CN111610332A - 用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条与检测方法 - Google Patents

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Abstract

长余辉免疫层析试纸条包括底板与设置于底板上依次相连的样品区、检测区和吸附区；样品区含有与第一生物标记物偶联的长余辉纳米微球；长余辉纳米微球包括高分子聚合物微球和包埋于高分子聚合物微球内部的长余辉发光材料；第一生物标记物能与待测样中含有的新冠病毒待检测目标物特异性结合；检测区内设置有检测线和质控线；检测线喷涂有能与待检测目标物特异性结合的第二生物标记物；质控线喷涂有活性验证物；活性验证物用于指示生物标记物的有效性。长余辉免疫层析试纸条具有检测方便，灵敏度高、测试准确、成本低与容易推广等优点。

Description

用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条与检测方法
技术领域
本发明属于免疫层析检测技术领域，特别涉及用于检测新冠病毒的长 余辉免疫层析试纸条与检测方法。
背景技术
新型冠状病毒感染后仍无症状的患者，也存在感染他人的风险，最有 效方式就是对疑似病患进行专业的免疫检测，确认其显性还是隐性。其中， 免疫检测包括对新型冠状病毒的核酸链段、新型冠状病毒的特异性蛋白、 新型冠状病毒产生的抗体等待检测目标物进行测定。
免疫检测中最常用的即是免疫试纸条，荧光免疫层析试纸条技术是以 抗原抗体间特异性识别为基础，以荧光微球作为信号标签，通过荧光信号 实现对待测样本中目标分析物精准和快速定量，广泛应用于临床医学领 域。基于长余辉发光微球的免疫层析试纸条，由于无激发光等造成的背景 信号干扰，能获得更高的信噪比，有利于试纸条的精准检测。
目前长余辉发光微球多为无机长余辉发光纳米微球。无机长余辉发光 纳米微球及探针的制备比较困难，且发光较弱，发光信号难以肉眼明显可 见。而且，现有的长余辉发光材料难以直接利用太阳光、室内灯光等常见 的白光激发，激发光一般选自例如紫外灯、LED、激光等特定波段的光源， 不利于在各种日常使用环境下的检测。另外，弱信号的检测需要借助于复 杂的专业设备，而且在应用于免疫层析检测时的效果也比较受限。
发明内容
本发明的目的是提供用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条与 检测方法，解决了现有免疫试纸条发光较弱且需要专业设备的技术问题。
本发明提供的技术方案如下：
本发明的目的一是提供：用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，包 括底板，所述底板上设置有依次相连的样品区、检测区和吸附区；
所述样品区含有与第一生物标记物偶联的长余辉纳米微球；所述长余辉纳 米微球包括高分子聚合物微球和包埋于所述高分子聚合物微球内部的长余辉 发光材料；
所述第一生物标记物能与待测样中含有的新冠病毒待检测目标物特异性 结合；
所述检测区内设置有检测线和质控线；所述检测线喷涂有能与第一生物标 记物特异性结合或待检测目标物特异性结合的第二生物标记物；所述质控线喷 涂有活性验证物；所述活性验证物用于指示生物标记物的有效性。
作为优选地，所述第一生物标记物为新冠病毒核酸适配体、新冠病毒抗原 蛋白或新冠病毒抗体。
作为优选地，所述第一生物标记物为新冠病毒核酸适配体；所述待检测目 标物为新冠病毒特异性的核酸链段；所述第二生物标记物为与待检测目标物互 补的链段。所述新冠病毒特异性的核酸链段，可以为通过RT-PCR技术由新冠 病毒的RNA序列转换而成的DNA序列，即使用RT-PCR扩增后获得大量的 DNA序列，可用试纸条进行检测，其中RT-PCR为逆转录聚合酶链式反应 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)的技术。
