测样本中存在SARS-CoV-2病毒中和抗体时，中和抗体与信号物标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合阻断膜上的重组ACE2蛋白与信号物标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合，检测线不出现检测信号(或条带)，检测结果呈阳性。当检测样本中不存在SARS-CoV-2病毒中和抗体时，膜上的重组SARS-CoV-2病毒 RBD蛋白与信号物标记的重组ACE2蛋白结合。检测线出现检测信号(或条带)，检测结果呈阴性(见图2)。
免疫层析装置
本发明的免疫层析装置是指利用免疫显色标记技术和抗原抗体反应相结合而形成的一种应用形式，包括免疫层析的检测试纸，免疫检测试纸包装入盒体内，如卡盒形成免疫层析试剂盒。
本发明的具体装置可以体现为由反应管、支撑板(底板)、加样垫、结合垫、检测膜(反应垫)和吸水垫构成。反应管中含有信号物标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白，结合垫喷洒有信号物标记的小鼠单克隆抗体，检测膜上含有检测线(T线)和质控线(C线)。检测线(T线)喷洒重组人ACE2受体，质控线(C线)喷洒兔抗小鼠抗体(见图3)。
本发明提供了一种检测冠状病毒中和抗体的免疫层析装置，具体涉及SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体免疫层析检测试剂盒，可以体现为SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒，SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体量子点检测试剂盒，SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体免疫荧光检测试剂盒，SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体时间分辨免疫荧光检测试剂盒，以及利用层析原理和中和抗体阻断SARS-CoV-2病毒 RBD蛋白和ACE2蛋白相互作用产生信号的试剂盒。
本发明提供的检测SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体免疫层析试剂盒包括SARS- CoV-2病毒或其变体的刺突蛋白部分、特异性结合所述冠状病毒刺突蛋白部分的ACE2蛋白或其功能片段以及固相支持物。进一步，在所述固相支持物上检测待测样品对所述冠状病毒刺突蛋白部分与ACE2蛋白或其功能片段结合的影响，判断样品中是否存在SARS-CoV-2冠状病毒或其变体的中和抗体。
优选地，本发明提供检测SARS-CoV-2病毒的中和抗体免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括SARS-CoV-2病毒的刺突蛋白部分、特异性结合所述冠状病毒刺突蛋白部分的ACE2蛋白或其功能片段以及固相支持物，在所述固相支持物上检测待测样品对所述冠状病毒刺突蛋白部分与ACE2蛋白或其功能片段结合的影响，判断样品中是否存在SARS-CoV-2冠状病毒或其变体的中和抗体。
在一些实施方案中，所述SARS-CoV-2病毒或其变体的刺突蛋白连接信号物，所述ACE2蛋白或其功能片段固定在固相载体上。
在另一些实施方案中，所述ACE2蛋白或其功能片段连接信号物，所述SARS-CoV-2病毒或其变体的刺突蛋白固定在固相载体上。
(一)SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒及其制备
本发明中SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒可以体现为金颗粒标记的SARS-CoV-2病毒或其变体RBD蛋白，ACE2蛋白固定在固相支持物特定位置，通过SARS-CoV-2病毒中和抗体阻断RBD蛋白和ACE2蛋白结合产生检测信号的检测试剂盒。
具体地，SARS-CoV-2病毒或其变体中和抗体胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，所述试纸条包括加样垫、结合垫、反应垫和吸水依次粘附在底板上，所述反应垫上包含依次设置的检测线和质控线，所述检测线包被有ACE2蛋白，所述质控线包被有抗免疫球蛋白抗体。
在一些具体实施方案中，所述胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包含重组人 ACE2蛋白，所述质控线包含抗免疫球蛋白抗体。
其中，所述ACE2蛋白0.2-1.0μg/cm均匀包被在反应垫的检测线(T线)位置形成检测线。优选地，所述ACE2蛋白以0.5μg/cm均匀包被在反应垫的检测线位置形成检测线。其中，所述抗免疫球蛋白抗体浓度为0.5-3.6μg/cm均匀包被在反应垫的质控线(C线)位置形成质控线。将包被好检测线和质控线的反应垫烘干待用。
进一步，所述试剂盒包括胶体金标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白和胶体金标记的免疫球蛋白。
其中，所述胶体金标记的免疫球蛋白喷洒在所述结合垫上。根据本领域的常规操作对所述胶体金标记的免疫球蛋白(浓度1mg/ml)进行喷洒，保证在层析反应中发生信号反应即可。所述胶体金标记的免疫球蛋白3.75μl/ml喷洒到处理过的结合垫上。
所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白烘干后作为金标物管，待与样品溶液混合。所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为1.0-5mg。优选地，所述金标管中包含胶体金标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为1.5mg，待与样品溶液混合。
进一步所述试剂盒中还包括样品稀释液。所述样品稀释液包括20-50mM PBS，0.01％ Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5
本发明的SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(1)制备胶体金标记的SARS-CoV-2病毒或其变体RBD和胶体金标记的免疫球蛋白；
(2)将ACE2蛋白包被在反应垫上形成检测线，将抗免疫球蛋白抗体包被在反应垫上形成质控线，将胶体金标记的免疫球蛋白喷洒在结合垫上；
(3)将样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的反应垫和吸水垫按照顺序依次粘附在底板上，组装后得到免疫层析装置。
步骤(1)包括将胶体金标记的SARS-CoV-2病毒或其变体RBD烘干制成金标记物管。所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为1.0-5.0mg，优选为1.5mg。
步骤(2)中所述ACE2蛋白以0.2-1.0μg/cm均匀包被在反应垫的检测线(T线)位置形成检测线。优选地，所述ACE2蛋白0.5μg/cm均匀包被在反应垫的检测线位置形成检测线。其中，所述抗免疫球蛋白抗体0.5-3.6μg/cm均匀包被在反应垫的质控线(C线)位置形成质控线。将包被好检测线和质控线的反应垫烘干待用。其中，所述胶体金标记的免疫球蛋白浓度为1mg/ml，3.75μl/ml喷洒到处理过的结合垫上，烘干待用。
步骤(3)包括将组装完成的片材切割成试纸条，切好的试纸条组装到备好的试纸卡壳中，加样窗口对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应试纸条的检测区，再与干燥剂封存在铝箔袋中。
进一步，将制备好的金标记物管、SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金试纸条和样本稀释液放置在盒体内，组装成试剂盒。
(二)SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒及其制备
本发明中SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒还可以体现为金颗粒标记的ACE2蛋白，SARS-CoV-2病毒或其变体RBD蛋白固定在固相支持物特定位置，通过SARS-CoV-2病毒中和抗体阻断RBD蛋白和ACE2蛋白结合产生检测信号的检测试剂盒。
具体地，SARS-CoV-2病毒或其变体中和抗体胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有SARS-CoV-2病毒或其变体RBD蛋白，所述质控线包被有抗免疫球蛋白抗体。
在一些具体实施方案中，所述胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包含重组 SARS-CoV-2病毒RBD蛋白，所述质控线包含抗小鼠IgG抗体。
其中，所述SARS-CoV-2病毒RBD蛋白浓度为0.5-1.5μg/cm均匀包被在反应垫的检测线(T线)位置形成检测线。优选地，所述SARS-CoV-2病毒RBD蛋白以1.0μg/cm均匀包被在反应垫的检测线位置形成检测线。其中，所述抗免疫球蛋白抗体浓度为0.5-3.6μg/cm均匀包被在反应垫的质控线(C线)位置形成质控线。将包被好检测线和质控线的反应垫烘干待用。
进一步，所述试剂盒包括胶体金标记的ACE2蛋白(浓度在0.1-1mg/ml之间)和胶体金标记的免疫球蛋白(浓度在0.1-1.0mg/ml之间)。所述金标记的ACE2蛋白和胶体金标记免疫球蛋白按体积比1：1充分混合，以3.75μl/ml喷洒到结合垫上烘干，其中，所述胶体金标记的ACE2蛋白为0.1-1mg/ml，胶体金标记的免疫球蛋白抗体为0.1-1mg/ml。
所述试剂盒还包括样品稀释液。所述样品稀释液包括20-50mM PBS，0.01％Tween-20， 0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5。
