CN114236119A - 新冠总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新型冠状病毒总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸及其制备方法和应用。本发明的试纸由固相有鼠抗人IgG/IgM抗体(检测线T1)、基因重组新型冠状病毒ACE2蛋白(检测线T2)和羊抗兔IgG抗体(质控线C)的层析膜、预先喷涂有胶体金标记基因重组新型冠状病毒刺突蛋白S1抗原和兔IgG抗体的结合垫、以及其他辅料依次粘贴制成。本发明的试纸采用抑制法和捕获法原理，用于体外定性的检测人血液样本中的新型冠状病毒总抗体和中和抗体，可以有效排除假阳性，提高检测准确度。
Description
技术领域
本发明属于免疫化学体外检测技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒总抗体和中和抗体胶体金法快速检测试纸及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒侵入人体后，体内浆细胞会产生病毒特异性抗体，其中只有一部分是中和抗体。其中特异性IgM抗体多在发病3-5天后开始出现阳性，IgG抗体滴度恢复期交急性期有4倍及以上增高，一般发病1周内阳性率均较低。
新型冠状病毒中和抗体是由病毒最外层的包膜或衣壳抗原刺激机体产生的一类能与病毒结合并使之丧失感染力的抗体。刺突蛋白(S蛋白)是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，决定了病毒的宿主范围和特异性，是宿主中和抗体的重要位点以及疫苗设计的关键靶点。S蛋白含有两个亚基，S1和S2。因此，针对该结构域的抗体可能对SARS-CoV-2具有高度特异性，这些抗体从而可以显示个体是否暴露于可能导致COVID-19的病毒中。
发明内容
本发明主要目的在于提供一种总抗体和中和抗体联合检测试剂盒。要解决的技术问题在于中和抗体的产生是在依赖于IgG和IgM抗体，避免由于体内存在干扰物质或样本原因，中和抗体检测可能会出现假阳性。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种通过捕获法判断样本中是否针对新型冠状病毒的IgG/IgM抗体，第二条线上采用抑制法原理进行新型冠状病毒中和抗体的检测。
一方面，本申请提供了一种新型冠状病毒总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸，所述试纸包含层析膜、缓冲垫、结合垫；所述层析膜上沿液体层析方向依次设有检测线T1和T2以及质控线，所述结合垫上已经预先吸附有先稀释的胶体金标记结合物，同时在层析膜和结合垫中间设有缓冲垫。
进一步地，检测线T1线为鼠抗人IgG和IgM混合包被线，T2线为基因重组新型冠状病毒的细胞表面受体ACE2包被线。
进一步地，质控线的包被物为为羊抗兔IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体或DNP-BSA。
进一步地，缓冲垫为滤血膜或玻璃纤维。
进一步地，结合垫的一端喷涂有混合稀释的胶体金标记的基因重组新型冠状病毒刺突蛋白S1。
进一步地，结合垫的另一端喷涂有混合稀释的胶体金标记的兔Ig抗体、鼠IgG抗体或兔抗DNP抗体。
进一步地，所述层析膜制备过程中包被液浓度为：鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM浓度分别为0.3-0.6mg/mL、基因重组新型冠状病毒的细胞表面受体ACE2蛋白浓度为0.8-1.2mg/mL。
进一步地，结合垫制备过程包括：
使柠檬酸和氯金酸溶于热水中制备胶体金溶液；
向胶体金溶液中加入碳酸钾、SARS-COV2-S1蛋白和牛血清白蛋白溶液，离心并收集沉淀；向胶体金溶液中加入碳酸钾、兔IgG和牛血清白蛋白溶液，离心并收集沉淀；
进一步地，结合垫制备过程包括：
量取1％柠檬酸三钠体积40毫升，2％氯金酸体积50毫升；将氯金酸加入到1000毫升纯化中，加热至沸腾，然后快速加入称取好的柠檬酸三钠，继续加热10分钟后，停止加热，待胶体金溶液冷却后，补加超纯水至1000g；