作为优选地，所述第一生物标记物的新冠病毒抗原蛋白为S蛋白和/或N 蛋白；所述待检测目标物为人抗新冠病毒总抗体、lgG抗体与lgM抗体中的至 少一种；所述第二生物标记物为新冠病毒抗原蛋白抗人总抗体、抗人lgG与抗 人lgM中的至少一种。
作为优选地，样品区含有与S蛋白和/或N蛋白偶联的长余辉纳米微球和 鸡lgY标记的长余辉纳米微球；检测线喷涂有抗人lgG和/或抗人lgM；所述质 控线喷涂有抗所述鸡lgY的羊抗鸡lgY；含有人IgG和人IgM(也为人抗新冠 病毒lgG抗体与lgM抗体)介导时，所述抗人lgG与抗人lgM均分别能与新冠 病毒S蛋白和新冠病毒N蛋白发生免疫反应。试纸条滴加的样品中含有人抗新 冠的抗体标准品，其中含有IgM抗体和/或IgG抗体。抗人IgG和抗人IgM分 别与人IgG和IgM反应；人IgG和人IgM分别是与S蛋白和N蛋白反应，S 蛋白和N蛋白是偶联在长余辉球上的，整体就会形成夹心，然后就能检测到长 余辉发光。
作为优选地，所述第一生物标记物的新冠病毒抗体为人抗新冠病毒总抗 体、lgG抗体与lgM抗体中的至少一种；所述待检测目标物为新冠病毒抗原蛋 白为S蛋白和/或N蛋白；所述第二生物标记物为新冠病毒抗原蛋白抗人总抗 体、抗人lgG与抗人lgM中的至少一种。
作为优选地，所述活性验证物为羊抗鸡lgY；所述第一生物标记物还包括 鸡lgY标记的长余辉纳米微球。
人体在接触外来抗原2019新型冠状病毒(SARS-CoV-2)时，最早感染和 免疫后产生IgM抗体，实际是B淋巴细胞表面的B细胞受体(BCR)的分泌 形式，在IgM识别抗原以后，产生这些IgM的B细胞会进入淋巴结，并从B 细胞分化为浆细胞，浆细胞可以大量分泌抗体IgG，IgG抗体的亲和力比IgM 会高很多，会在机体内存在很长时间，但是IgM只在病原体刚来的时候会出现， 持续时间大约一周。所以用两者进行检测是都能达到标识的目的，两者联用更 是能进一步帮助确诊。
核酸检测是新冠病毒检测的金标准，但是受取样影响，检测的敏感性受限， 同时由于需要专业设备和人员操作，检测时间周期较长，用于大范围检测效率 受影响。抗体检测作为核酸检测的重要补充，操作简单，检测时间一般仅需 15-20分钟，已成为新冠诊断的重要手段，极大的加速了新冠诊断的时间。
作为优选地，所述长余辉发光材料包括吸光剂、缓存剂与发光剂；所述吸 光剂能吸收激发光的能量后产生单线态氧；所述缓存剂被所述单线态氧氧化生 成不稳定中间体，所述不稳定中间体断键释放能量；所述发光剂吸收所述能量 并释放长余辉发光。
作为优选地，所述吸光剂包括长波吸光剂与短波吸光剂；所述发光剂发光 波长为380nm～780nm。
作为优选地，所述长波吸光剂为
Figure BDA0002472342030000041
Figure BDA0002472342030000042
中的至少一种；所述短波吸光剂为
Figure BDA0002472342030000043
Figure BDA0002472342030000044
所述发光剂为
Figure BDA0002472342030000045
所述缓存剂为
Figure BDA0002472342030000046
PdPc主要吸收紫外、蓝光和近红外光波段；PtTPBP主要吸 收紫外、蓝光、和红光波段；PdOEP主要吸收紫外和绿光波段。发光剂的发光 波长为615nm，正好落在可见光的范围中。缓存剂的传递效率也很高，足以提 供肉眼可见的强度。
作为优选地，所述吸光剂为
Figure BDA0002472342030000051
Figure BDA0002472342030000052
与
Figure BDA0002472342030000053
的组合物，三者的摩尔比为2:1:5；所 述吸光剂组合物与发光剂的摩尔比为1:200-2000。其三者配合，可以吸收紫外、 绿光波段、紫外、蓝光和近红外光波段。白光为混合光，此处吸光剂的混合搭 配，能更有效地吸收白光中的各个波段的光子，可以有效的扩大白光下的能量 吸收。能够积累足够的能量使得发光剂发出肉眼可见波段的光，且强度足够肉 眼识别。