本发明的SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(1)制备胶体金标记ACE2蛋白的和胶体金标记的免疫球蛋白；
(2)将SARS-CoV-2病毒或其变体RBD包被在反应垫上形成检测线，将抗免疫球蛋白抗体包被在反应垫上形成质控线，将胶体金标记ACE2蛋白和胶体金标记的免疫球蛋白喷洒在结合垫上；
(3)将样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的反应垫和吸水垫按照顺序依次粘附在底板上，组装后得到免疫层析装置。
步骤(2)中所述SARS-CoV-2病毒RBD蛋白0.5-1.5μg/cm均匀包被在反应垫的检测线 (T线)位置形成检测线。优选地，所述SARS-CoV-2病毒RBD蛋白1.0μl/cm均匀包被在反应垫的检测线位置形成检测线。其中，所述抗免疫球蛋白抗体浓度为0.5-3.6μg/cm均匀包被在反应垫的质控线(C线)位置形成质控线。
步骤(2)中所述金标记的ACE2蛋白(1mg/ml)和胶体金标记免疫球蛋白(1mg/ml)按体积比1：1充分混合，以3.75μl/ml喷洒到结合垫上烘干，其中，所述胶体金标记的 ACE2蛋白为1mg/ml，胶体金标记的免疫球蛋白抗体为1mg/ml。
步骤(3)包括将组装完成的片材切割成试纸条，切好的试纸条组装到备好的试纸卡壳中，加样窗口对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应试纸条的检测区，再与干燥剂封存在铝箔袋中。
进一步，将制备好的SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金试纸条和样本稀释液按次序放置在盒体内，组装成试剂盒。
(三)SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体时间分辨免疫荧光检测试剂盒及其制备方法
本发明SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体时间分辨免疫荧光检测试剂盒，可以体现为免疫荧光微球标记SARS-CoV-2病毒RBD蛋白，ACE2蛋白固定在固相支持物的特定位置上，通过SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体阻断RBD蛋白和ACE2蛋白结合产生检测信号的检测试剂盒。
具体地，SARS-CoV-2病毒或其变体中和抗体胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有ACE2蛋白，所述质控线包被有抗免疫球蛋白抗体。
在一些具体实施方案中，所述胶体金检测试剂盒包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向依次设有检测线和质控线，所述检测线包被有重组 ACE2蛋白，所述质控线包被有抗小鼠IgG抗体。
其中，所述ACE2蛋白以0.2-1.0μg/cm均匀包被在反应垫的检测线(T线)位置形成检测线。优选地，所述ACE2蛋白以0.3μg/cm均匀包被在反应垫的检测线位置形成检测线。其中，所述抗免疫球蛋白抗体以0.5-3.6μg/cm均匀包被在反应垫的质控线(C线)位置形成质控线。将包被好检测线和质控线的反应垫烘干待用。
进一步，所述试剂盒包括荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白和荧光微球标记的免疫球蛋白。
其中，所述荧光微球标记的免疫球蛋白(浓度为0.1mg/ml)喷洒在所述结合垫上。根据本领域的常规操作对所述荧光微球标记的免疫球蛋白进行喷洒，保证在层析反应中发生信号反应即可。所述荧光微球标记的免疫球蛋白3.75μl/ml喷洒到处理过结合垫上。
所述荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白烘干后作为标记物管，待与样品溶液混合。在一些实施方案中，所述荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为1.0μg- 5μg。在一个优选实施方案中，所述荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为1.5 μg。
进一步所述试剂盒中还包括样品稀释液。所述样品稀释液包括20-50mM PBS，0.01％ Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5。
本发明的SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体胶体金检测试剂盒的制备方法包括以下步骤：
(1)制备荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒或其变体RBD和荧光微球标记的免疫球蛋白；
(2)将ACE2蛋白包被在反应垫上形成检测线，将抗免疫球蛋白抗体包被在反应垫上形成质控线，将荧光微球标记的免疫球蛋白喷洒在结合垫上；
(3)将样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的反应垫和吸水垫按照顺序依次粘附在底板上，组装后得到免疫层析装置。
步骤(1)包括将荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒或其变体RBD烘干制成荧光微球标记物管。在一些实施方案中，所述荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为1.0μg-5μg。在一个优选实施方案中，所述荧光微球标记的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的量为 1.5μg。
步骤(2)中所述ACE2蛋白以0.2-1.0μg/cm均匀包被在反应垫的检测线(T线)位置形成检测线。优选地，所述ACE2蛋白，以0.3μg/cm均匀包被在反应垫的检测线位置形成检测线。其中，所述抗免疫球蛋白抗体以0.5-3.6μg/cm均匀包被在反应垫的质控线(C线) 位置形成质控线。将包被好检测线和质控线的反应垫烘干待用。其中，所述胶体金标记的免疫球蛋白以0.1mg/ml浓度，3.75μl/ml喷洒到处理过的结合垫上烘干。
步骤(3)包括将组装完成的片材切割成试纸条，切好的试纸条组装到备好的试纸卡壳中，加样窗口对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应试纸条的检测区，再与干燥剂封存在铝箔袋中。
进一步，将制备好的荧光微球标记物管、SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫荧光纸条、和样本稀释液放置在盒体内，组装成试剂盒。
SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体时间分辨免疫荧光检测试剂盒还可以体现为免疫荧光微球标记ACE2蛋白，SARS-CoV-2病毒或其变体的RBD蛋白固定在固相支持物特定位置上，通过SARS-CoV-2病毒中和抗体阻断RBD蛋白和ACE2蛋白结合产生检测信号的检测试剂盒。
本发明还提供了SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体量子点检测试剂盒，可以体现为量子点标记SARS-CoV-2病毒或其变体的RBD蛋白，ACE2蛋白固定在固相支持物特定位置上，通过SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体阻断RBD蛋白和ACE2蛋白结合产生检测信号的检测试剂盒。
本发明也提供了SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体量子点检测试剂盒，可以体现为量子点标记ACE2蛋白，SARS-CoV-2病毒RBD蛋白固定在固相支持物特定位置，通过SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体阻断RBD蛋白和ACE2蛋白结合产生检测信号的检测试剂盒。
免疫层析装置的使用方法
本发明提供了上述免疫层析装置的使用方法，包括如下步骤：
(1)待测样品中加入样品稀释液稀释后，加入信号标记物混匀；
(2)将混合物滴加至所述免疫层析装置的加样垫上；
(3)待一段时间后，根据检测线和质控线的显色情况，判断样品中是否有冠状病毒中和抗体，判断方法如下：
(a)阳性：所述质控线呈现信号，检测线不呈现信号，说明样品中含有冠状病毒中和抗体；
(b)阴性：所述质控线和检测线均呈现信号，说明样品中不含有冠状病毒中和抗体；
(c)失效：所述质控线和检测线均不呈现信号，说明免疫层析装置失效。
本发明的免疫层析试剂盒的结果判断：当样本中存在SARS-CoV-2病毒中和抗体时，质控线出现信号(或条带)和检测线不出现信号(或条带)；当样本中不存在SARS-CoV-2病毒中和抗体时，检测线和质控线同时出现信号(或条带)。
为了实现上述目的，本发明所采用以下三种技术方案是：
1)一种SARS-CoV-2病毒中和抗体检测试剂盒(胶体金法1)由SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金检测试纸条、SARS-CoV-2RBD金标物管和样本稀释液组成。SARS-CoV-2病毒中和抗体试纸由支撑板、加样垫、结合垫、检测膜和吸水垫构成，结合垫吸附胶体金标记的小鼠单克隆抗体，检测膜上含有检测线(T线)“|”和质控线(C线)“|”印迹，检测线T为重组人ACE2受体印迹，质控线(C线)为兔抗小鼠IgG印迹。SARS-CoV-2病毒中和抗体加样管中含有胶体金标记的SARS-CoV-2RBD重组蛋白。所述试剂盒通过阻断人ACE2受体与SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合模式检测SARS-CoV-2病毒中和抗体，若在检测线(T 线)和质控线(C线)显现红色条带“|”，则为SARS-CoV-2病毒中和抗体阴性；若仅质控线(C线)显现一条红色条带“|”，则为SARS-CoV-2病毒中和抗体阳性。
