CN113009132A - 高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113009132A
CN113009132A CN202110182289.3A CN202110182289A CN113009132A CN 113009132 A CN113009132 A CN 113009132A CN 202110182289 A CN202110182289 A CN 202110182289A CN 113009132 A CN113009132 A CN 113009132A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
neutralizing antibody
cov
sars
novel coronavirus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110182289.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113009132B (zh
Inventor
李慧
周洪锐
魏华英
李昀地
刘钟泉
赵娜
张粲
王俊水
肖福磊
李轩
秦月
贾凌云
贺敬文
刘陈针玉
钱龙
李娜
孟佳
李洲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Newscen Coast Bio Pharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Newscen Coast Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Newscen Coast Bio Pharmaceutical Co ltd filed Critical Newscen Coast Bio Pharmaceutical Co ltd
Priority to CN202110182289.3A priority Critical patent/CN113009132B/zh
Publication of CN113009132A publication Critical patent/CN113009132A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113009132B publication Critical patent/CN113009132B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/165—Coronaviridae, e.g. avian infectious bronchitis virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法，包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS‑CoV‑2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS‑CoV‑2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS‑CoV‑2重组抗体。本发明可减少中和抗体的抱团效应，增大竞争性物质的位阻效应，有利于中和抗体和SARS‑CoV‑2重组抗原的结合，提高检测灵敏度和准确度，测定的样本种类多，适应不同场合，操作方便，用户体验便捷。

Description

高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于免疫荧光检测技术领域，尤其是涉及一种高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法。
背景技术
血管紧张素转化酶2(Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2)是一种Ⅰ型跨膜蛋白，是SARS-CoV-2感染人体，进入细胞的重要靶点。SARS-CoV-2通过表面的S-蛋白与人上皮细胞的ACE2结合，侵入细胞后利用细胞内的物质进行复制繁衍，即新型冠状病毒S蛋白受体结合域(receptor binding domain，RBD)可与病毒与宿主细胞表面的血管紧张素转化酶2(ACE2)结合。当SARS-CoV-2在侵入机体时，会刺激机体产生具有保护作用的中和抗体，专门阻止病原微生物进入细胞，防止感染。中和抗体是由适应性免疫应答细胞分泌的一种可溶性蛋白，具有识别病毒表面蛋白、阻断其与细胞表面特异性受体结合的功能，从而发挥抗病毒作用。中和抗体的多少是疫苗免疫保护效果的一项重要指标，是疫苗评估和质控的重要依据。
西湖大学研究团队发现AXL是新冠病毒感染人类呼吸系统的潜在受体，研究团队发现新冠病毒在人类呼吸系统中可能存在其他重要受体。研究团队证明肺细胞上的AXL蛋白与新冠病毒刺突蛋白相结合，并在细胞膜上存在强共定位。且与呼吸系统上皮细胞结合强度排名前三的候选受体分别为：AXL蛋白、EGFR蛋白和LDLR蛋白。