作为优选地，所述缓存剂为长余辉发光材料总质量的1％-20％。
作为优选地，所述第二生物标记物的含量为0.1mg/mL-2mg/mL；所述第 一生物标记物的含量占与第一生物标记物偶联的长余辉纳米微球总质量的 15％-25％。所述高分子聚合物微球的粒径为50-500nm，变异系数小于5％。
作为优选地，所述样品区设有样品垫；所述检测区设有NC膜；所述吸附 区设有吸水纸；所述样品垫、NC膜与吸水纸顺次搭接；
作为优选地，所述高分子聚合物微球为羧基化聚苯乙烯球、氨基化聚苯乙 烯球、醛基化聚苯乙烯球中的至少一种。
作为优选地，所述长余辉免疫层析试纸条还可以包括结合垫，样品垫、结 合垫、NC膜与吸水纸顺次搭接；样品区用于上样，与检测抗体偶联的长余辉 纳米微球转而上样至结合垫上；所述长余辉免疫层析试纸条外侧卡扣有卡壳。
本发明的另一目的在于提供：长余辉免疫层析试纸条的检测方法，包括以 下步骤：
S1、将NC膜设于底板中部，样品垫和吸附区吸水纸分别搭接于NC膜的 两侧；然后取与生物标准物偶联的长余辉纳米微球与鸡lgY标记的长余辉纳米 微球喷涂至样品区；检测线喷涂第二生物标记物；所述质控线喷涂有抗所述鸡 lgY的羊抗鸡lgY；
S2、取含有新冠病毒待检测目标物的待测样本滴加至所述长余辉免疫层析 试纸条的样品区，至待测样本爬升完全；
S3、激发光照射所述长余辉免疫层析试纸条；
S4、停止照射，读取步骤S3所述长余辉免疫层析试纸条的发光信号，判 断待测样本中是否含有新冠病毒的抗体。
作为优选地，生物标准物为人抗新冠lgG和/或人抗新冠lgM；第二生物标 记物为抗人lgG和/或抗人lgM；长余辉免疫层析试纸条的检测方法，具体包括 以下步骤：
S1、将NC膜设于底板中部，样品垫和吸附区吸水纸分别搭接于NC膜的 两侧；然后取与人抗新冠lgG和/或人抗新冠lgM偶联的长余辉纳米微球与鸡 lgY标记的长余辉纳米微球喷涂至样品区；检测线喷涂抗人lgG和/或抗人lgM； 所述质控线喷涂有抗所述鸡lgY的羊抗鸡lgY；
S2、取待测样本滴加至所述长余辉免疫层析试纸条的样品区，至待测样本 爬升完全；
S3、激发光照射所述长余辉免疫层析试纸条；
S4、停止照射，读取步骤S3所述长余辉免疫层析试纸条的发光信号，判 断待测样本中是否含有新冠病毒的抗体。
紫外灯下可以清楚观察到试纸条上检测线与质控线上紫红色条带。
作为优选地，本发明吸光剂为
Figure BDA0002472342030000071
Figure BDA0002472342030000072
与
Figure BDA0002472342030000073
所述发光剂为
Figure BDA0002472342030000074
所述缓存剂为
Figure BDA0002472342030000075
于白光下照射， 爬升完全(1min-10min)后，将试纸条置于黑暗环境下，非紫外灯下也能观察 到明显的显色条带。因为PdPc主要吸收紫外、蓝光和近红外光波段；PtTPBP 主要吸收紫外、蓝光、和红光波段；PdOEP主要吸收紫外和绿光波段。发光剂 的发光波长为615nm，正好落在可见光的范围中。缓存剂的传递效率也很高， 足以提供肉眼可见的强度。
作为优选地，所述步骤S4的具体过程为停止照射，读取步骤S3所述长余 辉免疫层析试纸条的发光信号，将发光信号的发光强度与发光强度-样品浓度校 准曲线相拟合，得到此发光强度下对应的待测样中人抗新冠病毒抗体对的样品 浓度。
步骤S3采用太阳光、照明灯光、手机闪光灯、手电筒与白光LED的白光 等的白光照射试纸条2s-10s，长余辉纳米微球中的吸光剂能吸收激发光的能量 后产生单线态氧；所述缓存剂被所述单线态氧氧化生成不稳定中间体，所述不 稳定中间体断键释放能量；所述发光剂吸收所述能量并释放可见光波长的长余 辉。故而会在检测线与质控线处出现肉眼可见的长余辉光，且因为本发明中的 材料为长余辉材料，发光波长也为肉眼可见，发光时间够长，可以供肉眼辨别。