每100毫升胶体金溶液，首先加入0.2M的0.70毫升碳酸钾，混匀；按照每毫升胶体金溶液加入10微克的比例加入SARS-COV2-S1蛋白，混匀，静置5分钟，然后加入10％牛血清白蛋白溶液0.5克，混匀。10000rpm离心15分钟，收集沉淀，测定OD530nm的值；每1000克胶体金溶液，首先加入0.2M碳酸钾溶液0.7毫升，混匀；按照每毫升胶体金溶液8微克的比例加入兔IgG，混匀，静置5分钟，然后加入10％牛血清白蛋白溶液0.5克，混匀，静置5分钟。10000rpm离心15分钟，收集沉淀，测定OD530nm的值；
将所述沉淀使用胶体金结合物稀释液进行稀释后，使用喷涂机在玻璃纤维垫子上。
进一步地，喷涂中喷液量设定为0.6μl/mm，导轨速度50mm/秒，气泵控制在1.5-2psi。
另一方面，本申请提供了上述快速检测试纸在制备新冠抗体检测试剂盒或新冠疫苗效果检测试剂盒中的应用。
所述层析膜上沿着样本流动的方向，依次固相有鼠抗人IgG抗体/鼠抗人IgM抗体(检测线，T1线)、ACE2-hFc(检测线，T2线)和羊抗兔IgG抗体(质控线，C)。
所述结合垫喷涂有胶体金标记的SARS-COV2-S1和兔IgG抗体。
所述的质控线可以选择不同的原料系统，只要和检测线不相关作用，不产生非特异性。如兔IgG和羊抗兔IgG、鼠IgG和羊抗鼠IgG、DNP-BSA和兔抗DNP等。
所述的缓冲垫在层析膜和结合垫之间，可以让多抗体-胶体金结合物在停留，增加相互作用的时间，最大限度的减少该复合物在检测线T1和T2的作用时间，避免试剂在结果判断时间内色度的变化。
本产品进行样本检测时，将待测的血液样本和样本稀释液滴加在样品垫上，样本中抗体与结合垫上胶体金标记SARS-COV2-S1结合，形成SARS-COV2-S1与抗体复合物。该复合物沿着层析膜向前移动，依次经过T1线、T2线。其中，样本中新冠IgG和IgM抗体被被T1线包被的鼠抗人IgG和IgM抗体捕获，依照夹心法的原理，形成一条红色的T1线，显色的深度随着抗体浓度的增加会加深；其中在检测线T2区域，含有的中和抗体和SARS-COV2-S1胶体金结合物会竞争结合，随之样本中中和抗体的浓度增加，检测线T2的显色会变浅。
附图说明
图1为本发明实施例1中所提供试纸条的结构示意图；其中1为吸收垫、2为层析膜(2a-质控线，2b-检测线T2、2c-检测线T1)、3为阻挡垫、4为结合垫、5为样品垫、6为粘贴板(表面有胶粘剂，正常情况下使用离型纸覆盖)。
具体实施方式
实施例1试纸条的制备
按照以下方法制备图1所示结构的试纸条
1.层析膜
1.1材料和试剂
(1)汕头伊能膜业有限公司生产的YN100B系列背衬膜，宽度为2.5厘米。
(2)新型冠状病毒重组ACE2-hFc和SARS-COV2-S1蛋白，均来自江苏东抗生物医药科技有限公司。
(3)其他抗体均来自于润和生物医药科技(汕头)有限公司，比如鼠抗人IgG单克隆抗体、鼠抗人IgG单克隆抗体、以及羊抗兔IgG抗体和兔IgG抗体。
1.2主要设备
BIO-DOT包被机
1.3溶液配置
(1)T线：其中鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM浓度分别为0.4mg/mL、新型冠状病毒重组ACE2-hFc蛋白浓度为0.9mg/mL。
(2)质控线：羊抗兔IgG抗体浓度为0.6mg/mL，稀释液为含有3％海藻糖的0.04M磷酸盐缓冲液(PH7.4)。
1.4操作
按照包被机的说明书进行操作，包被后的硝酸纤维素膜放室温过夜，温度控制：20℃-30℃，湿度20％～40％，干燥时间应不少于24小时。
将包被有检测线和质控线的层析膜密封保存在铝箔袋中，2-8℃保存，有效期为1年。
2.结合垫
2.1材料和试剂
(1)胶体金还原剂：1％柠檬酸三钠
(2)胶体金氧化剂：2％氯金酸
(3)PH调节剂：0.2M碳酸钾
(4)胶体金结合物稀释液：0.1-0.5M Tris缓冲液(PH8.0)、1-2％牛血清白蛋白、0.5-1％PVP K30、20％海藻糖、0.1％叠氮钠。
(5)新型冠状病毒重组刺突蛋白S1抗原，来自江苏东抗生物医药科技有限公司。
(6)兔IgG抗体来自于润和生物医药科技(汕头)有限公司。
2.2设备和器具
(1)电子调温电热套、三口圆底烧瓶、搅拌器和搅拌头、直型冷凝管；
(2)高速离心机、天平
(3)紫外分光光度仪、冰箱；
以及锥形瓶、烧杯、量筒、移液管等。
2.3操作