目前已经建立的冠状病毒中和抗体检测方法有双抗原夹心法、间接法和竞争法。其中双抗原夹心法与间接法检测的是总抗体含量，不能针对性反应样本中的中和抗体含量。目前已公开专利中，竞争法检测中和抗体含量多为常规竞争的方式。例如，公告号为CN111781354B的已授权专利公开了新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒。现有技术多为：标记抗原，包被受体蛋白，样本中的中和抗体与受体蛋白直接竞争抗原，通过结合的数量反应中和抗体的含量。该方法提供的主要为直接并同时竞争的内环境，存在的问题有：对于低滴度的中和抗体，竞争优势不显著，灵敏度较低，对于较高滴度的中和抗体，竞争梯度小，容易造成检测结果偏差大等问题。同时目前已知的免疫学检测中，中和抗体检测均为通过抗体浓度或数量的结合，反应中和抗体的浓度，同时现有技术多用于酶免、胶体金法等试剂盒的检测，采用微流控免疫荧光法实现快速检测，目前未见到。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一是发明一种高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒(微流控法)，二是发明一种高灵敏度的新型冠状病毒中和抗体间接竞争检测方法，以克服现有的新冠中和抗体灵敏度低的问题，准确检测受试者体内的中和抗体含量，准确评估新冠疫苗的有效性。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS-CoV-2重组抗体。
优选的，所述SARS-CoV-2重组抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段，优选S-RBD蛋白。
新型冠状病毒入侵宿主是通过表面的S蛋白与宿主细胞结合，而最主要的功能位点是S蛋白上的受体结合域即S-RBD，S-RBD蛋白直接与中和抗体结合，亲和力更高。
优选的，SARS-CoV-2重组抗原混合有具有高免疫原性的结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，混合方式为SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白混匀后与信号粒子进行标记、SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白分别与信号粒子标记后进行混匀、SARS-CoV-2重组抗原与信号粒子进行标记后再在其中直接添加结构蛋白中的一种。
本发明在标记区混合添加新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，样本中的中和抗体流经标记区会与添加的N蛋白、E蛋白、M蛋白结合，有利于消耗高浓度样本中的中和抗体，使得检测试剂的高区线性梯度较好，扩大检测范围。
优选的，所述SARS-CoV-2重组抗原的标记浓度为0.5-2mg/mL，结构蛋白的浓度为1-3mg/mL。
优选的，所述竞争性物质为ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白、LDLR蛋白的至少一种，优选ACE2蛋白或AXL蛋白，标记浓度优选0.05-0.5mg/ml。
ACE2是SARS-CoV-2感染人体，进入细胞的重要靶点，且AXL是新冠病毒感染人类呼吸系统的潜在受体，均能与S-RBD蛋白有很高的结合强度。
优选的，所述竞争性物质包被到T位点的方式有以下两种：
A、通过生物素化的受体蛋白抗体将受体蛋白包被在微流控芯片上，即形成亲合素/链霉亲合素-受体蛋白抗体-受体蛋白偶联物，受体蛋白抗体的浓度为5-50μg/mL，受体蛋白的浓度为2-40μg/mL；
B、通过生物素-亲合素/链霉亲合素系统将受体蛋白包被在基片上，即形成亲合素/链霉亲合素-生物素-亲合素/链霉亲合素-受体蛋白。
本发明T位点采用生物素化的抗体-抗原偶联物或亲合素/链霉亲合素-生物素系统将受体蛋白间接包被至基片上，可增大SARS-CoV-2重组抗原与受体蛋白结合的空间位阻效应，有利于中和抗体与SARS-CoV-2重组抗原的结合，放大信号，提高灵敏度。
优选的，所述信号粒子包括荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒的至少一种，其中荧光粒子包括荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球的至少一种，所述信号粒子粒径在100-1000nm范围内。
优选的，所述SARS-CoV-2重组抗体为生物素化的S-RBD抗体，浓度为2-80μg/mL，所述检测区T位点和C位点预先包被有亲合素/链霉亲和素，亲合素/链霉亲和素的浓度为5mg/mL。
优选的，所述载体包括微流控芯片或层析试纸，所述试剂盒的样本为血液样本，所述血液样本为指尖血、静脉血、血清或血浆，加样量为30-40μL。
检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片，微流控芯片包括固定连接的基片和盖片，微流控芯片沿样本流动方向分别设有加样孔、标记区、检测区和废液槽。样本经加样孔流经标记区后与信号粒子标记物结合后进入检测区发生免疫反应，最终流入废液槽后终止反应。
样本经加样孔流经微通道至废液槽后反应终止，反应时间为2-4min。
本发明的另一目的在于提供高灵敏的新型冠状病毒中和性抗体免疫荧光检测方法，包括以下步骤：
S1：使血液样本流经固定干燥有信号粒子标记的消耗性物质的区域，所述消耗性物质为SARS-CoV-2重组抗原和/或结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，血液样本中的一部分中和抗体与消耗性物质偶联形成中和抗体-消耗性物质-信号粒子；
S2：使S1得到的血液样本流经包被有竞争性物质的T检测区，其中，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，未结合中和抗体的信号粒子与竞争性物质偶联；
S3：使S2得到的血液样本流经包被有SARS-CoV-2重组抗体的C检测区，未与竞争性物质结合的信号粒子与SARS-CoV-2重组抗体偶联；