作为优选地，步骤S4后还包括S5降噪算法；所述降噪算法步骤如下：
S51、定量测定检测区长余辉发光区域与非长余辉发光区域的发光信号；
S52、长余辉发光区域与非长余辉发光区域的发光强度经降噪算法计算后， 得到纯净的长余辉发光区域发光物质的发光强度；纯净的发光强度与发光强度 -长余辉物质浓度校准曲线相拟合，得到此发光强度下对应的长余辉物质浓度；
所述长余辉发光区域为检测线与质控线；所述非长余辉发光区域为检测区 除长余辉发光区域之外的区域；
所述长余辉发光区域与非长余辉发光区域的发光强度为RGB信号；所述 RGB信号包括红元素信号与绿元素信号；
所述降噪算法包括以下步骤：
Rz/Gy＝Rf/Gf (1)
上式(1)中，Rz为长余辉发光区域的红色荧光噪声信号强度；Gy为长余辉 发光区域的绿元素信号强度；Rf为非长余辉发光区域的红元素信号强度；Gf为 非长余辉发光区域的绿元素信号强度；
R＝Ry-Gy×(Rf/Gf) (2)
上式(2)中，R为长余辉发光区域的发光物质发出红光信号强度；Ry为长 余辉发光区域检测到的红元素信号强度；Gy为长余辉发光区域的绿元素信号强 度；Rf为非长余辉发光区域的红元素信号强度；Gf为非长余辉发光区域的绿元 素信号强度。
因长余辉信号多为红色信号，此处选择红元素进行去噪声演算，同理，还 可以根据具体情况选择蓝元素或绿元素。作为对比的绿元素也可以根据需要进 行替换。
步骤S4既能定性，对此患者进行确诊。如要定量者还需要结合步骤S5。
上述检测方法实为半定量方法，目前市场上还没有纯净的标准品，实验室 使用的多数为纯净的未知具体浓度的为设定标准浓度的标准品，依此作为基 准，最后得到的浓度为相对浓度，而非绝对浓度。
作为优选地，所述激发光为太阳光、照明灯光、手机闪光灯、手电筒与白 光LED的白光中的至少一种；步骤S3所述激发光照射的照射时间为2s–10s。
作为优选地，用于读取发光信号的仪器为手机、发光成像系统与专业长余 辉发光检测设备中的一种。
有益效果：本发明的长余辉免疫层析试纸条用于检测新型冠状病毒，在IgG 和IgM介导存在下，分别对新型冠状病毒的G蛋白与M蛋白进行检测。人体 在接触外来抗原(2019-nCoV)时，最早由产生IgM抗体，实际是B淋巴细胞 表面的B细胞受体(BCR)的分泌形式，在IgM在识别抗原以后，产生这些 IgM的B细胞会进入淋巴结，并从B细胞分化为浆细胞，浆细胞可以大量分泌 抗体IgG，IgG抗体的亲和力比IgM会高很多，会在机体内存在很长时间，但是IgM只在病原体刚来的时候会出现，持续时间大约一周。分别用IgM抗体 与IgG抗体进行检测时都能达到标识的目的，两者联用更是能进一步帮助确诊。 可以最大程度的确保检测的准确性。
本发明中使用的长余辉材料包含吸光剂、缓存剂与发光剂；吸光剂包括至 少一种，当为两种以上设置时，两种吸光剂的吸收波长有交叉，能很大程度上 增大吸光剂的吸光范围。对于阳性检测来说，试纸条可于紫外灯照射下清楚看 到检测线和质控线有紫红色线条带。
本发明的长余辉材料吸光剂包括长波吸光剂与短波吸光剂；两组设置时， 最大程度的增大了激发光的范围，使得在紫外、可见与红外波段后会发生激发。
进一步的，吸光剂为
Figure RE-GDA0002582461290000091
的 组合物；缓存剂为
Figure RE-GDA0002582461290000092
发光剂为
Figure RE-GDA0002582461290000093
其中吸光剂能吸收足够的能量，缓存剂能高效的进行能量传递，并延缓发光时 间；发光剂的发射光波长为可见光。以上虽只是一种将日光灯常见光收集后， 缓存2s-10s后，以可见光发射的长余辉材料。本发明的检测试纸可以在日光下 激发微球，并可以实现肉眼辨识；在快速高效、高灵敏度的前提下，且具有便 利性，在非专业设备下也能显示，有利于试纸条的推广使用。