2.3.1胶体金溶液制备
量取1％柠檬酸三钠体积40毫升，2％氯金酸体积50毫升，备用。将氯金酸加入到1000毫升纯化中，电炉加热至沸腾，然后快速加入称取好的柠檬酸三钠,继续加热10分钟后，停止加热，待胶体金溶液冷却后，补加超纯水至1000g。
2.3.2标记
2.3.2.1胶体金标记SARS-COV 2-S1
每100毫升胶体金溶液，首先加入0.70毫升碳酸钾(0.2M)，混匀。按照每毫升胶体金溶液加入10微克的比例加入SARS-COV2-S1蛋白，混匀，静置5分钟，然后加入10％牛血清白蛋白溶液0.5克，混匀。10000rpm离心15分钟，收集沉淀，测定OD530nm的值。2.3.2.2胶体金标记兔IgG抗体
每1000克胶体金溶液，首先加入0.2M碳酸钾溶液0.7毫升，混匀。按照每毫升胶体金溶液8微克的比例加入兔IgG，混匀，静置5分钟，然后加入10％牛血清白蛋白溶液0.5克，混匀，静置5分钟。0000rpm离心15分钟，收集沉淀，测定OD530nm的值。。
2.3.3胶体金结合物稀释和喷涂
将上述胶体金标记结合物沉淀使用胶体金结合物稀释液进行稀释后，使用喷涂机在玻璃纤维垫子上。备注：喷液量设定为0.6μl/mm，导轨速度50mm/秒，气泵控制在1.5-2psi之间。
2.3.4干燥
温度35℃～40℃，湿度≤30％，时间≥24小时；
2.3.5保存
将含有胶体金结合物的玻璃纤维结合垫密封保存在铝箔袋中，应于2-8℃冷藏保存，有效期限为1年。
2.4样品垫
使用含有1％RBC、0.5％S9、0.5％S16、1％PVP K30、0.5％酪蛋白钠、0.1％Proclin950的0.04M PH7.6磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维，晾干后，分切至需要宽度使用。
2.5样本稀释液
样本稀释液中包含有0.25％诺酪蛋白钠、2％山羊血清、1％氯化钠的0.02M磷酸盐缓冲液(PH7.6)。
3.检验方法
3.1组装和分切
将产品各组分按照一定的规律，依次粘贴，分切为需要的宽度，如3毫米。
首先撕开粘贴板(6)一端的胶带离型纸，将层析膜(2)的质控线(2a)位置向下沿小双面胶贴下；然后将吸收垫(1)和层析膜(2)的靠近质控线(2a)的一端层压约1毫米的位置进行粘贴。
反转过来，撕去另外一端的胶带离型纸，将阻拦垫(3)层压约1毫米在层析膜(2)靠近检测线T2(2c)一端进行粘贴；然后将胶体金-抗体结合垫(4)层压阻拦垫(3)约1毫米压下粘贴；最后将同样将样品垫(5)层压结合垫(4)约1毫米压下粘贴在粘贴板(6)上。所有组分辅料必须保证黏贴到位。
3.2检验方法
3.2.1检验方法
在试剂的样品垫端叠加2滴待测试样本(全血、血清或血浆)，稍等约1分钟，待样本渗入样品垫后，再滴加1滴样本稀释液，开始计时，10-20分钟判断结果。
3.2.2判断结果的解释
(1)无效结果：质控线(C)不显色。提示试剂失效或操作不当，需要重新检测。
(2)阳性结果：检测线T1显色，检测线T2不显色或显色很弱。提示待测样本中检出新型冠状病毒IgG抗体和/或IgM抗体，同时新型冠状病毒中和抗体也为阳性。
(3)疑似结果：检测线T1显色，检测(T2)显色，提示待测样本中检出新型冠状病毒IgG抗体和/或IgM抗体，但是新型冠状病毒中和抗体没有检出；检测线T1和T2都不显色，提示样本中检测结果不确定。
建议7天后出现检测。
(4)阴性结果：检测线T1不显色，检测线T2不显色。提示样本中未检出新型冠状病毒抗体。
4.性能评价
选择接种新型冠状病毒灭活疫苗的人群，收集他们的血液样本，共计250份。其中新型冠状病毒IgG抗体/IgM抗体使用同品种试剂进行测试，该试剂为已经取得国家药品监督管理总局核准的医疗器械注册证的产品，检测结果显示的阳性结果中，可能的组合有：IgM抗体和IgG抗体中的一种或2种为阳性。
表 检测结果汇总表
其中包括11份样本结果为可疑。
将上述本发明试剂测试为阳性(172份)和阴性(67份)样本，使用已经获得美国FDAEUA的试剂作为对比试剂。
基础数据统计
| 编号 | 数值比 | 百分率(95％可信区间) |
| 阳性符合率 | 168/172 | 97.67％(94.15％-99.36％) |
| 阴性符合率 | 63/67 | 94.03％(85.41％-98.35％) |