2)一种SARS-CoV-2病毒中和抗体检测试剂盒(时间分辨免疫荧光法)由SARS-CoV-2病毒中和抗体时间分辨免疫层析试纸条、SARS-CoV-2RBD蛋白荧光微球标记物管和样本稀释液组成。SARS-CoV-2病毒中和抗体试纸由支撑板、加样垫、结合垫、检测膜和吸水垫构成，结合垫吸附荧光微球标记的小鼠单克隆抗体，检测膜上含有检测线(T线)“|”和质控线 (C线)“|”印迹，检测线(T线)为重组人ACE2受体印迹，质控线(C线)为兔抗小鼠 IgG印迹。SARS-CoV-2病毒中和抗体加样管中含有荧光微球标记的SARS-CoV-2RBD重组蛋白。所述试纸通过阻断人ACE2受体与SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合模式检测SARS- CoV-2病毒中和抗体。根据抑制率判断中和抗体的存在情况。
3)一种SARS-CoV-2病毒中和抗体检测试剂盒(胶体金法2)由SARS-CoV-2病毒中和抗体试纸条和样本稀释液组成。SARS-CoV-2病毒中和抗体试纸由支撑板、加样垫、结合垫、检测膜和吸水垫构成，结合垫吸附胶体金标记的小鼠单克隆抗体和胶体金标记的ACE2受体，检测膜上含有检测线(T线)“|”和质控线C“|”印迹，检测线(T线)为重组SARS- CoV-2RBD印迹，质控线(C线)为兔抗小鼠IgG印迹。所述试剂盒通过阻断人ACE2受体与SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合模式检测SARS-CoV-2病毒中和抗体，若在检测线(T 线)和质控线(C线)显现红色条带“|”，则为SARS-CoV-2病毒中和抗体阴性；若仅质控线(C线)显现一条红色条带“|”，则为SARS-CoV-2病毒中和抗体阳性。
免疫层析装置的应用
本发明提供了上述免疫层析装置在检测受试者感染或疑似感染SARS-CoV-2病毒或其变体中的应用。机体感染新型冠状病毒SARS-CoV-2之后，起初，未来得及引起机体的免疫反应，因此，此时只能检测到新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原。之后，引起机体的免疫反应，最早出现的免疫球蛋白是IgM抗体，之后出现IgG抗体。因此，通过检测机体内新型冠状病毒COVID-19抗原，及其特异性的IgM抗体和IgG抗体的存在与否，可以诊断机体对新型冠状病毒SARS-CoV-2抗原的免疫反应状态。对于疑似感染的受试者可以通过本发明的试剂盒检测血清中SARS-CoV-2病毒中和抗体的存在情况，以确定受试者是否感染SARS-CoV-2 病毒。已感染的受试者可以通过本发明的试剂盒检测血清中SARS-CoV-2病毒中和抗体的存在情况，以确定是否在机体内产生有效的免疫。
本发明提供了上述免疫层析装置在检测受试者接种针对SARS-CoV-2或其变体的疫苗后是否产生有效免疫中的应用。目前临床正在积极开发SARS-CoV-2病毒的疫苗，部分疫苗的研发已进入临床阶段。本发明的试剂盒可用于快速检测接种SARS-CoV-2疫苗的受试者是否已产生有效的免疫，确定接种疫苗的受试者血清中是否产生中和抗体。这对于SARS-CoV-2 疫苗的研发有重要作用。
又一方面，本发明提供了上述免疫层析装置用于检测通过生物学方法获得的SARS- CoV-2中和抗体的应用。目前大量针对SARS-CoV-2或其变体的抗体正在开发中，通过本领域常见的方法，包括动物免疫、噬菌体展示库等方法获得的抗SARS-CoV-2抗体，需要快速有效的方法筛选出有中和能力的抗体。本发明的免疫层析装置可用于测定免疫的动物血清中 SARS-CoV-2中和抗体的检测。也可用于其他不同方式纯化得到的SARS-CoV-2抗体中中和抗体的检测。
本发明中“冠状病毒”是指是一类在动物与人类之间传播的人畜共患的RNA病毒。冠状病毒可感染哺乳动物、鸟类，引起牛和猪的消化道疾病或鸡的上呼吸道疾病。自然界常见，已知可感染人类的冠状病毒共有七种，会引起人类的呼吸道感染，可引发普通感冒，乃至中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)、2019年冠状病毒疾病(COVID- 19或SARS-CoV-2)等较严重疾病。本发明中所述冠状病毒选自SARS-CoV-2或其变体、 SARS-CoV或其变体或者MERS-Cov或其变体。优选地，所述冠状病毒为SARS-CoV-2或其变体。
本发明中“新型冠状病毒”(SARS-CoV-2)，亦称为2019-nCoV，其属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARSr-Cov和MERSr-CoV有明显区别。研究显示，其与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。体外分离培养时，2019-nCov 96个小时左右即可在人呼吸道上皮细胞内发现，而在Vero E6和Huh-7细胞系中分离培养需约6天。
本发明中“SARS-CoV-2病毒变体”是指目前发现的新型冠状病毒具有序列高度同源性的病毒。目前已有研究团队从马来亚穿山甲中分离出的一种冠状病毒在E，M，N和S基因中分别与2019-nCoV表现出100％，98.2％，96.7％和90.4％的氨基酸一致性。特别地，穿山甲冠状病毒的S蛋白的受体结合域实际上与2019-nCoV的S蛋白的受体结合域相同，仅具有一个氨基酸差异(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.17.951335v1)。本发明中所述SARS-CoV-2病毒变体的基因序列与新型冠状病毒的基因序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列一致性。本发明所述SARS-CoV-2病毒变体宝库偶近期发现的英国病毒突变体B.1.1.7、南非病毒突变体B.1.351以及印度出现的新冠病毒突变株B.1.617等。
“SARS-CoV-2病毒抗原”是指SARS-CoV-2全病毒裂解液的抗原或者重组表达的SARS-CoV-2抗原。SARS-CoV-2病毒包括刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、基质蛋白(M) 和核衣壳蛋白(N)抗原，其中S蛋白是SARS-CoV-2最大的结构蛋白。S蛋白在宿主酶的作用下能裂解为S1和S2亚单位，其中S1亚单位含有受体结合区RBD，是主要的靶抗原。本发明中，所述SARS-CoV-2病毒抗原选自刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、基质蛋白(M) 和/或核衣壳蛋白(N)抗原。优选地，所述SARS-CoV-2病毒抗原为SARS-CoV-2S1亚基或SARS-CoV-2S RBD抗原。本发明中所述SARS-CoV-2S RBD抗原可采用常规重组表达的方法生产，通过构建表达SARS-CoV-2SRBD的质粒，如pFastBac1、pTT5，包含目的基因的表达载体转染表达细胞，如CHO细胞、SF9细胞，表达纯化得到SARS-CoV-2S RBD 重组蛋白。
本文所用的术语“中和抗体”指通过与病毒分子结合防止细胞被某种抗原或感染源侵害的抗体，其原理是通过抑制乃至中和它们的某种生化作用。本文所用的术语“SARS-CoV-2 病毒中和抗体”是指通过与SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合来阻断SARS-CoV-2病毒RBD与人ACE2受体结合的抗体。
本发明中“ACE2”或“ACE2蛋白”可以体现为重组ACE2蛋白，可以体现为可溶性ACE2蛋白，可以体现为Fc标签ACE2蛋白。本发明中“ACE2蛋白的功能片段”是指能发挥与冠状病毒的刺突蛋白结合，特别是SARS-CoV-2病毒RBD蛋白结合作用的ACE2蛋白的片段，可以是ACE2蛋白中发挥结合功能的部分区域。
本发明中“冠状病毒刺突蛋白部分”是指包括冠状病毒能发挥功能的刺突蛋白部分，可以是病毒RBD蛋白，病毒S1蛋白和病毒S蛋白。优选地为SARS-CoV-2病毒RBD蛋白，SARS-CoV-2病毒S1蛋白和SARS-CoV-2病毒S蛋白，更优选为SARS-CoV-2病毒RBD蛋白或SARS-CoV-2病毒S1蛋白。
本文术语“SARS-CoV-2病毒RBD蛋白”，可以体现为重组SARS-CoV-2病毒RBD蛋白，带有His标签的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白，带有Fc标签的SARS-CoV-2病毒RBD 蛋白，包含有SARS-CoV-2病毒RBD蛋白的分子，比如SARS-CoV-2病毒S1亚基(如 SEQ ID NO:2所示序列)和SARS-CoV-2病毒S蛋白。
本文术语“信号物”可以指可视化信号物、荧光信号物、磁信号物中的至少一种。可视化信号物包括胶体金、胶体银、彩色乳胶微球和彩色染料等。荧光信号物包括荧光微球、量子点等。荧光微球包括上转换荧光微球、时间分辨荧光微球等。
本发明中“免疫荧光微球”,可以体现为含钐(SM)免疫荧光微球，含铕(Eu)免疫荧光微球，含镝(Dy)免疫荧光微球,含锝(Te)免疫荧光微球。
本发明中量子点可选用以下颗粒：(1)单一化合物的量子点，如InAs，InP，InGaAs，AlGaAs，InAlAs，BaSe，BaTe，ZnS，ZnSe，ZnTe，CSiC，SiGe中的任意一种；第IV族和第VI族组成的化合物。(2)由量子点化合物与其它化学物质组装而成的量子点颗粒，如 ZnS包覆CdSe，二氧化硅包覆CdSe，可以是有机高分子聚合物与量子点化合物组装而成，如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚丙烯、交联葡聚糖、树形分子等任意一种包裹一种量子点或几种量子点制成的颗粒。
本发明所述结合垫的材料不作特别限定，可采用本领域技术人员熟知的材料即可，作为优选，所述结合垫为玻璃纤维膜。