S4：检测T检测区和C检测区的信号值，分别记为T信号值和C信号值，计算T信号值/C信号值的比值即为检测结果。
工作原理：
取一定量的样本至加样孔，样本在毛细作用力下沿微通道向前流动，流经标记区后，样本中一部分中和抗体与标记区固定干燥的信号粒子(Fb)中的SARS-CoV-2重组抗原-信号粒子偶联形成中和抗体-SARS-CoV-2重组抗原-信号粒子(F1)，一部分中和抗体与Fb中的新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白其他蛋白形成中和抗体-蛋白(-信号粒子)(F2)。未结合中和抗体(游离中和抗体)的Fb随着样本的流动流至检测区，与检测线T位点间接包被的受体蛋白结合，被T位点捕获，发出荧光信号值，记为T信号值；而未与T位点结合的Fb在毛细管作用力下继续向前流动，流至质控线C位点，与C位点包被的SARS-CoV-2重组抗体偶联，被C位点捕获，发出荧光信号值，记为C信号值。故样本中中和抗体浓度越高，形成的F1和F2越多，被T位点捕获的Fb越少，T位点的信号值越低，反之，T位点信号值强，样本中中和抗体的浓度与T位点的荧光信号值成反比例关系。以中和抗体浓度为横坐标，信号值比T/C(通过T/C可消除一些外在因素造成的偏差，提高芯片均一性)为纵坐标绘制中和抗体浓度检测标准曲线。
相对于现有技术，本发明所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法具有以下有益效果：
(1)本发明T位点采用包被生物素化的抗体-抗原偶联物的间接竞争法或亲合素/链霉亲合素-生物素系统将受体蛋白，优选ACE2蛋白或AXL蛋白的一种间接包被至基片上，可增大SARS-CoV-2重组抗原与受体蛋白结合的空间位阻效应，有利于中和抗体与SARS-CoV-2重组抗原的结合，放大信号，提高灵敏度。
(2)本发明在标记区添加新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，更有利于消耗高浓度样本中的中和抗体，使得检测试剂的高区线性梯度较好，扩大检测范围。
(3)本发明C位点利用生物素化的S-RBD抗体与信号粒子标记的S-RBD结合发出荧光信号，替代常规的二抗+抗体系统或添加独立的质控线系统，本发明中C位点可随着外界误差而引起信号值的改变，通过T/C可减少外界误差，减少独立质控线系统对检测试剂的干扰，提高检测准确度。
(4)本发明测定的样本种类多，适应不同场合，操作方便，用户体验便捷。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为采用实施例1的改进技术和采用现有技术分别制备的新冠中和抗体微流控芯片测定新冠病毒中和抗体的线性曲线；
图2为采用实施例2的改进技术和采用现有技术分别制备的新冠中和抗体微流控芯片测定新冠病毒中和抗体的线性曲线。
图3为采用实施例3的改进技术和采用现有技术分别制备的新冠中和抗体微流控芯片测定新冠病毒中和抗体的线性曲线。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
本发明的目的是建立一种灵敏度高、特异性强、操作简便、诊断快速、的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片及其制备方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚，以下结合实施例及附图对本发明进一步详细说明。
实施例1：检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片的制备
1材料和仪器
1.1新冠刺突蛋白S-RBD、ACE2受体蛋白、ACE2-Ab和S-RBD-Ab，购自深圳市菲鹏生物股份有限公司；
1.2亲和素和EZ-link生物素，购自Sigma；
1.3荧光免疫分析仪(F10pro)，天津中新科炬生物制药股份有限公司
2.芯片卡的构成
本发明所述的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片包括：包括固定连接的底片和盖片，基片沿样本流动方向依次设有标记区，检测区和废液槽。本发明所述的标记区固定干燥有荧光微球标记的S-RBD重组蛋白。
本发明所述的检测区T位点包被有ACE2受体，C位点包被S-RBD-Ab-B。
2.1荧光偶联抗体标记
取活化的荧光微球1mL，分别加入终浓度为0.1mg/mLS-RBD抗原，20min后离心去上清，加入0.01M PBS定容至1mL，加入质量浓度为1％的酪蛋白进行封闭10min，离心取上清，加入含0.1％Tween、1％糖的0.1mLPBS缓冲液定容，储存备用。
2.2检测位点制备
分别取ACE2-Ab、S-RBD-Ab及EZ-LINK生物素。抗体及受体蛋白与生物素的质量浓度比例按10:1混合，4℃0.01M PBS透析过夜后，于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。分别形成生物素化ACE2-Ab和生物素化的S-RBD-Ab。
2.2.1质控位点C的制备
取生物素化的S-RBD-Ab，用0.01MPBS稀释为终浓度10μg/mL，形成质控点包被液。
2.2.2检测位点T的制备
取ACE2受体蛋白和生物素化的ACE2-Ab，分别用0.01MPBS稀释为终浓度10μg/mL和15μg/mL，形成检测点包被液。
2.3芯片制作
取终浓度5mg/mL亲和素溶液，分别点样于微流控基片T、C相应的位点，常温高湿孵育1h，用0.01M PBS冲洗，晾干。
分别将荧光偶联抗体溶液、检测点包被液、质控点包被液点样于干燥后的微流控基片相应位置，常温干燥后，取盖片压合固定于基片上。