本发明的检测方法可半定量的测得待测抗原的含量，故而可以帮助医生判 断其是否是高危病症，进而节省医疗资源，提高效率。本发明还采用了降噪算 法的处理，因试纸条的原理是毛细管作用，在长余辉纳米微球的爬升过程中， 不可避免的会在其经过的路径上残留部分地长余辉物质，在对检测线与质控线 的光信号采集时，也会得到因为残留而产生的噪声，本发明假设爬升的过程中 各部分地噪声相对均匀了，故而采用将检测线与质控线的光信号减去非长余辉 区域的光信号，得到矫正后的纯净光信号，再根据事先得到的标准曲线，得到 待检样品中的抗原浓度，进而得到对应病患的感染程度。
本发明的试纸条与检测方法具有检测方便，测试准确，成本不高，容易推 广等优点。
附图说明
下面将以明确易懂的方式，结合附图说明优选实施方式，对用于检测 新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条与检测方法的上述特性、技术特征、优 点及其实现方式予以进一步说明。
图1是本发明长余辉免疫层析试纸条的示意图；
图2是长余辉材料的发光原理图；
图3是实施例4的试纸条测试0mg/mL待测样品后，紫外灯下的显色图；
图4是实施例4的试纸条测试0.00009mg/mL待测样品后，紫外灯下的显色 图；
图5是实施例4的试纸条测试0.00037mg/mL待测样品后，紫外灯下的显色 图；
图6是实施例4的试纸条测试0.00075mg/mL待测样品后，紫外灯下的显 色图；
图7是实施例4的试纸条测试0.003mg/mL待测样品后，紫外灯下的显色 图；
图8是实施例4的试纸条测试0.006mg/mL待测样品后，紫外灯下的显色 图；
图9是实施例4与对比例1对比实验后，暗处长余辉发光显色图。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对 照附图说明本发明的具体实施方式。显而易见地，下面描述中的附图仅仅 是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图，并获得其他的实施 方式。
实施例1
长余辉材料分别由吸光剂、缓存剂发光剂组成；吸光剂为
Figure BDA0002472342030000121
的组合物(三种吸光剂 的摩尔比2:1:5)；发光剂为
Figure BDA0002472342030000122
缓存剂为
Figure BDA0002472342030000123
PdPc主要吸收紫外、蓝光和近红外光波段；PtTPBP主要吸 收紫外、蓝光、和红光波段；PdOEP主要吸收紫外和绿光波段。发光剂的发光 波长为615nm，正好落在可见光的范围中。缓存剂的传递效率也很高，足以提 供肉眼可见的强度。
其吸光剂、缓存剂发光剂三者组成的长余辉材料的发光机理为：吸光剂吸 收激发光后，能级跃迁至激发态，不稳定的激发态将能量转移至氧气产生单线 态氧，单线态氧将光能缓存单元氧化成中间体1,2-氧杂环丁烷，中间体不稳定 会分解成双酮分子，并释放出能量；该能量被发光剂吸收后跃迁至激发态，中 间体1,2-氧杂环丁烷的分解为一元反应，半衰期在秒级，中间体的分解步骤为 决速步骤，因此发光剂的发光寿命可被延长至秒级。当去掉激发光后，分子的 长余辉强度降到激发时的长余辉最大强度的1/e所需要的时间，称为长余辉寿 命。
如图2所示，把长余发光辉材料包埋在高分子聚合物微球内，高分子聚合 物微球表面偶联有第一生物标记物(新冠病毒S蛋白和/或新冠病毒N蛋白)； 将此偶联有第一生物标记物的长余辉纳米微球与鸡lgY标记的长余辉纳米微球 喷涂于样品垫上；再在检测线喷涂有抗人lgG和抗人lgM；所述质控线喷涂有 抗所述鸡lgY的羊抗鸡lgY。
实施例2
在实施例1的基础上，如图1所示，检测区依次设有lgM线(喷涂有抗人 lgM)、lgG线(喷涂有抗人lgG)与C线(喷涂有羊抗鸡lgY)。lgG线上能 截获新冠病毒S蛋白和新冠病毒N蛋白；lgM线也能截获新冠病毒S蛋白和新 冠病毒N蛋白，C线上的羊抗鸡lgY能与结合垫上因毛细管作用爬升来的鸡lgY 特异性结合，用于确认同在结合垫上的新冠病毒S蛋白和/或新冠病毒N蛋白 是否失活。