本发明所述加样垫，结合垫是经过处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述处理液含有如下组分：Tween 20、Triton x-405、Casein、BSA、PEG-20000，PVP和NaCl。
本发明中反应垫包括但不限于硝酸纤维素膜和醋酸纤维素膜，优选为硝酸纤维素膜。其中的硝酸纤维素膜可以为任何商品化的硝酸纤维素膜，包括S&SAE99、whatman 8um、Millipore M135、Sartoirus CN140等。
本发明中“检测线”是设在反应垫上的，由喷洒或划上的化合物，如蛋白等形成的一条线。例如，首先在反应垫上沿垂直于样品流动的方向确定检测线位置，再将蛋白等分子通过喷洒或划线等方法均匀固定在检测线位置形成检测线。在试纸条或检测试剂盒中会指示出检测线位置，加入待检测样本后，可通过观察检测线显示信号情况判断样品中的分子是否与检测线上包含的分子发生反应。
本发明中“质控线”是设在反应垫上的，由喷洒或划上的对照化合物，如蛋白、生物素、生物素、配体等，形成的一条线，通常设在检测线沿样品流动方向的下游且与检测线平行。首先在反应垫上选择检测线沿样品流动方向的下游位置，再将蛋白、生物素或亲和素等分子通过喷洒或划线等方法固定在质控线位置形成质控线。
本发明中吸水垫可以用任何能吸收液体的材料制成，但吸收能力应足够大。可使用的材料包括但不局限于脱脂棉吸水垫、硅胶吸水垫或海绵吸水垫。
本发明所述底板用于承载所述样品垫、结合垫、反应垫和吸水垫；所述底板可以是各种不吸水的具有支撑作用的薄片，作为举例，所述底板可以为聚氯乙烯(PVC)板、聚丙烯(PP)板、聚乙烯(PE)板或聚氨酯(PU)板，优选为PVC板。
本发明中试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次粘附在底板上。具体地，试纸条结构为反应垫(如硝酸纤维素膜) 置于底板(如聚氯乙烯板)上面，样品垫平贴于反应垫左侧，吸收垫(如吸水纸)平贴于反应垫(硝酸纤维素膜)右侧，结合垫平贴于样品垫与硝酸纤维素膜之间，使其一端压于样品垫之下，另一端覆于反应垫之上。本发明中“搭接”是指加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫相邻两个部分相互重合的连接，这样的搭接结构能保证在加样层析过程中样品能依次流经加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫。在一些情况下，在保证样品流经加样垫、结合垫和反应垫时，可不包括吸水垫。在另一些情况下，在保证加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫完成样品的层析时，可不包括底板。
如本文使用的术语“受试者”指需要缓解、预防和/或治疗疾病或病症如病毒感染的动物，优选哺乳动物，更优选人。术语包括具有冠状病毒如SARS-CoV-2感染或处于具有冠状病毒如SARS-CoV-2感染风险的人受试者。健康受试者是指未感染SARS-CoV-2病毒的健康动物，优选哺乳动物，更优选人。
本发明中样品包括但不限于(1)感染或疑似感染冠状病毒的血浆、血清或全血；(2) 接种冠状病毒疫苗后的血浆、血清或全血；(3)冠状病毒刺突蛋白免疫动物后的血浆、血清或全血；或(4)生物学方法获得的抗冠状病毒的抗体样品。样品可来源于感染或疑似感染SARS-CoV-2病毒的人或动物的血浆、血清、全血、胸腹腔积液、脑脊液或组织标本，还可来源于生物学方法如动物免疫制备的动物血清、血浆、全血或抗SARS-CoV-2冠状病毒的抗体的溶液。
关于肽或多肽序列的“百分比(％)氨基酸序列一致性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
有益技术效果
SARS-CoV-2病毒血清学检测方法均为检测SARS-CoV-2总抗体(Ab)和SARS-CoV-2IgM抗体和SARS-CoV-2IgG抗体。快速诊断SARS-CoV-2中和抗体在辅助诊断中、疫苗评价的价值尚未被开发。通过SARS-CoV-2RBD蛋白片段与人可溶性ACE2受体的相互作用开发诊断试剂盒的方法比较新颖，尚为被开发利用。通过读取检测线信号等方式可以计算出中和抗体的抑制率水平，方便、快捷。用层析试纸条实现快速诊断，避免使用大型仪器和场地限制。
本发明提供的免疫层析装置检测病毒中和抗体的准确性高、特异性强，而且检测速度快、操作简便，不需要专业人员的操作，可应用于社区、基层医院、机场、海关甚至家庭等多种场所的初步筛查，能够在数分钟内判断结果，为疑似感染者排查和无症状感染者筛查提供更简便、更快速的现场检测手段，从而及早预防疫情扩散。
附图说明
图1为SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒的原理图，人ACE2蛋白固定在检测线 (T线)，信号物标记SARS CoV-2RBD蛋白；
图2为SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒的原理图，SARS CoV-2RBD蛋白固定在检测线(T线)，信号物标记人ACE2蛋白；
图3为SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒的俯视结构示意图，依次包含底板、加样垫(加样孔)、结合垫(金标垫)、检测线(T线)、质控线(C线)以及吸水垫；
图4为SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒检测效果图，图4A使用重组SARS-CoV-2病毒RBD蛋白免疫的动物血清作为阳性质控品。阳性质控品在质控线(C线)上出现条带，而在检测线(T线)上没有出现条带；图4B使用免疫前动物空白血清作为阴性质控品评估SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒，而阴性质控品在检测线(T线)和质控线 (C线)上均出现条带。
具体实施方式
除非另有说明，本发明所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术员通常所理解的含义。本发明通过以下实施例作进一步举例说明，这些实施例不应解释为对本发明的限制。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试剂盒(胶体金法1)制备及性能评估
1.1胶体金溶液制备
用超纯水溶解氯金酸，配成10％溶液。再用纯水配制成1L 0.01％的浓度放入烧杯中。将烧杯放置于可加热的混匀仪上，转速调到2000r/min，使溶液充分旋转。一次性迅速加入 0.561g柠檬酸三钠溶液。待溶液变成稳定的紫红色时，调小转速到200r/min，关掉加热，继续反应20min。待金溶液恢复成室温后，用清洁带盖的器皿盛装，4℃保存。
1.2 SARS-CoV-2RBD金标物管的制备
用干净的烧杯盛取10ml胶体金溶液，向其中分别加入40μL，50μL，60μL和70μL 优选40μL 0.1M碳酸钾溶液(1.38g碳酸钾，100mL超纯水，0.22μM膜滤过)，并迅速充分混匀3分钟。迅速加入50μg，100μg，150μg和200μg，优选100μg SARS-CoV-2RBD 蛋白(金斯瑞，T80302，序列见SEQ ID NO:1)，充分震荡后静置，室温反应30min。加入 250μL封闭液(5％BSA，0.1mM PBS)充分搅拌封闭，封闭时间30min。用尖底的离心管装胶体金混合液，10000g离心力下离心30min，充分吸取上清并丢弃，沉淀用20ml的保存液 (2％BSA，0.03％ProcLin300，0.01M PBS，pH 7.2)重悬。重悬后的金标物按1.5μl量分装于500μL尖底离心管底部，37℃过夜烘干。放于4℃保存。
1.3小鼠IgG金标物的制备
用干净的烧杯盛取10ml胶体金溶液，向其中加入40μL 0.1M碳酸钾溶液(1.38g碳酸钾，100mL超纯水，0.22μM过滤)，并迅速充分混匀3分钟。迅速加入100-200μg的小鼠IgG抗体(金斯瑞，A01011)，充分震荡后静置，室温反应30min。加入250μL封闭液 (5％BSA，0.1mMPBS)充分震荡后静置封闭，封闭时间30min。用尖底的离心管装胶体金混合液，10000g离心30min，充分吸取上清并丢弃，将沉淀用2ml保存液(2％BSA， 0.03％ProcLin300，0.01MPBS，pH 7.2)重悬，放于4℃保存。
1.4硝酸纤维素膜(NC膜)检测线和质控线包被及胶体金结合垫制备
将人ACE2重组蛋白(Swiss-Prot:Q9BYF1.2，序列见SEQ ID NO:3)用包被缓冲液(15g Na2HPO4，0.23g NaH2PO4，5-10g蔗糖，0.1-0.5g甲醇溶于1L超纯水中)稀释成0.5mg/ml， 1mg/ml，2mg/ml不同浓度梯度，优选1mg/ml，用三维平面点膜喷金仪(金标)以 0.3μg/cm均匀包被在硝酸纤维素膜(赛多利斯，1MN14ER100025NT)的T线位置(如图2 所示的检测线T线位置)。
将兔抗小鼠Ig抗体(金斯瑞：V90301)用包被缓冲液(15g Na2HPO4，0.23gNaH2PO4，5-10g蔗糖，0.1-0.5g甲醇溶于1L超纯水中)稀释成1-3mg/ml，用三维平面点膜喷金仪以0.5-1.2μL/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的C线位置(如图2所示的质控线C线位置)，然后放于37℃烘箱过夜烘干。
将上述制备好的胶体金标记小鼠IgG重悬液，用三维平面点膜喷金仪(金标)喷量3.75 μl/ml喷洒到处理过结合垫上。放于37℃干燥箱中过夜烘干。
1.5 SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金试纸条的组装、包装
如图1和图3所示，将样品垫(上海杰一，GL-b02)、结合垫(上海杰一，8951)、划有重组人ACE2蛋白作为检测线和划有兔抗小鼠lgG作为质控线的硝酸纤维素膜(反应垫)以及吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬(底板)上。将组装完成的片材切割成宽度4mm的试纸条，切好的试纸条组装到备好的试纸卡壳中，加样窗口对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应试纸条的检测区，再与干燥剂封存在铝箔袋中。温度应该控制在20-30℃，湿度控制在20-30％。