3检测结果
3.1灵敏度与线性曲线的验证
按照本发明建立的方法制成芯片后。取0.005μg/mL，0.04μg/mL，0.2μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL(分别为P1-P7)的新冠病毒中和抗体标准液。每个浓度点重复测定5次取平均值，分别记录T线信号值、C线信号、T/C比值，以现有竞争方法制成的成品芯片为对照，检测P1-P7，方法同上。并以新冠病毒中和抗体标准液浓度为横坐标，以信号比值T/C为纵坐标，用四参数拟合方程：y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，其中，A：曲线上渐近线估值；D：曲线下渐近线估值；B：曲线的斜率；C:T/C值。绘制的新冠病毒中和抗体检测线性曲线见图1。采用改进技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A＝3.95970；B＝0.59081；C＝0.89082；D＝0.06807；r^2＝0.99872。采用现有技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A＝2.53230；B＝1.33891；C＝0.15348；D＝0.74600；r^2＝0.96901。结果如图1所示。
结果表明：与现有技术制备的检测新冠中和抗体微流控芯片对比，改进技术制备的检测新冠中和抗体微流控芯片灵敏度高，可达0.005μg/mL，远高于现有技术灵敏度0.05μg/mL，检测范围为0.005μg/mL-15μg/mL，检测范围宽，线性梯度明显优于现有技术。
3.2准确度的验证
采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片对P2，P3和P5进行测定，每个浓度测5次，其检测结果与标定值的相对偏差如表1所示。
表1实施例1检测结果与标定值的相对偏差
Figure BDA0002942445910000091
实验结果表明:采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片测定P2，P3和P5，相对偏差均小于5％，表明改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片准确度高。
3.3精密度的验证
采用改进技术制备的微流控芯片对P5进行测定，至少重复10次，计算均值和CV，结果如表2所示。
表2实施例1精密度数据
序号 T C T/C
1 92783 91170 1.02
2 99287 103937 0.96
3 97205 96026 1.01
4 103139 105387 0.98
5 85562 87850 0.97
6 84554 90322 0.94
7 96595 89806 1.08
8 133673 124976 1.07
9 84415 88913 0.95
10 104883 107300 0.98
均值 98210 98569 0.99
SD 14520 11846 0.05
CV 14.78％ 12.02％ 4.86％
结果表明：采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片的CV为5％以下，精密度好，C线未采用二抗或者独立的C线，通过T/C可使得芯片的精密性得到改善。
实施例2：检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片的制备
1材料和仪器
1.1新冠刺突蛋白S-RBD、N蛋白、AXL受体蛋白、AXL-Ab和S-RBD-Ab，购自深圳市菲鹏生物股份有限公司；
1.2亲和素和EZ-link生物素，购自Sigma；
1.3荧光免疫分析仪(F10pro)，天津中新科炬生物制药股份有限公司
2.芯片卡的构成
本发明所述的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片包括：包括固定连接的底片和盖片，基片沿样本流动方向依次设有标记区，检测区和废液槽。本发明所述的标记区是固定干燥有荧光微球标记的S-RBD和N蛋白。本发明所述的检测区T位点包被有AXL受体，C位点包被有生物素化的S-RBD-Ab。
2.1荧光偶联抗体标记
取活化的荧光微球1mL，分别加入终浓度为0.1mg/mLS-RBD抗原和0.1mg/mLN蛋白，20min后离心去上清，加入0.01M PBS定容至1mL，加入质量浓度为1％的酪蛋白进行封闭10min，离心取上清，加入含0.1％Tween、1％糖的0.1mLPBS缓冲液定容，储存备用。
2.2检测位点制备
分别取AXL-Ab、S-RBD-Ab及EZ-LINK生物素。抗体及受体蛋白与生物素的质量浓度比例按10:1混合，4℃0.01M PBS透析过夜后，于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。分别形成生物素化AXL-Ab和生物素化的S-RBD-Ab。
2.2.1质控位点C的制备
取生物素化的S-RBD-Ab，用0.01MPBS稀释为终浓度10μg/mL，形成质控点包被液。
2.2.2检测位点T的制备
取AXL受体蛋白和生物素化的AXL-Ab，分别用0.01MPBS稀释为终浓度10μg/mL和15μg/mL，形成检测点包被液。
2.3芯片制作
取终浓度5mg/mL亲和素溶液，分别点样于微流控基片T、C相应的位点，常温高湿孵育1h，用0.01M PBS冲洗，晾干。
分别将荧光偶联抗体溶液、检测点包被液、质控点包被液点样于干燥后的微流控基片相应位置，常温干燥后，取盖片压合固定于基片上。