在试纸条质检时，在成品试纸条的样品区滴加待测样品(人抗新冠标准品， 也即是新冠阳性样品)，样品前沿爬升，至检测区时，其中含有的所有显示线 (质控线与检测线)均显色。如lgM线(喷涂有抗人lgM)和lgG线(喷涂有 抗人lgG)与C线(喷涂有羊抗鸡lgY)均显色，于紫外灯下为紫红色条带。
以上制得的试纸条，再经过在样品垫上上样，毛细管作用下，待测样本中 的人抗新冠病毒抗体先与新冠病毒S蛋白和/或新冠病毒N蛋白结合，也带上 了长余辉纳米微球。在吸附区吸水纸的作用下前沿逐步移动，至lgG线、lgM 线与C线。之后，在白光激发光的作用下，长余辉纳米微球中的发光剂吸收激 发光的能量后产生单线态氧；所述缓存剂被所述单线态氧氧化生成不稳定中间 体，所述不稳定中间体断键释放能量；所述发光剂吸收所述能量并释放长余辉， 长余辉波长为615nm，此长余辉为肉眼可见。
实施例3
与实施例2不同的是，本实施例中的检测区仅设有lgM线(喷涂有抗人 lgM)与C线(喷涂有羊抗鸡lgY)。
实施例4
与实施例2不同的是，本实施例中的检测区仅设有lgG线(喷涂有抗人lgG) 与C线(喷涂有羊抗鸡lgY)。
如图3-8所示，将实施例4中制得的6个试纸条上分别上0mg/mL、0.00009 mg/mL、0.00037mg/mL、0.00075mg/mL、0.003mg/mL、0.006mg/mL的待测 样品(人抗新冠标准品，也即是新冠阳性样品)，1min-10min后样品前沿爬升， 至检测区时，其紫外灯下显色。测得其浓度如下表1所示：
表1
T/C比值 浓度(mg/L)
0mg/mL 0.057 0.934
0.00009mg/mL 0.250 8.083
0.00037mg/mL 0.937 60.55
0.00075mg/mL 1.282 118.0
0.003mg/mL 1.589 196.2
0.006mg/mL 2.103 400.8
注：T/C比值为lgG线与C线上发光强度的比值。浓度为不同浓度下的 IgG/C。
如图3所示，0mg/mL时仅有C线有显色，lgG线无显色。如图4所示， 0.00009mg/mL时lgG线已经能观察到显色，lgG线(喷涂有抗人lgG)与C 线(喷涂有羊抗鸡lgY)均显色，于紫外灯下为紫红色条带。可见，本发明试 纸条的灵敏度为0.00009mg/mL。图5-8分别为0.00037mg/mL、0.00075mg/mL、 0.003mg/mL、0.006mg/mL，随着浓度的增大，其lgG线的显色逐渐加深。
对比例1
与实施例4不同的是，本对比例中的长余辉材料分别由吸光剂、缓存剂发 光剂组成；吸光剂为
Figure BDA0002472342030000141
发光剂为
Figure BDA0002472342030000142
缓存剂为
Figure BDA0002472342030000151
其他部分均相同。
将实施例4制得的试纸条与对比例1制得的试纸条进行对比实验，将两试 纸条分别上0.00037mg/mL的待测样品(人抗新冠标准品，也即是新冠阳性 样品)，1min-10min后样品前沿爬升，室内日光照射2-10s后，移至暗处观察， 拍摄其显色照片图9所示。如图9可得，将实施例4制得的试纸条可于暗处显 色，且肉眼或手机拍摄可视。对比例1则观察不到。本发明于白光激发，发射 出暗处时可以肉眼观察到的检测信号，能够肉眼完成测试。
实施例4制得的试纸条，试纸条判读窗口lgG线和C线位置出现清晰的紫 红色条带，判为抗新型冠状病毒lgG抗体阳性。
实施例3制得的试纸条，本发明制得试纸条，试纸条判读窗口lgM线和C 线位置出现清晰的紫红色条带，判为抗新型冠状病毒lgM抗体阳性。
判读窗口C线位置无紫红色条带，不论lgM线和lgG线位置是否出现紫红 色条带，判为抗新型冠状病毒lgM抗体阴性。