1.6 SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金检测试剂盒的组装
按照上述步骤制备好的金标记物管、SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金试纸条、和样本稀释液(20mM PBS，0.01％Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5)按次序放置在盒体内，组装成试剂盒，于4-25℃避光保存。
1.7 SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金检测试剂盒的质控
吸取20μL(2滴)阳性对照(金斯瑞制备动物抗SARS-CoV-2RBD重组蛋白抗血清) 和阴性对照(金斯瑞制备的正常动物抗血清，即免疫前动物空白血清)，分别加入到一管 80μL检测缓冲液(20-50mM PBS，0.01％tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH 7.0-7.5)中，充分混匀后，全部加入到重组SARS-CoV-2RBD金标物管中，充分混匀10min (混匀5-6次)。取所有混合液100μL垂直滴加至检测卡加样处(试纸条加样处)，开始计时，10-15min观察条带显色。结果判定若检测线(T线)和质控线(C线)均显条带，则为 SARS-CoV-2抗体检测为阴性，表明检测样品中不包含SARS-CoV-2中和抗体；若检测线 (T线)不显条带色而质控线(C线)显条带，则为SARS-CoV-2抗体检测阳性，表明检测样品中包含SARS-CoV-2中和抗体；若质控线不显色，则试纸无效。检测效果如图4所示，结果说明本发明的试剂盒可用于SARS-CoV-2病毒中和抗体的检测。
1.8 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒性能评估
将实施例1.2制备的金标记物管、SARS-CoV-2病毒中和抗体胶体金检测试纸条、人血清样本、质控品和样本稀释液(20-50mM PBS，0.01％Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5)恢复至18-30℃。吸取20μL血清样本，加入到一管80μL稀释液样本中，充分混匀后，全部加入到金标记物管中，充分混匀10min(混匀5-6次)；取所有混合液100μL垂直滴加至检测卡加样处，开始计时，10-15min观察条带显色；检测结果见表1，通过SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒检测40例健康人血清，检测结果均为阴性。本发明的试剂盒的阴性符合率为100％。通过检测4例阳性质控品(含有基质血清及抗 SARS-CoV-2S蛋白抗体9A9C9(重组中和抗体，南京金斯瑞))(P1、P2、P3、P4)，检测结果均为阳性。本发明的试剂盒阳性符合率100％。其中“+”表示阴性，
Figure BDA0003100671200000202
表示阳性。
表1 SARS-CoV-2病毒中和抗体检测试剂盒检测健康人血清特异性结果
Figure BDA0003100671200000201
Figure BDA0003100671200000211
实施例2 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试剂盒(时间分辨免疫荧光法)制备及性能评估
2.1 SARS-CoV-2RBD蛋白荧光微球标记物管的制备
移取90μl微球活化缓冲液(5-50mM MES PH5-6.5)和10μl的5％荧光微球(微测，MD001)加入到到2.0mL离心管中，震荡混匀。20000g离心20min，弃上清。用100μL微球活化缓冲液(5-50mM MES，pH5.0-6.5)重悬沉淀，用超声仪超声50S。加入1-3μL的 2mg/mL EDC(Sigmaaldrich，E6383)稀释液，放置混匀仪上混匀25min，转速为200r/min。 20000g离心20min，弃上清。用100μL微球标记缓冲液(20-100mM Hepes，pH7.0-8.0)重悬沉淀。向重悬后的荧光微球中加入5-20μg SARS-CoV-2RBD蛋白(金斯瑞，T80302)，混匀仪上混匀3h，温度30℃，转速200r/min。在荧光微球中加入10-30μL 10％BSA，2-10μL 的CE510(JSR CE510)放置混匀仪上混匀1h，温度30℃，转速200r/min。20000g离心 10min，弃上清。用2000μL荧光微球重悬液(2％BSA，0.03％ProcLin300，0.01M pH 7.2 PBS，0.22μm过滤)重悬后的SARS-CoV-2RBD蛋白荧光微球标记物。按1.5-5μl量分装于500μL尖底离心管底部，37℃过夜烘干，形成SARS-CoV-2RBD蛋白荧光微球标记物管。放于4℃保存。
2.2小鼠IgG荧光微球标记物的制备
移取90μl微球活化缓冲液(5-50mM MES，pH5-6.5)和10μl 5％荧光微球(微测，MD001)加入到2.0mL离心管中，震荡使其充分混匀。20000g离心20min，弃上清。用100 μL微球活化缓冲液(5-50mM MES，pH5.0-6.5)重悬沉淀，超声仪超声50S。加入1-3μL 2mg/mL EDC(Sigmaaldrich，E6383)稀释液。放置混匀仪上混匀25min，反应温度为30℃，转速为200r/min。置于离心机中20000g离心20min，弃上清。取100μL微球标记缓冲液 (20-100mM Hepes，pH7.0-8.0)重悬沉淀，用超声仪超声50S。在荧光微球中加入10-30μ g小鼠IgG抗体(金斯瑞，A01011)，放置混匀仪上混匀3h，温度30℃，转速200r/min。在荧光微球中加入10-30μL10％BSA，CE510(JSR CE510)2-10μL在涡旋混匀仪上混匀 10秒，放置混匀仪上混匀1h，温度30℃，转速200r/min。20000g离心10min，弃上清。加入2000μL荧光微球重悬液(2％BSA，0.03％ProcLin300，0.01MPBS，pH 7.2，0.22μm过滤)，置4℃备用。
2.3硝酸纤维素膜(NC膜)检测线和质控线包被及结合垫制备
将人ACE2重组蛋白用包被缓冲液(15gNa2HPO4，0.23gNaH2PO4，5-10g蔗糖，0.1-0.5g 甲醇溶于1L超纯水中)稀释成0.5mg/ml，1mg/ml，2mg/ml不同浓度梯度，优选1mg/ml，以0.3μg/cm均匀包被在硝酸纤维素膜(赛多利斯，1MN14ER100025NT)的T线位置(如图2所示的检测线T线位置)。将兔抗小鼠Ig抗体(金斯瑞：V90301)用包被缓冲液稀释成1-3mg/ml，以0.5-1.2μL/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的C线位置(如图2所示的质控线 C线位置)，然后放于37℃烘箱过夜烘干。将上述制备好的小鼠IgG荧光微球标记物重悬液，三维平面点膜喷金仪(金标)喷量3.75μl/ml喷洒到结合垫上，然后放于37℃干燥箱中过夜烘干。
2.4 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试纸条(时间分辨免疫荧光法)的组装
如图2所示，将样品垫(上海杰一，GL-b02)、结合垫(上海杰一，8951)、划有重组人ACE2蛋白的为检测线和划有兔抗小鼠lgG作为质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬(底板)上。将组装完成的片材切割成宽度4mm的试纸条，切好的试纸条组装到备好的试纸卡壳中，加样窗口对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应试纸条的检测区，再与干燥剂封存在铝箔袋中。温度应该控制在20-30℃，湿度控制在20-30％。
2.5 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试剂盒(时间分辨免疫荧光法)组装
按照上述2.1步骤制备好的SARS-CoV-2RBD蛋白荧光微球标记物管、SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试纸条、和样本稀释液(20mM PBS，0.01％Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5)按次序放置在盒体内，组装成试剂盒，于4-25℃避光保存。
2.6 SARS-CoV-2病毒中和抗体时间分辨免疫荧光试剂盒性能评估
将上述的SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试剂盒(时间分辨免疫荧光法)和人血清、质控品样本恢复至18-30℃。吸取20μL血清样本，加入到一管80μL稀释液样本中，充分混匀后，全部加入到SARS-CoV-2RBD蛋白荧光微球标记物管中，充分混匀10min(混匀5-6次)。取所有混合液100μL垂直滴加至检测卡加样处，开始计时，10-15min观察荧光检测仪读数。检测结果见表2，通过SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒检测50例健康人血清、4例阳性质控品(含有基质血清及抗SARS-CoV-2S蛋白抗体9A9C9，P1、P2、 P3、P4)和16例阳性兔血清(通过SARS-CoV-2S蛋白片段免疫兔获取的血清，R1-R16)，计算抑制率，抑制率＜30％，结果判定为阴性，抑制率≥30％，结果判定为阳性。50例健康人血清检测抑制率均＜30％，阴性符合率100％，4例阳性质控品和16例阳性兔血清检测抑制率≥30％，阳性符合100％。检测结果见表2。