3检测结果
3.1灵敏度与线性曲线的验证
按照本发明建立的方法制成芯片后。取0.005μg/mL，0.04μg/mL，0.2μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL(分别为P1-P7)的新冠病毒中和抗体标准液。每个浓度点重复测定5次取平均值，分别记录T线信号值、C线信号、T/C比值，以现有竞争方法制成的成品芯片为对照，检测P1-P7，方法同上。并以新冠病毒中和抗体标准液浓度为横坐标，以信号比值T/C为纵坐标，用四参数拟合方程：y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，其中，A：曲线上渐近线估值；D：曲线下渐近线估值；B：曲线的斜率；C:T/C值。绘制的新冠病毒中和抗体检测线性曲线见图1。采用改进技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A＝3.69837；B＝0.46907；C＝1.52956；D＝-0.57920；r^2＝0.99996。采用现有技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A＝2.53230；B＝1.33891；C＝0.15348；D＝0.74600；r^2＝0.96901。结果如图2所示。
结果表明：与现有技术制备的检测新冠中和抗体微流控芯片对比，改进技术制备的检测新冠中和抗体微流控芯片灵敏度高，可达0.005μg/mL，远高于现有技术灵敏度0.05μg/mL，检测范围为0.005μg/mL-20μg/mL，检测范围宽，线性梯度明显优于现有技术。
3.2准确度的验证
采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片对P2，P3和P5进行测定，每个浓度测5次，其检测结果与标定值的相对偏差如表3所示。
表3实施例2检测结果与标定值的相对偏差
Figure BDA0002942445910000121
实验结果表明：采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片测定P2，P3和P5，相对偏差均小于5％，表明改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片准确度高。
3.3精密度的验证
采用改进技术制备的微流控芯片对P5进行测定，至少重复10次，计算均值和CV，结果如表4所示。
表4实施例2精密度数据
序号 T C T/C
1 100669 101979 0.99
2 129998 128824 1.01
3 107039 108109 0.99
4 87102 88132 0.99
5 105637 103730 1.02
6 84423 80565 1.05
7 94047 104257 0.90
8 100078 107349 0.93
9 98555 104570 0.94
10 109696 107384 1.02
均值 101724 103490 0.98
SD 12877 12731 0.05
CV 12.66％ 12.30％ 4.61％
结果表明：采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片的CV为5％以下，精密度好，C线未采用二抗或者独立的C线，通过T/C可使得芯片的精密性得到改善。
实施例3：检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片的制备
1材料和仪器
1.1新冠刺突蛋白S-RBD、N蛋白、ACE2受体蛋白和S-RBD-Ab，购自深圳市菲鹏生物股份有限公司；
1.2亲和素和EZ-link生物素，购自Sigma。
1.3荧光免疫分析仪(F10pro)，天津中新科炬生物制药股份有限公司
2.芯片卡的构成
本发明所述的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片包括：包括固定连接的底片和盖片，基片沿样本流动方向依次设有标记区，检测区和废液槽。本发明所述的标记区是固定干燥有荧光微球标记的S-RBD和N蛋白的混合物。
本发明所述的检测区T位点包被有ACE2受体，C位点包被有生物素化的S-RBD-Ab。
2.1荧光偶联抗体标记
取活化的荧光微球1mL，分别加入终浓度为0.1mg/mL S-RBD抗原，20min后离心去上清，加入0.01M PBS定容至1mL，加入质量浓度为1％的酪蛋白进行封闭10min，离心取上清，加入含0.1％Tween、1％糖的0.1mLPBS缓冲液定容，然后加入N蛋白使其终浓度为0.1mg/mL，储存备用。
2.2检测位点制备
分别取S-RBD-Ab、ACE2受体蛋白及EZ-LINK生物素。抗体及受体蛋白与生物素的质量浓度比例按10:1混合，4℃0.01M PBS透析过夜后，于紫外分光光度计分别测定蛋白浓度。分别形成生物素化的S-RBD-Ab和生物素化的ACE2受体蛋白。
2.2.1质控位点C的制备
取生物素化的S-RBD-Ab，用0.01MPBS稀释为终浓度10μg/mL，形成质控点包被液。
2.2.2检测位点T的制备
2.2.2.1取生物素，用蒸馏水稀释至200μg/mL，形成检测点包被液①
2.2.2.2取生物素化的ACE2受体蛋白和亲和素，分别用0.01MPBS稀释为终浓度10μg/mL和50μg/mL，形成检测点包被液②。
2.3芯片制作
取终浓度5mg/mL亲和素溶液，分别点样于微流控基片T、C相应的位点，常温高湿孵育1h，用0.01M PBS冲洗，晾干。将检测点包被液①点样于T位点，孵育30min，然后分别将荧光偶联抗体溶液、检测点包被液②、质控点包被液点样于干燥后的微流控基片相应位置，常温干燥后，取盖片压合固定于基片上。