| 阳性预期值 | 168/172 | 97.67％(94.15％-99.36％) |
| 阴性预期值 | 63/67 | 94.03％(85.41％-98.35％) |
| 总符合率 | 231/239 | 96.65％(93.51％-98.54％) |
Kappa一致性检验
| 编号 | 统计值 |
| Kappa值 | 0.9170，一致性较好 |
| 标注误Se(K) | 0.0288 |
| 95％可信区间 | 0.8606-0.9735 |
| 标注误Se0(K) | 0.065 |
| 检验值Z | Z＝14.1771，概率值P＝0.0000 |
| 检验结果 | P<0.05，拒绝HO，Kappa值来自非0的总体 |
显然，上述实施例仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (11)
1.一种新型冠状病毒总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸，其特征在于：所述试纸包含层析膜、缓冲垫、结合垫；所述层析膜上沿液体层析方向依次设有检测线T1和T2以及质控线，所述结合垫上已经预先吸附有先稀释的胶体金标记结合物，同时在层析膜和结合垫中间设有缓冲垫。
2.根据权利要求1所述的快速检测试纸，其中检测线T1线为鼠抗人IgG和IgM混合包被线，T2线为基因重组新型冠状病毒的细胞表面受体ACE2包被线。
3.根据权利要求1或2所述的快速检测试纸，其中质控线的包被物为为羊抗兔IgG抗体、羊抗鼠IgG抗体或DNP-BSA。
4.根据权利要求1-3任一项所述的快速检测试纸，其中缓冲垫为滤血膜或玻璃纤维。
5.根据权利要求1-4任一项所述的快速检测试纸，其中结合垫的一端喷涂有混合稀释的胶体金标记的基因重组新型冠状病毒刺突蛋白S1。
6.根据权利要求5所述的快速检测试纸，其中结合垫的另一端喷涂有混合稀释的胶体金标记的兔Ig抗体、鼠IgG抗体或兔抗DNP抗体。
7.根据权利要求1-6任一项所述的快速检测试纸，其中所述层析膜制备过程中包被液浓度为：鼠抗人IgG抗体和鼠抗人IgM浓度分别为0.3-0.6mg/mL、基因重组新型冠状病毒的细胞表面受体ACE2蛋白浓度为0.8-1.2mg/mL。
8.根据权利要求1-6任一项所述的快速检测试纸的制备方法，其中结合垫制备过程包括：
使柠檬酸和氯金酸溶于热水中制备胶体金溶液；
向胶体金溶液中加入碳酸钾、SARS-COV2-S1蛋白和牛血清白蛋白溶液，离心并收集沉淀；
向胶体金溶液中加入碳酸钾、兔IgG和牛血清白蛋白溶液，离心并收集沉淀；
将上述两种沉淀分别使用胶体金结合物稀释液进行稀释后，使用喷涂机在玻璃纤维垫子上。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其中结合垫制备过程包括：
量取1％柠檬酸三钠体积40毫升，2％氯金酸体积50毫升；将氯金酸加入到1000毫升纯化中，加热至沸腾，然后快速加入称取好的柠檬酸三钠，继续加热10分钟后，停止加热，待胶体金溶液冷却后，补加超纯水至1000g；
每100毫升胶体金溶液，首先加入0.2M的0.70毫升碳酸钾，混匀；按照每毫升胶体金溶液加入10微克的比例加入SARS-COV2-S1蛋白，混匀，静置5分钟，然后加入10％牛血清白蛋白溶液0.5克，混匀；10000rpm离心15分钟，收集沉淀，测定OD530nm的值；
每1000克胶体金溶液，首先加入0.2M碳酸钾溶液0.7毫升，混匀；按照每毫升胶体金溶液8微克的比例加入兔IgG，混匀，静置5分钟，然后加入10％牛血清白蛋白溶液0.5克，混匀，静置5分钟；10000rpm离心15分钟，收集沉淀，测定OD530nm的值；
将上两种沉淀分别使用胶体金结合物稀释液进行稀释后，使用喷涂机在玻璃纤维垫子上。
10.根据权利要求9所述的快速检测试纸的制备方法，其中喷涂中喷液量设定为0.6μl/mm，导轨速度50mm/秒，气泵控制在1.5-2psi。
11.根据权利要求1-10任一项所述的快速检测试纸或制备方法制备得到的快速检测试纸在制备新冠抗体检测试剂盒或新冠疫苗效果检测试剂盒中的应用。
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Legal Events