实施例2中制得的试纸条通过lgG线、lgM线与C线先显色情况判断待测 样品中是否含有抗原，进而判断采样病患是否感染了新型冠状病毒。C线显色， lgG线与lgM线均未显色，则判断此患者未感染新型冠状病毒。
lgG线、lgM线与C线显色，且lgM线较深，lgG线较浅，则判断此患者 为感染新型冠状病毒为阳性，处于感染阶段。
lgG线、lgM线与C线显色，且lgM线较浅，lgG线较深，则判断此患者 为感染新型冠状病毒为阳性，处于免疫阶段。
对应检测样的含量，则需要对lgG线、lgM线与C线的长余辉强度进行相 关运算。定量测定检测区lgG线、lgM线与C线的长余辉强度；计算得到T/C 比值，然后根据标准曲线，对应的即可得到对应待测样中的浓度。
实际检测时，需将全血样处理得到血清，再进行测试。
实施例5
与实施例2不同的是，本实施例中样品区含有与第一生物标记物偶联的长 余辉纳米微球为lgG抗体偶联的长余辉纳米微球与lgM抗体偶联的长余辉纳米 微球；样品区滴加上样待测样，待测样中含有的待检测目标物为新冠病毒抗原 蛋白为S蛋白和/或N蛋白。
实施例6
与实施例2不同的是，本实施例中样品区含有与第一生物标记物偶联的长 余辉纳米微球为人抗新冠病毒总抗体偶联的长余辉纳米微球；检测线上含有抗 人总抗体；样品区滴加上样的待测样，待测样中含有的待检测目标物为新冠病 毒抗原蛋白为S蛋白和/或N蛋白。
实施例7
与实施例2不同的是，本实施例中样品区含有与新冠病毒核酸适配体偶联 的长余辉纳米微球；检测线上的第二生物标记物为与待检测目标物互补的链 段。样品中待检测目标物为新冠病毒特异性的核酸链段，所述新冠病毒特异性 的核酸链段通过RT-PCR技术由新冠病毒的核酸序列扩增获得。
应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上所述仅是本 发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说， 在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和 润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，其特征在于：
所述用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条包括底板，所述底板上设置有依次相连的样品区、检测区和吸附区；
所述样品区含有与第一生物标记物偶联的长余辉纳米微球；所述长余辉纳米微球包括高分子聚合物微球和包埋于所述高分子聚合物微球内部的长余辉发光材料；
所述第一生物标记物能与待测样中含有的新冠病毒待检测目标物特异性结合；
所述检测区内设置有检测线和质控线；所述检测线喷涂有能与待检测目标物特异性结合的第二生物标记物；所述质控线喷涂有活性验证物；所述活性验证物用于指示生物标记物的有效性。
2.根据权利要求1所述用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，其特征在于：所述第一生物标记物为新冠病毒核酸适配体、新冠病毒抗原蛋白或新冠病毒抗体；
优选的，所述第一生物标记物为新冠病毒核酸适配体；所述待检测目标物为新冠病毒特异性的核酸链段；所述第二生物标记物为与待检测目标物互补的链段；
优选的，所述第一生物标记物的新冠病毒抗原蛋白为S蛋白和/或N蛋白；所述待检测目标物为人抗新冠病毒总抗体、lgG抗体与lgM抗体中的至少一种；所述第二生物标记物为新冠病毒抗原蛋白抗人总抗体、抗人lgG与抗人lgM中的至少一种；
优选的，所述第一生物标记物的新冠病毒抗体为人抗新冠病毒总抗体、lgG抗体与lgM抗体中的至少一种；所述待检测目标物为新冠病毒抗原蛋白为S蛋白和/或N蛋白；所述第二生物标记物为新冠病毒抗原蛋白抗人总抗体、抗人lgG与抗人lgM中的至少一种。