表2 SARS-CoV-2病毒中和抗体时间分辨免疫荧光试剂盒健康人血清特异性和质控品检测灵敏度结果
阴性样本编号 检测结果 阴性样本编号 检测结果
1 -5％ 26 18％
2 18％ 27 4％
3 7％ 28 15％
4 25％ 29 8％
5 23％ 30 9％
6 20％ 31 22％
7 0％ 32 19％
8 -6％ 33 -1％
9 1％ 34 24％
10 21％ 35 14％
11 3％ 36 10％
12 9％ 37 15％
13 6％ 38 20％
14 -3％ 39 -2％
15 -1％ 40 12％
16 15％ 41 14％
17 16％ 42 11％
18 11％ 73 12％
19 20％ 44 2％
20 6％ 45 21％
21 -14％ 46 1％
22 6％ 47 28％
23 2％ 48 4％
24 9％ 49 3％
25 24％ 50 11％
P1 43％ R7 33％
P2 59％ R8 93％
P3 84％ R9 88％
P4 87％ R10 75％
R1 62％ R11 56％
R2 33％ R12 72％
R3 61％ R13 52％
R4 45％ R14 58％
R5 76％ R15 32％
R6 53％ R16 83％
实施例3 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析检测试剂盒(胶体金法2)制备及性能评估
3.1胶体金溶液制备
用超纯水溶解氯金酸，配成10％溶液。再用纯水配制成1L 0.01％的浓度放入烧杯中。将烧杯放置于可加热的混匀仪上，转速调到2000r/min，使溶液充分旋转。一次性迅速加入0.561g柠檬酸三钠溶液。待溶液变成稳定的紫红色时，调小转速到200r/min，关掉加热，继续反应20min。待金溶液恢复成室温后，用清洁带盖的器皿盛装，4℃保存，有效期1年。
3.2人ACE2重组蛋白金标物的制备
用干净的烧杯盛取10ml胶体金溶液，向其中分别加入40μL，50μL，60μL和70μL，优选60μL 0.1M碳酸钾溶液(1.38g碳酸钾，100mL超纯水，0.22μM过滤)，并迅速充分混匀3分钟。迅速加入50μg，100μg，150μg和200μg，优选100μg的人的ACE2重组蛋白，充分震荡后静置，室温反应30min。加入250μL封闭液(5％BSA，0.1mM PBS)充分搅拌封闭，封闭时间30min。用尖底的离心管装胶体金混合液，10000g离心力下离心30min，充分吸取上清并丢弃，沉淀5ml的保存液(2％BSA，0.03％ProcLin300，0.01M PBS，pH 7.2) 重悬。
3.3小鼠IgG金标物的制备：
用干净的烧杯盛取10ml胶体金溶液，向其中加入40μL 0.1M碳酸钾溶液(1.38g碳酸钾，100mL超纯水，0.22μM过滤)，并迅速充分混匀3分钟。迅速加入100-200μg的小鼠 IgG抗体(金斯瑞，A01011)，充分震荡后静置，室温反应30min。加入250μL封闭液 (5％BSA，0.1mM PBS)充分震荡后静置封闭，封闭时间30min。用尖底的离心管装胶体金混合液，10000g离心力下离心30min，充分吸取上清并丢弃，将沉淀用2ml保存液(2％ BSA，0.03％ProcLin300，0.01M PBS，pH 7.2)重悬，放于4℃保存。
3.4硝酸纤维素膜(NC膜)检测线和质控线包被及结合垫制备
将人SARS-CoV-2RBD蛋白(金斯瑞，T80302)用包被缓冲液(15g Na2HPO4，0.23gNaH2PO4，5-10g蔗糖，0.1-0.5g甲醇溶于1L超纯水中)稀释成0.1mg/ml，0.3mg/ml，0.6 mg/ml不同浓度梯度，优选0.3mg/ml,以0.5μl/cm均匀包被在硝酸纤维素膜(赛多利斯，1MN14ER100025NT)的T线位置(如图2所示的检测线T线位置)。将兔抗小鼠Ig抗体 (金斯瑞：V90301)用包被缓冲液(15gNa2HPO4、0.23gNaH2PO4，5-10g蔗糖、0.1-0.5g甲醇溶于IL超纯水中)稀释成1-3mg/ml，以0.5-1.2μL/cm均匀包被在硝酸纤维素膜的C线位置(如图2所示的质控线C线位置)，然后放于37℃烘箱过夜烘干。将上述制备好的人 ACE2重组蛋白金标物重悬液和胶体金标记小鼠IgG重体积比悬液按1：1充分混合，三维平面点膜喷金仪喷量3.75μl/ml喷洒到结合垫上，然后放于37℃干燥箱中过夜烘干。
3.5 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试纸条(胶体金法2)的组装，包装
如图2和图3所示，将样品垫(上海杰一，GL-b02)、结合垫(上海杰一，8951)、划有人SARS-CoV-2RBD蛋白的作为检测线和划有兔抗小鼠lgG作为质控线的硝酸纤维素膜以及吸收垫按顺序依次粘附在聚乙烯背衬(底板)上。将组装完成的片材切割成宽度4mm的试纸条，切好的试纸条组装到备好的试纸卡壳中，加样窗口对应试纸条的样品垫，结果显示窗对应试纸条的检测区，再与干燥剂封存在铝箔袋中。温度应该控制在20-30℃，湿度控制在20-30％。
3.6 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒(胶体金法2)的组装
按照上述步骤制备SARS-CoV-2病毒中和抗体试纸条、和样本稀释液(20mM PBS，0.01％Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5)按次序放置在盒体内，组装成试剂盒，于4-25℃避光保存。
3.7 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒(胶体金法2)的质控
吸取20μL(2滴)阳性对照(金斯瑞制备动物抗SARS-CoV-2RBD重组蛋白抗血清) 和阴性对照(金斯瑞制备的正常动物抗血清，即免疫前动物空白血清)，分别加入到一管 80μL检测缓冲液(20-50mM PBS，0.01％tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH 7.0-7.5)中，充分混匀后，全部加入到重组SARS-CoV-2RBD金标物管中，充分混匀10min (混匀5-6次)。取所有混合液100μL垂直滴加至检测卡加样处(试纸条加样处)，开始计时，10-15min观察条带显色。结果判定若检测线(T)和质控线(C)均显条带，则为 SARS-CoV-2抗体检测为阴性，表明检测样品中不包含SARS-CoV-2中和抗体；若检测(T) 线不显条带色而质控线(C)显条带，则为SARS-CoV-2抗体检测阳性，表明检测样品中包含SARS-CoV-2中和抗体；若质控线不显色，则试纸无效。检测效果如图4所示，结果说明本发明的试剂盒可用于SARS-CoV-2病毒中和抗体的检测。
3.8 SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒(胶体金法2)特异性分析
将实施例3.5中制备的SARS-CoV-2病毒中和抗体免疫层析试纸条、人血清样本和样本稀释液(20-50mM PBS，0.01％Tween-20，0.09％NaCl，0.03％ProcLin300，pH7.0-7.5)恢复至18-30℃。吸取20μL血清样本，加入到一管80μL稀释液样本中，充分混匀。取所有混合液100μL垂直滴加至检测卡加样处，开始计时，10-15min观察条带显色。通过SARS- CoV-2病毒中和抗体免疫层析试剂盒检测健康人血清，检测结果均为阴性。本发明的试剂盒的特异性为100％。其中“+“表示阴性，
Figure BDA0003100671200000251
表示阳性。
序列信息：
SARS-CoV-2刺突蛋白RBD蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:1)
RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSF VIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNG VEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF
SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基氨基酸序列(SEQ ID NO:2)
SQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFAS TEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFL MDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWT AGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVF NATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNY KLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVG YQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEIL DITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR
人ACE2蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO:3)