3检测结果
3.1灵敏度和线性曲线的验证
按照本发明建立的方法制成芯片后。取0.005μg/mL，0.04μg/mL，0.2μg/mL，1μg/mL，5μg/mL，10μg/mL，20μg/mL(分别为P1-P7)的新冠病毒中和抗体标准液。每个浓度点重复测定5次取平均值，分别记录T线信号值、C线信号、T/C比值，以现有竞争方法制成的成品芯片为对照，检测P1-P7，方法同上。并以新冠病毒中和抗体标准液浓度为横坐标，以信号比值T/C为纵坐标，用四参数拟合方程：y＝(A-D)/[1+(X/C)^B]+D，其中，A：曲线上渐近线估值；D：曲线下渐近线估值；B：曲线的斜率；C:T/C值。绘制的新冠病毒中和抗体检测线性曲线见图2。采用改进技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A＝4.11822；B＝0.43376；C＝2.83756；D＝-1.19773；r^2＝0.99994。采用现有技术制得的检测新冠病毒中和抗体微流控芯片测得曲线的四参数分别为A＝2.53230；B＝1.33891；C＝0.15348；D＝0.74600；r^2＝0.96901。结果如图3所示。
结果表明：与现有技术制备的检测新冠中和抗体微流控芯片对比，改进技术制备的检测新冠中和抗体微流控芯片灵敏度高，可达0.005μg/mL，远高于现有技术灵敏度0.05μg/mL，检测范围为0.005μg/mL-20μg/mL，检测范围宽，线性梯度明显优于现有技术。
3.2准确度的验证
采用改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片对P2，P3和P5进行测定，每个浓度测5次，其检测结果与标定值的相对偏差如表5所示。
表5实施例3检测结果与标定值的相对偏差
Figure BDA0002942445910000151
Figure BDA0002942445910000161
实验结果表明：芯片卡测定P2，P3和P5的相对偏差均低于5％，符合实验要求，说明改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片准确度高。
3.3精密度的验证
采用改进技术制备的微流控芯片对P5进行测定，至少重复10次，计算均值和CV，结果如表6所示。
表6实施例3精密度数据表
序号 T C T/C
1 110610 97559 1.13
2 130234 115481 1.13
3 126038 110584 1.14
4 112113 99972 1.12
5 109101 98419 1.11
6 120491 108598 1.11
7 111754 99061 1.13
8 160612 130356 1.23
9 100223 84674 1.18
10 120069 100774 1.19
均值 120125 104548 1.15
SD 16730 12406 0.04
CV 13.93％ 11.87％ 3.56％
结果表明：改进技术制备的检测新型冠状病毒中和抗体的微流控芯片CV为5％以下，精密度好。
注：实施例1-3所述的现有技术采用授权公开号为CN111781354B的专利公开的试剂盒。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：包括载体，所述载体上设有标记区、T位点和C位点，所述标记区固定干燥有信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原，T位点包被有竞争性物质，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，C位点包被有SARS-CoV-2重组抗体。
2.根据权利要求1所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗原包括S蛋白全长片段或S蛋白部分片段，优选S-RBD蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗原混合有具有高免疫原性的结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，混合方式为SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白混匀后与信号粒子进行标记、SARS-CoV-2重组抗原和结构蛋白分别与信号粒子标记后进行混匀、SARS-CoV-2重组抗原与信号粒子进行标记后再在其中直接添加结构蛋白中的一种。
4.根据权利要求3所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗原的标记浓度为0.5-2mg/mL，结构蛋白的浓度为1-3mg/mL。
5.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述竞争性物质包括ACE2蛋白、AXL蛋白、EGFR蛋白、LDLR蛋白的至少一种，优选ACE2蛋白或AXL蛋白，标记浓度优选0.05-0.5mg/ml。
6.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述竞争性物质包被到T位点的方式有以下两种：
A、通过生物素化的受体蛋白抗体将受体蛋白包被在微流控芯片上，即形成亲合素/链霉亲合素-受体蛋白抗体-受体蛋白偶联物，受体蛋白抗体的浓度为5-50μg/mL，受体蛋白的浓度为2-40μg/mL；
B、通过生物素-亲合素/链霉亲合素系统将受体蛋白包被在基片上，即形成亲合素/链霉亲合素-生物素-亲合素/链霉亲合素-受体蛋白。