3.根据权利要求1所述用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，其特征在于：所述活性验证物为羊抗鸡lgY；所述第一生物标记物还包括鸡lgY标记的长余辉纳米微球；
优选的，所述长余辉发光材料包括吸光剂、缓存剂与发光剂；所述吸光剂能吸收激发光的能量后产生单线态氧；所述缓存剂被所述单线态氧氧化生成不稳定中间体，所述不稳定中间体断键释放能量；所述发光剂吸收所述能量并释放长余辉。
4.根据权利要求3所述的用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，其特征在于：所述吸光剂包括长波吸光剂与短波吸光剂；所述发光剂发光波长为380nm～780nm；
优选的，所述长波吸光剂为
Figure FDA0002472342020000021
(PdPc)和
Figure FDA0002472342020000022
(PtTPBP)中的至少一种；所述短波吸光剂为
Figure FDA0002472342020000023
(PdOEP)；所述发光剂为
Figure FDA0002472342020000024
所述缓存剂为
Figure FDA0002472342020000025
优选的，所述吸光剂为
Figure FDA0002472342020000031
与
Figure FDA0002472342020000032
的组合物，三者的摩尔比为2:1:5；所述吸光剂组合物与发光剂的摩尔比为1:200-2000；
优选的，所述缓存剂为长余辉发光材料总质量的1％-20％。
5.根据权利要求1所述的用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，其特征在于：所述第二生物标记物的含量为0.1mg/mL-2mg/mL；所述第一生物标记物的含量占与第一生物标记物偶联的长余辉纳米微球总质量的15％-25％。
6.根据权利要求1所述的用于检测新冠病毒的长余辉免疫层析试纸条，其特征在于：所述样品区设有样品垫；所述检测区设有NC膜；所述吸附区设有吸水纸；所述样品垫、NC膜与吸水纸顺次搭接；
优选的，所述高分子聚合物微球为羧基化聚苯乙烯球、氨基化聚苯乙烯球、醛基化聚苯乙烯球与磺酸根化聚苯乙烯球中的至少一种。
7.如权利要求1-6任一项所述长余辉免疫层析试纸条的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将NC膜设于底板中部，样品垫和吸附区吸水纸分别搭接于NC膜的两侧；然后取与生物标准物偶联的长余辉纳米微球与鸡lgY标记的长余辉纳米微球喷涂至样品区；检测线喷涂第二生物标记物；所述质控线喷涂有抗所述鸡lgY的羊抗鸡lgY；
S2、取含有新冠病毒待检测目标物的待测样本滴加至所述长余辉免疫层析试纸条的样品区，至待测样本爬升完全；
S3、激发光照射所述长余辉免疫层析试纸条；
S4、停止照射，读取步骤S3所述长余辉免疫层析试纸条的发光信号，判断待测样本中是否含有新冠病毒的抗体。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4的具体过程为：停止照射，读取步骤S3所述长余辉免疫层析试纸条的发光信号，将发光信号的发光强度与发光强度-样品浓度校准曲线相拟合，得到此发光强度下对应的待测样中人抗新冠病毒抗体对的样品浓度。
9.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：所述激发光为太阳光、照明灯光、手机闪光灯、手电筒与白光LED的白光中的至少一种；步骤S3所述激发光照射的照射时间为2s–10s。
10.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：用于读取发光信号的仪器为手机、发光成像系统与专业长余辉发光检测设备中的一种。
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