QSTIEEQAKTFLDKFNHEAEDLFYQSSLASWNYNTNITEENVQNMNNAGDKWSAFLKEQSTLAQMYPLQEIQNLTVKLQL QALQQNGSSVLSEDKSKRLNTILNTMSTIYSTGKVCNPDNPQECLLLEPGLNEIMANSLDYNERLWAWESWRSEVGKQLRP LYEEYVVLKNEMARANHYEDYGDYWRGDYEVNGVDGYDYSRGQLIEDVEHTFEEIKPLYEHLHAYVRAKLMNAYPSYIS PIGCLPAHLLGDMWGRFWTNLYSLTVPFGQKPNIDVTDAMVDQAWDAQRIFKEAEKFFVSVGLPNMTQGFWENSMLTDP GNVQKAVCHPTAWDLGKGDFRILMCTKVTMDDFLTAHHEMGHIQYDMAYAAQPFLLRNGANEGFHEAVGEIMSLSAAT PKHLKSIGLLSPDFQEDNETEINFLLKQALTIVGTLPFTYMLEKWRWMVFKGEIPKDQWMKKWWEMKREIVGVVEPVPHD ETYCDPASLFHVSNDYSFIRYYTRTLYQFQFQEALCQAAKHEGPLHKCDISNSTEAGQKLFNMLRLGKSEPWTLALENVVG AKNMNVRPLLNYFEPLFTWLKDQNKNSFVGWSTDWSPYADQSIKVRISLKSALGDKAYEWNDNEMYLFRSSVAYAMRQ YFLKVKNQMILFGEEDVRVANLKPRISFNFFVTAPKNVSDIIPRTEVEKAIRMSRSRINDAFRLNDNSLEFLGIQPTLGPPNQP PVSIWLIVFGVVMGVIVVGIVILIFTGIRDRKKKNKARSGENPYASIDISKGENNPGFQNTDDVQTSF。
SEQUENCE LISTING
<110> Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd.(南京金斯瑞生物科技有限公司)
<120> 检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的免疫层析装置及其应用
<130> 201
<150> PCT/CN2020/094749
<151> 2020-06-05
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 2
<211> 673
<212> PRT
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
Ser Gln Cys Val Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr
1 5 10 15
Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg
20 25 30
Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser
35 40 45
Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr
50 55 60
Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe
65 70 75 80
Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr
85 90 95
Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr
100 105 110
Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe
115 120 125
Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu
130 135 140
Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser
145 150 155 160
Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn
165 170 175
Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr
180 185 190
Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe
195 200 205
Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr
210 215 220
Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly
225 230 235 240
Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly
245 250 255
Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr
260 265 270
Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys
275 280 285
Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser
290 295 300
Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile
305 310 315 320
Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala
325 330 335
Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp
340 345 350
Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr
355 360 365
Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr
370 375 380
Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro
385 390 395 400
Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp
405 410 415
Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys
420 425 430
Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn
435 440 445
Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly
450 455 460
Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu
465 470 475 480
Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr
485 490 495
Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val
500 505 510
Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn
515 520 525
Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn
530 535 540
Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr
545 550 555 560
Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr
565 570 575
Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr
580 585 590
Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val
595 600 605
Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr
610 615 620
Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly
625 630 635 640
Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala
645 650 655
Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala
660 665 670
Arg
<210> 3
<211> 788
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
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35 40 45
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50 55 60
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130 135 140
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Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg Ala
165 170 175
Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu Val
180 185 190
Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu Asp
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210 215 220
Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile Ser