7.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述的信号粒子包括荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒的至少一种，其中荧光粒子包括荧光素填充微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球的至少一种，所述信号粒子粒径在100-1000nm范围内。
8.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述SARS-CoV-2重组抗体为生物素化的S-RBD抗体，浓度为2-80μg/mL，所述T位点和C位点预先包被有亲合素/链霉亲和素，亲合素/链霉亲和素的浓度为5mg/mL。
9.根据权利要求1或2所述的高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒，其特征在于：所述载体包括微流控芯片或层析试纸，所述试剂盒的样本为血液样本，所述血液样本为指尖血、静脉血、血清或血浆，加样量为30-40μL。
10.高灵敏的新型冠状病毒中和性抗体免疫荧光检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：使血液样本流经固定干燥有信号粒子标记的消耗性物质的区域，所述消耗性物质为SARS-CoV-2重组抗原和/或结构蛋白，所述结构蛋白包括新型冠状病毒的N蛋白、E蛋白、M蛋白中的至少一种，血液样本中的一部分中和抗体与消耗性物质偶联形成中和抗体-消耗性物质-信号粒子；
S2：使S1得到的血液样本流经包被有竞争性物质的T检测区，其中，所述竞争性物质为与信号粒子标记的SARS-CoV-2重组抗原特异性反应的受体蛋白，未结合中和抗体的信号粒子与竞争性物质偶联；
S3：使S2得到的血液样本流经包被有SARS-CoV-2重组抗体的C检测区，未与竞争性物质结合的信号粒子与SARS-CoV-2重组抗体偶联；
S4：检测T检测区和C检测区的信号值，分别记为T信号值和C信号值，计算T信号值/C信号值的比值即为检测结果。
CN202110182289.3A 2021-02-10 2021-02-10 高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法 Active CN113009132B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110182289.3A CN113009132B (zh) 2021-02-10 2021-02-10 高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110182289.3A CN113009132B (zh) 2021-02-10 2021-02-10 高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113009132A true CN113009132A (zh) 2021-06-22
CN113009132B CN113009132B (zh) 2024-02-23

Family

ID=76402098

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110182289.3A Active CN113009132B (zh) 2021-02-10 2021-02-10 高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113009132B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113341145A (zh) * 2021-07-28 2021-09-03 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 一种s1f-axl复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用
CN114236119A (zh) * 2021-11-08 2022-03-25 润和生物医药科技(汕头)有限公司 新冠总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸及其制备方法
CN115227240A (zh) * 2022-07-05 2022-10-25 杭州恒升医学科技有限公司 血液或组织液采集处理芯片及检测装置和方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110058013A (zh) * 2019-04-19 2019-07-26 天津中新科炬生物制药股份有限公司 一种提高微流控芯片检测准确度的方法
CN111273016A (zh) * 2020-02-26 2020-06-12 浙江诺迦生物科技有限公司 一种基于s蛋白配体与ace2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒
CN111562369A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒
CN111610332A (zh) * 2020-04-28 2020-09-01 复旦大学 用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条与检测方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110058013A (zh) * 2019-04-19 2019-07-26 天津中新科炬生物制药股份有限公司 一种提高微流控芯片检测准确度的方法