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Applicant after: Guangzhou Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd. Address before: Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Applicant before: Guangzhou Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd. Address after: Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Applicant after: Guangzhou Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd. Address before: 515063 Rongsheng science and Technology Park, University Road, Tuolian street, Jinping District, Shantou City, Guangdong Province Applicant before: RUNBIO BIOTECH Co.,Ltd. |
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| CI02 | Correction of invention patent application | ||
| CI02 | Correction of invention patent application |
Correction item: Applicant|Address Correct: RUNBIO BIOTECH Co.,Ltd.|515063 Rongsheng science and Technology Park, University Road, Tuolian street, Jinping District, Shantou City, Guangdong Province False: Guangzhou Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd.|Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Number: 08-01 Volume: 39 |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Applicant after: Guangdong Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd. Address before: Inside Rongsheng Science and Technology Park, Daxue Road, Tuolian Street, Jinping District, Shantou City, Guangdong Province, 510801 Applicant before: RUNBIO BIOTECH Co.,Ltd. Address after: Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Applicant after: Guangdong Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd. Address before: Room 116, Floor 1, Transportation Bureau Building, No. 95, Yingbin Avenue, Huacheng Street, Huadu District, Guangzhou, Guangdong Province, 510801 Applicant before: Guangdong Iconas Biomedical Technology Co.,Ltd. |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220325 |