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Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly Arg
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Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys Pro
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Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala Gln
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Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly Lys
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435 440 445
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Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu Lys
595 600 605
Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met Tyr
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Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val Ala
645 650 655
Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro Lys
660 665 670
Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile Arg
675 680 685
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Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val Ile
725 730 735
Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg Lys
740 745 750
Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile Asp
755 760 765
Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp Val
770 775 780
Gln Thr Ser Phe
785

Claims (23)

1.一种检测SARS-CoV-2病毒中和抗体的免疫层析装置，其特征在于，所述装置包括检测试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的加样垫、结合垫、反应垫和吸水垫，所述加样垫、结合垫、反应垫、吸水垫依次粘附在底板上，所述反应垫上沿样品流动方向包含依次设置的检测线和质控线，其中，所述检测线上包含ACE2蛋白或其功能片段，所述装置还包括信号物标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分，所述信号物标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分与所述ACE2蛋白或其功能片段结合产生检测信号，所述信号物标记SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分的量为1.0μg-5mg。
2.根据权利要求1所述的免疫层析装置，所述ACE2蛋白或其功能片段选自重组ACE2蛋白或带Fc标签ACE2蛋白。
3.根据权利要求2所述的免疫层析装置，所述ACE2蛋白或其功能片段包含SEQ ID NO:3所示氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的免疫层析装置，所述SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分包括SARS-CoV-2病毒S蛋白、SARS-CoV-2病毒S1蛋白、SARS-CoV-2病毒RBD蛋白或者带有His或者Fc标签的SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。
5.根据权利要求4所述的免疫层析装置，所述SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分包含SARS-CoV-2病毒S1蛋白或SARS-CoV-2病毒RBD蛋白。
6.根据权利要求4所述的免疫层析装置，所述SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分包含SEQID NO:1或2所示氨基酸序列。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的免疫层析装置，所述质控线上包含第一分子，所述加样垫上包含第二分子或检测时所述加样垫上另添加第二分子，所述第二分子能与第一分子结合产生检测信号。
8.根据权利要求7所述的免疫层析装置，所述第一分子和第二分子分别选自免疫球蛋白和抗免疫球蛋白抗体，受体和配体，或者生物素和亲和素组成的分子对中的任一个。
9.根据权利要求8所述的免疫层析装置，其中，所述第一分子选自抗免疫球蛋白抗体、配体或者生物素，对应地所述第二分子选自信号物标记的免疫球蛋白、信号物标记的受体或者亲和素；或所述第一分子选自免疫球蛋白、受体或者亲和素，对应地所述第二分子选自信号物标记的抗免疫球蛋白抗体、信号物标记的配体或者生物素。
10.根据权利要求1所述的免疫层析装置，所述ACE2蛋白或其功能以0.2-1.0μg/cm的量均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。
11.根据权利要求1-6和10中任一项所述的免疫层析装置，所述信号物选自胶体金、量子点或免疫荧光微球。
12.根据权利要求11所述的免疫层析装置，所述免疫荧光微球选自含钐免疫荧光微球，含铕免疫荧光微球，含镝免疫荧光微球或含锝免疫荧光微球。
13.根据权利要求11所述的免疫层析装置，所述量子点选自第IV族和第VI族组成的化合物或由量子点化合物与其它化学物质组装而成的量子点颗粒。
14.根据权利要求1-6和10中任一项所述的免疫层析装置，所述装置还包括样品稀释液。
15.根据权利要求1-6和10中任一项所述的免疫层析装置，其中，待测的样品包括：
（1）感染或疑似感染SARS-CoV-2病毒的血浆、血清或全血；
（2）接种SARS-CoV-2病毒疫苗后的血浆、血清或全血；
（3）SARS-CoV-2病毒刺突蛋白免疫动物后的血浆、血清或全血；或
（4）生物学方法获得的抗SARS-CoV-2病毒的抗体样品。
16.根据权利要求1-6和10中任一项所述的免疫层析装置，所述SARS-CoV-2病毒选自SARS-CoV-2或其变体。
17.权利要求1-16中任一项免疫层析装置在制备用于通过下述方法检测样品中SARS-CoV-2病毒中和抗体的装置中的应用，所述方法包括如下步骤：
（1）待测样品中加入样品稀释液稀释后，加入信号标记物混匀；
（2）将混合物滴加至所述免疫层析装置的加样垫上；
（3）待一段时间后，根据检测线和质控线的显示信号情况，判断样品中是否有SARS-CoV-2病毒中和抗体，判断方法如下：
（a）阳性：所述质控线呈现信号，检测线不呈现信号，说明样品中含有SARS-CoV-2病毒中和抗体；
（b）阴性：所述质控线和检测线均呈现信号，说明样品中不含有SARS-CoV-2病毒中和抗体；
（c）失效：所述质控线和检测线均不呈现信号，说明免疫层析装置失效。
18.根据权利要求17所述的应用，所述信号标记物为胶体金标记的SARS-CoV-2 刺突蛋白S1亚基、胶体金标记的SARS-CoV-2 RBD、荧光微球标记的SARS-CoV-2 刺突蛋白S1亚基或荧光微球标记的SARS-CoV-2RBD。
19.权利要求1-16中任一项所述的免疫层析装置的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）制备信号物标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白和信号物标记的免疫球蛋白抗体；
（2）将ACE2蛋白或其功能片段包被在反应垫上形成检测线，将抗免疫球蛋白抗体包被在反应垫上形成质控线，将信号物标记的免疫球蛋白抗体喷洒在结合垫上；
（3）将样品垫、结合垫、带有检测线和质控线的反应垫和吸水垫按照顺序依次粘附在底板上，组装后得到免疫层析装置；
其中，所述信号物标记的SARS-CoV-2病毒刺突蛋白部分的量为1.0μg-5mg。
20.根据权利要求19所述的制备方法，所述步骤（2）中所述ACE2蛋白或其功能片段以0.2-1.0μg/cm的量均匀划线或喷洒包被在检测线位置形成检测线。
21.权利要求1-16中任一项所述的免疫层析装置在制备用于检测受试者是否感染SARS-CoV-2病毒或其变体的装置中的应用。
22.权利要求1-16中任一项所述的免疫层析装置在制备用于检测样品中SARS-CoV-2病毒或其变体的中和抗体的装置中的应用。
23.根据权利要求22所述的应用，其中，所述样品来源于感染或疑似感染SARS-CoV-2病毒或其变体的受试者，感染SARS-CoV-2病毒或其变体后康复者，接种针对SARS-CoV-2或其变体的疫苗的受试者，或者通过生物学方法获得的抗SARS-CoV-2或其变体的抗体。
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