CN111273016A (zh) * 2020-02-26 2020-06-12 浙江诺迦生物科技有限公司 一种基于s蛋白配体与ace2受体竞争法层析的冠状病毒快速检测的试剂盒
CN111610332A (zh) * 2020-04-28 2020-09-01 复旦大学 用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条与检测方法
CN111562369A (zh) * 2020-06-18 2020-08-21 威海威高生物科技有限公司 SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113341145A (zh) * 2021-07-28 2021-09-03 瑞博奥(广州)生物科技股份有限公司 一种s1f-axl复合物、试剂盒和检测该复合物的方法及应用
CN114236119A (zh) * 2021-11-08 2022-03-25 润和生物医药科技(汕头)有限公司 新冠总抗体和中和抗体胶体金快速检测试纸及其制备方法
CN115227240A (zh) * 2022-07-05 2022-10-25 杭州恒升医学科技有限公司 血液或组织液采集处理芯片及检测装置和方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113009132B (zh) 2024-02-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113009132B (zh) 高灵敏的新型冠状病毒中和抗体检测试剂盒及检测方法
EP2853894B1 (en) Diagnostic kits and immunoassay methods for diagnosis and differentiation of African Swine Fever Virus (ASFV) and Classical Swine Fever Virus (CSFV)
EP1340086B1 (en) Assay for directly detecting a rs virus related biological cell in a body fluid sample
US8530230B2 (en) Multiplexed assay methods
CN112986580B (zh) 一种新型冠状病毒中和抗体检测方法及试剂盒
CN106053794A (zh) 一种用于准确检测待测物的试剂卡、试剂盒和用途
JP2004526156A (ja) 定量的アッセイ法における特異的結合の変動の補償
AU2002210384A1 (en) Assay for directly detecting a RS virus related biological cell in a body fluid sample
WO2021258618A1 (zh) 一种生物样品检测方法及检测试剂盒
CN116249902A (zh) SARS-CoV-2免疫测定及其材料
CN113321715B (zh) 新型冠状病毒抗原及其检测用途
CN106053802A (zh) 一种肺炎支原体抗体双标记纳米时间分辨荧光免疫层析定量试纸及其制备方法
Chand et al. Development of a rapid lateral flow immunochromatography assay for the detection of group-specific antibodies against VP7 protein of bluetongue virus in multiple species
CN104849443B (zh) 基于pH计的酶联免疫吸附测定方法
CN110988325B (zh) 封闭剂及包含该封闭剂的试剂盒
CA2944708A1 (en) Controls for implementing multiplex analysis methods
JPH11133023A (ja) 尿試料を使用する免疫クロマトグラフィー検定の尿素の影響を減らすための配合物
CN204287192U (zh) 髓过氧化物酶免疫层析定量检测试纸条
CN112798781A (zh) 用于人附睾蛋白4检测的组合物及应用和磁微球电化学发光免疫检测试剂盒与检测方法
EP1397388B1 (en) Fxiii subunit a detection for verifying serum sample
US20230120734A1 (en) Lateral flow assay device for detection of analytes and method of detection thereof
CN114814243B (zh) 应用于蛋白质抗原的定量检测试剂盒及方法
US20220042984A1 (en) Lateral Flow Assay Device for Detection of Analytes and Method of Detection Thereof
CN210090472U (zh) 一种免疫侧流层析试剂条及包括该试剂条的试剂盒
CN114942323A (zh) 一种血管内皮生长因子(vegf)检测试剂盒及其制备和使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant